Parte

I Introduo

1 Uma Viso Geral das Clulas e da Pesquisa Celular 2 A Qumica das Clulas 3 Fundamentos de Biologia Molecular

Captulo

1
Vrus e

Uma Viso Geral das Clulas e da Pesquisa Celular

A Origem e a Evoluo das Clulas 4 Clulas como Modelos Experimentais 15 Ferramentas da Biologia Celular 20
EXPERIMENTO-CHAVE:

Cultura de Clulas Animais 32 Cncer 35

MEDICINA MOLECULAR:

uma rea dinmica de pesquisa que fundamental para todas as cincias biolgicas. Isto verdade no somente do ponto de vista da pesquisa bsica, mas tambm em relao a um nmero crescente de aplicaes prticas na medicina, agricultura e biotecnologia. Especialmente com a concluso da seqncia do genoma humano, o progresso na biologia celular e molecular est abrindo novos horizontes na prtica da medicina. Exemplos notveis incluem o desenvolvimento de novas drogas especificamente direcionadas a interferir no crescimento de clulas cancerosas e no uso potencial de clulas-tronco para substituir os tecidos danificados e tratar pacientes que sofrem de doenas como diabetes, doena de Parkinson, doena de Alzheimer, leses na coluna vertebral e doenas cardacas. Em virtude de a biologia celular e molecular ser uma rea de pesquisa de rpido desenvolvimento, relevante compreender sua base experimental, assim como o estado atual do nosso conhecimento. Por essa razo, este captulo abordar a maneira como as clulas so estudadas e revisar algumas das suas propriedades bsicas. A apreciao das semelhanas e diferenas entre as clulas de vital importncia para a compreenso da biologia celular. Portanto, a primeira parte deste captulo discute tanto a uniformidade quanto a diversidade das clulas atuais em termos da evoluo a partir de um ancestral comum. Por um lado, todas as clulas compartilham propriedades fundamentais nicas que tm sido conservadas durante a evoluo. Por exemplo, todas as clulas utilizam o DNA como material gentico, so circundadas por membranas plasmticas e usam os mesmos mecanismos bsicos para o metabolismo energtico. Por outro lado, as clulas atuais desenvolveram uma grande variedade de modos de vida. Muitos organismos, como bactrias, amebas e leveduras, so constitudos de clulas isoladas que so capazes de se replicar independentemente. Organismos mais complexos so compostos de uma coleo de clulas que funcionam de uma maneira coordenada, com diferentes clulas especializadas para realizar uma funo determinada. O corpo humano, por exemplo, composto por mais de 200 tipos de clulas diferentes, cada uma especializada para funes distintas, como memria, viso, movimento e digesto. A diversidade exibida por esses vrios diferentes tipos de clulas surpreendente; considere, por exemplo, as diferenas entre as bactrias e as clulas do crebro humano. As semelhanas fundamentais entre diferentes tipos de clulas fornecem um tpico nico para a biologia celular, permitindo que os princpios bsicos
COMPREENSO DA BIOLOGIA MOLECULAR DAS CLULAS

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aprendidos a partir de experimentos com um tipo de clula sejam extrapolados e generalizados para outros tipos de clulas. Vrios tipos de clulas e organismos so amplamente usados para estudar diferentes aspectos da biologia celular e molecular. A segunda parte do captulo discute algumas das propriedades dessas clulas, que as fazem particularmente valiosas como modelos experimentais. Finalmente, importante reconhecer que os progressos em biologia celular dependem fortemente da disponibilidade de ferramentas experimentais que permitem que os cientistas faam novas observaes ou conduzam novos tipos de experimentos. Este captulo introdutrio, portanto, concludo com uma discusso de alguns mtodos experimentais usados para estudar as clulas, bem como com uma reviso de alguns dos principais desenvolvimentos histricos que permitiram a compreenso atual da estrutura e funo celular.

A Origem e a Evoluo das Clulas

As clulas so dividas em dois tipos principais, definidos pela presena ou no de um ncleo. As clulas procariticas (bactrias) no apresentam um envelope nuclear; as clulas eucariticas tm um ncleo, no qual o material gentico est separado do citoplasma. As clulas procariticas geralmente so menores e mais simples do que as clulas eucariticas; alm da ausncia de ncleo, seus genomas so menos complexos e elas no apresentam organelas citoplasmticas ou um citoesqueleto (Tabela 1.1). Apesar dessas diferenas, os mesmos mecanismos moleculares bsicos controlam a vida de ambas, procariticas e eucariticas, indicando que todas as clulas atuais descendem de um ancestral primordial comum. Como essa primeira clula se desenvolveu? Como evoluram a complexidade e a diversidade exibidas pelas clulas atuais? A Primeira Clula Provavelmente, a vida apareceu h pelo menos 3,8 bilhes de anos, aproximadamente 750 milhes de anos aps a Terra ter sido formada (Figura 1.1). Como a vida originou-se e como a primeira clula surgiu so assuntos de especulao, uma vez que esses eventos no podem ser reproduzidos em laboratrio. Contudo, diversos tipos de experimentos fornecem evidncias importantes da direo de algumas etapas do processo. Foi por volta de 1920 que, pela primeira vez, sugeriu-se que molculas orgnicas simples, sob as condies que se imagina que existiam na atmosfera da Terra primitiva, poderiam formar-se e espontaneamente polimerizar-se em macromolculas. Supe-se que, quando a vida se originou, a atmosfera da Terra tivesse pouco ou nenhum oxignio livre e, em vez disso, consistisse principalmente em CO2 e N2 e quantidades menores de gases como H2, H2S e CO. Semelhante atmosfera fornece condies redutoras nas quais molculas orgnicas, dada uma fonte de energia como

TABELA 1.1 Clulas Procariticas e Eucariticas Caracterstica Ncleo Dimetro de uma clula tpica Citoesqueleto Organelas citoplasmticas Contedo de DNA (pares de bases) Cromossomos Procariotos Ausente 1 m Ausente Ausente 1 106 a 5 106 Uma nica molcula de DNA circular Eucariotos Presente 10-100 m Presente Presente 1,5 107 a 5 109 Mltiplas molculas de DNA linear

A CLULA /
Figura 1.1 Escala de tempo da evoluo A escala indica o tempo aproximado no qual supe-se que alguns dos principais eventos na evoluo das clulas tenham ocorrido.

Presente

Organismos multicelulares 2

Bilhes de anos atrs Primeiros eucariotos Metabolismo oxidativo Fotossntese

Primeiras clulas

Eletrodo NH3

CH4 H2O H2O

4,6

Formao da Terra

H2 NH3

H2 Descarga eltrica

CH4

a luz solar ou descargas eltricas, podem ser formadas espontaneamente. A formao espontnea de molculas orgnicas foi pela primeira vez demonstrada experimentalmente na dcada de 1950, quando Stanley Miller (ento um estudante de graduao) mostrou que a descarga de fascas eltricas em uma mistura de H2, CH4 e NH3, na presena de gua, levava formao de uma grande variedade de molculas orgnicas, inclusive de vrios aminocidos (Figura 1.2). Embora os experimentos de Miller no tenham repetido precisamente as condies da Terra primitiva, eles demonstraram claramente a possibilidade da sntese espontnea de molculas orgnicas, fornecendo o material bsico a partir do qual se originaram os primeiros organismos vivos. A prxima etapa na evoluo foi a formao de macromolculas. Tem sido demonstrado que, sob as provveis condies pr-biticas, os blocos monomricos

gua

Resfriamento

Calor Molculas orgnicas Alanina cido asprtico cido glutmico Glicina Uria cido ltico cido actico cido frmico

Figura 1.2 Formao espontnea de molculas orgnicas O vapor de gua circulou atravs de uma atmosfera composta de CH4, NH3 e H2, dentro da qual fascas eltricas foram liberadas. A anlise dos produtos da reao revelou a formao de uma variedade de molculas orgnicas, incluindo os aminocidos alanina, cido asprtico, cido glutmico e glicina.

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formam, por polimerizao espontnea, as macromolculas. Por exemplo, o aquecimento de misturas secas de aminocidos resulta na polimerizao para formar polipeptdeos. Contudo, a caracterstica essencial da macromolcula a partir da qual a vida evoluiu deve ter sido a capacidade de auto-replicao. Somente uma macromolcula capaz de controlar a sntese de novas cpias de si prpria poderia ser capaz de reproduo e posterior evoluo. Dos dois tipos principais de macromolculas informativas presentes atualmente (cidos nuclicos e protenas), somente os cidos nuclicos so capazes de controlar sua auto-replicao. Os cidos nuclicos podem servir de moldes para sua prpria sntese como resultado do pareamento especfico de bases entre nucleotdeos complementares (Figura 1.3). A etapa essencial no entendimento da evoluo molecular foi alcanada no incio da dcada de 1980, quando foi descoberto nos laboratrios de Sid Altman e Tom Cech que o RNA capaz de catalisar vrias reaes qumicas, incluindo a polimerizao de nucleotdeos. Estudos mais avanados ampliaram as atividades catalticas conhecidas do RNA, incluindo a descrio de molculas de RNA que controlam a sntese de uma nova fita de RNA a partir de um RNA-molde. O RNA , assim, tanto capaz de servir como molde quanto capaz de catalisar sua prpria replicao. Conseqentemente, em geral aceito que o RNA tenha sido o sistema gentico inicial, e supe-se que a fase inicial da evoluo qumica tenha sido baseada nas molculas de RNA auto-replicativas um perodo da evoluo conhecido como mundo de RNA. Ento, interaes ordenadas entre RNA e aminocidos evoluram para o cdigo gentico atual, e o DNA finalmente substituiu o RNA como material gentico. Presume-se que a primeira clula tenha originado-se da incluso de RNAs autoreplicativos em uma membrana composta de fosfolipdeos (Figura 1.4). Como discutido em detalhes no prximo captulo, os fosfolipdeos so os componentes bsicos de todas as membranas biolgicas atuais, incluindo as membranas plasmticas de clulas procariticas e eucariticas. A caracterstica-chave dos fosfolipdeos que formam as membranas que eles so molculas anfipticas, significando que uma poro da molcula solvel em gua e a outra poro insolvel. Os fosfolipdeos tm longas caudas de hidrocarbonetos insolveis em gua (hidrofbica) ligadas a uma cabea com grupos fosfato solvel em gua (hidroflica). Quando colocados na gua, os fosfolipdeos agregam-se espontaneamente em uma bicamada, com suas cabeas com grupos fosfato na poro exterior em contato com a gua e suas caudas de hidrocarbonetos no interior em contato umas com as outras. Tais bicamadas de fosfolipdeos formam uma barreira estvel entre dois compartimentos aquosos por exemplo, separando o interior de uma clula do meio externo. A incluso do RNA auto-replicativo e de molculas associadas em uma membrana de fosfolipdeos poderia t-los mantido, assim, como uma unidade, capaz de auto-replicao e posterior evoluo. A sntese de protena controlada por RNA j

Figura 1.3 Auto-replicao do RNA O pareamento complementar entre nucleotdeos (adenina [A] com uracil [U] e guanina [G] com citosina [C]) permite que uma fita de RNA sirva como molde para a sntese de uma nova fita com a seqncia complementar.

C G A G A U U G A C

C G A G A U U G A C

G C U C
U
A

C G A G A U U
C
U

G C U C U A A C U G

C G A G A U U G A C

G C U C U A A C U G

C G A G A U U G A C

G C U C
U

G C U C U A U A C U G G A C
U

A
C

G A C

U
G

A CLULA /
RNA Membrana de fosfolipdeo

gua

Molcula de fosfolipdeo Cabea com grupo hidroflico Cauda hidrofbica

Figura 1.4 Incluso do RNA autoreplicativo em uma membrana de fosfolipdeos Supe-se que a primeira clula tenha sido criada pela incluso de RNA auto-replicativo e molculas associadas em uma membrana composta de fosfolipdeos. Cada molcula de fosfolipdeo tem duas longas caudas hidrofbicas ligadas a uma cabea hidroflica. As caudas hidrofbicas esto inseridas na bicamada lipdica; as cabeas hidroflicas esto expostas gua em ambos os lados da membrana.

gua

poderia ter sido desenvolvida neste tempo, no qual a primeira clula poderia ser constituda de um RNA auto-replicativo e das protenas por ele codificadas. A Evoluo do Metabolismo Em razo de as clulas terem originado-se em um mar de molculas orgnicas, elas eram capazes de obter alimento e energia diretamente do ambiente. Todavia, essa situao autolimitante, e por isso as clulas precisaram desenvolver seus prprios mecanismos para gerao de energia e sntese de molculas necessrias para sua replicao. A gerao e a utilizao controlada da energia metablica so essenciais para todas as atividades celulares, e as principais vias do metabolismo energtico (discutido em detalhes no Captulo 2) so bastante conservadas nas clulas atuais. Todas as clulas usam adenosina 5-trifosfato (ATP) como fonte de energia metablica para controlar a sntese dos constituintes celulares e realizar outras atividades que exigem energia, como o movimento (por exemplo, contrao muscular). Presume-se que o mecanismo usado pelas clulas para gerao de ATP evoluiu em trs etapas, correspondentes evoluo da gliclise, fotossntese e metabolismo oxidativo (Figura 1.5). O desenvolvimento dessas vias metablicas mudou a atmosfera da Terra, dessa forma alterando o futuro curso da evoluo. Presume-se que na atmosfera anaerbica da Terra primitiva as primeiras reaes de gerao de energia envolviam a quebra de molculas orgnicas na ausncia de

Gliclise C6H12O6 Glicose 2 C3H6O3 cido ltico Gerao de 2 ATP

Fotossntese 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 Glicose Metabolismo oxidativo C6H12O6 + 6 O2 Glicose 6 CO2 + 6 H2O Gerao de 36-38 ATP

Figura 1.5 Gerao do metabolismo energtico A gliclise a hidrlise anaerbica da glicose para cido ltico. A fotossntese utiliza a energia da luz solar para fazer a sntese de glicose a partir de CO2 e H2O, com a liberao de O2 como subproduto. O O2 liberado pela fotossntese usado no metabolismo oxidativo, no qual a glicose quebrada em CO2 e H2O, liberando muito mais energia que a obtida pela gliclise.

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oxignio. Essas reaes eram provavelmente reaes semelhantes gliclise atual a quebra anaerbica da glicose para cido ltico com o ganho energtico lquido de duas molculas de ATP. Alm do uso do ATP como fonte de energia qumica intracelular, todas as clulas atuais realizam gliclise, o que compatvel com a noo de que essas reaes surgiram muito cedo na evoluo. A gliclise forneceu o mecanismo pelo qual a energia de molculas orgnicas pr-formadas (por exemplo, glicose) poderia ser convertida em ATP, o qual podia ento ser usado como fonte de energia para direcionar outras reaes metablicas. Presume-se que a seguinte etapa evolutiva importante tenha sido o desenvolvimento da fotossntese, que permitiu s clulas captar energia da luz solar e forneceu a independncia da utilizao de molculas orgnicas pr-formadas. A primeira bactria fotossinttica, que surgiu h mais de 3 bilhes de anos, provavelmente utilizava H2S para converter CO2 em molculas orgnicas uma via de fotossntese ainda utilizada por algumas bactrias. O uso de H2O como doador de eltrons e hidrognio para a converso do CO2 em componentes orgnicos evoluiu mais tarde e teve a importante conseqncia de mudar a atmosfera da Terra. O uso de H2O nas reaes de fotossntese origina, como produto secundrio, o O2 livre; presume-se que esse mecanismo tenha sido o responsvel por tornar o O2 abundante na atmosfera da Terra. A liberao do O2, como conseqncia da fotossntese, mudou o ambiente no qual as clulas estavam em desenvolvimento, e presume-se que tenha levado ao desenvolvimento do metabolismo oxidativo. Alternativamente, o metabolismo oxidativo pode ter evoludo antes da fotossntese, com o aumento do O2 atmosfrico, fornecendo, ento, uma forte vantagem evolutiva para os organismos capazes de usar O2 nas reaes produtoras de energia. Em ambos os casos, o O2 uma molcula altamente reativa, e o metabolismo oxidativo, usando esta reatividade, forneceu um mecanismo para gerao de energia a partir de molculas orgnicas que muito mais eficiente que a gliclise anaerbica. Por exemplo, a hidrlise completa da glicose em CO2 e H2O rende energia equivalente a 36-38 molculas de ATP, em contraste com as 2 molculas de ATP formadas pela gliclise anaerbica. Com poucas excees, as clulas atuais usam reaes oxidativas como principal fonte de energia. Procariotos Atuais Os procariotos atuais, que incluem todos os diversos tipos de bactrias, so divididos em dois grupos as arqueobactrias e as eubactrias que divergiram precocemente na evoluo. Algumas arqueobactrias vivem em ambientes extremos, que atualmente so raros, mas que poderiam ter sido predominantes na Terra primitiva. Por exemplo, os termoacidfilos vivem em fontes trmicas sulfurosas com temperaturas to altas quanto 80oC e pH to baixo quanto 2. As eubactrias incluem as formas comuns das bactrias atuais um grande grupo de organismos que vive em uma ampla variedade de ambientes, incluindo solo, gua e outros organismos (por exemplo, patgenos humanos). Muitas clulas bacterianas so esfricas, em forma de bastonete ou espirais, com dimetros de 1 a 10 m. O contedo de DNA varia entre 0,6 milho e 5 milhes de pares de bases, uma quantidade suficiente para codificar aproximadamente 5.000 protenas diferentes. As cianobactrias so os maiores e mais complexos procariotos, bactrias que desenvolveram a fotossntese. A estrutura de uma clula procaritica tpica ilustrada pela Escherichia coli (E. coli), uma bactria comum, habitante do trato intestinal dos humanos (Figura 1.6). A clula um bastonete, com aproximadamente 1 m de dimetro e 2 m de comprimento. Como a maioria dos outros procariotos, a E. coli circundada por uma parede celular rgida composta de polissacardeos e peptdeos. Dentro da parede celular est a membrana plasmtica, que uma bicamada de fosfolipdeos e protenas associadas. Enquanto a parede celular porosa e facilmente penetrada por uma variedade de molculas, a membrana plasmtica fornece a separa-

Membrana plasmtica Parede celular

Nucleide 0,5 m

Figura 1.6 Micrografia eletrnica de E. coli A clula circundada pela parede celular, dentro da qual est a membrana plasmtica. O DNA est localizado no nucleide. (Menge and Wurtz/Biozentrum, University of Basel/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

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o funcional entre o interior da clula e o ambiente externo. O DNA da E. coli uma molcula circular nica no nucleide, o qual, em contraste com o ncleo dos eucariotos, no circundado por uma membrana que o separa do citoplasma. O citoplasma contm aproximadamente 30.000 ribossomos (o local da sntese protica), que contribuem para sua aparncia granular. Clulas Eucariticas Como as clulas procariticas, todas as clulas eucariticas so circundadas pela membrana plasmtica e contm ribossomos. Entretanto, as clulas eucariticas so muito mais complexas e apresentam um ncleo, organelas citoplasmticas e um citoesqueleto (Figura 1.7). A maior e mais proeminente organela das clulas eucariticas o ncleo, com um dimetro de aproximadamente 5 m. O ncleo contm a informao gentica da clula, que nos eucariotos organizada como uma molcula de DNA linear, em vez de circular. O ncleo o local da replicao do DNA e da sntese do RNA; a traduo do RNA em protenas ocorre em ribossomos no citoplasma. Alm do ncleo, as clulas eucariticas apresentam no citoplasma uma variedade de organelas circundadas por membranas. Essas organelas formam compartimentos nos quais se localizam as diferentes atividades metablicas. Em geral, as clulas eucariticas so muito maiores que as clulas procariticas, freqentemente tendo um volume celular de, no mnimo, mil vezes maior. A compartimentalizao causada pelas organelas citoplasmticas que permite o funcionamento eficiente das clulas eucariticas. Duas dessas organelas, as mitocndrias e os cloroplastos, exercem papel fundamental no metabolismo energtico. As mitocndrias, que so encontradas em quase todas as clulas eucariticas, so os locais do metabolismo oxidativo e so responsveis pela gerao da maior parte do ATP derivado da quebra de molculas orgnicas. Os cloroplastos so os locais da fotossntese e so encontrados somente nas clulas de plantas e algas verdes. Os lisossomos e os peroxissomos tambm fornecem compartimentos metablicos especializados para a digesto de macromolculas e vrias reaes oxidativas, respectivamente. Alm disso, a maioria das clulas vegetais contm grandes vacolos que executam uma variedade de funes, incluindo a digesto de macromolculas e a estocagem de produtos de excreo e nutrientes. Devido ao tamanho e complexidade das clulas eucariticas, o transporte de protenas para seus destinos corretos uma tarefa extremamente complexa. Duas organelas citoplasmticas, o retculo endoplasmtico e o complexo de Golgi, so dedicadas especificamente para a organizao e o transporte de protenas destinadas secreo, incorporao membrana plasmtica e incorporao aos lisossomos. O retculo endoplasmtico uma extensa rede de membranas intracelulares, estendendo-se a partir da membrana nuclear por todo o citoplasma. Ele funciona no somente no processamento e transporte de protenas, mas tambm na sntese de lipdeos. As protenas so transportadas em pequenas vesculas a partir do retculo endoplasmtico para o complexo de Golgi, onde so processadas e organizadas para o transporte ao destino final. Alm do papel no transporte de protenas, o complexo de Golgi serve como local da sntese de lipdeos e (em clulas vegetais) como local de sntese de alguns polissacardeos que formam a parede celular. As clulas eucariticas tm outro nvel de organizao interna: o citoesqueleto, uma rede de filamentos proticos que se estende por todo o citoplasma. O citoesqueleto fornece a estrutura da clula, determinando o formato celular e gerando a organizao do citoplasma. Alm disso, o citoesqueleto responsvel pelos movimentos da clula inteira (por exemplo, a contrao das clulas musculares), pelo transporte intracelular e pelo posicionamento das organelas e outras estruturas, incluindo o movimento dos cromossomos durante a diviso celular. Os eucariotos surgiram h pelo menos 2,7 bilhes de anos, seguindo em 1 a 1,5 bilho de anos a evoluo dos procariotos. Estudos das seqncias de DNA indicam que as arqueobactrias e eubactrias so to diferentes entre si quanto so dos eucariotos atuais. Portanto, um evento muito precoce na evoluo parece ter sido a diver-

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Clula animal Peroxissomo Centrolo Mitocndria

Retculo endoplasmtico rugoso

Ncleo

Retculo endoplasmtico liso

Nuclolo

Lisossomo Citoesqueleto

Membrana plasmtica

Complexo de Golgi

Ribossomos

Figura 1.7 Estruturas das clulas animais e vegetais Tanto as clulas animais como as vegetais so circundadas pela membrana plasmtica e contm um ncleo, um citoesqueleto e muitas organelas citoplasmticas. As clulas vegetais so tambm circundadas pela parede celular e contm cloroplastos e vacolos grandes.

gncia dos trs grupos de descendentes a partir de um ancestral comum, originando as atuais arqueobactrias, as eubactrias e os eucariotos. De forma interessante, muitos genes de arqueobactrias so mais parecidos com os de eucariotos que com os de eubactrias, indicando que as arqueobactrias e os eucariotos compartilham uma linha evolutiva em comum e so mais proximamente relacionados um ao outro do que qualquer um dos dois s eubactrias (Figura 1.8). Uma etapa crtica na evoluo das clulas eucariticas foi a aquisio das organelas subcelulares circundadas por membranas, permitindo o desenvolvimento das caractersticas complexas dessas clulas. Supe-se que as organelas tenham sido adquiridas como o resultado de uma associao de clulas procariticas com eucariotos ancestrais. A hiptese de que clulas eucariticas evoluram a partir de uma associao de simbiose com procariotos endossimbiose bem sustentada pelos estudos de mitocndrias e cloroplastos, os quais supe-se terem evoludo a partir de bactrias que viviam em clulas maiores. Ambos, mitocndrias e cloroplastos, so similares s bactrias em tamanho, e como bactrias, reproduzem-se por diviso binria. E o mais importante, ambos, mitocndrias e cloroplastos, contm seu prprio DNA, o qual codifica alguns dos seus componentes. Os DNAs de mitocndrias e cloroplastos so replicados cada vez que a organela se divide, e os genes que eles codificam so transcritos dentro da organela e traduzidos no ribossomo da organela. A mitocndria e o cloroplasto contm seus prprios sistemas genticos, que so diferentes do usado no genoma nuclear da clula. Alm disso, o ribossomo e o RNA ribossomal dessas organelas so mais proximamente relacionados com os de bactrias do que com os codificados pelo genoma nuclear dos eucariotos.

A CLULA /

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Clula vegetal Peroxissomo

Citoesqueleto

Mitocndria Vacolo Ribossomo

Cloroplastos Retculo endoplasmtico liso

Retculo endoplasmtico rugoso

Nuclolo Ncleo

Parede celular

Complexo de Golgi Membrana plasmtica

Outras Cianobactrias eubactrias

Plantas

Fungos Animais (leveduras) Protistas

Arqueobactrias

Cloroplastos

Mitocndrias

Figura 1.8 Evoluo das clulas As clulas atuais evoluram de um ancestral procarioto comum por trs linhas de descendncia, dando origem s arqueobactrias, s eubactrias e aos eucariotos. As mitocndrias e os cloroplastos originaram-se da associao por endossimbiose de bactrias aerbicas e cianobactrias com o ancestral dos eucariotos, respectivamente.

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A origem dessas organelas por endossimbiose amplamente aceita, e supe-se que a mitocndria tenha evoludo de bactrias aerbicas e o cloroplasto, de bactrias fotossintticas, como as cianobactrias. A aquisio de bactrias aerbicas poderia ter fornecido a uma clula anaerbica a capacidade de realizar reaes de metabolismo oxidativo. A aquisio de bactrias fotossintticas poderia ter fornecido a independncia nutricional proporcionada pela habilidade de efetuar a fotossntese. Dessa maneira, essas associaes por endossimbiose foram altamente vantajosas e foram positivamente selecionadas pela evoluo. Ao longo do tempo, a maioria dos genes originalmente presentes nas bactrias foi, aparentemente, incorporada no genoma nuclear da clula, e somente poucos componentes da mitocndria e do cloroplasto ainda so codificados pelos genomas das organelas. O Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares Muitos eucariotos so organismos unicelulares que, como as bactrias, consistem em somente uma nica clula capaz de auto-replicao. Os eucariotos mais simples so as leveduras. As leveduras so mais complexas que as bactrias, porm menores e mais simples que as clulas de animais e plantas. Por exemplo, a comumente estudada levedura Saccharomyces cerevisiae tem aproximadamente 6 m de dimetro e seu DNA contm 12 milhes de pares de bases (Figura 1.9). Entretanto, outros eucariotos unicelulares so clulas muito mais complexas, algumas contendo tanto DNA quanto as clulas humanas (Tabela 1.2). Eles incluem organismos especializados para realizar uma grande variedade de aes, incluindo a fotossntese, o movimento e a captura e ingesto, como alimento, de outros organismos. Por exemplo, a Amoeba proteus uma clula grande e complexa. Seu volume de mais de 100.000 vezes o de uma E. coli e seu comprimento excede 1 mm, quando a clula est totalmente estendida (Figura 1.10). As amebas so organismos com alta mobilidade que usam extenses citoplasmticas, chamadas de pseudpodos, para mover e para englobar outros organismos, incluindo bactrias e leveduras, como alimentos. Outros organismos eucariotos unicelulares (como algas verdes) contm cloroplastos e so capazes de realizar fotossntese. Os organismos multicelulares evoluram a partir de eucariotos unicelulares h, pelo menos, 1,7 bilho de anos. Alguns eucariotos unicelulares formam agregados multicelulares que parecem representar uma transio evolutiva entre clulas individuais e organismos multicelulares. Por exemplo, as clulas de muitas algas (como a alga verde Volvox) associam-se umas com as outras para formarem colnias multice-

TABELA 1.2 Contedo de DNA das Clulas Organismo Contedo haplide de DNA (milhes de pares de bases) Bactrias Mycoplasma E. coli Eucariotos unicelulares Saccharomyces cerevisiae (Levedura) Dictyostelium discoideum Euglena Plantas Arabidopsis thaliana Zea mays (milho) Animais Caenorhabditis elegans (nematide) Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) Galinha Zebrafish* Camundongo Humano 1.200 1.700 3.000 3.000 180 97 125 5.000 70 3.000 12 0,6 4,6

* N. de R.T. Zebrafish um peixe usado como modelo experimental e recebe o nome comum no Brasil de paulistinha. Ver pgina 19.

5 m

Figura 1.9 Micrografia eletrnica de varredura do Saccharomyces cerevisiae Cor artificial foi adicionada micrografia. (Andrew Syed/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

A CLULA /

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lulares (Figura 1.11), que se supe terem sido os precursores evolutivos das plantas atuais. O aumento da especializao celular direcionou a transio de agregados coloniais para verdadeiros organismos multicelulares. A contnua especializao celular e a diviso de tarefas entre as clulas do organismo levaram complexidade e diversidade observadas entre os diferentes tipos de clulas que compem as plantas e os animais atuais, incluindo os seres humanos. As plantas so compostas por uma menor variedade de tipos celulares que os animais, mas cada tipo diferente de clula vegetal especializado para realizar uma funo especfica necessria para o organismo como um todo (Figura 1.12). As clulas das plantas so organizadas em trs principais sistemas de tecidos: tecido de sustentao, tecido drmico e tecido vascular. O tecido de sustentao contm as clulas do parnquima, que realizam a maioria das reaes metablicas das plantas, incluindo a fotossntese. O tecido de sustentao tambm contm dois tipos de clulas especializadas (clula do colnquima e clula do esclernquima), que so caracterizadas pelas grossas paredes celulares e fornecem o suporte estrutural para a planta. O tecido drmico cobre a superfcie da planta e composto de clulas epidrmicas, formando uma camada de proteo e permitindo a absoro de nutrientes. Finalmente, diversos tipos de clulas alongadas formam o sistema vascular (o xilema e o floema), que responsvel pelo transporte de gua e nutrientes por toda a planta. As clulas encontradas nos animais so consideravelmente mais diversificadas que as das plantas. O corpo humano, por exemplo, composto por mais de 200 tipos diferentes de clulas que geralmente so consideradas os componentes de cinco tipos principais de tecidos: tecido epitelial, tecido conectivo, sangue, tecido nervoso
(A) (B)

0,2 mm

Figura 1.10 Micrografia tica de Amoeba proteus (M.I. Walker/Photo Researchers, Inc.)

Figura 1.11 Colnia de alga verde Clulas individuais de Volvox formam colnias, nas quais centenas ou milhares de clulas esto incorporadas em uma matriz gelatinosa. (Cabisco/Visuals Unlimited.)

(C)

(D)

50 mm

Figura 1.12 Micrografias ticas de clulas representativas de plantas (A) Clulas do parnquima, que so responsveis pela fotossntese e por outras reaes metablicas. (B) Clulas do colnquima, que so responsveis pela sustentao e apresentam paredes celulares espessas. (C) Clulas da epiderme na superfcie de uma folha. Poros pequenos (estmatos) so flanqueados por clulas especializadas chamadas de clulas-vigia. (D) Elementos dos vasos e traquedeos so clulas alongadas que so organizadas uma de ponta para a outra para formar os vasos do xilema. (A, Jack M. Bastsack/Visuals Unlimited; B, A. J. Karpoff/Visuals Unlimited; C, Alfred Owczarzak/ Biological Photo Service; D, Biophoto Associates/Science Source/Photo Researchers Inc.)

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e msculo (Figura 1.13). As clulas epiteliais formam camadas que cobrem a superfcie do corpo e recobrem os rgos internos. H muitos tipos diferentes de clulas epiteliais, cada um especializado para uma funo especfica, incluindo proteo (a pele), absoro (por exemplo, as clulas da mucosa do intestino delgado) e secreo (por exemplo, as clulas da glndula salivar). O tecido conectivo inclui ossos, cartilagens e tecido adiposo, cada um formado por diferentes tipos de clulas (respectivamente, osteoblastos, condrcitos e adipcitos). O tecido conectivo frouxo, que intercala

(A)i Boca

(A)ii Ducto biliar

(A)iii Intestino

(B)

Figura 1.13 Micrografias ticas de clulas animais representativas (A) Clulas do epitlio da boca (uma grossa camada multicelular), do ducto biliar e do intestino. (B) Fibroblastos so clulas do tecido conectivo, caracterizados por sua forma alongada. (C) Eritrcitos, granulcitos, linfcitos e moncitos no sangue humano. ([A]i e [A]ii, G. W. Willis/Biological Photo Service; [A]iii, Biophoto Associates/Photo Researchers, Inc.; B, Don W. Fawcett/Visuals Unlimited; C. G. W. Willis/Biological Photo Service.)

(C)

Eritrcito

Linfcito

Moncito

Granulcito

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as camadas epiteliais e preenche os espaos entre rgos e tecidos do corpo, formado por outro tipo de clula, o fibroblasto. O sangue contm vrios tipos diferentes de clulas, que funcionam no transporte do oxignio (clulas vermelhas ou eritrcitos), nas reaes inflamatrias (granulcitos, moncitos e macrfagos) e na resposta imunolgica (linfcitos). O tecido nervoso composto pelas clulas nervosas, ou neurnios, que so altamente especializadas para transmitir sinais atravs do corpo. Vrios tipos de clulas sensoriais, como as clulas dos olhos e dos ouvidos, so mais especializados para receberem sinais externos do ambiente. Finalmente, vrios diferentes tipos de clulas musculares so responsveis pela produo da fora e do movimento. Claramente, a evoluo dos animais envolveu o desenvolvimento de uma considervel diversidade e especializao no nvel celular. A compreenso dos mecanismos de controle do crescimento e de diferenciao em tal grupo complexo de clulas especializadas, originadas a partir de um nico ovo fertilizado, um dos principais desafios que se apresentam biologia celular e molecular contempornea.

Clulas como Modelos Experimentais

A evoluo das clulas atuais a partir de um ancestral comum tem importantes implicaes para a biologia celular e molecular como uma cincia experimental. J que as propriedades fundamentais de todas as clulas foram conservadas durante a evoluo, os princpios bsicos aprendidos com experimentos feitos com um tipo de clula so geralmente aplicveis para outras clulas. Por outro lado, em razo da diversidade das clulas atuais, muitos tipos de experimentos podem ser mais facilmente realizados em um tipo de clula do que em outro. Vrios tipos diferentes de clulas e organismos so comumente usados como modelos experimentais para estudar diversos aspectos da biologia celular e molecular. As caractersticas de algumas dessas clulas que as tornam de particular utilidade como modelos experimentais so discutidas nas sees seguintes. E. coli Em virtude da sua simplicidade relativa, clulas procariticas (bactrias) so modelos ideais para o estudo de diversos aspectos fundamentais da bioqumica e da biologia molecular. A espcie de bactria mais amplamente estudada a E. coli, que tem sido, h muito tempo, o organismo favorito para pesquisa dos mecanismos bsicos da gentica molecular. A maioria dos nossos conceitos atuais de biologia molecular incluindo nossa compreenso da replicao do DNA, do cdigo gentico, da expresso gnica e da sntese protica deriva dos estudos com essa modesta bactria. A E. coli tem sido especialmente til para os bilogos moleculares, tanto por sua relativa simplicidade, como pela facilidade com que pode ser reproduzida e estudada em laboratrio. O genoma da E. coli, por exemplo, consiste em aproximadamente 4,6 milhes de pares de bases e contm cerca de 4.000 genes. O genoma humano quase mil vezes maior (aproximadamente 3 bilhes de pares de bases) e pensa-se que contenha 30-40.000 genes (ver Tabela 1.2). O pequeno tamanho do genoma da E. coli (que foi completamente seqenciado em 1997) fornece bvia vantagem para a anlise gentica. Experimentos de gentica molecular so facilitados pela rpida multiplicao da E. coli em condies laboratoriais bem definidas. Em condies timas de cultura, a cada 20 minutos a E. coli divide-se. Alm disso, uma populao clonal de E. coli, na qual todas as clulas derivam da multiplicao de uma nica clula, pode ser facilmente isolada como uma colnia crescendo em meio semi-slido contendo gar (Figura 1.14). Uma vez que colnias de bactrias contendo 108 clulas podem ser cultivadas em apenas uma noite, a seleo de variantes genticas de uma cepa de E. coli por exemplo, mutantes que so resistentes a um antibitico como a penicilina fcil e rpida. A facilidade com que esses mutantes podem ser selecionados e analisados foi essencial para o sucesso dos experimentos que definiram os princpios bsicos da gentica molecular, discutidos no Captulo 3.

Figura 1.14 Colnias de bactrias Fotografia de colnias de E. coli crescendo na superfcie de um meio contendo gar. (A. M. Siegelman/Visuals Unlimited.)

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A mistura de nutrientes na qual a E. coli divide-se mais rapidamente inclui glicose, sais e vrios compostos orgnicos, como aminocidos, vitaminas e precursores de cidos nuclicos. Entretanto, a E. coli tambm pode crescer em um meio muito mais simples, contendo somente sais, uma fonte de nitrognio (como a amnia) e uma fonte de carbono e energia (como a glicose). Nesse meio, a bactria cresce um pouco mais lentamente (com o tempo de diviso de aproximadamente 40 minutos), pois ela deve sintetizar todos os seus aminocidos, nucleotdeos e outros compostos orgnicos. A habilidade da E. coli de realizar estas reaes de biossntese em um meio definido simples tornou-a extremamente til para a elucidao das vias bioqumicas envolvidas nestes processos. Assim, o rpido crescimento e as exigncias nutritivas simples da E. coli tm facilitado muito os experimentos fundamentais em biologia molecular e bioqumica. Leveduras Embora as bactrias sejam um inestimvel modelo para o estudo de muitas propriedades conservadas das clulas, elas, obviamente, no podem ser utilizadas para estudar aspectos da estrutura celular e funes que sejam exclusivas dos eucariotos. As leveduras, os eucariotos mais simples, apresentam diversas vantagens experimentais semelhantes s da E. coli. Conseqentemente, as leveduras tm sido um modelo essencial para estudos de muitos aspectos fundamentais da biologia celular de eucariotos. O genoma da levedura mais freqentemente estudada, Saccharomyces cerevisiae, consiste em 12 milhes de pares de bases de DNA e contm aproximadamente 6.000 genes. Apesar do genoma da levedura ser cerca de trs vezes maior do que o da E. coli, ele muito mais manejvel do que o genoma dos eucariotos mais complexos, como o dos humanos. Mesmo com sua simplicidade, a clula da levedura apresenta as caractersticas tpicas das clulas eucariticas (Figura 1.15): ela contm o ncleo isolado pela membrana nuclear, seu DNA genmico organizado em 16 cromossomos lineares e seu citoplasma contm um citoesqueleto e organelas subcelulares. As leveduras podem ser facilmente cultivadas em laboratrio e podem ser estudadas por muitas das tcnicas de gentica molecular que so utilizadas com a E. coli. Apesar das leveduras no se replicarem to rapidamente quanto as bactrias, elas dividem-se freqentemente, a cada 2 horas, e podem ser facilmente cultivadas em colnias a partir de clulas isoladas. Conseqentemente, as leveduras podem ser utilizadas para uma variedade de manipulaes genticas semelhantes quelas que podem ser feitas com bactrias. Essas caractersticas tm feito da clula de levedura a clula eucarionte mais abordvel pelo ponto de vista da biologia molecular. Leveduras mutantes tm sido importantes para o entendimento de muitos processos fundamentais em eucariotos, incluindo a replicao do DNA, a transcrio, o processamento do RNA, a organizao protica e a regulao da diviso celular, que sero discutidos nos captulos seguintes. A unidade da biologia celular e molecular tem ficado mais clara pelo fato de que os princpios gerais da estrutura e funo celular, que tm sido revelados pelos estudos das leveduras, aplicam-se a todas as clulas eucariticas.

Dictyostelium discoideum
O Dictyostelium discoideum um fungo aqutico que, como as leveduras, um eucarionte unicelular relativamente simples. O genoma do Dictyostelium aproximadamente dez vezes maior que o da E. coli mais complexo que o genoma das leveduras, porm consideravelmente mais simples que o genoma dos eucariotos superiores. Alm disso, o Dictyostelium pode ser facilmente cultivado em laboratrio e suscetvel a uma variedade de manipulaes genticas. Sob condies de alimentao farta, o Dictyostelium vive como uma ameba unicelular, alimentando-se de bactrias e leveduras. Ele uma clula com grande mobilidade, e essa propriedade tem feito do Dictyostelium um importante modelo

2m

Figura 1.15 Micrografia eletrnica de Saccharomyces cerevisiae (David Scharf/Peter Arnold, Inc.)

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para estudos dos mecanismos moleculares responsveis pelo movimento das clulas animais (Figura 1.16). Por exemplo, a introduo no Dictyostelium de mutaes especficas tem revelado o papel de vrios genes envolvidos na mobilidade celular. Uma caracterstica interessante adicional do Dictyostelium a habilidade de clulas isoladas agregarem-se em estruturas multicelulares. Se um suplemento adequado de alimento no fornecido, as clulas associam-se para formar uma estrutura vermiforme chamada de lesma, cada uma contendo at 100.000 clulas que funcionam como um indivduo. Por esse motivo o Dictyostelium parece estar no limite entre organismos unicelulares e multicelulares, e fornece um importante modelo para estudos de sinalizao celular e interao clula-clula.

Caenorhabditis elegans
Os eucariotos unicelulares Saccharomyces e Dictyostelium so importantes modelos para estudos de clulas eucariticas, mas a compreenso do desenvolvimento de organismos multicelulares requer a anlise experimental de plantas e animais, organismos que so muito mais complexos. O nematide Caenorhabditis elegans (Figura 1.17) possui vrias caractersticas importantes que o transformam em um dos modelos mais usados para estudos de desenvolvimento e diferenciao celular dos animais. Embora o genoma do C. elegans (aproximadamente 100 milhes de pares de bases) seja maior que o dos eucariotos unicelulares, ele mais simples e mais manipulvel que o genoma da maioria dos animais. A seqncia completa j foi determinada, revelando que o genoma do C. elegans contm aproximadamente 19.000 genes quase trs vezes o nmero de genes das leveduras, e a metade do nmero de genes dos humanos. Biologicamente, o C. elegans um organismo multicelular relativamente simples: os vermes adultos so compostos de somente 959 clulas somticas e 1.000 a 2.000 clulas germinativas. Alm disso, o C. elegans pode ser facilmente cultivado e submetido a manipulaes genticas em laboratrio. A simplicidade do C. elegans tem permitido que o curso do seu desenvolvimento seja observado em detalhes por observao microscpica. Essas anlises definiram a origem embrionria e a linhagem de todas as clulas de um verme adulto. Estudos genticos tambm tm identificado vrias das mutaes responsveis por anormalidades do desenvolvimento, permitindo o isolamento e a caracterizao de genes essenciais que controlam o desenvolvimento e a diferenciao do nematide. De grande importncia, genes similares tambm tm sido encontrados em animais complexos (incluindo humanos), fazendo do C. elegans um importante modelo para estudos do desenvolvimento animal.

10 m

Figura 1.16 Dictyostelium discoideum Estas fotografias mostram o movimento de duas amebas durante o tempo de 40 segundos. (Cortesia de David Knecht, University of Connecticut.)

Drosophila melanogaster
Como o C. elegans, a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster (Figura 1.18) tem sido um organismo-modelo essencial em biologia do desenvolvimento. O genoma da Drosophila de tamanho similar ao do C. elegans, embora o genoma da Drosophila contenha apenas

Ovrio

Intestino

Faringe

Ovos 1 mm

Vulva

Reto

nus

Figura 1.17 Caenorhabditis elegans (De J. E. Sulston e H. R. Horvitz, 1977. Dev. Biol. 56:110.)

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cerca de 14.000 genes. Alm disso, a Drosophila pode ser facilmente mantida e reproduzida em laboratrio, e o seu curto ciclo reprodutivo (aproximadamente 2 semanas) a transformou em um organismo extremamente til para experimentos genticos. Muitos conceitos fundamentais da gentica como a relao entre genes e cromossomos foram derivados de estudos com Drosophila no incio do sculo XX (ver Captulo 3). Extensas anlises genticas da Drosophila tm revelado muitos genes que controlam o desenvolvimento e a diferenciao, e os atuais mtodos de biologia molecular tm permitido que as funes desses genes sejam analisadas em detalhes. Conseqentemente, os estudos em Drosophila tm levado a surpreendentes avanos na compreenso dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento animal, particularmente com respeito formao do plano do corpo de organismos multicelulares complexos. Como com o C. elegans, existem genes e mecanismos similares em vertebrados, validando o uso da Drosophila como um importante modelo experimental na biologia do desenvolvimento contempornea.

Figura 1.18 Drosophila melanogaster (Darwin Dale/Photo Researchers, Inc.)

Arabidopsis thaliana
O estudo da biologia molecular e do desenvolvimento em plantas uma rea ativa e em expanso de considervel importncia econmica, bem como de interesse intelectual. Uma vez que os genomas de plantas apresentam uma complexidade comparvel com a dos genomas dos animais (ver Tabela 1.2), um modelo ideal para estudos com plantas deveria ser um organismo relativamente simples com algumas das caractersticas vantajosas do C. elegans e da Drosophila. A pequena planta com flor Arabidopsis thaliana (Figura 1.19) atende a esse critrio, sendo amplamente usada como um modelo para o estudo da biologia molecular das plantas. A Arabidopsis notvel pelo seu genoma de somente cerca de 120 milhes de pares de bases, que contm aproximadamente 15.000 genes diferentes uma complexidade semelhante do C. elegans e da Drosophila. Alm disso, a Arabidopsis relativamente fcil de ser cultivada em laboratrio, e mtodos para manipulaes genticas moleculares dessa planta j foram desenvolvidos. Esses estudos tm permitido a identificao dos genes envolvidos em vrios aspectos do desenvolvimento em plantas, como o desenvolvimento das flores. A anlise desses genes aponta para muitas similaridades, mas tambm diferenas notveis, entre os mecanismos que controlam o desenvolvimento das plantas e dos animais. Vertebrados Os animais mais complexos so os vertebrados, incluindo o homem e outros mamferos. O genoma humano tem aproximadamente 3 bilhes de pares de bases cerca de 30 vezes maior que o genoma do C. elegans, da Drosophila e da Arabidopsis e contm 30-40.000 genes. Alm disso, o corpo humano composto de mais de 200 diferentes tipos de clulas especializadas. Essa complexidade torna difcil estudar os vertebrados pela perspectiva da biologia celular e molecular, mas muito do interesse das cincias biolgicas origina-se do desejo da compreenso do organismo humano. Alm disso, o entendimento de muitas questes de importncia prtica imediata (por exemplo, na medicina) deve ser baseado diretamente em estudos sobre tipos celulares humanos (ou proximamente relacionados). Um importante meio de estudar clulas humanas e de outros mamferos cultivar clulas isoladas, de forma que possam ser manipuladas em condies laboratoriais controladas. O uso de cultura celular tem permitido o estudo de muitos aspectos da biologia celular de mamferos, incluindo experimentos que tm elucidado os mecanismos da replicao do DNA, da expresso gnica, da sntese e do processamento protico e da diviso celular. Alm disso, a habilidade de cultivar clulas em meios quimicamente definidos tem permitido o estudo dos mecanismos de sinalizao que controlam o crescimento e a diferenciao normal dentro do organismo inteiro. As propriedades especializadas de algumas clulas altamente diferenciadas tm feito delas modelos importantes para estudos de aspectos especficos da biologia celular. Clulas musculares, por exemplo, so altamente especializadas para suportar

Figura 1.19 Arabidopsis thaliana (Jeremy Burgess/Photo Researchers, Inc.)

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contrao, produzindo fora e movimento. Em virtude dessa especializao, as clulas musculares so um modelo essencial para o estudo de movimento celular no nvel molecular. Outro exemplo fornecido pelas clulas nervosas (neurnios), que so especializadas para conduzir sinais eletroqumicos a grandes distncias. Em humanos, os axnios das clulas nervosas podem ter mais de um metro de comprimento, e alguns invertebrados, como a lula, tm neurnios gigantes com axnios com mais de 1 mm de dimetro em largura. Em razo de suas estruturas e funes altamente especializadas, esses neurnios gigantes tm sido um modelo importante para estudos sobre o transporte de ons atravs da membrana plasmtica e sobre o papel do citoesqueleto no transporte das organelas citoplasmticas. O sapo Xenopus laevis um modelo importante para estudos do desenvolvimento inicial dos vertebrados. Os ovos do Xenopus so clulas extraordinariamente grandes, com o dimetro de aproximadamente 1 mm (Figura 1.20). J que os ovos se desenvolvem fora do corpo materno, todos os estgios do desenvolvimento a partir do ovo at o girino podem ser facilmente estudados no laboratrio. Alm disso, os ovos de Xenopus podem ser obtidos em grande nmero, facilitando as anlises bioqumicas. Por causa dessas vantagens tcnicas, o Xenopus tem sido amplamente utilizado em estudos da biologia do desenvolvimento e tem proporcionado descobertas importantes dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento, a diferenciao e a diviso celular em embries. O zebrafish (paulistinha) (Figura 1.21) possui numerosas vantagens para estudos genticos do desenvolvimento de vertebrados. Esse pequeno peixe facilmente mantido em laboratrio e reproduz-se rapidamente. Alm disso, o embrio desenvolve-se fora da me e transparente, fazendo com que os estgios iniciais do desenvolvimento possam ser observados facilmente. Mtodos poderosos tm sido desenvolvidos para facilitar o isolamento de mutaes que afetem o desenvolvimento do zebrafish, e vrios milhares dessas mutaes tm sido identificados. Por ser um vertebrado de fcil estudo, o zebrafish um promissor ponto de conexo para a anlise das diferenas entre os humanos e os sistemas invertebrados mais simples, como o C. elegans e a Drosophila. Dentre os mamferos, o camundongo o mais adequado para anlises genticas, que sero facilitadas pela concluso recente da seqncia genmica deste organismo. Apesar das dificuldades tcnicas em estudar a gentica do camundongo (comparada, por exemplo, com a gentica da levedura ou Drosophila) serem grandes, muitas mutaes que afetam o desenvolvimento do camundongo tm sido identifi-

1 mm

Figura 1.20 Ovos do sapo Xenopus laevis (Cortesia de Michael Danilchik e Kimberly Ray.)

(A)

Figura 1.21 Zebrafish (A) Um embrio com 24 horas. (B) Um peixe adulto. (A, cortesia de Charles Kimmel, University of Oregon; B, cortesia de S. Kondo.)

(B)

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cadas. Mais importante, avanos recentes na biologia molecular tm permitido a produo de camundongos transgnicos, nos quais genes mutantes especficos so introduzidos nas linhagens germinativas do camundongo, fazendo com que seus efeitos no desenvolvimento ou em outros aspectos da funo celular possam ser estudados no contexto do animal completo. A adequao do camundongo como modelo para o estudo do desenvolvimento humano indicada no apenas pelas similaridades dos genomas humanos e de camundongo, mas tambm pelo fato de que mutaes em genes homlogos resultam em defeitos semelhantes no desenvolvimento de ambas as espcies (Figura 1.22); um defeito de pigmentao fornece excelente exemplo.

Ferramentas da Biologia Celular

Como em todas as cincias experimentais, a pesquisa em biologia celular depende de tcnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e a funo celular. Avanos muito importantes na compreenso das clulas tm sucedido diretamente o desenvolvimento de novas tcnicas, que permitiram novos meios de investigao. O exame das metodologias experimentais disponveis para a biologia celular essencial para a compreenso tanto da situao atual como do direcionamento futuro dessa rea de avano rpido da cincia. Algumas das importantes tcnicas de uso comum da biologia celular so descritas nas sees seguintes. Outros mtodos experimentais, incluindo os mtodos bioqumicos e de biologia molecular, sero discutidos em captulos posteriores. Microscopia tica J que a maioria das clulas muito pequena para ser vista a olho nu, o estudo das clulas depende fortemente do uso de microscpios. Na realidade, a descoberta das clulas resultou do desenvolvimento do microscpio: Robert Hooke inventou o termo clula aps suas observaes de um pedao de cortia com um microscpio tico simples, em 1665 (Figura 1.23). Usando um microscpio que aumentava os objetos cerca de 300 vezes seu tamanho real, Antony van Leeuwenhoek, por volta de 1670, foi capaz de observar uma grande variedade de tipos celulares diferentes, incluindo espermatozides, glbulos vermelhos e bactrias. A proposta da teoria celular por Matthias Schleiden e Theodor Schwann, em 1838, pode ser vista como o nascimento da biologia celular contempornea. Estudos microscpicos de tecidos de plantas por Schleiden e de tecidos animais por Schwann

Figura 1.22 O camundongo como modelo para o desenvolvimento do homem Uma criana e um camundongo apresentam defeitos de pigmentao semelhantes como resultado de mutaes no gene necessrio para a migrao normal dos melancitos (as clulas responsveis pela pigmentao da pele) durante o desenvolvimento do embrio. (Cortesia de R. A. Fleischman, Markey Cancer Center, University of Kentucky.)

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levaram s mesmas concluses: todos os organismos so compostos por clulas. Pouco tempo aps, foi reconhecido que as clulas no so formadas de novo, mas originam-se somente por diviso de clulas preexistentes. Conseqentemente, em razo das observaes feitas com o microscpio tico, a clula foi reconhecida como a unidade fundamental de todos os organismos vivos. O microscpio tico permanece como um instrumento bsico dos bilogos celulares, com aperfeioamentos tcnicos permitindo a crescente visualizao de detalhes da estrutura celular. Os microscpios ticos atuais so capazes de ampliar objetos at mil vezes. J que a maioria das clulas tem entre 1 e 100 m de dimetro, elas podem ser observadas por microscopia tica, como tambm o podem algumas das organelas subcelulares maiores, como ncleo, cloroplastos e mitocndrias. Entretanto, o microscpio tico no suficientemente poderoso para revelar detalhes finos da estrutura celular, j que a resoluo a habilidade de um microscpio de distinguir objetos separados por distncias pequenas mais importante do que a ampliao. Imagens podem ser ampliadas tanto quanto desejado (por exemplo, por projeo em uma tela grande), mas a ampliao no aumenta o nvel dos detalhes que podem ser observados. O limite da resoluo do microscpio tico de aproximadamente 0,2 m; dois objetos separados por uma distncia menor que essa aparecem como uma nica imagem, em vez de serem distinguidos um do outro. Esse limite terico da microscopia tica determinado por dois fatores o comprimento de onda () da luz visvel e a convergncia tica das lentes microscpicas (abertura numrica, NA) de acordo com a seguinte equao: Resoluo = 0,61 NA

Figura 1.23 A estrutura celular da cortia Uma reproduo do desenho de Robert Hooke de uma fina lmina de cortia observada em um microscpio tico. As clulas que Hooke observou eram na verdade somente as paredes celulares remanescentes das clulas que j tinham morrido.

O comprimento de onda da luz visvel de 0,4 a 0,7 m, de modo que o valor de fixado em aproximadamente 0,5 m para o microscpio tico. A abertura numrica pode ser considerada como o tamanho do cone de luz que entra nas lentes do microscpio aps passar atravs da amostra (Figura 1.24). Isto dado pela equao: NA= sen onde o ndice de refrao do meio atravs do qual a luz passa entre a amostra e a lente. O valor de para o ar de 1,0, mas pode ser aumentado para um mximo de

Lentes da objetiva

Amostra

Lentes do condensador

Luz

Figura 1.24 Abertura numrica A luz focalizada na amostra pelas lentes do condensador e ento coletada pelas lentes da objetiva do microscpio. A abertura numrica determinada pelo ngulo do cone de luz que entra nas lentes da objetiva () e pelo ndice de refrao do meio (geralmente ar ou leo) entre as lentes e a amostra.

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aproximadamente 1,4 pelo uso de uma lente para leo de imerso, quando a amostra vista atravs de uma gota de leo. O ngulo corresponde metade do comprimento do cone de luz recebido pela lente. O valor mximo de 90o, sendo seno = 1, de modo que o maior valor possvel para a abertura numrica 1,4. Portanto, o limite terico para a resoluo do microscpio tico pode ser calculado como segue: Resoluo = 0,61 x 0,5 = 0,22 m 1,4 Microscpios capazes de atingir esse nvel de resoluo j podiam ser feitos no fim do sculo XIX; portanto, aprimoramentos nesse aspecto da microscopia tica no devem ser esperados. Vrios tipos diferentes de microscopia tica so rotineiramente usados para o estudo de vrios aspectos da estrutura celular. O mais simples a microscopia de campo claro, no qual a luz passa diretamente atravs da clula e a capacidade de distinguir diferentes partes da clula depende do contraste resultante da absoro da luz visvel pelos componentes celulares. Em muitos casos, clulas so coradas com corantes que reagem com protenas e cidos nuclicos com o objetivo de aumentar o contraste entre as diferentes partes da clula. Antes da colorao, as amostras em geral so tratadas com fixadores (como lcool, cido actico ou formaldedo) para estabilizar e preservar suas estruturas. A anlise de tecidos fixados e corados pela microscopia de campo claro o mtodo-padro para a anlise de amostras de tecidos em laboratrios de histologia (Figura 1.25). Entretanto, esses procedimentos de colorao matam as clulas e, portanto, no so adequados para muitos experimentos, nos quais a observao de clulas vivas desejvel. Sem colorao, a passagem direta da luz no fornece contraste suficiente para distinguir muitas partes da clula, limitando a utilizao da microscopia de campo claro. Entretanto, variaes do microscpio tico podem ser usadas para aumentar o contraste entre as ondas de luz que passam atravs de regies da clula de densidades diferentes. Dois dos mtodos mais comuns para visualizao de clulas vivas so a microscopia de contraste de fase e a microscopia de contraste de interferncia diferencial (Figura 1.26). Ambos os tipos de microscopia usam sistemas ticos que convertem variaes de densidade ou espessura

Figura 1.25 Micrografia de campo claro de tecido corado Seco de um tumor benigno de rim. (G. W. Willis/Biological Photo Service.)

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Figura 1.26 Observao microscpica de clulas vivas Micrografias de clulas humanas obtidas com microscopia de (A) campo claro, (B) contraste de fase e (C) contraste de interferncia diferencial. (Cortesia de Mort Abramowitz, Olympus, America, Inc.)
(A)

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entre partes diferentes da clula em diferenas no contraste que podem ser vistas na imagem final. Na microscopia de campo claro, estruturas transparentes (como o ncleo) tm pouco contraste porque absorvem pouca luz. Entretanto, a luz tem a velocidade reduzida pela passagem nessas estruturas de tal forma que sua fase alterada, comparada luz que passa atravs do citoplasma que circunda o ncleo. A microscopia de contraste de fase e a de contraste de interferncia diferencial convertem essas diferenas na fase para diferenas no contraste, desse modo produzindo melhores imagens de clulas vivas no-coradas. O poder do microscpio tico foi consideravelmente expandido pelo uso de cmaras digitais e computadores para anlise e processamento das imagens. Os sistemas eletrnicos de anlise e processamento de imagens podem melhorar substancialmente o contraste das imagens obtidas com o microscpio tico, permitindo a visualizao de pequenos objetos que de outro modo no seriam detectados. Por exemplo, a microscopia de contraste de interferncia diferencial intensificada por vdeo permite a visualizao do movimento das organelas atravs dos microtbulos, que so filamentos proticos do citoesqueleto com um dimetro de apenas 0,025 m (Figura 1.27). Entretanto, esta amplificao no ultrapassa o limite terico da resoluo do microscpio tico, de aproximadamente 0,2 m. Ento, embora o realce pelo vdeo permita a visualizao dos microtbulos, eles aparecem como imagens borradas de pelo menos 0,2 m de dimetro e um microtbulo individual no pode ser distinguido de um feixe de estruturas adjacentes. A microscopia tica tem sido usada no nvel de anlise molecular por mtodos de marcao de molculas especficas, e assim elas podem ser visualizadas no interior das clulas. Genes ou RNA transcritos especficos podem ser detectados por hibridizao com sondas de cidos nuclicos com seqncias complementares, e protenas podem ser detectadas pelo uso de anticorpos apropriados (ver Captulo 3). Tanto sondas de cidos nuclicos como anticorpos podem ser marcados com uma variedade de substncias que permitem sua visualizao no microscpio tico, tornando possvel determinar a localizao de molculas especficas dentro de clulas individuais. A microscopia de fluorescncia um mtodo muito sensvel e amplamente usado para o estudo da distribuio intracelular de molculas (Figura 1.28). Um corante fluorescente usado para marcar a molcula de interesse dentro de clulas fixadas ou vivas. O corante fluorescente uma molcula que absorve luz em um comprimento de onda e emite luz em um segundo comprimento de onda. Essa fluorescncia detectada pela iluminao da amostra com luz no comprimento de onda que excita o corante fluorescente, seguida do uso de filtros adequados para detectar o comprimento de onda especfico que o corante emite. A microscopia de fluorescncia pode ser usada para estudar diferentes molculas dentro das clulas. Uma aplicao freqente a marcao direta de anticorpos contra uma protena especfica com corante fluorescente, fazendo com que a distribuio intracelular da protena possa ser determinada. Um avano importante e recente na microscopia de fluorescncia foi o uso da protena fluorescente verde (GFP), do ingls Green Fluorescent Protein, de uma medusa para visualizar protenas dentro de clulas vivas. A GFP pode ser fusionada a
Figura 1.27 Microscopia de contraste de interferncia diferencial intensificada por vdeo O processamento eletrnico de imagem permite a visualizao de microtbulos individuais. (Cortesia de E. D. Salmon, University of North Carolina, Chapel Hill.)

(B)

(C)

50 m

2,5 m

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(A)
Ocular

(B)

Filtro barreira

Espelho dicrico

Luz fluorescente Filtro excitatrio Lentes da objetiva Amostra 10 m

Figura 1.28 Microscopia de fluorescncia (A) A luz passa atravs de um filtro excitatrio para selecionar o comprimento de onda da luz (por exemplo, azul) que excita o corante fluorescente. Um espelho dicrico reflete a luz excitada para baixo para atingir a amostra. A luz fluorescente emitida pela amostra (por exemplo, verde) passa atravs do espelho dicrico e por um segundo filtro (o filtro barreira) para selecionar o comprimento de onda da luz emitida pelo corante. (B) Microscopia fluorescente de uma clula de pulmo na qual o DNA corado em azul e os microtbulos no citoplasma so corados em verde. (Conly S. Rieder/Biological Photo Service.)

qualquer protena de interesse, pelo uso de tcnicas-padro de DNA recombinante, e ento a protena ligada GFP pode ser introduzida nas clulas e detectada por microscopia de fluorescncia, sem necessidade de fixar e corar a clula, como seria preciso para a deteco de protenas com anticorpos. Devido sua versatilidade, o uso de GFP se tornou extremamente difundido em biologia celular e tem sido empregado para acompanhar a localizao e os movimentos de uma ampla variedade de protenas dentro de clulas vivas (Figura 1.29). A microscopia confocal combina a microscopia de fluorescncia com a anlise eletrnica de imagens para obter imagens com contraste e detalhes aumentados. Um pequeno ponto de luz, usualmente emitido por um laser, focado na amostra, em uma profundidade especfica. A luz fluorescente emitida coletada por um detector com uma cmera de vdeo. Entretanto, antes da luz emitida alcanar o detector, ela deve passar atravs de uma abertura capilar (chamada de abertura confocal) precisamente colocada no ponto onde a luz emitida, a partir da profundidade escolhida na amostra, aproxima-se do foco (Figura 1.30). Conseqentemente, somente a luz emitida a partir do plano de foco capaz de atingir o detector. Uma varredura da amostra gera uma imagem bidimensional do

Figura 1.29 Microscopia de fluorescncia de uma protena marcada com GFP Uma protena mitocondrial fusionada GFP foi introduzida em clulas humanas em cultura e visualizada por meio da microscopia de fluorescncia. (Courtesy of BD Biosciences Clontech.)

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Figura 1.30 Microscopia confocal Um fino feixe de luz focado na amostra em uma profundidade especfica, e a luz fluorescente emitida coletada por um detector. Antes de atingir o detector, a luz fluorescente emitida pela amostra passa atravs de uma abertura confocal colocada no ponto onde a luz emitida a partir da profundidade escolhida da amostra entra em foco. Como resultado, somente a luz emitida no foco da profundidade escolhida da amostra detectada.

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Detector

Luz em foco alcana o detector Abertura confocal Luz fora de foco impedida de alcanar o detector Luz fluorescente emitida Em foco Fora de foco Amostra

plano de foco, uma imagem muito mais precisa que a obtida com a microscopia de fluorescncia padro (Figura 1.31). Alm do mais, uma srie de imagens obtidas de diferentes profundidades pode ser usada para a construo de uma imagem tridimensional da amostra. A microscopia de excitao multifton uma alternativa para a microscopia confocal que pode ser usada em clulas vivas. A amostra iluminada com um comprimento de onda de luz que, para excitar o corante fluorescente, necessita da absoro simultnea de dois ou mais ftons (Figura 1.32). A probabilidade de dois ou mais ftons simultaneamente excitarem o corante fluorescente s significativa no ponto da amostra acima do qual o feixe do laser focado, de modo que a fluorescncia s emitida a partir do plano de foco da luz emitida. Essa excitao altamente localizada fornece automaticamente uma resoluo tridimensional, sem a necessidade da passagem da luz emitida atravs de uma abertura capilar, como na microscopia confocal. Alm do mais, a excitao localizada minimiza os danos amostra, permitindo imagens tridimensionais de clulas vivas. Microscopia Eletrnica Em razo do limite da resoluo do microscpio tico, a anlise de detalhes da estrutura celular requer o uso de tcnicas microscpicas mais potentes por exemplo, a microscopia eletrnica, que foi desenvolvida na dcada de 1930 e foi usada pela primeira vez para anlise de amostras biolgicas por Albert Claude, Keith Porter e George Palade durante os anos de 1940 e 1950. O microscpio eletrnico pode

Figura 1.31 Micrografia confocal de clulas humanas Microtbulos e filamentos de actina so corados com corantes fluorescentes vermelho e verde, respectivamente. (K.G Murti/Visuals Unlimited.)

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Figura 1.32 Microscopia de excitao de dois ftons A absoro simultnea de dois ftons necessria para excitar o corante fluorescente. Isso somente ocorre no ponto da amostra no qual a luz focada, de modo que a luz fluorescente emitida apenas a partir de uma profundidade escolhida da amostra.
Amostra contendo fluorforos Fluorforo Pulso de laser

Fluorforo excitado

Excitao de dois ftons

Fton

5 m

Figura 1.33 Colorao positiva Micrografia eletrnica de transmisso de um polimorfonuclear corado positivamente. (Don W. Fawcett/Visuals Unlimited.)

alcanar uma resoluo muito maior que a obtida pelo microscpio tico porque o comprimento de ondas dos eltrons menor do que o da luz. O comprimento de onda dos eltrons em um microscpio eletrnico pode ser to curto quanto 0,004 nm cerca de 100.000 vezes menor que o comprimento de onda da luz visvel. Teoricamente, esse comprimento de onda poderia permitir uma resoluo de 0,002 nm, mas tal resoluo no pode ser obtida na prtica, porque a resoluo determinada no somente pelo comprimento de onda, mas tambm pela abertura numrica das lentes microscpicas. A abertura numrica um fator limitante para a microscopia eletrnica porque as propriedades inerentes das lentes eletromagnticas limitam seu ngulo de abertura em cerca de 0,5 grau, correspondente a aberturas numricas de cerca de 0,01. Ento, sob condies timas, a capacidade de resoluo do microscpio eletrnico de aproximadamente 0,2 nm. Alm do mais, a resoluo que pode ser obtida com amostras biolgicas tambm limitada pela perda inerente de contraste da amostra. Conseqentemente, para amostras biolgicas, o limite prtico da resoluo do microscpio eletrnico de 1 a 2 nm. Embora essa resoluo seja muito menor que a predita simplesmente pelo comprimento de onda dos eltrons, ela representa um aumento de mais cem vezes na capacidade de resoluo do microscpio tico. Dois tipos de microscopia eletrnica transmisso e varredura so amplamente utilizados para estudar as clulas. Em princpio, a microscopia eletrnica de transmisso similar observao de clulas coradas com o microscpio de campo claro. As amostras so fixadas e coradas com sais de metais pesados, que fornecem contraste atravs da disperso de eltrons. Um feixe de eltrons passado atravs da amostra e focado para formar uma imagem em uma tela fluorescente. Eltrons que encontram um on de metal pesado quando passam atravs da amostra so defletidos e no contribuem para a imagem final, de maneira que reas coradas da amostra aparecem escuras. Amostras para serem examinadas por microscopia eletrnica de transmisso podem ser preparadas por colorao negativa ou positiva. Na colorao positiva, os tecidos da amostra so cortados em seces finas e corados com sais de metais pesados (como tetraxido de smio, acetato de urnio e citrato de chumbo) que reagem com lipdeos, protenas e cidos nuclicos. Esses ons de metais pesados ligam-se a uma variedade de estruturas celulares, que conseqentemente aparecem escuras na imagem final (Figura 1.33). Um procedimento alternativo da colorao positiva pode ser usado tambm para identificar macromolculas especficas dentro da clula. Por exemplo, anticorpos marcados com metais pesados eletrodensos (como partculas de ouro) so freqentemente usados para determinar a localizao subcelular de protenas especficas com o microscpio eletrnico. Esse mtodo similar ao uso de anticorpos marcados com corantes fluorescentes na microscopia de fluorescncia. A colorao negativa til para a visualizao de estruturas biolgicas intactas, como uma bactria, organelas subcelulares isoladas e macromolculas (Figura 1.34). Nesse mtodo, a amostra biolgica depositada sobre um filme de suporte, e um

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Figura 1.34 Colorao negativa Micrografia eletrnica de transmisso de filamentos de actina corados negativamente. (Cortesia de Roger Craig, University of Massachusetts Medical Center.)

corante de metal pesado seco ao redor da sua superfcie. A amostra no-corada coberta por um filme de corante eletrodenso, produzindo uma imagem na qual a amostra aparece clara contra um fundo escuro corado. O sombreamento metlico outra tcnica usada para visualizar a superfcie de estruturas subcelulares isoladas ou macromolculas com o microscpio eletrnico de transmisso (Figura 1.35). A amostra coberta com uma fina camada de um metal vaporizado, como a platina. O metal borrifado sobre a amostra em um ngulo tal que as superfcies da amostra em frente da fonte das molculas de metal vaporizado so mais cobertas do que as outras. Esse revestimento diferencial cria um efeito de sombra, dando amostra uma aparncia tridimensional nas micrografias eletrnicas. A preparao de amostras por criofratura, em combinao com o sombreamento metlico, tem sido particularmente importante nos estudos da estrutura de membranas. Amostras so congeladas em nitrognio lquido (a -196C) e ento quebradas com uma lmina no-cortante. Freqentemente, esse processo divide a bicamada de lipdeos, revelando a face interior da membrana celular (Figura 1.36). A amostra ento recoberta com platina, e o material biolgico dissolvido com cido, produzindo uma rplica metlica da superfcie da amostra. O exame dessas rplicas no microscpio eletrnico revela muitas alteraes na superfcie, correspondendo s protenas que atravessam a bicamada de lipdeos. Uma variao da criofratura chamada de esboo por congelamento, que permite, alm das faces internas, a visualizao das superfcies externas das membranas celulares. O segundo tipo de microscopia eletrnica, a microscopia eletrnica de varredura, usado para dar uma imagem tridimensional das clulas (Figura 1.37). Na microscopia eletrnica de varredura, o feixe de eltrons no passa atravs da amostra. Em vez disso, a

Figura 1.35 Sombreamento metlico Micrografia eletrnica de filamentos de actina/miosina do citoesqueleto preparados por sombreamento metlico. (Don W. Fawcett, J. Heuser/Photo Researchers, Inc.)

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(A) (B)

Protenas

Fosfolipdeos

Figura 1.36 Criofratura (A) A criofratura divide a bicamada de lipdeos, deixando as protenas associadas a uma das duas metades da membrana. (B) Micrografia de membrana plasmtica criofragmentada de duas clulas adjacentes. Protenas que atravessam a bicamada de lipdeos aparecem como partculas dentro das membranas (seta). (Don W. Fawcett/Photo Researchers, Inc.)

superfcie da clula coberta com um metal pesado, e um feixe de eltrons usado para varrer a superfcie da amostra. Eltrons que so dispersos ou emitidos a partir da superfcie da amostra so detectados para gerarem uma imagem tridimensional conforme o feixe de eltrons move-se atravs da clula. Uma vez que a resoluo da microscopia eletrnica de varredura de somente 10 nm, seu uso geralmente restrito ao estudo de clulas inteiras em vez de organelas subcelulares ou macromolculas. Fracionamento Subcelular Embora o microscpio eletrnico permita visualizao detalhada da estrutura celular, a microscopia sozinha no suficiente para definir as funes dos vrios componentes de clulas eucariticas. Para responder a muitas das questes concernentes s funes das organelas subcelulares, tem sido necessrio isolar as organelas de clulas eucariticas de modo que possam ser utilizadas para estudos bioqumicos. Isso geralmente realizado por centrifugao diferencial um mtodo desenvolvido primariamente por Albert Claude, Christian de Duve e seus colegas nas dcadas de 1940 e 1950 para separar componentes da clula com base em seus tamanhos e densidades. A primeira etapa no fracionamento subcelular a ruptura da membrana plasmtica sob condies em que no ocorra a destruio dos componentes internos da clula. Diversos mtodos so usados, incluindo sonicao (exposio a sons de alta freqncia), triturao com homogeneizadores mecnicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade (liquidificadores). Todos esses procedimentos quebram a membrana plasmtica e o retculo endoplasmtico em pequenos fragmentos, enquanto deixam intactos outros componentes da clula (como ncleo, lisossomos, peroxissomos, mitocndrias e cloroplastos). A suspenso de clulas rompidas (chamada de lisado ou homogenato) ento fracionada em seus componentes por uma srie de centrifugaes em uma ultracentrfuga, que roda amostras em velocidades muito grandes (acima de 100.000 rpm) para produzir foras at 500.000 vezes maiores que a gravidade. Essa fora leva os componentes celulares a moverem-se em direo ao fundo do tubo da centrfuga e formarem um sedimento (um processo chamado de sedimentao) em uma velocidade que depende do seu tamanho e densidade, com as estruturas maiores e mais pesadas sedimentando-se mais rapidamente (Figura 1.38). Geralmente, o homoge-

5 m

Figura 1.37 Microscopia eletrnica de varredura Micrografia eletrnica de varredura de um macrfago. (David Phillips/Visuals Unlimited.)

A CLULA /

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Figura 1.38 Fracionamento subcelular As clulas so lisadas e os componentes subcelulares so separados por uma srie de centrifugaes com velocidades crescentes. Aps cada centrifugao, as organelas que se sedimentaram no fundo do tubo so recolhidas. O sobrenadante novamente centrifugado em uma velocidade maior para sedimentar as organelas seguintes em tamanho.

Centrifugar a 800 a gravidade (10 min)

Suspenso de clulas rompidas contendo componentes subcelulares, como lisossomos, peroxissomos e fragmentos da membrana

Centrifugar sobrenadante a 15.000 a gravidade (10 min)

Ncleos sedimentados Centrifugar sobrenadante a 100.000 a gravidade (60 min) Mitocndrias, lisossomos e peroxissomos sedimentados

Centrifugar sobrenadante a 200.000 a gravidade (3 horas) Fragmentos da membrana plasmtica e retculo endoplasmtico sedimentados

Citosol

Ribossomos sedimentados

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nato celular primeiro centrifugado a uma baixa velocidade, na qual sedimentam apenas as clulas no-lisadas e a maior estrutura subcelular o ncleo. Ento, uma frao enriquecida de ncleos pode ser recuperada do sedimento da centrifugao a uma baixa velocidade enquanto os outros componentes celulares permanecem no sobrenadante (a soluo remanescente). O sobrenadante ento centrifugado a uma maior velocidade para sedimentar as mitocndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos. A recentrifugao do sobrenadante em velocidade ainda mais alta sedimenta fragmentos da membrana citoplasmtica e o retculo endoplasmtico. Uma quarta centrifugao, com velocidade ainda mais alta, sedimenta os ribossomos, deixando somente a poro solvel do citoplasma (o citosol) no sobrenadante. As fraes obtidas pela centrifugao diferencial correspondem a preparaes enriquecidas, mas ainda no-puras, de organelas. Um grau maior de purificao pode ser obtido por centrifugao em gradiente de densidade, na qual as organelas so separadas por sedimentao atravs de um gradiente de uma substncia densa, como a sacarose. Na centrifugao por velocidade, o material de partida colocado no topo do gradiente de sacarose (Figura 1.39). Partculas de diferentes tamanhos sedimentam atravs do gradiente em taxas diferentes, movendo-se como bandas definidas. Aps a centrifugao, a coleta das fraes individuais do gradiente permite uma
A amostra colocada no topo de um gradiente de sacarose. Partculas de sedimentao lenta Centrifugar Gradiente de sacarose Partculas de diferentes tamanhos sedimentam como bandas definidas.

Partculas de sedimentao rpida

Coletar as fraes do gradiente.

Figura 1.39 Centrifugao de velocidade em um gradiente de densidade A amostra colocada no topo de um gradiente de sacarose e as partculas de tamanhos diferentes sedimentam atravs do gradiente como bandas definidas. As partculas separadas so coletadas em fraes individuais do gradiente, que podem ser obtidas simplesmente furando o fundo do tubo de centrifugao e coletando-se as gotas.

Partculas de sedimentao rpida

Partculas de sedimentao lenta

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resoluo suficiente para separar organelas de tamanhos semelhantes, como mitocndrias, lisossomos e peroxissomos. A centrifugao de equilbrio em gradientes de densidade pode ser usada para separar componentes subcelulares com base nas suas densidades de flutuao, independentemente de seu tamanho ou forma. Neste processo, a amostra centrifugada em um gradiente contendo alta concentrao de sacarose ou cloreto de csio. Em vez de serem separadas com base na velocidade de sedimentao, as partculas da amostra so centrifugadas at atingirem uma posio de equilbrio, na qual sua densidade igual da soluo de sacarose ou cloreto de csio. Essas centrifugaes de equilbrio so teis na separao de diferentes tipos de membranas e so suficientemente sensveis para separar macromolculas que so marcadas com diferentes istopos. Um exemplo clssico, discutido no Captulo 3, a anlise da replicao do DNA atravs da separao de molculas de DNA contendo istopos pesados e leves de nitrognio (15N e 14N) por centrifugao de equilbrio em gradiente de cloreto de csio. Crescimento de Clulas Animais em Cultura A habilidade de estudar clulas depende muito de quo facilmente elas podem ser cultivadas e manipuladas em laboratrio. Apesar do processo ser tecnicamente mais difcil do que cultivar bactrias ou leveduras, uma grande variedade de clulas de animais e plantas pode ser cultivada e manipulada em cultura. Esses sistemas de cultivo de clulas in vitro tm permitido que os cientistas estudem o crescimento e a diferenciao celular, bem como efetuem manipulaes genticas necessrias para a compreenso da estrutura e funo dos genes. As culturas de clulas animais so iniciadas pelo isolamento de clulas a partir de pedaos de tecidos e, a seguir, as clulas so adicionadas em placas de cultivo contendo meio nutritivo. A maioria dos tipos de clulas animais, como fibroblastos e clulas epiteliais, adere-se e cresce na superfcie plstica das placas usadas para cultivo de clulas (Figura 1.40). Embries e tumores so freqentemente usados como material de partida, j que eles contm clulas de crescimento rpido. Particularmente, fibroblastos de embries crescem muito bem em cultura e como conseqncia so um dos tipos mais amplamente estudados de clulas animais. Entretanto, sob condies apropriadas, muitos tipos de clulas especializadas tambm podem crescer em cultura, permitindo que suas propriedades diferenciadas possam ser estudadas em um ambiente experimental controlado. As clulas-tronco embrionrias so um exemplo particularmente interessante. Essas clulas so estabelecidas em cultura a partir de embries precoces e mantm sua capacidade de diferenciar-se em todos os tipos de clulas presentes em organismos adultos. Conseqentemente, as clulastronco embrionrias desempenham um papel importante no estudo das funes de muitos genes no desenvolvimento do camundongo, assim como oferecem a possibilidade de contribuir para o tratamento de doenas humanas, fornecendo uma fonte de tecidos para transplantoterapias. Os meios de cultura necessrios para a propagao de clulas animais so muito mais complexos que o meio mnimo suficiente para sustentar o crescimento de bactrias e leveduras. Os primeiros estudos de cultura celular utilizavam meios compostos de componentes indefinidos, como plasma, soro e extratos de embrio. Um importante avano foi feito em 1955, quando Harry Eagle descreveu o primeiro meio definido que sustentava o crescimento de clulas animais. Alm de sais e glicose, os meios usados para cultivo de clulas animais contm vrios aminocidos e vitaminas, que as clulas no podem sintetizar. O meio de crescimento para a maioria das clulas animais em cultura tambm inclui soro, que serve como fonte de fatores de crescimento necessrios para estimular a diviso celular. Vrios fatores de crescimento tm sido identificados. Eles servem como reguladores essenciais para o crescimento e a diferenciao de clulas em organismos multicelulares, fornecendo sinais pelos quais clulas diferentes comunicam-se entre si. Por exemplo, uma importante funo dos fibroblastos da pele no animal intacto a proliferao quando for necessrio

10 m

Figura 1.40 Clulas animais em cultura Micrografia eletrnica de varredura de fibroblastos humanos aderidos superfcie de uma placa de cultura. (David M. Phillips/ Visuals Unlimited.)

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EXPERIMENTO-CHAVE

Cultura de Clulas Animais

Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue Culture
Harry Eagle National Institutes of Health, Bethesda, MD
Science, Volume 122, 1955, pages 501-504

O Contexto
As primeiras culturas de clulas envolveram o crescimento de clulas a partir de fragmentos de tecidos que foram apoiados em cogulos de plasma um sistema de cultura que estava muito distante do necessrio para anlises experimentais. No final da dcada de 1940, um grande avano foi o estabelecimento de linhagens celulares que cresciam a partir de clulas isoladas aderidas superfcie de placas de cultura. Mas essas clulas eram ainda cultivadas em meios indefinidos que consistiam em uma combinao variada de soro e extratos embrionrios. Por exemplo, uma linhagem de clula de cncer humano amplamente usada (chamada de clulas HeLa) foi estabelecida inicialmente em 1952 pelo crescimento em um meio contendo plasma de galinha, extrato de embrio bovino e soro de cordo umbilical humano. O uso desse meio de cultura complexo e indefinido torna impossvel a anlise das necessidades especficas para o crescimento de clulas animais. Harry Eagle foi o primeiro a resolver esse problema, mediante a realizao de uma anlise sistemtica dos nutrientes necessrios para sustentar o crescimento de clulas animais em cultura.

componentes desse meio, Eagle foi capaz de determinar os nutrientes especficos necessrios para o crescimento celular. Alm dos sais e da glicose, esses nutrientes incluem 13 aminocidos e vrias vitaminas. Tambm foi necessria uma pequena quantidade de protenas de soro. O meio bsico desenvolvido por Eagle est descrito na tabela anexa, uma cpia do seu artigo de 1955*.

Harry Eagle

O Impacto
O meio desenvolvido por Eagle ainda o meio bsico usado para cultura de clulas animais. Seu uso tem permitido aos cientistas o cultivo de uma

ampla variedade de clulas sob condies experimentais definidas, que tem sido essencial para estudos do crescimento e da diferenciao de clulas animais, incluindo a identificao dos fatores de crescimento presentes no soro atualmente sabe-se que incluem polipeptdeos que controlam o comportamento das clulas individuais no animal intacto.

Table 4. Basal media for cultivation of the HeLa cell and mouse fibroblast (10 ) L-Amino acids* (mM ) Arginine Cystine Glutamine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine 0.1 0.05 2.0 0.05 0.2 0.2 0.2 0.05 0.1 0.2 0.02 0.1 0.2 (0.02) (1.0)|| (00.2) (0.1) (0.1) (0.05) (0.1) (0.01) (0.1) Vitamins (mM ) Biotin 10-3 Choline 10-3 Folic acid 10-3 Nicotinamide 10-3 Pantothemic acid 10-3 Pyridoxal 10-3 Thiamine 10-3 Riboflavin 10-4 ____________________ Salts (mM ) ____________________ NaCl 100 KCl 5 NaH2PO4 . H2O 1 NaHCO3 20 1 CaCl2 MgCl2 0.5 Miscellaneous Glucose 5mM Penicillin 0.005%# Streptomycin 0.005%# Phenol red 0.0005%# ________________________ For studies of cell nutrition Dialyzed horse serum, 1% Dialyzed human serum, 5% ________________________ For stock cultures Whole horse serum, 5% Whole human serum, 10%

Os Experimentos
Eagle estudou o crescimento de duas linhagens de clulas estabelecidas: clulas HeLa e uma linhagem de fibroblasto de camundongo chamada de clulas L. Ele foi capaz de cultivar essas clulas em um meio contendo uma mistura de sais, carboidratos, aminocidos e vitaminas, suplementado com protenas de soro. Variando sistematicamente os

* Conveniently stored in the refrigerator as a single stock solution containing 20 times the indicated concentration of each amino acid. For mouse fibroblast. Conveniently stored as a single stock solution containing 100 or 1000 times the indicated concentration of each vitamin; kept frozen. Conveniently stored in the refrigerator in two stock solutions, one containing NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, and glucose at 10 times the indicated concentration of each, and the second containing CaCl2 and MgCl2 at 20 times the indicated concentration. || Conveniently stored as a 100mM stock solution; frozen when not in use. # Conveniently stored as a single stock solution containing 100 times the indicated concentrations of penicillin, streptomycin, and phenol red. *N. de T. Esta tabela foi mantida em ingls em funo de seu valor histrico.

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reparar danos resultantes de um corte ou ferimento. A diviso induzida por um fator de crescimento liberado por plaquetas durante a coagulao sangnea, estimulando, desse modo, a proliferao de fibroblastos na regio prxima ao tecido lesado. A identificao de fatores de crescimento especficos tem tornado possvel a cultura de uma variedade de clulas em meio sem soro (meio no qual o soro substitudo por fatores de crescimento especficos necessrios para a proliferao das clulas em questo). As primeiras culturas celulares estabelecidas a partir de um tecido so chamadas de culturas primrias (Figura 1.41). As clulas em uma cultura primria geralmente crescem at cobrirem a superfcie da placa de cultura. Ento, elas devem ser removidas da placa e colocadas em uma nova placa com menor concentrao de clulas para formar uma cultura secundria. Este processo pode ser repetido muitas vezes, mas a maioria das clulas normais no pode ser crescida em cultura indefinidamente. Por exemplo, fibroblastos humanos normais geralmente podem ser cultivados por 50 a 100 duplicaes da populao, aps o que eles param de crescer e morrem. Em contraste, clulas-tronco embrionrias e clulas derivadas de tumores com freqncia proliferam indefinidaTecido mente em cultura e so chamadas de linhagens de clulas imortalizadas ou permanentes. Alm disso, uma variedade de linhagens de clulas imortalizadas de roedores tem sido isolada a partir de culturas de fibroblastos normais. Em vez de morrerem, como a maioria das suas companheiras, algumas poucas clulas dessas culturas Um pedao de tecido continuam a proliferar indefinidamente, formando lidissociado em uma suspenso nhagens celulares como as derivadas de tumores. Essas de clulas individuais. linhagens de clulas permanentes tm sido muito teis para vrios tipos de experimentos porque fornecem uma fonte contnua e uniforme de clulas que podem ser manipuladas, clonadas e indefinidamente propagadas em laboratrio. Mesmo sob condies timas, o tempo de diviSuspenso de so das clulas animais com maior capacidade de cresclulas cimento ao redor de 20 horas dez vezes maior que Meio lquido o tempo de diviso das leveduras. Conseqentemente, experimentos com clulas animais cultivadas so mais difceis e mais demorados que os com bactrias e leveduras. Por exemplo, o crescimento de uma colnia visvel de clulas animais a partir de uma nica As clulas da cultura primria aderem-se clula demora uma semana ou mais, ao passo que placa e crescem at cobrirem a superfcie da placa de cultura. colnias de E. coli ou leveduras demoram uma noite para crescerem a partir de uma nica clula. Contudo, manipulaes genticas de clulas de animais em cultura tm sido indispensveis para a compreenso da estrutura e funo celular.

As clulas so colocadas em uma placa de cultura com meio nutritivo.

Cultura primria

Cultura de Clulas Vegetais As clulas podem ser ento removidas da placa de cultura e replaqueadas em Clulas vegetais tambm podem ser cultivadas em meios uma concentrao menor para formar contendo molculas reguladoras de crescimento adequauma cultura secundria. das. Em contraste com os fatores de crescimento polipeptdicos que regulam a proliferao da maioria das clulas animais, os reguladores de crescimento das clulas vegetais so molculas Cultura secundria pequenas que podem passar atravs da parede da clula vegetal. Quando providos de misturas adequadas dessas molculas reguladoras do crescimento, muitos tipos de clulas vegetais proliferam em cultura, produzindo uma massa de clulas indiferenciadas, chamada de calo (Figura 1.42). Figura 1.41 Cultura de clulas animais

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notvel que muitas clulas vegetais sejam capazes de formar qualquer um dos diferentes tipos de clulas e tecidos, essencialmente necessrios para regenerar uma planta inteira. Conseqentemente, sob apropriadas manipulaes de nutrientes e de molculas reguladoras de crescimento, clulas vegetais indiferenciadas em cultura podem ser induzidas a formar uma variedade de tecidos da planta, includas razes, troncos e folhas. Em muitos casos, at uma planta inteira pode ser regenerada a partir de uma nica clula em cultura. Alm do interesse terico, a capacidade de produzir uma nova planta a partir de uma nica clula que tenha sido manipulada em cultura torna fcil a introduo de alteraes genticas em plantas, fornecendo importantes possibilidades para a engenharia gentica na agricultura.
Figura 1.42 Cultura de clulas vegetais Uma massa indiferenciada de clulas vegetais (um calo) crescendo em um meio slido. (John N. A. Lott/Biological Photo Service.)

Vrus Vrus so parasitas intracelulares que no podem replicar por si prprios. Eles reproduzem-se pela infeco de uma clula hospedeira e pela usurpao da maquinaria celular para produzir mais partculas virais. Nas formas mais simples, os vrus so compostos somente do cido nuclico genmico (ou DNA ou RNA) circundado por uma capa protica (Figura 1.43). Os vrus so importantes na biologia celular e molecular porque fornecem sistemas simples que podem ser usados para investigar as funes das clulas. Pelo fato de a replicao viral depender do metabolismo da clula infectada, estudos dos vrus tm revelado muitos aspectos fundamentais da biologia celular. Estudos de vrus que infectam bactrias contriburam substancialmente para nossa compreenso acerca dos mecanismos bsicos da gentica molecular, e experimentos com vrus de vegetais (vrus do mosaico do tabaco) foram os primeiros a demonstrarem o potencial gentico do RNA. Vrus de animais tm fornecido sondas especialmente teis para a investigao de vrias atividades das clulas eucariticas. O crescimento rpido e o genoma de pequeno tamanho tornam as bactrias excelentes alvos para experimentos na biologia molecular, e os vrus bacterianos (bacterifagos) simplificam ainda mais o estudo da gentica bacteriana. Um dos mais importantes bacterifagos o T4, que infecta e replica em E. coli. A infeco com uma nica partcula de T4 leva formao de aproximadamente 200 partculas virais filhas em um perodo de 20 a 30 minutos. A clula inicialmente infectada rompe (lise), liberando as partculas virais no meio, onde elas podem infectar novas clulas.

(A)

(B)

Figura 1.43 Estrutura de um vrus de animal (A) A partcula do papilomavrus contm uma pequena molcula de DNA circular recoberta por uma capa protica (o capsdeo). (B) Micrografia eletrnica de partculas de papilomavrus humano. Foi adicionada colorao artificial. (B, Linda Stannard/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

50 nm DNA Protenas do capsdeo

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MEDICINA MOLECULAR

Vrus e Cncer
A Doena
O cncer um grupo de doenas caracterizado pela proliferao descontrolada de clulas. O crescimento de clulas animais normais cuidadosamente regulado para atingir as necessidades de um organismo completo. Em contraste, as clulas cancerosas crescem de um modo no-regulado, acabando por invadir e interferir com a funo de tecidos e rgos normais. O cncer a segunda das causas mais comuns de morte (aps as doenas cardacas) nos Estados Unidos. Aproximadamente um em cada trs norte-americanos desenvolver cncer em algum momento de sua vida e, apesar dos grandes avanos no tratamento, aproximadamente um em cada quatro norte-americanos morrer dessa doena. O entendimento das causas do cncer e o desenvolvimento de mtodos mais efetivos para o seu tratamento representam um dos principais objetivos da pesquisa mdica. de um gene causador de cncer (oncogene) carregado pelo vrus, e descoberta de genes relacionados em clulas normais de todas as espcies de vertebrados, inclusive humanos. Agora, sabe-se que alguns cnceres humanos so causados por vrus; outros resultam de mutaes em genes celulares normais semelhantes ao primeiro oncogene identificado no RSV. Outros cnceres humanos so causados por mutaes em genes de clulas normais, a maioria delas ocorrendo durante a vida do indivduo, em vez de serem herdadas. Estudos em vrus causadores de cncer tm levado identificao de muitos dos genes responsveis por cnceres no-induzidos por vrus e compreenso dos mecanismos moleculares responsveis pelo desenvolvimento de cncer. Os principais esforos atuais so direcionados para o uso de tais informaes sobre a biologia celular e molecular dos cnceres no desenvolvimento de novos mtodos para o seu tratamento. Realmente, a primeira droga resultante de engenharia gentica eficaz no tratamento de um cncer humano (a droga STI-571, discutida no captulo 15) foi desenvolvida contra um gene muito semelhante ao oncogene do RSV.

Preveno e Tratamento
Os cnceres humanos que so causados por vrus incluem o cervical e outros cnceres anogenitais (papilomavrus), cncer heptico (vrus das hepatites B e C) e alguns tipos de linfomas (vrus de Epstein-Barr e vrus linfotrpico das clulas T humanas). Juntos, esses cnceres induzidos por vrus representam cerca de 20% da incidncia mundial de cncer. Em princpio, esses cnceres poderiam ser prevenidos por vacinao contra os vrus responsveis, e um considervel avano nessa rea foi feito pelo desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o vrus da hepatite B.

Bases Celulares e Moleculares

Sabe-se que o cncer resulta de mutaes nos genes que normalmente controlam a proliferao celular. Os principais indcios que levaram identificao desses genes surgiram de estudos de vrus que causam cncer em animais, o prottipo dos quais foi isolado por Peyton Rous em 1911. Rous descobriu que sarcomas (cnceres dos tecidos conjuntivos) em galinhas poderiam ser transmitidos por um vrus, agora conhecido por vrus do sarcoma de Rous, ou RSV. Uma vez que o RSV um retrovrus com um genoma de somente 10.000 pares de bases, ele pode ser alvo de anlises moleculares com muito mais facilidade que o genoma complexo das galinhas ou de clulas de animais. Finalmente, esses estudos levaram identificao

Referncia
Rous, P. 1911. A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor cells. J. Exp. Med. 13:397-411.

O tumor transplantvel de onde foi isolado o vrus do sarcoma de Rous.

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Em uma cultura de bactrias crescendo em meio com gar, a replicao do T4 leva formao de uma rea clara de clulas lisadas (uma placa) na camada de bactrias (Figura 1.44). Justamente pelo fato de as partculas virais infecciosas serem fceis de cultivar e testar, mutantes virais por exemplo, vrus que crescero em uma cepa de E. coli, mas no em outra so facilmente isolados. Assim, o T4 manipulado muito mais facilmente que a E. coli para estudos de gentica molecular. Alm do mais, o genoma do T4 20 vezes menor que o da E. coli aproximadamente 0,2 milho de pares de bases facilitando ainda mais as anlises genticas. Outros bacterifagos tm genomas ainda menores o mais simples consiste em molculas de RNA de somente 3.600 nucleotdeos. Por isso, os vrus bacterianos tm fornecido sistemas experimentais extremamente prticos para a gentica molecular. So basicamente os estudos desses vrus que tm levado elucidao de muitos princpios fundamentais da biologia molecular. Por causa da grande complexidade do genoma das clulas animais, os vrus tm sido mais importantes nos estudos das clulas animais do que nos estudos das bactrias. Muitos vrus de animais replicam-se e podem ser observados pela formao de placas em culturas de clulas, parecido com o que fazem os bacterifagos. Alm do mais, os genomas dos vrus de animais so similares em complexidade aos dos vrus bacterianos (variando aproximadamente de 3.000 a 300.000 pares de bases), de modo que os vrus de animais so mais manipulveis que suas clulas hospedeiras. Existe muita diversidade nos vrus de animais, cada um contendo ou DNA ou RNA como material gentico (Tabela 1.3). A maioria dos vrus com genomas de RNA replica-se mediante sntese de novas cpias do RNA de seus genomas, a partir de moldes de RNA nas clulas infectadas. Contudo, uma famlia de vrus de animais os retrovrus contm genoma de RNA nas suas partculas virais, mas sintetiza uma cpia de DNA do seu prprio genoma nas clulas infectadas. Esses vrus fornecem um bom exemplo da importncia dos vrus como modelos, porque os estudos dos retrovrus foram os primeiros a demonstrarem a sntese de DNA a partir de RNA um modo fundamental de transferir informaes genticas e que agora se sabe ocorrer em todas as clulas eucariticas. Outros exemplos nos quais os vrus de animais forneceram importantes modelos para investigao de suas clulas hospedeiras incluem estudos de replicao de DNA, transcrio, processamento do RNA e transporte e secreo de protenas. particularmente notvel que infeces de alguns vrus de animais, em vez de matarem as clulas hospedeiras, convertem uma clula normal em uma clula cancerosa. Estudos desses vrus carcinognicos, primeiramente descritos por Peyton Rous em 1911, no somente tm fornecido bases para nossa atual compreenso do cncer no nvel da biologia celular e molecular, mas tambm tm levado elucidao de muitos mecanismos moleculares que controlam o crescimento e a diferenciao das clulas animais.

Figura 1.44 Placas de bacterifagos Placas de T4 so visveis na camada de E. coli. Cada placa surge pela replicao de uma nica partcula viral. (E.C.S. Chen/Visuals Unlimited.)

TABELA 1.3 Exemplos de Vrus de Animais Famlia de vrus Genoma de RNA Picornavrus Togavrus Flavivrus Paramixovrus Ortomixovrus Retrovrus Genoma de DNA Hepadnavrus Papovavrus Adenovrus Herpesvrus Poxvrus Membro representativo Tamanho do genoma (milhares de pares de bases) 7-8 12 10 16-20 14 9 3,2 5-8 36 120-200 130-280

Vrus da poliomielite Vrus da rubola Vrus da febre amarela Vrus do sarampo Vrus da gripe Vrus da imunodeficincia humana Vrus da hepatite B Vrus do papiloma humano Adenovrus Vrus herpes simples Vrus da varola

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RESUMO A ORIGEM E A EVOLUO DAS CLULAS A Primeira Clula: Todas as clulas atuais, tanto procariticas como eucariticas, so descendentes de um nico antepassado. Supe-se que a primeira clula tenha surgido h pelo menos 3,8 bilhes de anos, como resultado da incluso de um RNA auto-replicativo em uma membrana de fosfolipdeos. A Evoluo do Metabolismo: As primeiras reaes para a gerao de energia metablica foram uma forma de gliclise anaerbica. A fotossntese ento evoluiu, seguida pelo metabolismo oxidativo. Procariotos Atuais: Os procariotos atuais so divididos em dois grupos, as arqueobactrias e as eubactrias, que divergiram cedo na evoluo.

PALAVRAS-CHAVE clulas procariticas, clulas eucariticas, mundo de RNA, fosfolipdeos, anfiptica, hidrofbica, hidroflica adenosina 5-trifosfato (ATP), gliclise, fotossntese, metabolismo oxidativo arqueobactrias, eubactrias, cianobactrias, Escherichia coli (E. coli), parede celular, membrana plasmtica, ribossomo ncleo, mitocndria, cloroplasto, lisossomo, peroxissomo, vacolo, retculo endoplasmtico, complexo de Golgi, citoesqueleto, endossimbiose levedura, Saccharomyces cerevisiae, pseudpodo, clula epitelial, fibroblasto, eritrcito, granulcito, moncito, macrfago, linfcito, neurnio

Clulas Eucariticas: As clulas eucariticas, que so maiores e mais complexas que as clulas procariticas, contm um ncleo, organelas citoplasmticas e um citoesqueleto. Supe-se que elas tenham surgido a partir da associao simbitica de procariotos. O Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares: Os eucariotos mais simples so organismos unicelulares, como as leveduras e as amebas. Os organismos multicelulares evoluram a partir da associao entre eucariotos unicelulares, e a diviso das funes levou ao desenvolvimento dos muitos tipos de clulas especializadas que formam os animais e vegetais atuais. CLULAS COMO MODELOS EXPERIMENTAIS E. coli : Em razo da sua simplicidade gentica e facilidade de estudo, bactrias como a E. coli so particularmente teis para a pesquisa de aspectos fundamentais da bioqumica e biologia molecular. Leveduras : Sendo as clulas eucariticas mais simples, as leveduras so modelos importantes para o estudo de vrios aspectos da biologia celular de eucariotos. Dictyostelium discoideum: O eucarionte unicelular Dictyostelium discoideum amplamente usado para anlises experimentais do movimento celular. Caenorhabditis elegans: O nematide Caenorhabditis elegans um organismo multicelular simples que serve como um modelo importante na biologia do desenvolvimento. Drosophila melanogaster: Em virtude da extensa anlise gentica, estudos da mosca-da-fruta Drosophila tm levado a grandes avanos no entendimento do desenvolvimento animal. Arabidopsis thaliana: A pequena planta com flor Arabidopsis amplamente usada como modelo para estudos da biologia molecular e do desenvolvimento de plantas. Vertebrados : Muitos tipos de clulas de vertebrados podem crescer em cultura, onde podem ser estudados em condies controladas. Tipos de clulas especiali-

Dictyostelium discoideum Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Arabidopsis thaliana Xenopus laevis, zebrafish, camundongo transgnico

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zadas, como os neurnios e as clulas musculares, fornecem modelos teis para investigar aspectos particulares da biologia celular. O sapo Xenopus e o zebrafish so modelos importantes para estudos do desenvolvimento inicial dos vertebrados, e o camundongo uma espcie de mamfero adequada para anlises genticas. FERRAMENTAS DA BIOLOGIA CELULAR Microscopia tica: Uma variedade de mtodos usada para visualizar as clulas e estruturas subcelulares e para determinar a localizao intracelular de molculas especficas pelo uso do microscpio tico.

resoluo, microscopia de campo claro, microscopia de contraste de fase, microscopia de contraste de interferncia diferencial, microscopia de contraste de interferncia diferencial intensificada por vdeo, microscopia de fluorescncia, protena verde fluorescente (GFP), microscopia confocal, microscopia de excitao multifton microscopia eletrnica de transmisso, sombreamento metlico, criofratura, esboo por congelamento, microscopia eletrnica de varredura centrifugao diferencial, ultracentrfuga, centrifugao em gradiente de densidade, centrifugao por velocidade, centrifugao de equilbrio clulas-tronco embrionrias, cultura primria, linhagem de clulas imortalizadas calo bacterifago, retrovrus

Microscopia Eletrnica: A microscopia eletrnica, com uma resoluo que aproximadamente cem vezes maior que a da microscopia tica, usada para anlise de detalhes da estrutura celular.

Fracionamento Subcelular: As organelas das clulas eucariticas podem ser isoladas para anlises bioqumicas por centrifugao diferencial.

Crescimento de Clulas Animais em Cultura: A propagao de clulas animais em cultura tem permitido estudos dos mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular. Cultura de Clulas Vegetais: Clulas vegetais em cultura podem diferenciar-se para formar clulas especializadas e, em alguns casos, podem regenerar plantas inteiras. Vrus: Os vrus fornecem um modelo simples para estudos da funo celular.

Perguntas 1. Quais so as caractersticas fundamentais que todas as clulas vivas compartilham na terra? Cite pelo menos trs. 2. O que os experimentos de Stanley Miller mostraram sobre a formao de molculas orgnicas? 3. Que tipo de macromolcula capaz de controlar sua auto-replicao? 4. Por que se pensa que a evoluo da fotossntese tenha favorecido a evoluo subseqente do metabolismo oxidativo? 5. Por que a formao de uma membrana plasmtica semipermevel ao redor de um grupo de macromolculas que se auto-replicam foi um passo to importante na origem da vida? 6. Discuta as evidncias de que as mitocndrias e os cloroplastos se originaram de bactrias que foram incorporadas pelo precursor das clulas eucariticas. 7. Que resoluo pode ser obtida com um microscpio ptico, se a amostra for visualizada atravs de ar, em vez de atravs de leo? Considere que o comprimento de onda da luz visvel de 0,5 m.

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8. Que vantagem o uso da protena verde fluorescente (GFP) tem sobre o uso de anticorpos marcados com fluorescncia, no estudo da localizao e do movimento de uma protena nas clulas? 9. Identifique as diferentes caractersticas das propriedades das organelas que Referncias e Leituras Adicionais
A Origem e a Evoluo das Clulas
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permitem a separao, em um gradiente de sacarose, pela centrifugao por velocidade e pela centrifugao de equilbrio. 10. As leveduras tm sido usadas como um modelo para o estudo de muitos aspectos da biologia das clulas eucariticas. Por que elas no so um modelo
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apropriado para a anlise dos movimentos de clulas animais? 11. Por que a capacidade de cultivar clulas-tronco embrionrias importante? 12. Qual a diferena entre culturas celulares primrias e linhagem de clulas imortalizadas?
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