BAB V

PEWARNAAN GRAM

5.1 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa mampu melakukan teknik
pewarnaan mikroorganisme dan mengetahui gram positif dan gram negatif

5.2 Tinjauan Pustaka

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya. Metode ini dinamai
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 –1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara bakteri
pneumokokus dan Klebsiella pneumoniae (Aditya, 2010)
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop. Sel
bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali
lebih panjang dari pada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup
dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu
elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam
hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu
bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Atika
et al., 2016)
Pewarnaan Gram atau metode Gram merupakan suatu metode atau teknik
pewarnaan diferensial yang penting untuk membedakan atau mencirikan bakteri.
Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi diberi larutan tertentu yaitu kristal
violet, lugol, alkohol dan safranin. Bakteri yang sudah diberi warna dengan
menggunakan metode pewarnaan ini dapat dibedakan menjadi dua kelompok yaitu
gram positif dan gram negatif. Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram
positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini,
berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara
kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram
negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi
kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif.
 Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan
alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel
meningkat. Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari
keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga
mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu
pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga
kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada bakteri gram posiif. Pori-pori dalam
peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar
kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram psitif
diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya
yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol
gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini
menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat
tertahannya zat pewarna pertama yaitu kristal violet (Idrus & Hayati, 2021)
pewarnaan gram melibatkan penggunaan larutan kristal violet atau metilen biru
sebagai warna primer. Sebutan organisme yang mempertahankan warna primernya
dan tampak ungu kecokelatan di bawah mikroskop adalah organisme Gram-positif.
Organisme yang tidak mengambil pewarnaan primer tampak merah di bawah
mikroskop dan merupakan organisme Gram-negatif (Beveridge, 2001)

5.3 Alat dan Bahan

5.5.1 Alat
1. Mikroskop
2. Jarum ose
3. bunsen
4. Kaca preparat
5. Deck glass
6. Pipet tetes
7. Penjepit kayu
8. Gelas beaker
9. pemantik

5.5.2 Bahan
1. Aquades
2. Minyak imersi
 3. Larutan kristal violet
4. Larutan safranin
5. Larutam lugol ( J2 dalam larutan Ki)
6. Sampel inokulasi air bekas aquarium
7. Sampel inokulasi air bekas cucian piring
8. Sampel inokulasi air bekas cucian ikan
9. alkohol 95%

5.4 Prosedur Kerja

Tabel 5.1 Prosedur Kerja dan Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram
No. Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan

Semua bahan dan

1 Menyiapkan alat dan bahan alat di persiapkan
dipersiapkan

2 Menyalakan bunsen
Bunsen dinyalakan

Ambil satu kaca

preparat dan jepit
Mengambil satu kaca preparat dan
3 dengan penjepit
jepit dengan penjepit kayu
kayu

Kaca preparat di
Memanaskan kaca preparat dekat panaskan dekat
4
bunsen bunsen
No. Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan

Petridish diambil
5 mengambil petridish dari inkubator dari inkubator

Kertas sampul coklat

Membuka kertas sampul coklat pada pada petridish
6
petridish dibuka

Bakteri inokulasi
Mengambil bakteri inokulasi dengan diambil dengan
7 jarum ose dan meletakanya pada kaca jarum ose dan di
preparat diposisi tengah letakan pada kaca
preparat

Larutan kristal violet

Meneteskan larutan kristal violet
diteteskan pada
sebanyak 1 tetes dengan pipet tetes
8 bakteri dan diamkan
diatas bakteri dan diamkan selama 1
selama 1 menit
menit

bakteri dibersihkan
Membersihkan bakteri dari sisa
9 dengan aquades
larutan kristal violet dengan aquades
No. Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan

Ambil 1 tetes larutan

lugol dan diteteskan
Meneteskan 1 tetes larutan lugol
pada bakteri
10 diatas bakteri dengan pipet tetes
kemudian didiamkan
kemudian diamkan selama 1 menit
selama 1 menit

Bakteri dibersihkan
Membersihkan bakteri dari sisa menggunakan
11
larutan lugol menggunakan aquades aquades

Bakteri diteteskan 5
Mengambil alkohol 95% dan tetes alkohol 95%
meneteskannya sebanyak 5 tetes untuk kolonisasi
12
diatas bakteri untuk kolonisasi dan di diamkan
kemudian diamkan selama 1 menit selama 1 menit

Ambil larutan
safranin dan
Mengambil larutan safranin Dan diteteskan sebanyak
meneteskanya sebanyak 1 tetes diatas 1 tetes diatas bakteri
13
bakteri dengan pipet tetes kemudian di kemudian di
diamkan selama 1 menit diamkan selama 1
menit

Bakteri dibersihkan
Membersihkan kembali bakteri dari
14 dengan aquades dan
sisa larutan safranin dengan aquades
No. Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan
Kaca preparat
ditutup dengan deck
menutup kaca preparat dengan
glass dan diletakan
deckglass dan meletakan kaca
15 pada mikroskop
preparat pada mikroskop untuk
untuk dilakukan
dilakukan pengamatan
pengamatan

Mengamati bakteri dengan perbesaran Pengamatan dengan

16 100X perbesaran 100X

Mengamati bakteri dengan perbesaran Pengamatan dengan

17 400X perbesaran 400X

Kaca preparat
Meneteskan 1 tetes minyak imersi
diteteskan minyak
pada kaca preparat sebelum
18 imersi sebanyak 1
pengamatan pada perbesaran 1000X
tetes

Mengamati bakteri dengan perbesaran Pengamatn dengan

19 1000X perbesaran 1000X
No. Prosedur Kerja Pengamatan Keterangan

Dilakukan
pencacatan hasil
Melakukan pencacatan hasil dan pengamatan pada
16 pengamatan praktikum pewarnaan praktikum
gram pewarnaan gram

Sumber: Dokumentasi Pribadi

5.5 Hasil dan Pembahasan

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, mengetahui sifat-sifat fisik dan
kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan menjadi tiga macamya itu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial . Pewarnaan sel bakteri secara Gram merupakan
salah satu prosedur yang penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi
bakteri. Melalui metode ini, bakteri dapat dibedakan menjadi dua kelompok besar,
yaitu bakteri gram positif yang berwarna ungu pada akhir pewarnaan dan bakteri Gram
negative yang berwarna merah pada akhir pewarnaan .karena kemampuan
membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan
ini juga disebut pewarnaan diferensial
Teknik pewarnaan merupakan prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel bakteri atau bagian-bagian sel bakteri. Sedangkan
pengecatan struktural seperti pengecatan endospora, flagella, dan kapsula hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Zat
warna digunakan untuk mewarnai bakteri atau latar belakangnya untuk mempermudah
pengamatan bakteri. Bakteri tidak mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya yang
menyebabkan sulit dilihat dengan mikroskop cahaya. zat warna mengadsorbsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Dengan penerapan teknik pewarnaan sel bakteri ini akan mempermudah penentuan
dan pengamatan mikroba
Tujuan dari pewarnaan bakteri secara umum bertujuan untuk mempermudah
pengamatan morfologi bakteri dengan menggunakan bantuan mikroskop, memperjelas
ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas
dari bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan
sekitarnya.Secara umum bakteri tidak berwarna dan hampir tidak nampak. Pewarnaan
sangat diperlukan untuk dapat melihat bakteri dengan jelas, baik untuk melihat
struktur internal ataupun eksternalnya secara keseluruhan. Pewarnaan Gram adalah
pewarnaan diferensial yang digunakan untuk membedakan antara bakteri dinding sel
tebal (bakteri Gram-positif) dan bakteri dinding sel tipis (bakteri Gram-negatif).
Contoh bakteri Gram positif adalah Staphylococcus aureus dan Streptococcus
pneumoniae. Contoh bakteri Gram-negatif adalah E.coli dan Hemophilus influenzae
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
ungu metil pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
pewarna metil ungu tua setelah dicuci dengan alkohol, sedangkan bakteri gram negatif
tidak. Dalam uji pewarnaan Gram, sebuah counterstain ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif berwarna merah atau merah muda.
Uji ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua jenis bakteri tersebut berdasarkan
perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Bakteri
gram positif akan mempertahankan warna ungu tua setelah dicuci dengan alkohol,
sedangkan bakteri gram negatif tidak. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu selama proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis
ini akan tampak berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi kedua jenis
bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan paling luar, yaitu
lipoposakarida (lipid), dapat tersapu oleh alkohol, sehingga bila diwarnai dengan
safranin akan berubah menjadi merah. Bakteri gram positif memiliki dinding sel
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan crystal violet pori-pori dinding
sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap berwarna
biru. Sel bakteri gram positif dapat tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak berwarna ungu jika waktu dekolorisasi
terlalu singkat
Fungsi alkohol pada pewarnaan gram adalah untuk melunturkan kelebihan zat
warna pada dinding sel bakteri. Sedangkan fungsi larutan kristal violet pada
pewarnaan gram adalah untuk memberi warna primer (utama) pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna ungu. Fungsi dari larutan lugol adalah untuk
melekatkan warna pada dinding sel bakteri sehingga pada saat pencucian
menggunakan alkohol warna pada bakteri tidak mudah untuk luntur. Dan fungsi dari
larutan safronin adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet
5.5.1 Hasil dan pembahasan sampel air bekas aquarium
Langkah pertama dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan
bahan kemudian menyalakan bunsen dan ambil satu kaca preparat denga
penjepit kayu. Lalu panaskan kaca preparat mendekati bunsen dengan
menggunakan penjepit kayu. Setelah itu buka petridish dan ambil bakteri
inokulasi menggunakan jarum ose dan diletakan pada kaca preparat pada posisi
tengah. Kemudian teteskan 1 tetes larutan kristal violet diatas bakteri dengan
pipet tetes dan diamkan selama 1 menit. Kemudian bersihkan sisa larutan
kristal violet pada bakteri menggunakan aquades dan setelah itu ambil 1 tetes
laritan lugol dan teteskan diatas bakteri lalu didiamkan selama 1 menit.
Selanjutnya bersihkan sisa larutan lugol pada bakteri dengan menggunakan
aquades. Lalu ambil 5 tetes alkohol 95% dan teteskan bakteri untuk tujuan
kolonisasi dan tambahkan juga 1 tetes larutan safranin pada bakteri .
Selanjutnya bakteri di bersihkan kembali menggunakan aquades dan ditutup
dengan deckglass. Selanjutnya kaca preparat diletakan pada mikroskop untuk
dilakukan pengamatan dengan perbesaran 100X,perbesaran 400X,dan
perbesaran 1000X. Sebelum melakukan pada perbesaran 1000X kaca preparat
diteteskan 1 tetes minyak imersi tujuanya untuk dapat membantu memperjelas
objek yang diamati.Lalu dilakukan pencatatan hasil pengamatan pada
prakrtikum pewarnaan gram. Pada kaca preparat sampel (air bekas aquarium)
dengan perbesaran 100X ditemukan bakteri berbentuk (irrengular) kemudian
pada perbesaran 400X ditemukan bakteri berbentuk panjang dan bercabang
(irrengular) selanjutnya pada perbesaran 1000X diteteskan minyak imersi
tujuanya untuk membantu memperjelas objek yang akan diamati. Kemudian
 pada perbesaran 1000X ditemukan bakteri berbentuk irrengular dan bewarna
ungu. Hasil sampel pada air bekas aquarium ini adalah termasuk jenis bakteri
gram positif (bewarna ungu)
5.5.2 Hasil dan pembahasan sampel air bekas cucian piring
Langkah pertama dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan
bahan kemudian menyalakan bunsen dan ambil satu kaca preparat denga
penjepit kayu. Lalu panaskan kaca preparat mendekati bunsen dengan
menggunakan penjepit kayu. Setelah itu buka petridish dan ambil bakteri
inokulasi menggunakan jarum ose dan diletakan pada kaca preparat pada posisi
tengah. Kemudian teteskan 1 tetes larutan kristal violet diatas bakteri dengan
pipet tetes dan diamkan selama 1 menit. Kemudian bersihkan sisa larutan
kristal violet pada bakteri menggunakan aquades dan setelah itu ambil 1 tetes
laritan lugol dan teteskan diatas bakteri lalu didiamkan selama 1 menit.
Selanjutnya bersihkan sisa larutan lugol pada bakteri dengan menggunakan
aquades. Lalu ambil 5 tetes alkohol 95% dan teteskan bakteri untuk tujuan
kolonisasi dan tambahkan juga 1 tetes larutan safranin pada bakteri.
Selanjutnya bakteri di bersihkan kembali menggunakan aquades dan ditutup
dengan deckglass. Selanjutnya kaca preparat diletakan pada mikroskop untuk
dilakukan pengamatan dengan perbesaran 100X,perbesaran 400X,dan
perbesaran 1000X. Sebelum melakukan pada perbesaran 1000X kaca preparat
diteteskan 1 tetes minyak imersi tujuanya untuk dapat membantu memperjelas
objek yang diamati.Lalu dilakukan pencatatan hasil pengamatan pada
prakrtikum pewarnaan gram. Pada kaca preparat sampel (air bekas cucian
piring) dengan perbesaran 100X ditemukan bakteri berbentuk bintik bintik
(punciform) dan bewarna merah muda kemudian pada perbesaran 400X
ditemukan bakteri berbentuk spindel dan bewarna merah muda selanjutnya
pada perbesaran 1000X diteteskan minyak imersi tujuanya untuk membantu
memperjelas objek yang akan diamati. Kemudian pada perbesaran 1000X
ditemukan bakteri berbentuk spindel dan bewarna merah muda. Hasil sampel
pada air bekas cucian piring ini adalah termasuk jenis bakteri gram negatif
(bewarna merah muda)
5.5.3 Hasil dan pembahasan sampel air bekas cucian ikan
Langkah pertama dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan
bahan kemudian menyalakan bunsen dan ambil satu kaca preparat denga
penjepit kayu. Lalu panaskan kaca preparat mendekati bunsen dengan
 menggunakan penjepit kayu. Setelah itu buka petridish dan ambil bakteri
inokulasi menggunakan jarum ose dan diletakan pada kaca preparat pada posisi
tengah. Kemudian teteskan 1 tetes larutan kristal violet diatas bakteri dengan
pipet tetes dan diamkan selama 1 menit. Kemudian bersihkan sisa larutan
kristal violet pada bakteri menggunakan aquades dan setelah itu ambil 1 tetes
laritan lugol dan teteskan diatas bakteri lalu didiamkan selama 1 menit.
Selanjutnya bersihkan sisa larutan lugol pada bakteri dengan menggunakan
aquades. Lalu ambil 5 tetes alkohol 95% dan teteskan bakteri untuk tujuan
kolonisasi dan tambahkan juga 1 tetes larutan safranin pada bakteri.
Selanjutnya bakteri di bersihkan kembali menggunakan aquades dan ditutup
dengan deckglass. Selanjutnya kaca preparat diletakan pada mikroskop untuk
dilakukan pengamatan dengan perbesaran 100X,perbesaran 400X,dan
perbesaran 1000X. Sebelum melakukan pada perbesaran 1000X kaca preparat
diteteskan 1 tetes minyak imersi tujuanya untuk dapat membantu memperjelas
objek yang diamati.Lalu dilakukan pencatatan hasil pengamatan pada
prakrtikum pewarnaan gramPada kaca preparat sampel (air bekas cucian
ikan) dengan perbesaran 100X ditemukan bakteri spindel dan bewarna ungu
kemudian pada perbesaran 400X ditemukan bakteri berbentuk spindel dan
bewarna ungu selanjutnya pada perbesaran 1000X diteteskan minyak imersi
tujuanya untuk membantu memperjelas objek yang akan diamati. Kemudian
pada perbesaran 1000X ditemukan bakteri berbentuk spindel dan bewarna
ungu. Dan Hasil sampel pada air bekas cucian ikan ini adalah termasuk jenis
bakteri gram positif (bewarna ungu)

5.6 Kesimpulan
 Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya.
 Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan bakteri gram negatif dan
gram posistif
 Bakteri gram positif adalah bakteri yang menyerap warna primer (utama) dan
berndinding sel tebal
 bakteri gram negatif adalah bakteri yang menyerap warna sekunder (sofranasi)
dan berdinding sel tipis
  pada sampel (air bekas aquarium) ditemukan bakteri berbentuk irrengular
(berbentuk tidak rata) , bewarna ungu dan termasuk jenis bakteri gram positif.
 pada sampel (air bekas cucian piring) ditemukan bakteri berbentuk spindel
(berbentuk cerutu) , bewarna merah muda dan termasuk jenis bakteri gram
negatif.
 pada sampel (air bekas cucian ikan) ditemukan bakteri berbentuk spindel
(berbentuk cerutu) , bewarna ungu dan termasuk jenis bakteri gram positif.

5.7 Daftar Pustaka

Aditya, M. (2010). laporan teknik pewarnaan bakteri (p. 5).
Atika, A. R., Arasy, D. N., Mala, F., Cahyo, F. T. fajar, & Dewi, F. M. (2016).
Pewarnaan Bakteri Secara Gram.
Idrus, muhammad yunus sulthan azhar, & Hayati, D. T. (2021). jurnal
praktikum mikrobiologi kehutanan.
Beveridge, T. J. (2001). the Gram stain in microbiology. Biotechnic and
Histochemistry, 76(3)