FISIOLOGA ECOLGICA Y EVOLUTIVA DE ANIMALES Y PLANTAS : CONCEPTOS Y CASOS DE ESTUDIO . Francisco Bozinovic & Marino Cabrera (eds).

Ediciones Universidad Catlica de Chile. Santiago, Chile 2003, p XX-XX.

L A ABSORCIN INTESTINAL DE SUSTANCIAS HIDROSOLUBLES Y

SUS IMPLICANCIAS ECOLGICAS Y EVOLUTIVAS .

ENRIQUE CAVIEDES-VIDAL1

Palabras clave: absorcin, intestino delgado, va paracelular, compuestos hidrosolubles, aves

Departamento de Bioqumica y Ciencias Biolgicas, Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco 917. 5700 San Luis. Argentina. Email: ecv@unsl.edu.ar

INTRODUCCIN. POR QU ESTUDIAR LAS VAS DE ABSORCIN DE LOS NUTRIENTES?

Un aspecto bsico dentro del estudio de la fisiologa digestiva y la ecologa nutricional, lo constituye la absorcin de sustancias por el sistema gastrointestinal. La incorporacin de sustancias a travs del epitelio del intestino delgado constituye la va principal de ingreso de nutrientes que ingresan al organismo y posibilitan la supervivencia de stos, ya que aportan energa y materiales esenciales que los animales no son capaces de manufacturar por s mismos. Tambin pueden ingresar drogas teraputicas, toxinas y otros compuestos que se encuentren en el lumen del intestino. En este sentido, el epitelio del intestino delgado juega un rol crucial en el transporte de nutrientes y otros solutos desde el lumen intestinal a los lquidos corporales subyacentes, como la sangre y la linfa. La sustancias presentes en el lumen intestinal encuentran dos barreras limitantes: (a) una capa de clulas epiteliales denominadas enterocitos y (b) la uniones entre estas clulas. Es decir, que estas dos barreras definen respectivamente dos vas posibles de absorcin, la transcelular y la paracelular. La va transcelular, compuesta por los enterocitos, muestra a la luz del intestino delgado una membrana celular con una especializacin formada por repliegues de sta, denominada ribete en cepillo. La naturaleza de esta membrana, constituida por una bicapa de fosfolpidos con protenas inmersas o adheridas a sta, determina la tasa de absorcin intestinal de sustancias. El traspaso de sustancias a travs de la bicapa est positivamente correlacionado con el coeficiente de particin lpido-agua. De esta manera, la bicapa restringe el paso a sustancias inicas y polares, como los hidratos de carbono y los aminocidos. Estos compuestos hidrosolubles requieren de protenas transportadoras para atravesar la membrana. Los mecanismos descriptos en el transporte mediado (a travs de protenas) puede ser pasivo (el pasaje de los compuestos ocurre a favor de un gradiente de electroqumico, sin gasto de energa metablica) o activo (el pasaje de los compuestos es en

contra de un gradiente electroqumico y requiere de energa metablica para su funcionamiento). En la va pasiva, el paso de sustancias desde el lumen intestinal hacia el espacio intercelular a travs de la va de transporte paracelular se encuentra restringido por los complejos de unin (Anderson 2001) ubicados apicalmente y los espacios basolaterales. Los complejos de unin estn formados principalmente por las uniones estrechas (znula occludens o uniones estancas), desmo somas y uniones en hendidura, donde la estructura ms importante en la restriccin del paso de solutos a travs de la va paracelular, son las uniones estrechas (Ballard et al. 1995). La absorcin de sustancias hidrosolubles es relevante para los organismos por lo que ha recibido una atencin particular por parte de los investigadores, en especial la absorcin de D-glucosa ha sido estudiada ampliamente por constituir la fuente primaria de energa qumica en los animales. A partir de 1961, cuando Crane y sus colaboradores propusieron para el ingreso de glucosa a travs del epitelio intestinal, el mecanismo del cotransporte Na+-glucosa, ste se estableci firmemente en el campo de la fisiologa de la absorcin. As durante los 25 aos siguientes prcticamente domin el concepto que las sustancias hidrosolubles deban incorporarse al organismo mediante protenas transportadoras adecuadas. Sin embargo, dos hechos que fueron y continan siendo clave en los cuales existe consenso entre la mayora de los investigadores- es que: (a) el cotransportador Na+-glucosa se satura in vivo entre 30 y 50 mM y (b) que existen numerosos estudios de que la tasa de absorcin D- glucosa se incrementa en forma casi lineal a partir de 50 mM hacia arriba (para revisin ver Kellett 2001). Estos dos hechos permitieron proponer que debera existir otro/s mecanismo /s de absorcin de la glucosa Dglucosa de tipo pasivo en adicin al del cotransportador Na+-glucosa. Como se previ, se han acumulado diversas evidencias acerca de este componente pasivo de la absorcin de la D-glucosa, que recibi un soporte mecanstico en 1987 cuando Pappenheimer y Reiss proponen la teora del arrastre por solvente a travs de la va paracelular como una explicacin para los fenmenos observados. De esta ma nera se gener una controversia importante que ha dominado esta rea de estudio en los ltimos aos, no acerca de si la va pasiva ocurre o no, sino ms bien acerca de su magnitud, caractersticas y de sus posibles implicancias tanto ecolgicas como evolutivas.

POR QU EXISTE CONTROVERSIA ACERCA DE LA ABSORCIN PASIVA ,

Y POR QU ESTA ES IM PORTANTE?

Los estudios con mamferos y peces omnvoros han provisto de una amplia evidencia que los transportadores intestinales de nutrientes son modulados de varias maneras: a veces irreversible y especficamente durante el desarrollo, reversible y no especficamente cuando cambia el nivel de ingesta, reversible y especficamente cuando vara la composicin de la dieta (Buddington & Diamond 1989, Ferraris & Diamond 1989, Karasov 1988, Karasov & Hume 1997). Diamond (1991) plantea que estos cambios tendran un significado fisiolgico cuestionable si hubiese capacidades absortivas de nutrientes en exceso o sobredimensionadas. Asimismo, este investigador junto a otros colegas interpretan estos cambios diciendo que la capacidad de transporte de los transportadores apicales de azcares y aminocidos estn equilibrados con las demandas metablicas (Diamond 1993, Caviedes-Vidal & Karasov 1996) ms un cierto margen de seguridad (Diamond & Hammond 1992). Sin embargo, otros autores (Pappenheimer & Reiss 1987, Pappenheimer 1993) sugieren en cambio, que la capacidad del intestino de los mamferos de absorber glucosa va cotransporte Na+glucosa es inadecuada para transportar la ingesta diaria de glucosa y que la absorcin ocurre principalmente mediante un mecanismo de arrastre de solvente a travs de la uniones estrechas intestinales y secundariamente a travs de un transporte activo de azcares y aminocidos. Pappenheimer (1993) adems sugiere, que los cambios de tipo adaptativos o durante el desarrollo que ocurren en el transporte activo debieran ser interpretados como parte del mecanismo de arrastre por solvente.

LA

ABSORCIN

INTESTINAL

EN

AVES

SUS

IMPLICANCIAS

ECOLGICAS.

Durante los ltimos quince aos ha habido un esfuerzo de parte de un grupo de ecofisilogos por estudiar la fisiologa digestiva de aves y sus implicancias ecolgicas. Uno de los objetivos perseguidos fue el de clarificar de qu manera las caractersticas de los procesos digestivos (e.g. morfologa del tracto digestivo, digestin enzimtica, absorcin, etc.) de estos animales estn adecuados a sus dietas y, a distintos niveles de ingesta de alimento en diferentes periodos de los ciclos anual y/o de vida (para revisin ver Karasov

1996). Un hecho notable que surge de estas investigaciones lo constituye la ausencia de cambios o modulacin de las tasas de transporte activo de nutrientes en el intestino delgado de las aves estudiadas, que caba esperar sobre la base de lo planteado por Diamond en 1991. Este autor propuso que a travs de la accin de la seleccin natural, la capacidad absortiva del intestino delgado de los vertebrados est equilibrada con el nivel de ingesta de alimento. Justific esta especulacin diciendo que, si no hubiese existiese equilibrio, entonces una parte valiosa de energa de los alimentos podra ser desperdiciada en las excretas cuando se alimentaran dietas con alto contenido de sustratos que no son absorbidos. Adems, los costos metablicos de sintetizar y mantener la maquinaria molecular para absorber sustratos sera tambin desperdiciada si se forrajearan dietas con muy bajos niveles de sustratos. Entonces, de acuerdo con esta hiptesis de modulacin adaptativa, el transporte de los monosacridos o aminocidos debe estar positivamente correlacionado con el nivel de los sustratos en la dieta (Diamond 1991). A la fecha, se ha investigado en al menos cuatro especies de aves omnvoras (Levey & Karasov 1992, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Afik et al. 1997, Karasov et al. 1996) su capacidad para incrementar la absorcin mediada intestinal de D- glucosa cuando se las aclimata a dietas con alto contenido en carbohidratos y, la capacidad de absorcin de aminocidos cuando se las aclimata a dietas hiperproteicas. Al igual que otros vertebrados, los pjaros exhibieron transporte mediado de D- glucosa in vitro con una constante de Michaelis aparente en el rango de 1 a 10 mM (Karasov & Hume 1997). Sin embargo, a diferencia de los mamferos y peces omnvoros que pueden doblar la tasa de absorcin de glucosa con dietas ricas en carbohidratos (Karasov 1992), los mirlos americanos (Turdus migratorius; Levey & Karasov 1992), las reinitas coronadas (Dendroica coronata; Afik et al. 1997), los gorriones (Passer domesticus) (Caviedes-Vidal & Karasov 1996) y las codornices cotu (Colinus virginianus; Karasov et al. 1996) mostraron muy pequea o ninguna modulacin de la actividad de transporte de D- glucosa mediado (i.e. activo) in vitro. Ms aun, en todas estas especies las tasas de transporte activo de glucosa obtenidas in vitro dieron valores mucho ms bajos (30% o menos) que las tasas de absorcin de Dglucosa estimadas a partir de medida de eficiencia de extraccin en aves intactas. Estos resultados llevaron a cuestionarse si el transporte activo era verdaderamente la va primaria para la absorcin de azcares en estas aves.

Un supuesto implcito que subyace en la hiptesis de modulacin adaptativa es que la absorcin mediada es la va primaria de absorcin de glucosa y por lo tanto su regulacin es el objeto de la seleccin natural. Por otro lado, Pappenheimer (1990) propuso como se menciona ms arriba - que la absorcin pasiva es relativamente ms importante que le transporte mediado. Como consecuencia entonces, en una serie de estudios (Karasov & Cork 1994, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Karasov et al. 1996, Levey & Cipollini 1996, Afik et al. 1997), se someti a prueba la importancia de la absorcin pasiva. En estos experimentos se utiliz un mtodo farmacocintico en pjaros que se alimentaban libremente con el que se estim la absorcin de [3 H] L- glucosa, el estereoismero de la Dglucosa que no interacciona con el cotransportador intestinal Na+-glucosa. Sorprendentemente, se encontr una absorcin prcticamente total de la L-glucosa ingerida en todas las especies: (a) , tricogloso de pecho rojo (Trichoglossus haematodus, 80%; Karasov & Cork 1994), nectarvoro, (b) gorriones (80%, Caviedes-Vidal & Karasov 1996), granvoro, (c) reinita coronada (91%; Afik et al. 1997), frugvoro/insectvoro y (d) codorniz coti (92%; Karasov et al. 1996, Levey & Cipollini 1996), herbvoro. La semejanza de estos hallazgos en aves con diferentes dietas y asociaciones taxonmicas sugieren una generalidad de este fenmeno en aves. Ahora bien, la medicin de la absorcin de la L-glucosa y su utilizacin en conclusiones acerca de la absorcin pasiva de la D-glucosa descansa sobre varios supuestos. Se asume que la absorcin de la L-glucosa medida in vivo es solamente pasiva. Varios estud ios indican que no existe un transportador para la L-glucosa porque su absorcin no es inhibida por si misma, es decir que la absorcin de de L-glucosa marcada no es influenciada por la presencia de grandes cantidades de L-glucosa no marcada, al menos en mamferos (Meddings & Westergaard 1989, Thomson et al. 1982). Tambin es parte de los supuestos la L- glucosa no se metaboliza y se excreta totalmente. En el estudio con los tricoglosos de pecho rojo no se observ indicio alguno de metabolizacin (Karasov & Cork 1994) y la L-glucosa marcada fue excretada totalmente. Adems tambin se valid utilizando cromatografa de capa fina, que el 95% del tritio recuperable en el plasma de gorriones y reinitas coronadas estaba ligado a la molcula de L-glucosa, de lo que se concluye que la L- glucosa detectada en plasma fue absorbida como tal.

Estos hallazgos descritos son muy relevantes. Por un lado, ayudan a resolver el aparente desencuentro que se observa entre las altas concentraciones de azcar absorbida in vivo y la baja capacidad de transporte mediada de D-glucosa medida in vitro. Tambin permiten explicar por qu el transporte activo de D- glucosa no es modulado en las especies de aves estudiadas. Por otro lado, ha sido propuesto que debido a que los alimentos pueden contener toxinas, podra haber una seleccin en contra de la absorcin pasiva y a favor de la especificidad de absorcin va protenas transportadoras especficas en el ribete en cepillo del intestino delgado (Diamond 1991). El descubrimiento de una magnitud importante de absorcin de L glucosa en aves gener, un nueva etapa en el estudio de la absorcin de sustancias hidrosolubles en este grupo taxonmico. Esta comprendi, un avance en las metodologas de estudio de la funcin absortiva, una extensin de la investigacin a otras molculas hidrosolubles absorbibles, la caracterizacin funcional y fisicoqumica y, la visualizacin de la va paracelular, que se describen a continuacin.

NUEVO DISEO EXPERIMENTAL : Recientemente, (Chediack et al. 2001, 2003) se ha

desarrollado una metodologa para el estudio de la absorcin de azcares en aves intactas. En sta, los compuestos se administran en forma de un pulso intragstrico e inyectan en el msculo pectoral. Luego de la administracin/inyeccin se colectan muestras de sangre en forma secuencial y se analizan mediante cromatografa gaseosa con detector de masas (Figura 1, para L- glucosa). La fraccin absorbida (F) o biodisponibilidad de los azcares fueron calculadas mediante ecuaciones farmacocinticas clsicas (Gibaldi & Perrier 1982, Shargel & Yu 1999, Riviere 1999): (1) F = AUCo S K e Do , (2) F = [ AUCo Do ] [ AUCi Di ] Donde, AUC: rea bajo la curva de la concentracin del compuesto en plasma en funcin del tiempo transcurrido luego de la administracin oral (o)/inyeccin (i); S: espacio o volumen de distribucin del compuesto; Ke : constante de eliminacin del compuesto del plasma despus de la inyeccin; D: dosis administrada (o)/inyectada (i). En estos estudios se observ que en promedio, un 69% de la dosis oral de los azcares (D- manitol y L-arabinosa) fue absorbida independientemente de la concentracin 7

administrada. Adems estos estudios dan soporte a las observaciones previas de una absorcin pasiva sustancial de L- glucosa en gorriones, usando distintos marcadores y distinto diseo experimental y de anlisis (farmacocintica de dosis nica).

EFECTO NUTRIENTE: La va propuesta para esta absorcin sustancial de solutos

hidrosolubles es paracelular, es decir que el transporte solutos es a travs de las uniones estrechas entre enterocitos adyacentes y no a travs de estos. El mecanismo, como lo propuso por primera vez Pappenheimer y Reiss en 1987, puede ser arrastre por solvente a travs de los espacios basolaterales, activado por cotransportadores Na+- nutriente (Madara & Pappenheimer 1987, Pappenheimer 1987, Pappenheimer & Reiss 1987, Turner & Madara 1995, Turner et al. 1997). Esta hiptesis predice que la absorcin de solutos hidrosolubles ser mxima cuando ellos se encuentren presente en el lumen del intestino delgado en acompaados por D- glucosa y/o aminocidos. Chang y col. (2003) estudiaron este problema realizando experimentos con gorriones utilizando una nuevo mtodo farmacocintica que desarrollaron para medir absorcin (Chediack et al. 2001, Chang 2003). En el experimento que se muestra en la figura 2, la fraccin absorbida de L- glucosa marcada fue significativamente mayor cuando se administraba a pjaros en ayunas en solucin con 200 mM D- glucosa y 80 mM cloruro de sodio comparada contra un control en el que se reemplaz la D- glucosa por D- manitol (0,78 + 0,016 vs. 0,69 + 0,029 respectivamente; test t de Student, T9 = -2,67, P = 0,013 test de una cola). Conjuntamente con la fraccin absorbida, Chang y col. (2003) determinaron las tasas de absorcin aparentes con los valores obtenidos en el experimento anterior. La constante de absorcin, Ka, para L- glucosa determinada por el mtodo de desglose de curva (figura 2B) dio un valor 133% ms alto en los gorriones a los que se les administr el marcador en solucin con D- glucosa comparado con los controles con D- manitol (0,22 + 0,04 min-1 vs. 0,09 + 0,01 min-1 respectivamente; t-test de Student, T6 = -3,29, una cola P = 0,009, figura 2B). Con este resultado es posible rechazar lo sugerido por Schwartz et al. (1995) acerca de que la mayor fraccin absorbida de L- glucosa en la presencia de nutrientes luminares ocurre debido a que el proceso absortivo con una baja constante de absorcin (i.e. Ka sin nutrientes en el lumen) se extiende por un periodo de tiempo mayor o porque el intestino incrementa su tamao. En efecto, a los gorriones

tratados con D- glucosa les tom menor tiempo (no mayor) para incorporar el 99% de Lglucosa absorbida que a los tratados con D- manitol. Estos resultados pueden interpretarse como consistentes con la hiptesis de arrastre por solvente, y revelan que compuestos hidrosolubles de tamao pequeo son absorbidos en mayor cantidad y ms rpido cuando hay nutrientes presentes en el intestino delgado. A este incremento de la absorcin por presencia de nutrientes en el lumen intestinal se lo denomina efecto nutriente.

VISUALIZACIN DE LA VA PASIVA : Utilizando fluorescena, un marcador de

tamao pequeo (PM=376) e hidrosoluble (log P = -1,52; (96)), Chang 2002 someti a prueba la prediccin acerca de que una importante cantidad de este marcador sera absorbido a travs de la va paracelular. Con este propsito gorriones en ayuno fueron administrados oralmente con 500 l de una solucin isotnica conteniendo 500 g/ml de flouresceinato de sodio, 100 mM de D- glucosa y 80 mM de cloruro de sodio. En un primer grupo de experimentos, valid que la fluorescena es absorbida, siendo su biodisponibilidad de 35 10% (n=6). Esta fraccin absorbida es menor que para los carbohidratos L-arabinosa o L- glucosa, probablemente por una serie de razones incluyendo su PM mayor que los compuestos mencionados y su carga negativa (ver prxima seccin). En un segundo grupo de experimentos se estudi la distribucin de este marcador en el tejido intestinal de los gorriones mediante microscopa confocal lser (detalles en la leyenda de la fig. 3). Con este tcnica se puede determinarse si la fluorescencia es apical basolateral y/o intracelular, es decir si el marcador utiliza la va transcelular y/o paracelular (Hurni et al. 1993). Como puede observarse en la figura 3 la fluorescencia (i.e. la fluorescena) fue detectada en el espacio basolateral y tambin en los vasos sanguneos de la vellosidad, pero no en el interior de los enterocitos. En consecuencia, con esta evidencias se puede afirmar que la fluorescena es absorbida a travs de la va paracelular, aportando un sustento visual importante de la utilizacin de esta va.

EFECTO DEL TAMAO Y DE LA CARGA ELCTRICA EN ABSORCIN DE

SOLUTOS HIDROSOLUBLES: Chediack et al. 2003 estudiaron el efecto del tamao

molecular en la absorcin pasiva de compuestos hidrosolubles a travs del epitelio del intestino delgado, administrando intraestomacal y simultneamente azcares que no son transportados activamente con peso molecular (PM) creciente (L-arabinosa PM=150,1, L-ramnosa PM=164,2, perseitol PM=212,2 y lactulosa PM=342,3), disueltos en una solucin 350 mosm/Kg, a gorriones. La concentracin en plasma de los marcadores fue medida en muestras de sangre seriales. Los carbohidratos fueron tambin inyectados en el pectoral para estimar las constantes de eliminacin de cada uno de los azcares. La fraccin absorbida, calculada como se describi anteriormente, disminuy con el incremento del peso molecular de los marcadores (figura 4) en forma ms rpida que los coeficientes de difusin libre en agua de los azcares, consistente con un fenmeno de movimiento a travs de poros efectivos en membranas (tamices) (Friedman 1987). La absorcin de todos los azcares fue aumentada por la presencia intraluminal de Dglucosa o comida (efecto nutriente) si se compara contra control de manitol. Estos hallazgos sugieren que la absorcin paracelular a travs del intestino delgado vara inversamente con el tamao del soluto y que la presencia de D- glucosa y nutrientes en el lumen del intestino delgado incrementan la absorcin. La va paracelular ha sido propuesta como catin selectiva (He et al. 1996; Madara et al. 1986; Pauletti et al. 1997). Chediack et al (2002) sometieron a prueba esto en gorriones usando pptidos indigestibles (sintetizados utilizando D-aminocidos) con peso molecular similar pero positivamente (serina - lisina) o negativamente cargados (serina cido asprtico). Usando la misma metodologa descrita arriba, se encontr que la fraccin absorbida del pptido cargado negativamente fue alrededor de la mitad del cargado positivamente (18 + 3 % vs. 30 + 3 % respectivamente, F1,7 = 16,3, P < 0,005). Cul es el significado funcional de estos experimentos? Recientemente, se ha sugerido que los nutrientes intestinales reclutaran transportadores GLUT2 a la membrana apical de los enterocitos, y que por lo tanto el componente difusivo sensible a los nutrientes intraluminales observado sera en realidad transcelular y mediado (Kellet & Helliwell 2000). Sin embargo, esta hiptesis ignora la evidencias como las presentadas en las figuras 2 y 3 de que la absorcin de muchos tipos de solutos hidrosolubles (e.g. carbohidratos, fluorescena) es paracelular e incrementada por la presencia de nutrientes en la luz del intestino.

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Cul es el mensaje ecolgico de estos experimentos? Los investigadores que son escpticos acerca de la importancia de la va paracelular han argumentado que una alta permeabilidad intestinal que permita una absorcin pasiva puede ser menos selectiva que un sistema mediado por transportadores para absorber nutrientes. Por esta razn podra dejar ms expuesto al animal al permitir que toxinas provenientes del material animal y vegetal que se encuentra en el lumen intestinal sean absorbidas (Diamond 1991). Los casos de estudio presentados ms arriba demarcan los posibles lmites de esta vulnerabilidad, ya que definen la selectividad de la va en contra de las grandes molculas y de los compuestos cargados negativamente. Adems, los casos de estudio presentados pueden tambin ayudar a mejorar la capacidad de prediccin de la biodisponibilidad de toxinas. Por ltimo, es importante agregar que los vertebrados son bastante vulnerables a toxinas lipoflicas y que concordantemente han desarrollado numerosos procesos de detoxificacin. Por todo lo expresado, la los argumentos presentados arriba, no constituye una crtica de peso respecto del concepto de absorcin paracelular a la luz del conocimiento actual.

LA RELEVANCIA DE LA VA PARACELULAR EN LA ABSORCIN DE

NUTRIENTES: La importancia de la absorcin paracelular es robustecida por su

contribucin a la absorcin de nutrientes. Pappenheimer sugiri que la mayor parte de absorcin de la D- glucosa ocurre por un mecanismo de arrastre por solvente a travs de las uniones estrechas del epitelio del intestino delgado (absorcin paracelular) y en menor medida por transporte activo transcelular. Bajo esta hiptesis se pueden predecir tasas de absorcin in vivo muy similares para los estereoismeros de la glucosa. Chang y Karasov (2001) sometieron a prueba estas predicciones, administrando oralmente e inyectando a gorriones, una mezcla de marcadores (a) [3 H]3-O- metil- D-glucosa (un anlogo no metabolizable de la D- glucosa que se transporta activamente utilizando el cotransportador Na+- glucosa) y (b) [14 C]L- glucosa (estereoismero tambin no metabolizable y que no interacta con el cotransportador Na+- glucosa) en una solucin conteniendo 200 mM de 3-O- metil- D- glucosa no marcada. Los niveles de los marcadores en la sangre se analizaron utilizando un modelo abierto de dos compartimientos y con cintica de eliminacin de primer orden. Los valores obtenidos

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de fraccin absorbida (F) de D- y L- glucosa no fueron significativamente diferentes (0,80 + 0,053 vs. 0,79 + 0,042; n = 6; T = 0,39, P = 0,72 respectivamente). Las tasas aparentes de absorcin de ambos azcares - determinadas mediante el procedimiento de Loo-Riegelman (Gibaldi & Perrier 1982, Shargel & Yu 1999, Riviere 1999) tampoco difirieron significativamente (P = 0,35) (Fig. 5A,B). Adems, la absorcin de ambos compuestos ocurri mayoritariamente (95%) durante los 40 min siguientes a la administracin oral de stos. La similitud de la magnitud y tasas de absorcin de la Dy L-glucosa encontradas en este trabajo constituyen un resultado provocativo que es consistente con la hiptesis de Pappenheimer (1987) acerca de una va paracelular importante para la absorcin de azcar.

DIRECCIONES FUTURAS.
A la luz del avance en el conocimiento de la funcin absortiva en aves, se desprende una pregunta obvia: cun significativa es la absorcin paracelular en otros animales? As por ejemplo, tal vez la absorcin paracelular es una caracters tica general de los vertebrados que ha sido magnificada dentro de un grupo de animales (e.g. las aves que vuelan, que se sabe que poseen intestinos delgados relativamente ms pequeos que las que no lo hacen (Karasov & Hume 1997) de manera de reforzar o suplementar otros tipos de absorcin de nutrientes (e.g. transporte activo de glucosa y aminocidos). Desde el punto de vista de los niveles de integracin organsmico o por encima de este, lo importante como se ha mencionado anteriormente- no es si el arrastre por solvente ocurre o no, sino su magnitud y significado biolgico en animales normales que viven libremente en sus ambientes. La respuesta tiene tremenda importancia para las investigaciones futuras en la fisiologa digestiva ecolgica y evolutiva. Por ejemplo, una pregunta extensiva a toda la biologa es, cun generalizado se encuentra el hecho de que las capacidades fisiolgicas y bioqumicas excedan las demandas naturales? Este problema fue especficamente abordado por primera vez estudiando el diseo del sistema respiratorio en relacin a la demanda metablica de oxgeno (Taylor & Weibel 1981). Ms recientemente ha sido extendido esta consideracin a la absorcin intestinal de nutrientes en relacin a la ingesta de stos (Chediack et al. 2003). Los intentos por medir el equilibrio entre la capacidad de absorcin de nutrientes con la ingesta (i.e., medir la capacidad de reserva o

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margen de seguridad) pueden no ser satisfactorios si la absorcin pasiva es importante pero no se toma en cuenta. Otro asunto a considerar que tambin lo hemos mencionado anteriormente- lo constituye el hecho de que la va pasiva con una alta permeabilidad intestinal inespecfica comparada con el sistema de transporte mediado podra permitirles a las toxinas de la materia vegetal y animal en el lumen intestinal a ser fcilmente absorbidas (Chediack et al. 2001). Esta vulnerabilidad a las toxinas podra constituir una importante fuerza directriz ecolgica, limitando las conductas exploratorias y limitando la amplitud del nicho dietario. Esto claramente constituye una lnea para futuras investigaciones acerca de los costos asociados con la detoxificacin de toxinas naturales absorbidas (e.g., Day et al. 2000) y tal vez la sensibilidad de animales de vida silvestre a las nuevas generaciones de herbicidas y pesticidas hidrosolubles producidas por el hombre. Aunque uno podra predecir una accin de la seleccin natural en contra de una dependencia de la absorcin pasiva, y a favor de una especificidad de absorcin por una va que utilice protenas especficas de transporte en el ribete en cepillo intestinal, las evidencias se estn acumulando en el sentido de que en algunos vertebrados ciertos solutos hidroflicos, de tamao pequeo y mediano, atraviesan el intestino en cantidades sustanciales por la ruta pasiva. Por ejemplo, en las ratas la creatinina y un octapptido hidrosoluble fue absorbido entre un 50 a 60% y luego excretado intacto en orina (Pappenheimer 1990, Pappenheimer et al. 1994), y manitol, polietilenglicol (PEG) 4000 (Ma et al. 1993) e inulina (Ma et al. 1993) fueron absorbidos mayoritariamente por va paracelular. En aves sin restriccin de alimentacin comiendo dietas naturales, la mayora de la L- glucosa fue absorbida (Afik et al. 1997, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Karasov & Cork 1994, Karasov et al. 1996). De estas observaciones para L-glucosa y otras evidencias preliminares de absorcin de dextrano 8000 Da (Caviedes-Vidal et al. 1998) en otra especie de ave y la evidencia reciente de Gilardi (1996) de absorcin de un alcaloide hidrosoluble por un ave provee una buena evidencia de que una considerable cantidad de absorcin pasiva ocurre en aves y que posiblemente tenga importantes implicancias ecolgicas y evolutivas.

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Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por subsidios FONCYT 1-3101, CYTUNSL 9502, NSF IBN 9723793 & 0216709.

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Leyenda de figuras.

Figura 1. Absorcin pasiva de solutos hidrosolubles estudiada con cintica de pulso nico. En la figura de arriba (1A), la L-glucosa aparece en el plasma luego de la administracin oral con manitol (tringulos) o D- glucosa (crculos: administracin oral en presencia del anlogo de la D- glucosa no metabolizable, 3-O-metil- D-glucosa). La toma de muestras de plasma se comienza durante la fase de incremento, dominada por la absorcin. La

concentracin declina post-absortivamente a medida que el compuesto desaparece del plasma debido a su excrecin; la pendiente expresa la tasa de eliminacin. Estos datos en conjunto con informacin acerca del espacio o volumen de distribucin (obtenido de experimentos con inyeccin de L-glucosa) son usados para calcular la fraccin absorbida, que fue en este caso superior cuando se estim en presencia de D-glucosa (efecto nutriente). La figura de abajo (1B) muestra la determinacin de la tasa aparente de

absorcin, Ka, a partir de los datos de la figura 1A mediante la tcnica del desglose de curva, un procedimiento estndar en farmacocintica) Los smbolos vacos representan los datos originales de la figura 1A, y los smbolos llenos constituyen los valores residuales derivados del desglosamiento de la curva, utilizados para calcular Ka. La tasa de absorcin de L- glucosa fue aproximadamente el doble cuando se estim en presencia de D-glucosa, como se desprende de la mayor pendiente observada de los crculos llenos comparados con los tringulos llenos.

Figura 2. Absorcin de fluorescena a travs de la va paracelular en el intestino de gorriones. La micrografa muestra la distribucin de la fluorescencia entre (no dentro) de las clulas epiteliales en un corte de vellosidad intestinal. El intestino fue colectado

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10 minutos despus de que el gorrin fuese administrado oralmente con una solucin que contena 500 g/ml de fluoresceinato de sodio, 100 mM D- glucosa, y 80 mM de cloruro de sodio. Trozos de tejido fueron extrados, incluidos y se obtuvieron cortes de 20 ~ 25 m, teidos con Sudn Black y etanol al 70 % para eliminar autofluorescencia (Clancy & Cauller 1998; Schnell, Staines, and Wessendorf, 1999). Los cortes se observaron mediante microscopio lser confocal. Las imgenes obtenidas fueron procesadas digitalmente para determinar de la distribucin de la sonda en el intestino del ave.

Figura. 3. La absorcin de compuestos hidrosolubles depende del tamao de la molcula y se incrementa en la presencia de nutrientes. (PM: peso molecular en Daltons; L-arabinosa PM 150,1, L-ramnosa PM 164,2, perseitol PM 212,2 y lactulosa PM 342,3).

Figura 4. En la figura superior 4A. se representa la actividad especfica de L- glucosa y 3O-metil- D-glucosa radiomarcada en plasma como una funcin del tiempo transcurrido luego de la administracin oral de las dos sondas simultneamente en un gorrin. Las reas bajo cada curva, normalizadas por la dosis administrada son utilizadas para calcular la fraccin de cada istopo que fue absorbida. Observar la similitud de curso temporal de ambas sondas, que sugiere tasas similares de absorcin. La diferencia en altura de las curvas se debe a diferencias en la dosis de compuestos radiomarcados administrados y no a diferencias en las cantidades absorbidas de cada sonda (ver texto). En la figura inferior 4B est graficada la media acumulada de seis gorriones de la fraccin absorbida de L- glucosa y de 3-O-metil-D-glucosa luego de la administracin simultnea de las sondas (grfica interna superior). La figura mayor muestra las tasas aparentes de absorcin de las dos 16

sondas, obtenidas de las pendientes instantneas de la grfica interna superior. La similitud en las tasas aparentes implica que la mayor parte de la 3-O-metil- D-glucosa es absorbida por el mismo proceso pasivo que la L-glucosa. Estas figuras estn confeccionadas con los datos de la figura 4A tratados con el procedimiento farmacocintico de Loo-Riegelman (ver texto).

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LITERATURA CITADA
AFIK D, BW DARKEN & WH KARASOV (1997) Is diet-shifting facilitated by modulation of intestinal nutrient uptake? Test of an adaptational hypothesis in yellow-rumped warblers. Physiological Zoology. 70: 213-221. AFIK D, SR MCW ILLIAMS & WH KARASOV (1997) A test for passive absorption of glucose in yellow-rumped warblers and its ecological significance. Physiological Zoology 70(3): 370-377. ANDERSON JM (2001) Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News in Physiological Science 16: 126-130 BALLARD ST, JH HUNTER & AE TAYLOR (1995) Regulation of tight-junction permeability during nutrient absorption across the intestinal epithelium. Annual Reviews in Nutrition 15: 3555. BUDDINGTON RK & JM DIAMOND (1989) Ontogenetic development of intestinal nutrient transporters. Annual Reviews in Physiology 51: 602-619. CAVIEDES -VIDAL E, D AFIK, C MARTINEZ DEL RIO & WH KARASOV (2000) Dietary modulation of intestinal enzymes of the house sparrow (Passer domesticus): testing an adaptive hypothesis. Comparative Biochemistry and Physiology A 125: 11-24. CAVIEDES -VIDAL E, JG CHEDIACK & E CAVIEDES CODELIA (1998). Preliminar data of passive absorption of dextran 8.8 kDa in Saltator aurentiirostris. Biocell 22: 3 (abstract). CAVIEDES -VIDAL E & WH KARASOV (1996) Glucose and amino acid absorption in house sparrow intestine and its dietary modulation. American Journal of Physiology 271: R561-R568. CHANG MH (2002) The magnitude and significance of passive absorption in intact house sparrows, Passer domesticus. Ph.D. Dissertation, University of Wisconsin, Madison. CHANG MH, JG CHEDIACK, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2003) Enhanced passive absorption in the presence of luminal nutrients in house sparrows (Passer domesticus). (submitted BMC Physiology). CHANG MH & WH KARASOV (2001) Similar extent and rate of absorption of D- and Lglucose in house sparrows, Passer domesticus. FASEB Journal 15(5), A830. Ref Type: Abstract

18

CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2002) Electroaffinity of the passive intestinal absorption pathway of birds. Biocell (in press). Ref Type: Abstract CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2003) Intestinal passive absorption of hydrosoluble compounds is size dependent and modulated by luminal nutrients in house sparrows (Passer domesticus). Journal of Comparative Physiology B (In press). CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL, WH KARASOV & M PESTCHANKER (2001) Passive absorption of hydrophilic probes by house sparrows, Passer domesticus. Journal of Experimental Biology 204: 723-731 CLANCY B, LJ CAULLER (1999) Widespread projections from subgriseal neurons (layer VII) to layer I in adult rat cortex. Journal of Comparative Neurology 407:275-86. CRANE RK, D MILLER & I BIHLER (1961) En: Membrane transport and metabolism. Kleinzeller A & A Kotyk (eds): 439-449. Academic Press, New York. DAY AJ, FJ CANADA , JC DIAZ, PA KROON, R M CLAUCHLAN, CB FAULDS, GW P LUMB, RA MORGAN & G WILLIAMSON (2000) Dietary flavonoid and isoflavone glycosides are hydrolysed by the lactase site of lactase phlorizin hydrolase. FEBS Letters 468:166170. DIAMOND JM (1991) Evolutionary design of intestinal nutrient absorption: enough but not too much. News in Physiological Science 6:92-96. DIAMOND JM (1993) Evolutionary physiology. En: The logic of life: The challenge of integrative physiology. Boyd CAR & D Noble (eds). Oxford University Press, New York. DIAMOND JM & K HAMMOND (1992) The matches, achieved by natural selection, between biological capacities and their natural loads. Experientia 48: 551-557. FERRARIS RP & JM DIAMOND (1989) Specific regulation of intestinal nutrient transporters by their dietary substrates. Annual Reviews in Physiology 51: 125-141. FRIEDMAN MH (1987) Principles and Models of Biological Transport. Berlin, SpringerVerlag. 1-260. GIBALDI M & D P ERRIER (1982) Pharmacokinetics. New York, Marcel Dekker, Inc. 1-494.

19

GILARDI, JD (1996) Ecology of parrots in the Peruvian Amazon: habitat use, nutrition, and geophagy. Ph.D. Dissertation. Davis: University of California. HE YL, S MURBY, L GIFFORD, A COLLETT, G WARHURST, KT DOUGLAS, M ROWLAND & J AYRTON (1996) Oral absorption of Doligopeptides in rats via the paracellular route. Pharmaceutical Research 113(11):1673-1678. HURNI MA, ARJ NOACH, MCM BLOM-ROOSEMALEN , A DE BOER, JF NAGELKERKE & DD BREIMER (1993) Permeability enhancement in Caco-2 cell monolayers by sodium salicylate and sodium taurodihydrofusid ate: assessment of effect-reversibility and imaging of transepithelial transport routes by confocal laser scanning microscopy. Journal of Pharmacology and Experimental Techniques 267:942-950. KARASOV WH (1988) Nutrient transport across vertebrate intestine. En: Advances in comparative and environmental physiology. Gilles R (ed.): 131-172, Springer-Verlag. Berlin. KARASOV WH (1992) Tests of the adaptive modulation hypothesis for dietary control of intestinal nutrient transport. American Journal of Physiolo gy 263: R496-R502. KARASOV WH (1996) Digestive plasticity in avian energetics and feeding ecology. En: Avian Energetics and Nutritional Ecology. CAREY C (ed) New York, Chapman and Hall. 61-84. KARASOV WH, D AFIK & BW DARKEN (1996) Do northern bobwhite quail modulate intestinal nutrient absorption in response to dietary change? A test of an adaptational hypothesis. Comparative and Biochemical Physiology A 113:233-238. KARASOV WH & SJ CORK (1994) Glucose absorption by a nectarivorous bird: the passive pathway is paramount. American Journal of Physiology 267:G18-G26. KARASOV WH & ID HUME (1997) Vertebrate gastrointestinal system. En: Handbook of Comparative Physiology. DANTZLER W (ed) Bethesda. MD. American Physiological Society. pp 409-480. KELLET GL (2001) The facilitated component of intestinal glucose absorption. Journal of Physiology 531: 585-595. KELLETT G & PA HELLIWELL (2000) The diffusive component of intestinal glucose absorption is mediated by the glucose- induced recruitment of GLUT2 to the brus hborder membrane. Biochemical Journal 350:155-162. LEVEY DJ & ML CIPOLLINI (1996) Is most glucose absorbed passively in northern bobwhite? Comparative and Biochemical Physiology A 113:225-231.

20

LEVEY DJ & WH KARASOV (1992) Digestive modulation in a seasonal frugivore, the American robin (Turdus migratorius ). American Journal of Physiology 262:G711G718. MA TY, D HOLLANDER, RA ERICKSON, H TRUONG, H N GUYEN & P KRUGLIAK (1995) Mechanism of colonic permeation of inulin: Is rat colon more permeable than small intestine? Gastroenterology 108: 12-20. MA TY, D HOLLANDER, R RIGA , & D. BHALLA (1993) Autoradiographic determination of permeation pathway of permeability probes across intestinal and tracheal epithelia. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 122: 590-600. MADARA JL, D BARENBERG & S CARLSON (1986) Effects of cytochalasin D on occluding junctions of intestinal absorptive cells: further evidence that the cytoskeleton may influence paracellular permeability and junctional charge selectivity. Journal of Cell Biology 102: 2125-2136. MADARA JL & JR PAPPENHEIMER (1987) Structural basis for physiological regulation of paracellular pathways in intestinal epithelia. Journal of Membrane Biology 100:149164. MEDDINGS JB & H WESTERGAARD (1989) Intestinal glucose transport using perfused rat jejunum in vivo: Model analysis and derivation of corrected kinetic constants. Clinical Sciences 76: 403-414. PAPPENHEIMER JR (1987) Physological regulation of transepithelial impedance in the intestinal mucosa of rats and hamsters. Journal of Membrane Biology 100:137-148. PAPPENHEIMER JR (1990) Paracellular intestinal absorption of glucose, creatinine, and mannitol in normal animals: Relation to body size. American Journal of Physiology 259:G290-G299. PAPPENHEIMER JR (1993) On the coupling of membrane digestion with intestinal absorption of sugars and amino acids. American Journal of Physiology 265:G409-G417. PAPPENHEIMER JR, CE DAHL, ML KARNOVSKY & JE MAGGIO (1994) Intestinal absorption and excretion of octapeptides composed of D amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States 91: 1942-1945. PAPPENHEIMER JR & KZ REISS (1987) Contribution of solvent drag through intercellular junctions to absorption of nutrients by the small intestine of the rat. Journal of Membrane Biology 100:123-136. 21

PAULETTI GM, FW OKUMU & RT BORCHARDT (1997) Effect of size and charge on the passive diffusion of peptides across Caco2 cell monolayers via the paracellular pathway. Pharmaceutical Research (New York) 14:164-168. RIVIERE JE (1999) Comparative Pharmacokinetics: Principles, Techniques, and Applications. Iowa State University Press. SCHWARTZ RM, JK FURNER & MD LEVITT (1995) Paracellular intestinal transport of sixcarbon sugars is negligible in the rat. Gastroenterology 109:1206-1213. SCHNELL SA, WA STAINES & MW W ESSENDORF (1999) Reduction of lipofuscin- like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 47:719-30. SHARGEL A & BC YU (1999) Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. McGrawHill/Appleton & Lange. TAYLOR CR & ER W EIBEL (1981) Design of the mammalian respiratory system. I. Problem and strategy. Respiration Physiology 44: 1-10. THOMSON ABR, CA HOTKE & WM W EINSTEIN (1982). Comparison of kinetic constants of hexose uptake in four animal species and man. Comparative Biochemistry & Physiology 72A: 225-236. TURNER JR & JL MADARA (1995) Physiological regulation of intestinal epithelial tight junctions as a consequence of Na+-coupled nutrie nt transport. Gastroenterology 109:1391-1396. TURNER JR, BK RILL, SL CARLSON, D CARNES, R K ERNER, RJ MRSNY & JL MADARA (1997) Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation. American Journal of Physiology 273:C1378C1385.

22