ENZIMAS Los enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos.

Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que slamente aceleran las que espontneamente podran producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH.

ASPECTOS GENERALES SOBRE LOS ENZIMAS

Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Los enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reaccin catalizada por un enzima: 1. La sustancia sobre la que acta el enzima se llama sustrato. 2. El sustrato se une a una regin concreta del enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende (1) un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccin 3. Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin

1.- El enzima y su sustrato

2.- Unin al centro activo

3.- Formacin de productos

Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan reacciones especficas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. El enzima sacarasa es muy especfico: rompe el enlace b-glucosdico de la sacarosa o de compuestos muy similares. As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural, mientras

que la maltosa y la isomaltosa son sustratos anlogos. El enzima acta con mxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos anlogos. Entre los enzimas poco especficos estn las proteasas digestivas como la quimotripsina, que rompe los enlaces amida de protenas y pptidos de muy diverso tipo. PROPIEDADES DE LOS ENZIMAS

Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser protenas y de actuar como catalizadores. Como protenas, poseen una conformacin natural ms estable que las dems conformaciones posibles. As, cambios en la conformacin suelen ir asociados en cambios en la actividad cataltica. Los factores que influyen de manera ms directa sobre la actividad de un enzima son: pH temperatura cofactores

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

A veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la figura inferior podemos observar una molcula de hemoglobina (protena que transporta oxgeno) y su coenzima (el grupo hemo). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prosttico= holoenzima

NOMENCLATURA DE LOS ENZIMAS Hay varias formas mediante las cuales se asigna un nombre a un enzima: nombres particulares nombre sistemtico cdigo de la comisin enzimtica (enzyme comission)

NOMBRES PARTICULARES Antiguamente, los enzimas reciban nombres particulares, asignados por su descubridor. Al ir aumentando el nmero de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemtica que informara sobre la accin especfica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba. NOMBRE SISTEMTICO

El nombre sistemtico de un enzima consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reaccin realizado terminacin "asa" Un ejemplo sera la glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerizacin de la glucosa-6-fosfato en fructosa-6fosfato. Muchos enzimas catalizan reacciones reversibles. No hay una manera nica para fijar cual de los dos sentidos se utiliza para nombrar al enzima. As, la glucosa fosfato isomerasa tambin podra llamarse fructosa fosfato isomerasa. Cuando la accin tpica del enzima es la hidrlisis del sustrato, el segundo componente del nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa. Adems de los nombre sistemticos, an persisten otros consagrados por el uso. As, la glucosa:ATP fosforiltransferasa se llama habitualmente glucoquinasa. NOMENCLATURA DE LA COMISIN ENZIMTICA

El nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico, encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro nmeros separados por puntos. El primer nmero indica a cual de las seis clases pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos qumicos especficos que intervienen en la reaccin. As, la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) se define como EC 2.7.1.2. El nmero 2 indica que es una

transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y el ltimo 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato. CLASIFICACIN DE LOS ENZIMAS En funcin de su accin cataltica especfica, los enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases: Clase 1: OXIDORREDUCTASAS Clase 2: TRANSFERASAS Clase 3: HIDROLASAS Clase 4: LIASAS Clase 5: ISOMERASAS Clase 6: LIGASAS Clase 1: OXIDORREDUCTASAS Catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir, transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la reaccin general: AH2 + B Ared + Box A + BH2 Aox + Bred

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.

Clase 2: TRANSFERASAS

Catalizan la transferencia de un grupo qumico (distinto del hidrgeno) de un sustrato a otro, segn la reaccin: A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reaccin representada en la Figura de la derecha: glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

Clase 3: HIDROLASAS

Catalizan las reacciones de hidrlisis: A-B + H2O Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin: lactosa + agua Clase 4: LIASAS glucosa + galactosa AH + B-OH

Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos: A-B A+B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reaccin: cido acetactico CO2 + acetona

Clase 5: ISOMERASAS

Catalizan la interconversin de ismeros: A B

Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa isomerasa, que catalizan las reacciones representadas en la tabla inferior:

fosfotriosa isomerasa gliceraldehdo-3-fosfato dihidroxiacetona-fosfato

fosfoglucosa isomerasa glucosa-6fosfato fructosa-6fosfato

Clase 6: LIGASAS

Catalizan la unin de dos sustratos con hidrlisis simultnea de un nucletido trifosfato (ATP, GTP, etc.): A + B + XTP Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reaccin: piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato + ADP + Pi A-B + XDP + Pi

MODO DE ACCIN DE LOS ENZIMAS En las reacciones espontneas, los productos finales tienen menos energa libre de Gibbs (DG) que los reactantes (Figura inferior izquierda). Por tanto, en las reacciones espontneas se libera energa de Gibbs (DG<0). Sin embargo, el comienzo de la reaccin requiere un aporte inicial de energa. Esta energa inicial que hay que suministrar a los reactantes para que la reaccin transcurra se llama energa de activacin (Ea). Cuanto menor es la Ea ms fcilmente transcurre la reaccin. Perfil energtico de una reaccin espontnea Perfil energtico de una reaccin catalizada

La accin de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir la Ea (Figura superior derecha). Los enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea an ms que los catalizadores inorgnicos. Por ejemplo, la descomposicin del agua oxigenada (H2O2) para dar H2O y O2 puede ocurrir sin catalizador, con un catalizador inorgnico (platino), o con un enzima especfico (catalasa). Las respectivas Ea para cada proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. As, se puede calcular que el platino acelera la reaccin 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces. Para que una reaccin qumica tenga lugar, las molculas de los reactantes deben chocar con una energa y una orientacin adecuadas. La actuacin del enzima (1) permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientacin ptima para que la reaccin se produzca y (2) modifica las propiedades qumicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formacin de otros nuevos (Figuras inferiores):

Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido MODELO LLAVE-CERRADURA El modelo llave-cerradura supone que la estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura. Este modelo es vlido en muchos casos, pero no es siempre correcto.

MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO

En algunos casos, el centro activo adopta la conformacin idnea slo en presencia del sustrato. La unin del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formacin del producto. Este es el modelo del ajuste inducido Sera algo as como un cascanueces, que se adapta al contorno de la nuez.

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Una molcula de enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por: cambios en el pH cambios en la temperatura presencia de cofactores las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulacin alostrica modificacin covalente activacin por proteolisis isoenzimas

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH ptimo.

La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

A veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la figura de la izquierda podemos observar una molcula de mioglobina (protena que transporta oxgeno al tejido muscular) y su coenzima (el grupo hemo, representado en color verde). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prosttico= holoenzima

EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. La Figura de la derecha muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6 concentraciones distintas de sustrato. Adems, la presencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta, o incluso invertir su sentido (Figura inferior).

EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Ciertas molculas pueden inhibir la accin cataltica de un enzima: son los inhibidores. Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformacin espacial del enzima, impidiendo su unin al sustrato (inhibidor no competitivo) (Figuras inferiores). Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo

MODULACIN ALOSTRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma ms activa porque se une al sustrato con ms afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T (Figura inferior):

Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las molculas que favorecen la forma R pero que actan sobre una regin del enzima distinta del centro activo son los activadores alostricos (Figura inferior izquierda). Activador alostrico: favorece la unin Inhibidor alostrico: impide la unin del del sustrato sustrato

Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimtica son los moduladores negativos. Si estos moduladores actan en lugares distintos del centro activo del enzima se llaman inhibidores alostricos (Figura superior derecha) .

EFECTO DE LA MODIFICACIN COVALENTE SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra ms activa unindose covalentemente a un grupo qumico de pequeo tamao como el Pi o el AMP. Tambin se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al liberar algn grupo qumico. En las enzimas de las vas degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es ms activa que la no fosforilada, mientras que en las vas biosintticas ocurre lo contrario. En las figuras inferiores se ilustra la activacin de una protena por fosforilacin. Elementos de la reaccin El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

ACTIVACIN PROTEOLTICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como protenas precursoras sin actividad enzimtica. Estas protenas se llaman proenzimas o zimgenos. Para activarse, los zimgenos sufren un ataque hidroltico que origina la liberacin de uno o varios pptidos. El resto de la molcula proteica adopta la conformacin y las propiedades del enzima activo. Muchos enzimas digestivos se secretan en forma de zimgenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la a-quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsingeno (Figura superior). Si estos enzimas se sintetizasen directamente en forma activa destruiran la propia clula que las produce. As, la tripsina pancretica (una proteasa) se sintetiza como tripsingeno (inactivo). Si por alguna razn se activa en el propio pncreas, la glndula sufre un proceso de autodestruccin (pancreatitis aguda), a menudo mortal.

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su funcin biolgica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la funcin que debe realizar. As, podemos observar la existencia de isoenzimas en funcin de: el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isozimas distintos en msculo y corazn. el compartimento celular donde acta: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. el momento concreto del desarrollo del individuo: Por ejemplo, algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.

CINTICA ENZIMTICA Los principios generales de las reacciones qumicas se aplican tambin a las reacciones enzimticas. Por este motivo, antes de empezar con la cintica qumica, se van a repasar algunos conceptos bsicos de cintica qumica. A continuacin, se describirn los siguientes conceptos: Cintica enzimtica Modelo cintico de Michaelis-Menten Clculo de la KM y la Vmax de un enzima Actividad enzimtica

CONCEPTOS BSICOS DE CINTICA QUMICA

En una reaccin de orden cero, la velocidad de formacin del producto es independiente de la concentracin de sustrato: v = k En una reaccin de primer orden la velocidad de formacin de los productos es directamente proporcional a la concentracin del sustrato: v = k [A]. As, en la reaccin: sacarosa + agua glucosa + fructosa

La velocidad de hidrlisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentracin de sacarosa. Dicho matemticamente, donde [A] es la concentracin de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que sta es una reaccin de primer orden. Una reaccin de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formacin del producto depende

de la concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de condensacin): v = k [A1] [A2] del cuadrado de la concentracin de un nico sustrato (reaccin de dimerizacin): v = k [A]2 En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reaccin, y la forma de calcular sus parmetros cinticos.

ORDEN CERO Expresin diferencial de la velocidad Ecuacin integrada de la velocidad Vida media (t1/2) Representacin que da lugar a una recta Signo de la pendiente Significado de la pendiente Significado de la ordenada en el origen [A]0 es [A] vs t negativo -k [A]0 b [A] = -kt + [A]0

PRIMER ORDEN

SEGUNDO ORDEN

Ln[A] = -kt + Ln[A]0

Ln[A] vs t negativo -k Ln[A]0 eb

1/[A] vs t positivo k

1/b

CINTICA ENZIMTICA

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin (Figura de la derecha). Para evitar esta complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una grfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima (Vmax).

MODELO CINTICO DE MICHAELIS-MENTEN Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inical del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teora y propusieron una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas.

Para explicar la relacin oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la

formacin del producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre de constantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES] Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentracin total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es: [ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3): v1 = v2 + v3 Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es constante: v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que: k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que: , siendo , en donde la expresin (k2+k3)/k1 se ha sustitudo por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicacin sobre las razones que hacen de la KM un parmetro cintico importante. Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:

v = v3 = k3 [ES] = Para cualquier reaccin enzimtica, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos: A concentraciones de sustrato pequeas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los trminos entre parntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresin queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reaccin es un proceso cintico de primer orden. A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y por tanto, la reaccin es un proceso cintico de orden cero. Adems, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parmetro, la velocidad mxima de la reaccin (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzara cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato. Si introducimos el parmetro Vmax en la ecuacin general de la velocidad, (la frmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostricos, cuya grfica v frente a [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

CLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hiprbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax.

Para determinar grficamente los valores de KM y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual: La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

ACTIVIDAD ENZIMTICA

Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml). Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimtica como la

cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat). Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el nmero de centros activos por molcula de enzima, las medidas de actividad enzimtica permiten calcular el nmero de recambio del enzima, o sea, el nmero de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

MOTIVOS QUE HACEN DE KM UN PARMETRO CINTICO IMPORTANTE

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico importante pr mltiples razones: KM es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM = [S], la ecuacin de MichaelisMenten se reduce a: v = Vmax/2. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequea, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato). La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax. Los valores de KM de muchos enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.