Nasopharyngeal Brushing: Metode Pengambilan Sampel yang Nyaman dan

Layak untuk Penelitian Karsinoma Nasofaring Berbasis Asam Nukleat

Ilfa Heldiana, Betty

Abstrak
Latar belakang: Spesimen jaringan untuk penelitian karsinoma nasofaring (KNF)
langka karena kesulitan pengambilan sampel. Studi sebelumnya telah menyarankan
penyikatan nasofaring non-invasif sebagai metode pengambilan sampel yang efektif
untuk diagnosis KNF. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kelayakan
penyikatan nasofaring dalam perolehan asam nukleat KNF untuk penelitian.
Metode: Sampel sikat nasofaring diperoleh dari 24 individu sehat dan 48 pasien
KNF. Jaringan dari 48 KNF dan 18 pasien nasofaringitis dikumpulkan dengan biopsi
endoskopi. Tingkat ekspresi tumor suppressing gene (TSG) dan Epstein-Barr virus
(EBV) yang dikodekan mikroRNA serta nomor salinan DNA EBV diukur dengan
reaksi berantai polimerase kuantitatif pada kedua jenis sampel.
Hasil: Di antara enam TSG yang diperiksa, tingkat ekspresi dari dua gen secara
signifikan menurun pada penyikatan nasofaring dan sampel jaringan dari pasien KNF
dibandingkan dengan individu sehat/nasofaringitis. Empat mikroRNA yang
disandikan EBV, mir‐bart1‐5p, mir‐bart5, mir‐bart6‐5p, dan mir‐bart17‐5p, secara
signifikan diregulasi pada penyikatan KNF dan sampel jaringan dibandingkan dengan
yang berasal dari kontrol sehat/ nasofaringitis (P<0,001). DNA EBV meningkat
secara signifikan pada kedua sampel penyikatan nasofaring (P<0,001) dan sampel
jaringan (P<0,001) dari pasien KNF dibandingkan dengan kontrol sehat.
Kesimpulan: Menyikat nasofaring dapat memperoleh bahan tumor yang cukup untuk
analisis asam nukleat virus, termasuk mikroRNA yang dikodekan EBV dan DNA
EBV. Untuk deteksi ekspresi TSG, penyikatan nasofaring dapat dilakukan tetapi lebih
rendah dari sampel jaringan. Studi ini menegaskan menyikat nasofaring sebagai
metode pengambilan sampel yang dapat diterapkan yang dapat membantu dalam
penelitian KNF berbasis asam nukleat.
Kata kunci: Menyikat nasofaring, Sampel jaringan, Karsinoma nasofaring, Asam
nukleat, Penelitian kanker.

Latar Belakang

Karsinoma nasofaring (KNF) sangat lazim di Cina Selatan, dimana 20 – 50

per 100.000 orang berisiko mengalami KNF [1–4]. Menurut kriteria Organisasi
Kesehatan Dunia, KNF diklasifikasikan menjadi tiga jenis histologis, diantaranya
undifferentiated carcinoma adalah jenis yang paling umum di Cina Selatan dan
sangat terkait dengan infeksi Epstein-Barr virus (EBV) [5,6]. Hubungan etiologi yang
kuat antara infeksi EBV dan KNF dapat dengan jelas direfleksikan oleh viral load
DNA yang abnormal dan deregulasi ekspresi gen EBV dalam sel tumor.[7– 10].
Urutan genom EBV multipel ulangan, BamHI-W, telah banyak digunakan untuk
deteksi KNF dengan sensitivitas tinggi [6,8]. MikroRNA BamHI-A rightward
transcript (BART) yang dikodekan EBV telah ditemukan dengan ekspresi yang
sangat tinggi pada pasien KNF dan terkait erat dengan perkembangan KNF [7,9].
Studi sebelumnya juga melaporkan mRNA yang dikodekan EBV dikombinasikan
dengan beban DNA EBV sebagai biomarker yang berguna untuk diagnosis KNF [11].
Selain itu, perkembangan KNF juga dapat dikaitkan dengan faktor epigenetik.
Promotor hipermetilasi tumor suppressor genes (TSGs) yang divalidasi dengan benar
telah semakin terlibat sebagai indikator awal dalam karsinogenesis KNF [12,13].
Oleh karena itu, penyelidikan asam nukleat terkait virus dan tumor untuk skrining dan
diagnosis KNF telah menjadi topik utama dalam penelitian kanker.
Meskipun insiden KNF tinggi, sumber daya jaringan untuk penelitian KNF
tidak cukup. Tidak seperti banyak karsinoma lainnya, lesi KNF cukup kecil dan
jarang memerlukan pembedahan. Saat ini, metode pengambilan sampel jaringan yang
paling dapat diandalkan adalah biopsi endoskopi pada lokasi tumor yang dicurigai.
Namun, sampel biopsi kecil biasanya diterapkan untuk pemeriksaan histopatologi
berdasarkan prioritas dan jarang ditinggalkan untuk tujuan ilmiah setelah diagnosis.
[14, 15]. Selain itu, sampel jaringan dari individu sehat tidak tersedia karena invasif.
Cairan tubuh seperti darah dan urin tidak secara langsung berkontak dengan tempat
neoplastik dan karena itu mungkin tidak cukup spesifik untuk deteksi KNF [16,17].
Pada sebagian besar situasi klinis, hanya sejumlah kecil sel kanker yang terdapat
dalam cairan tubuh. Oleh karena itu, diperlukan metode yang lebih sensitif dan
spesifik untuk mendukung sepenuhnya penelitian KNF [18].
Penyikatan nasofaring, yang dikenal sebagai metode pengambilan sampel
jaringan non-invasif dan nyaman, bersentuhan langsung dengan situs neoplastik dan
dapat memperoleh epitel eksfoliatif atau sel tumor seperti yang ditunjukkan
sebelumnya [10,19]. Ini telah diterapkan pada skrining EBV skala besar dan
diagnosis KNF pada tingkat asam nukleat terkait EBV, termasuk DNA, mRNA, dan
mikroRNA, pada populasi berisiko tinggi [9,13,17,19–22]. Spesifisitas dan
sensitivitas biomarker terkait EBV pada sikat nasofaring cukup tinggi [8,9,11,22].
Pendekatan alternatif untuk mendeteksi hipermetilasi promotor gen tumor pada sikat
nasofaring telah diverifikasi untuk deteksi dini KNF, dengan sensitivitas dan
spesifisitas yang lebih tinggi daripada mendeteksi penanda DNA EBV dalam plasma
[13,21,23,24]. Penggunaan cytology brush untuk deteksi KNF juga telah dievaluasi,
meskipun pengambilan sitologi lebih rendah daripada yang diperoleh dengan biopsi
[25, 26]. Pengamatan ini menunjukkan kemungkinan kuat penyikatan nasofaring
dalam memperoleh sel tumor dan asam nukleat virus yang cukup untuk analisis KNF.
Untuk menetapkan metode penyikatan nasofaring invasif rendah untuk
penggunaan yang kuat dalam penelitian KNF translasi, kami melakukan penyelidikan
sistematis terhadap gen terkait tumor dan asam nukleat virus pada sampel penyikatan
nasofaring dan sampel jaringan. Ekspresi enam TSG KNF terkenal dan empat
mikroRNA EBV serta nomor salinan EBV BamHI-W dievaluasi dalam penelitian ini.
Metode
Koleksi sampel penyikatan
Sampel penyikatan nasofaring yang dikumpulkan dari 48 pasien NPC dan 24
orang sehat di Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC) antara 19 April
2013 dan 03 Agustus 2015 digunakan untuk analisis TSG. 20 pasang sampel sikat
nasofaring lainnya dari pasien NPC dan peserta sehat dikumpulkan selama periode
yang sama untuk analisis EBV DNA dan mikro-RNA. Di bawah panduan endoskopi
oleh dokter berpengalaman, sikat nasofaring (Copan Diagnostics, Murrieta, CA,
USA) dimasukkan ke dalam rongga nasofaring dan diputar beberapa kali di atas epitel
nasofaring di lokasi fokus yang dicurigai. Segera setelah pengambilan sampel, ujung
kuas (1,5 cm) dipotong dan ditempatkan dalam 1 mL larutan RNAlater (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) dan disimpan pada suhu -80 °C hingga digunakan. Semua
sampel penyikatan disimpan di Tumor Resource Bank SYSUCC dan disetujui oleh
Komite Etika Manusia SYSUCC. Semua peserta memberikan informed consent.

Pengumpulan sampel jaringan

Sampel jaringan nasofaring dikumpulkan dari 66 peserta yang diduga NPC di
klinik kepala dan leher di SYSUCC antara 05 Januari 2009 dan 03 Maret 2010. Di
antara peserta, 18 akhirnya didiagnosis dengan nasofaringitis kronis, dan 48
menunjukkan NPC biopsi-positif. Endoskopi perlahan-lahan ditarik ke nasofaring
pasien, dan gambar diambil di lokasi lesi yang mencurigakan. Jaringan dikumpulkan
dan diberi perlakuan awal dengan 1 mL RNAlater (Invitrogen), kemudian
dikeringkan dan disimpan pada suhu -80 °C. Semua sampel disimpan di Tumor
Resource Bank of SYSUCC. Komite Etika Manusia SYSUCC menyetujui penelitian
ini. Semua peserta memberikan informed consent.

Brush cytology
Sampel penyikatan nasofaring dioleskan ke slide patologis, difiksasi dalam
formalin 10%, dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin (HE) atau mengalami
hibridisasi in situ (ISH) untuk RNA kecil yang dikodekan EBV (EBER). Apusan
diamati menggunakan upright microscope (Nikon; NI-SS, 933394, Chiyoda-Ku,
Tokyo, Jepang).

Eksperimen histo-morfologi
Jaringan difiksasi dalam formalin 10%, disematkan dalam parafin, diiris
menjadi irisan 3–4 μm, dan diwarnai dengan HE atau dikenai ISH untuk EBER.
Bagian diamati menggunakan mikroskop tegak (Nikon).

Hibridisasi EBER 1/2 RNA

Kehadiran EBV dalam sel tumor dinilai oleh ISH menggunakan kit EBER
ISH (ZSGB Bio-tech Co Ltd., Beijing, China). ISH dilakukan sesuai dengan instruksi
pabriknya.

Ekstraksi RNA dan analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) dari
ekspresi RNA
Total RNA diekstraksi dari penyikatan nasofaring dan sampel jaringan
menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen) mengikuti instruksi pabriknya. Untuk
pemeriksaan mikro-RNA, total 350 ng RNA dari setiap sampel sikat nasofaring atau
100 ng dari setiap sampel jaringan digunakan untuk transkripsi terbalik dengan Kit
Transkripsi Terbalik TaqMan (MicroRNA) (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) menurut dengan protokol pabrikan. Reaksi transkripsi balik (volume/ sampel 20
μL) dilakukan dengan primer batang-loop khusus (Biosistem Terapan) khusus untuk
urutan matur yang sesuai yang diperoleh dari miRBase (http://www.miRBase.org,
File tambahan1: Tabel S1). RNA nuklir kecil U6 (RNU6B) digunakan sebagai
kontrol endogen. Empat mikroRNA EBV, mir-bart1-5p, mir- bart5, mir-bart6-5p, dan
mir-bart17-5p, digunakan sebagai target. Tingkat ekspresi relatif dari mikroRNA
target dihitung setelah dinormalisasi ke RNU6B. Semua primer disintesis oleh Life
Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA).
 Untuk memeriksa ekspresi 6 TSG, faktor pengikat I domain regulasi positif 1
dan protein yang mengandung retinoblastoma protein-interacting zinc-finger gene
domain-containing protein 5 (PRDM5), calcium channel regulatory subunit α2δ3
(CACNA2D3), retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene 1 (RIZ1),
checkpoint with forkhead and ring finger domains (CHFR), WNT inhibitory factor 1
(WIF1), dan Ras association domain family 1A (RAS-FF1A), 500 ng dari total RNA
ditranskripsi terbalik menjadi cDNA dan diamplifikasi menggunakan SYBR Green
Master Mix (Bio- Rad, Hercules, CA, USA) mengikuti protokol pabrikan. Desain
primer dilakukan dengan Primer BLAST. Urutan primer dirangkum dalam Tabel1.
qPCR dilakukan pada Sistem PCR Real-Time CFX96 (Bio-Rad). Tingkat ekspresi
relatif TSG dihitung setelah normalisasi ke gen referensi, protein ribosom S13
(RPS13).
Tabel 1. Primer dan sekuens probe yang digunakan pada qPCR untuk
deteksi TSGs dan EBV BamHI-W.

qPCR quantitative polymerase chain reaction, EBV Epstein–Barr virus, CACNA2D3

calcium channel regulatory subunit α2δ3, PRDM5 positive regulatory domain I-
binding factor 1 and retinoblastoma protein-interacting zinc-finger gene domain-
containing protein 5, WIF1 WNT inhibitory factor 1, RIZ1 retinoblastoma protein-
interacting zinc finger gene 1, CHFR checkpoint with forkhead and ring finger
domains, RASFF1A Ras association domain family 1A, RPS13 ribosomal protein S13
 Ekstraksi DNA dan analisis qPCR nomor salinan DNA EBV Total DNA dari
penyikatan nasofaring dan sampel jaringan diekstraksi menggunakan workstation
otomatis (Chemagic Star; Hamilton Robotic, Bonaduz, GR, Swiss) mengikuti
protokol pabrikan. Konsentrasi DNA dikuantifikasi menggunakan NanoDrop 1000
Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Waltham, MA, USA). qPCR dilakukan
berdasarkan sistem PCR fluorogenik yang sebelumnya matang [27]. Di dalam sistem,
primer amplifikasi yang menargetkan wilayah BamHI-W genom DNA EBV dan
probe hibridisasi berlabel ganda dimasukkan. Urutannya ditunjukkan pada Tabel1.
Tangga standar, yang berisi wilayah BamHI-W genom EBV (102,103, 104, 105, 106,
dan 107 salinan / 2 μL) digunakan untuk mendapatkan kurva standar. Setiap PCR
diatur dalam volume reaksi 8 μL, termasuk 4 μL master mix PCR, 1 μL primer, 0,2
μL probe, 0,8 μL air, dan 2 μL DNA template. Siklus termal dimulai dengan langkah
denaturasi 5 menit pada 95°C, dan kemudian 45 siklus 95°C selama 15 detik, 60 °C
selama 30 detik, dan 72°C selama 15 detik dilakukan. Tingkat DNA EBV dalam
penyikatan dan sampel jaringan dinyatakan sebagai salinan / ng DNA.

Analisis statistik
Metode 2−∆Ct digunakan untuk menghitung ekspresi gen target relatif
terhadap gen referensi yang sesuai. Signifikansi statistik ditentukan dengan
menggunakan uji Mann-Whitney U dua sisi yang tidak berpasangan atau uji t Student.
P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Lipatan perubahan level ekspresi
dihitung menggunakan rumus 2−(∆CT[kasus]−∆CT[kontrol]). Analisis statistik
dilakukan dengan menggunakan GraphPadPrism5.0 (perangkat lunak GraphPad,
Inc., La Jolla, CA, USA) dan perangkat lunak Excel (Microsoft Corporation,
Redmond, Washington DC, USA).
Hasil
Pengamatan histologis dan sitologis potongan jaringan dan apusan sikat
Bagian jaringan dari pasien nasofaringitis menunjukkan epitel inflamasi yang
diinfiltrasi dengan sejumlah besar limfosit (Gbr. 1).1a), sedangkan bagian jaringan
nasofaring dari pasien NPC menunjukkan sarang tumor yang jelas, dikelilingi oleh
infiltrasi limfosit (Gambar.1B). Pada apusan sikat, mukosa nasofaring normal dari
partisipan sehat menunjukkan sel kolumnar yang khas, sel skuamosa, dan sel limfoid
(Gbr. 1).1c), sedangkan pada mukosa nasofaring dari pasien NPC, diamati sejumlah
besar sel tumor eksfoliatif bercampur dengan beberapa sel epitel normal dan limfosit.
(Gbr. 1D). Hasil ini menunjukkan bahwa penyikatan nasofaring memang dapat
menjadi konstituen sitologi untuk pemeriksaan dan memastikan bahwa sampel
jaringan dan penyikatan yang dikumpulkan memenuhi syarat untuk studi lebih lanjut.

Gambar 1. Pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) pada bagian jaringan nasofaring dan

apusan sikat (40×). A. Jaringan nasofaring dari pasien nasofaring menunjukkan
radang epitel nasofaring yang diinfiltrasi dengan banyak limfosit. B. Jaringan poorly
differentiated nasopharyngeal (NPC) menunjukkan sarang tumor yang dikelilingi
oleh limfosit. C. Sampel smear dari partisipan yang sehat menunjukkan mukosa
nasofaring normal, terdiri dari sel kolumnar, sel skuamosa, dan sel limfoid. D.
Sampel apusan sikat dari pasien NPC menunjukkan sel-sel NPC yang khas dengan
inti besar, rasio nuklir/sitoplasma yang tinggi, dan nukleolus yang menonjol. Tanda
panah menunjukkan sel tumor.

Tingkat ekspresi TSG dalam penyikatan nasofaring dan sampel jaringan

Di antara enam TSG yang diperiksa, tingkat ekspresi relatif CHFR, RIZ1,
dan CACNA2D3 dalam sampel jaringan menurun secara signifikan pada pasien NPC
dibandingkan dengan pasien nasofaringitis (semua P<0,05; Gbr. 2a–c). Namun, tidak
ada perbedaan yang signifikan dalam level ekspresi PRDM5, WIF1, dan RAS-FF1A
antara kedua kelompok ini (data tidak ditampilkan). Dalam sampel penyikatan
nasofaring dari 48 pasien NPC (Tabel 2), tingkat ekspresi CHFR dan RIZ1
diturunkan secara signifikan dibandingkan dengan sampel dari kontrol sehat
(keduanya P<0,05; Gbr. 2d, e). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati dalam
ekspresi CACNA2D3 (Gambar. 2f), PRDM5, WIF1, atau RASFF1A (data tidak
ditampilkan). Lipatan berubah dari CHFR, RIZ1, dan Ekspresi CACNA2D3 masing-
masing adalah 0,18, 0,21, dan 0,40 pada sampel jaringan dan 0,42, 0,63, dan 0,69
pada sampel penyikatan. Hasil ini menunjukkan bahwa penyikatan nasofaring dapat
diterapkan tetapi lebih rendah daripada sampel jaringan untuk deteksi TSG.

Gambar 2. Tingkat ekspresi tumor suppressor genes calcium channel

regulatory subunit α2δ3 (CACNA2D3), retinoblastoma protein‐interacting zinc
finger gene 1 (RIZ1), dan checkpoint with forkhead and ring finger domains (CHFR)
dalam penyikatan nasofaring dan sampel jaringan. Level ekspresi relatif CACNA2D3
(A,D), CHFR (B,e), dan RIZ1 (C,F) pada penyikatan nasofaring dan sampel jaringan
dari kontrol sehat, pasien nasofaringitis, dan pasien NPC diukur dengan reaksi
berantai polimerase kuantitatif waktu nyata. Data dianalisis dengan Mann-Whitney U
test. SD standar deviasi. *P<0,05, ** P<0,01, ***P<0,001

Deteksi ISH terhadap EBER di bagian jaringan dan sapuan kuas

Untuk mengkonfirmasi keberadaan EBV pada sampel penyikatan dan
jaringan, kami melakukan deteksi ISH terhadap EBER 1/2. Bagian jaringan dari
pasien nasofaringitis menunjukkan sedikit sinyal EBER 1/2 (Gambar. 3a), sementara
pada irisan jaringan dari pasien NPC, diamati sinyal EBER 1/2 yang kuat yang
terlokalisasi dalam inti tumor (Gbr. 1).3B). Demikian pula, apusan sikat nasofaring
dari orang sehat tidak menunjukkan sinyal EBER seperti yang diharapkan (Gambar.3
C). Namun, pada brushing smear dari pasien NPC, ditemukan sinyal tinggi lokalisasi
nuklir EBER 1/2 di dalam sel tumor (Gbr. 1).3D). Hasil ini memverifikasi
keberadaan EBV baik di jaringan nasofaring dan penyikatan sampel, dan
dikonfirmasi bahwa sampel memenuhi syarat untuk studi asam nukleat terkait EBV
berikutnya.
Tabel 2. Stadium tumor pasien KNF yang dilakukan penyikatan
nasofaring
 Informasi stadium patologis dievaluasi oleh dokter klinis berdasarkan hasil
komprehensif magnetic resonance imaging (MRI), pemeriksaan histopatologis, dan
gejala klinis. Beberapa pasien didiagnosis dengan biopsi dengan NPC di pusat kanker
kami tetapi kemudian dipindahkan ke rumah sakit lain untuk diagnosis dan perawatan
lebih lanjut. Untuk pasien ini, hasil seperti MRI tidak dikumpulkan, sementara hanya
informasi histopatologis yang diperoleh. Informasi stadium dari 17 pasien hilang
dalam penelitian ini
NPC nasopharyngeal carcinoma
Gambar 3. Hibridisasi in situ RNA kecil yang dikodekan EBV (EBER) di bagian
jaringan nasofaring dan apusan sikat (40×). A. Jaringan nasofaring dari pasien
nasofaringitis tidak menunjukkan ekspresi EBER. B. Potongan jaringan nasofaring
dari pasien NPC menunjukkan sinyal kuat lokalisasi nuklir EBER di dalam sel tumor.
C. Sampel apusan sikat dari peserta yang sehat tidak menunjukkan sinyal EBER. D.
Sampel apusan sikat dari pasien NPC menunjukkan ekspresi EBER yang tinggi
dalam sel tumor.
Tingkat ekspresi mikroRNA yang disandikan EBV pada penyikatan nasofaring
dan sampel jaringan
Tingkat ekspresi mir-bart1-5p, mir-bart5, mir-bart6-5p, dan mir-bart17-5p
secara signifikan diatur dalam jaringan NPC dibandingkan dengan yang ada di
kontrol nasofaringitis (semua P<0,001; Gbr. 4a – d), di antaranya mir-bart1-5p adalah
yang paling jelas diatur. Dalam sampel penyikatan nasofaring, tingkat ekspresi
keempat mikroRNA juga diatur secara signifikan pada pasien NPC dibandingkan
dengan mereka yang berada di kontrol sehat (semua P<0,001; Gbr. 4e–h). Hasil ini
menunjukkan bahwa mikroRNA yang dikodekan EBV dapat diperoleh dan dideteksi
dalam sampel sikat nasofaring.

Gambar 4. Tingkat ekspresi dari empat mikroRNA yang dikodekan virus Epstein-
Barr (EBV) dalam penyikatan nasofaring dan sampel jaringan. Level ekspresi mir‐
bart1‐5p (A), mir‐bart5 (B), mir‐bart6‐5p (C), dan mir‐bart17‐5p (D) dalam sampel
jaringan nasofaring dari nasofaringitis dan pasien NPC serta tingkat ekspresi mir‐
bart1‐5p (e), mir‐bart5 (F), mir‐bart6‐5p (G), dan mir‐bart17‐5p (H) dalam sampel
sikat nasofaring dari kontrol sehat dan pasien NPC diukur dengan qPCR. Data
dianalisis dengan Student's T test. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,00.
Nomor salinan EBV BamHI‐W dalam penyikatan nasofaring dan sampel
jaringan
Untuk memeriksa kelayakan penggunaan sampel sikat nasofaring untuk
mendeteksi DNA EBV, kami menguji jumlah salinan EBV BamHI-W pada sampel
jaringan dan sikat. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.5, BamHI-W adalah
hampir tidak terdeteksi dalam sampel sikat dari kontrol yang sehat, dengan rata-rata
5,1 salinan/ng DNA, kecuali untuk peserta laki-laki sehat berusia 43 tahun dengan
viral capsid antibody positif (VCA-IgA). Sampel sikatnya mengandung 69,7
salinan/ng DNA. Dalam sampel sikat gigi, BamHI-W dapat dideteksi pada semua
pasien NPC, dengan jumlah salinan rata-rata 6221,1 salinan/ng DNA, yang secara
signifikan lebih tinggi daripada kontrol sehat (P<0,001). Jaringan dari pasien NPC
menghasilkan jumlah salinan rata-rata 4087,0 salinan/ng DNA, yang secara signifikan
lebih tinggi daripada sampel sikat dari kontrol yang sehat (P<0,001). Meskipun rata-
rata jumlah salinan BamHI-W dalam sampel jaringan lebih rendah daripada sampel
penyikatan dari pasien NPC, perbedaannya tidak signifikan. Hasil ini menegaskan
bahwa komponen DNA EBV dalam sampel penyikatan nasofaring konsisten dengan
yang ada dalam sampel jaringan dan bahwa penyikatan nasofaring dapat berfungsi
sebagai metode pengambilan sampel non-invasif yang menjanjikan dalam penentuan
NPC terkait DNA EBV.

Gambar 5. Salin nomor BamHI‐W yang dikodekan EBV dalam penyikatan

nasofaring dan sampel jaringan. Nomor salinan (salinan/ng DNA) BamHI-W yang
dikodekan EBV pada penyikatan nasofaring dan sampel jaringan dari kontrol sehat
dan pasien NPC diukur dengan qPCR. Data dianalisis dengan Student's T-test.
***P<0,001 tidak ada signifikansi

Diskusi
Dalam penelitian ini, mikroRNA yang disandikan EBV (mirbart1-5p, mir-
bart5, mir-bart6-5p, dan mir-bart17-5p) dan EBV BamHI-W mudah dideteksi pada
penyikatan nasofaring dan sampel jaringan dari pasien NPC. Untuk deteksi CHFR,
RIZ1, dan CAC-NA2D3, sampel penyikatan dapat diterapkan tetapi lebih rendah
daripada sampel jaringan. Penelitian ini memberikan bukti kuat bahwa menyikat
nasofaring non-invasif dapat diterapkan untuk mendukung penelitian NPC berbasis
asam nukleat.
Dengan keunggulan kemudahan dalam penanganan, non-invasif, penerimaan
yang mudah oleh pasien, biaya rendah, dan pengulangan dibandingkan biopsi
jaringan nasendoskopik, penyikatan nasofaring telah menarik perhatian yang
meningkat selama lebih dari satu dekade. Banyak penelitian telah mengungkapkan
bahwa sampel menyikat nasofaring tersedia untuk deteksi DNA EBV, microRNA,
dan mRNA pada pasien yang diduga NPC [8,9,11,21,28]. Sesuai dengan pengamatan
ini, hasil EBER ISH dalam penelitian ini menunjukkan pensinyalan EBER yang
tinggi pada apusan sikat dan bagian jaringan dari pasien NPC, sementara tidak ada
pensinyalan dari kontrol yang sehat dan nasofaringitis yang diamati (Gbr. 1).3).
Selain itu, kami mengamati peningkatan yang signifikan dari level mikroRNA EBV
dan nomor salinan DNA EBV dalam sampel sikat dari pasien NPC (Gambar.4,5).
Kelimpahan mikroRNA dalam sampel sikat nasofaring lebih rendah
daripada sampel jaringan nasofaring, yang mungkin disebabkan oleh pengambilan
sampel yang tidak mencukupi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.1, apusan sikat
mengandung lebih sedikit sel tumor daripada bagian jaringan. Hasil ini didukung oleh
studi sitologi penyikatan sebelumnya [25,26]. Anti-virus capsid antigen (VCA)-IgA-
positif pada orang sehat tidak menunjukkan tingkat mikroRNA berkode EBV yang
menyimpang dalam sampel penyikatan (data tidak ditampilkan), menunjukkan
mikroRNA berkode EBV sebagai biomarker spesifik untuk deteksi NPC.
Kami dan peneliti lain [11,21,28] juga mendeteksi DNA EBV dalam sampel
sikat nasofaring dari peserta yang sehat. Hasil ini memverifikasi bahwa limfosit B
yang terinfeksi EBV memiliki preferensi homing untuk wilayah nasofaring (cincin
Waldeyer) dan bahwa virus ditumpahkan ke dalam ruang orofaring [29,30].
Sebaliknya, beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan tidak adanya sama sekali
DNA EBV dalam sampel sikat nasofaring yang disumbangkan oleh pembawa EBV
yang sehat [20,21,31], yang kemungkinan karena pengambilan sampel nasofaring
yang tidak memadai atau uji qPCR yang tidak sensitif pada kontrol yang sehat. Studi
telah melaporkan bahwa hipermetilasi TSG dapat dideteksi pada sampel sikat
nasofaring dan menyarankan peran potensial penyikatan nasofaring dalam diagnosis
dini NPC [13,21,23,32]. Berbeda dari PCR khusus metilasi kualitatif yang dilakukan
dalam studi tersebut, kami melakukan qPCR untuk memverifikasi ekspresi diferensial
TSG. Di antara enam TSG terpilih, CHFR, RIZ1, dan CACNA2D3 secara signifikan
ditekan pada pasien NPC, menunjukkan bahwa qPCR dapat diterapkan untuk
skrining tambahan untuk potensi TSG. Untuk tiga TSG lainnya, tidak ada signifikansi
yang diamati antara NPC dan kontrol sehat/nasofaringitis, yang mungkin disebabkan
oleh status metilasi yang berbeda, karena penelitian sebelumnya telah melaporkan
bahwa frekuensi metilasi promotor dari masing-masing TSG bervariasi pada pasien
NPC [12,13].
Kecenderungan ekspresi TSG pada sampel penyikatan sesuai dengan yang
ada pada jaringan nasofaring. Dua TSG yang sangat tertekan dalam sampel jaringan,
CHFR dan RIZ1, secara signifikan ditekan dalam sampel penyikatan nasofaring yang
diperoleh dari pasien NPC, sedangkan CACNA2D3, yang secara signifikan diatur ke
bawah dalam jaringan, tidak berbeda secara signifikan antara pasien NPC dan kontrol
sehat dalam sampel penyikatan nasofaring. Hal ini mungkin disebabkan oleh
rendahnya jumlah sel tumor pada sampel sikat nasofaring seperti yang dilaporkan
sebelumnya [26] dan dibuktikan dengan hasil sitologi kami (Gambar.1d),
menunjukkan bahwa banyaknya sel non-NPC dapat memengaruhi deteksi TSG dalam
sampel penyikatan. Kesimpulan, menyikat nasofaring lebih rendah daripada biopsi
jaringan untuk deteksi qPCR TSG, tetapi masih dapat diterapkan untuk skrining
tambahan untuk potensi TSG.
Meskipun penyikatan nasofaring menjadi semakin populer untuk diagnosis
NPC, ia memiliki keterbatasan, seperti pengambilan sampel yang tidak memadai,
sumbatan hidung anatomis, tumor kecil yang hilang, adanya deviasi septum,
hipertrofi konka yang mencegah penyisipan sikat, polusi, dan spesifisitas yang rendah
[26]. Kami dan peneliti lainnya telah melaporkan tingkat akuisisi sel tumor yang
rendah, bahkan di bawah panduan endoskopi nasofaring [25, 26]. Namun demikian,
metode pengambilan sampel yang nyaman seharusnya tidak memerlukan visualisasi
endoskopi nasofaring untuk penempatan yang akurat. Modifikasi sikat trans-nasal,
seperti mengubah bentuk yang ada menjadi konfigurasi bulat dan menempelkan
rambut di ujung kenop plastik, dapat meningkatkan efisiensi penyikatan nasofaring
saat ini. Selain itu, untuk mencegah kontaminasi hidung dan meningkatkan
kemurnian sampel, telah dirancang sikat dengan selubung plastik geser [26]. Metode
menyikat nasofaring trans-oral yang dijelaskan sebelumnya mencapai sensitivitas dan
spesifisitas yang tinggi untuk mendeteksi NPC [33]. Metode ini lebih nyaman dan
non-invasif daripada penyikatan trans-nasal dan dapat mengatasi kelemahan
sumbatan dan kontaminasi hidung.
Namun, efisiensi penyikatan trans-oral tampaknya sangat bergantung pada
panduan skrining nasofaring dalam penelitian ini. Selain itu, pengambilan sampel
nasofaring trans-oral memerlukan sikat khusus dengan kepala miring, yang lebih sulit
diproduksi dan memerlukan modifikasi lebih lanjut. Selain itu, tampaknya sulit untuk
mengakses nasofaring dan menerapkan tekanan sikat gigi yang cukup dengan metode
trans-oral. Diperlukan pelatihan lebih lanjut dari para penyikat berpengalaman.
Kita harus mengakui beberapa kelemahan potensial dari penelitian kita.
Pertama, sebagian besar pasien yang direkrut berada pada stadium III-IV. Belum jelas
apakah sampel sikat nasofaring dari pasien stadium awal dapat diterapkan pada
penelitian berbasis asam nukleat. Studi sebelumnya telah melaporkan bahwa tingkat
mikroRNA yang dikodekan EBV dan muatan DNA EBV dari sampel sikat nasofaring
terkait dengan stadium tumor [8,9,34]. Ini akan sangat penting untuk menyelidiki
kelayakan penyikatan nasofaring pada pasien tahap awal untuk deteksi NPC. Selain
itu, karena alasan objektif, ukuran sampel yang digunakan dalam penelitian kami
kecil, dan sampel sikat gigi diambil hanya sekali dari rongga hidung pasien NPC atau
orang sehat. Untuk sepenuhnya menggambarkan penerapan penyikatan nasofaring
untuk penelitian kanker, penelitian lebih lanjut dengan sampel penyikatan yang lebih
banyak dan berulang harus dilakukan.

Kesimpulan
Penyikatan nasofaring dapat dilakukan untuk mendapat bahan tumor yang
cukup untuk analisis asam nukleat virus, termasuk mikroRNA yang dikodekan EBV
dan DNA EBV. Untuk deteksi ekspresi TSG, penyikatan nasofaring dapat dilakukan
tetapi lebih rendah daripada biopsi jaringan dan perlu pemeriksaan lebih lanjut. Studi
ini menegaskan penggunaan menyikat nasofaring sebagai metode pengambilan
sampel yang layak dalam penelitian asam nukleat terkait NPC.

DAFTAR PUSTAKA
1. Pathmanathan R, Prasad U, Chandrika G, Sadler R, Flynn K, Raab‐Traub N.
Undifferentiated, nonkeratinizing, and squamous cell carcinoma of the
nasopharynx. Variants of Epstein–Barr virus‐infected neoplasia. Am J Pathol.
1995;146(6):1355–67.
2. Chua ML, Wee JT, Hui EP, Chan AT. Nasopharyngeal carcinoma. Lancet.
2016;387(10022):1012–24.
3. Pak MW, To KF, Leung SF, van Hasselt CA. In vivo diagnosis of naso‐
pharyngeal carcinoma using contact rhinoscopy. Laryngoscope.
2001;111(8):1453–8.
4. Zhang LF, Li YH, Xie SH, Ling W, Chen SH, Liu Q, Huang QH, Cao SM.
Incidence trend of nasopharyngeal carcinoma from 1987 to 2011 in Sihui
County, Guangdong Province, South China: an age‐period‐cohort analysis.
Chin J Cancer. 2015;34(8):350–7.
5. Young LS, Dawson CW. Epstein–Barr virus and nasopharyngeal carci‐ noma.
Chin J Cancer. 2014;33(12):581–90.
6. Chan KC. Plasma Epstein–Barr virus DNA as a biomarker for nasopharyn‐
geal carcinoma. Chin J Cancer. 2014;33(12):598–603.
7. Spence T, Bruce J, Yip KW, Liu FF. MicroRNAs in nasopharyngeal carci‐
noma. Chin Clin Oncol. 2016;5(2):17.
8. Zheng XH, Lu LX, Li XZ, Jia WH. Quantification of Epstein–Barr virus
DNA load in nasopharyngeal brushing samples in the diagno‐ sis of
nasopharyngeal carcinoma in southern China. Cancer Sci. 2015;106(9):1196–
201.
9. Zheng XH, Lu LX, Cui C, Chen MY, Li XZ, Jia WH. Epstein–Barr virus mir‐
bart1‐5p detection via nasopharyngeal brush sampling is effective for
diagnosing nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 2016;7(4):4972–80.
10. Ramayanti O, Juwana H, Verkuijlen SA, Adham M, Pegtel MD, Greijer AE,
Middeldorp JM. Epstein–Barr virus mRNA profiles and viral DNA methyla‐
tion status in nasopharyngeal brushings from nasopharyngeal carcinoma
patients reflect tumor origin. Int J Cancer. 2017;140(1):149–62.
11. Stevens SJ, Verkuijlen SA, Hariwiyanto B, Harijadi, Paramita DK, Fachiroh
J, Adham M, Tan IB, Haryana SM, Middeldorp JM. Noninvasive diagnosis of
nasopharyngeal carcinoma: nasopharyngeal brushings reveal high Epstein–
Barr virus DNA load and carcinoma‐specific viral BARF1 mRNA. Int J
Cancer. 2006;119(3):608–14.
12. Cheung HW, Ching YP, Nicholls JM, Ling MT, Wong YC, Hui N, Cheung A,
Tsao SW, Wang Q, Yeun PW, et al. Epigenetic inactivation of CHFR in naso‐
 pharyngeal carcinoma through promoter methylation. Mol Carcinog.
2005;43(4):237–45.
13. Hutajulu SH, Indrasari SR, Indrawati LP, Harijadi A, Duin S, Haryana SM,
Steenbergen RD, Greijer AE, Middeldorp JM. Epigenetic markers for early
detection of nasopharyngeal carcinoma in a high risk population. Mol Cancer.
2011;10:48.
14. Low WK. The contact bleeding sign of nasopharyngeal carcinoma. Head
Neck. 1997;19(7):617–9.
15. Waldron J, Van Hasselt CA, Wong KY. Sensitivity of biopsy using local
anesthesia in detecting nasopharyngeal carcinoma. Head Neck.
1992;14(1):24–7.
16. Ji MF, Huang QH, Yu X, Liu Z, Li X, Zhang LF, Wang P, Xie SH, Rao HL,
Fang F, et al. Evaluation of plasma Epstein–Barr virus DNA load to
distinguish nasopharyngeal carcinoma patients from healthy high‐risk
populations in Southern China. Cancer. 2014;120(9):1353–60.
17. Freeman JL, Robinson A, Irish J. Brush biopsy for detection of naso‐
pharyngeal cancer. J Otolaryngol. 2001;30(6):355–6.
18. Anker P. Quantitative aspects of plasma/serum DNA in cancer patients. Ann
N Y Acad Sci. 2000;906:5–7.
19. Adham M, Greijer AE, Verkuijlen SA, Juwana H, Fleig S, Rachmadi L, Malik
O, Kurniawan AN, Roezin A, Gondhowiardjo S, et al. Epstein–Barr virus
DNA load in nasopharyngeal brushings and whole blood in nasopharyn‐ geal
carcinoma patients before and after treatment. Clin Cancer Res.
2013;19(8):2175–86.
20. Tune CE, Liavaag PG, Freeman JL, van den Brekel MW, Shpitzer T,
Kerrebijn JD, Payne D, Irish JC, Ng R, Cheung RK, et al. Nasopharyngeal
brush biop‐ sies and detection of nasopharyngeal cancer in a high‐risk
population. J Natl Cancer Inst. 1999;91(9):796–800.
21. Tong JH, Tsang RK, Lo KW, Woo JK, Kwong J, Chan MW, Chang AR, van
Hasselt CA, Huang DP, To KF. Quantitative Epstein–Barr virus DNA
analysis and detection of gene promoter hypermethylation in nasopharyngeal
(NP) brushing samples from patients with NP carcinoma. Clin Cancer Res.
2002;8(8):2612–9.
22. Makitie AA, Reis PP, Zhang T, Chin SF, Gullane P, Siu LL, Kamel‐Reid S,
Irish J. Epstein–Barr virus DNA measured in nasopharyngeal brushings in
patients with nasopharyngeal carcinoma: pilot study. J Otolaryngol.
2004;33(5):299–303.
23. Yang X, Dai W, Kwong DL, Szeto CY, Wong EH, Ng WT, Lee AW, Ngan
RK, Yau CC, Tung SY, et al. Epigenetic markers for noninvasive early
detection of nasopharyngeal carcinoma by methylation‐sensitive high
resolution melting. Int J Cancer. 2015;136(4):E127–35.
24. Zhang Z, Sun D, Hutajulu SH, Nawaz I, Van Nguyen D, Huang G, Haryana
SM, Middeldorp JM, Ernberg I, Hu LF. Development of a non‐invasive
method, multiplex methylation specific PCR (MMSP), for early diagnosis of
nasopharyngeal carcinoma. PLoS ONE. 2012;7(11):e45908.
25. Jan YJ, Chen SJ, Wang J, Jiang RS. Liquid‐based cytology in diagnosing
nasopharyngeal carcinoma. Am J Rhinol Allergy. 2009;23(4):422–5.
26. Chang AR, Liang XM, Chan AT, Chan MK, Teo PM, Johnson PJ. The use of
brush cytology and directed biopsies for the detection of nasopharyn‐ geal
carcinoma and precursor lesions. Head Neck. 2001;23(8):637–45.
27. Yu KH, Lo YM, Tse GM, Chan KC, Chan AB, Chow KC, Ma TK, Vlantis
AC, Leung SF, van Hasselt CA, et al. Quantitative analysis of cell‐free
Epstein– Barr virus DNA in plasma of patients with nonnasopharyngeal head
and neck carcinomas. Clin Cancer Res. 2004;10(5):1726–32.
28. Sheen TS, Ko JY, Chang YL, Chang YS, Huang YT, Chang Y, Tsai CH, Hsu
MM. Nasopharyngeal swab and PCR for the screening of nasopharyngeal
 carcinoma in the endemic area: a good supplement to the serologic screening.
Head Neck. 1998;20(8):732–8.
29. Thorley‐Lawson DA. Epstein–Barr virus: exploiting the immune system. Nat
Rev Immunol. 2001;1(1):75–82.
30. Laichalk LL, Hochberg D, Babcock GJ, Freeman RB, Thorley‐Lawson DA.
The dispersal of mucosal memory B cells: evidence from persistent EBV
infection. Immunity. 2002;16(5):745–54.
31. Poh SS, Chua ML, Wee JT. Carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma: an
alternate hypothetical mechanism. Chin J Cancer. 2016;35:9.
32. Li L, Zhang Y, Fan Y, Sun K, Su X, Du Z, Tsao SW, Loh TK, Sun H, Chan
AT, et al. Characterization of the nasopharyngeal carcinoma methylome
identifies aberrant disruption of key signaling pathways and methylated tumor
suppressor genes. Epigenomics. 2015;7(2):155–73.
33. Ng RH, Ngan R, Wei WI, Gullane PJ, Phillips J. Trans‐oral brush biopsies
and quantitative PCR for EBV DNA detection and screening of nasopharyn‐
geal carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 2014;150(4):602–9.
34. Chen YP, Zhao BC, Chen C, Shen LJ, Gao J, Mai ZY, Chen MK, Chen G,
Yan F, Liu S, et al. Pretreatment platelet count improves the prognostic
performance of the TNM staging system and aids in planning therapeutic
regimens for nasopharyngeal carcinoma: a single‐institutional study of 2,626
patients. Chin J Cancer. 2015;34(3):137–46.