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Prctica no.

3 TINCIN DE GRAM

OBJETIVOS: a) Al trmino de la prctica los alumnos describirn las caractersticas morfolgicas, estructurales, tintoriales y de agrupacin de las clulas microbianas de importancia mdica. b) Realizar un frotis bacteriolgico y describir su aplicacin en el diagnstico rpido en procesos infecciosos. Material: Medio de cultivo con colonias de bacterias Portaobjetos Puente de tincin Guantes Mechero Bunsen Microscopio Aceite de inmersin

Reactivos: Colorante de Cristal Violeta (colorante bsico) Lugol (mordiente) (Iodo + Ioduro de potasio + agua destilada) Alcohol acetona (decolorante) Safranina (colorante de contraste)

INTRODUCCIN:
La tincin de Gram es una tincin diferencial que nos permite diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales. Fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas que se tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la bacteria sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglucano.

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FUNDAMENTO DE LA TINCIN DE GRAM


El bacterilogo dans Christian Gram, en 1844 desarrolla una tcnica para diferenciar a las bacterias en relacin a su capacidad de retener colorantes. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y caractersticas de la pared celular bacteriana.

Caractersticas de la pared celular de bacterias Gram-positivas


Tiene una capa gruesa de peptidoglucano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos: cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglucano y unido a la membrana citoplsmica. cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglucano. organismo. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del

Caractersticas de la pared celular de bacterias Gram-negativas


Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En l la porcin de lpido (Lpido A y es txico) est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lipopolisacrido entero se llama endotoxina. Tiene porines (poros) para el transporte de substancias de bajo peso molecular. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

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Las bacterias Gram-positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloracin con alcohol-acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la clula. Las bacterias Gram-negativas, poseen una delgada capa de peptidoglucano no puede impedir la salida del complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste (safranina).

Mecanismo de la reaccin de Gram:


1. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas, estn teidas de azul. 2. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2 ; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas Gram-positivas como las Gram-negativas se encuentran en la misma situacin. 3. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2 -cristal violeta.

Algunos organismos (Gram-positivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram-negativos) lo hacen.

Resistencia a la decoloracin de Gram-positivas o A causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglucano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular, quedando coloreadas.

Resistencia a la decoloracin de Gram-negativas o La mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared celular (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglucano). La delgada capa de peptidoglucano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.

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Reactivos de la tincin de Gram: Requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Un colorante bsico (+) que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reaccione con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. 2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como por ejemplo, una solucin diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico; por ejemplo alcohol-acetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina. PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN DE GRAM: 1. Preparar el frotis 2. Fijar la muestra al portaobjetos a. Mtodos fsicos: accin del calor b. Mtodos qumicos: metanol 3. Colocar el portaobjetos con la muestra fijada, sobre un puente de tincin. 4. Agregar el primer colorante (cristal violeta), procurando cubrir toda la muestra y dejar actuar por 1 min. 5. Lavar la preparacin con agua para eliminar el exceso de colorante. Para ello, se inclina el portaobjetos y se aplica el agua corriente de grifo en su parte superior de manera que resbale poco a poco sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. 6. Agregar el mordiente (Lugol) y dejar actuar por 1 min. 7. Lavar nuevamente la preparacin pero con solventes orgnicos, decoloracin con mezcla alcoholacetona. 8. Lavar con agua. 9. Agregar el segundo colorante (safranina), y dejar actuar 1 min. 10. Lavar y despus secar el frotis. 11. Observar el frotis seco al microscopio con objetivo de inmersin (100x)

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TINCIN DE GRAM

Observaciones:

Comentarios: La utilidad que se le puede dar a la tincin de Gram, es que nos ayuda a conocer las caractersticas del agente infeccioso, y con ello elaborar un diagnstico y tratamiento eficaz.

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CONCLUSIONES: No todas las bacterias tienen las mismas caractersticas morfolgicas y estructurales, por ello se tienen que emplear tcnicas diferenciales para poder determinar el tipo de microorganismo patgeno. En la tincin de Gram, se ve la presencia de una pared bacteriana gruesa de peptidoglucano (Gram-Positiva) o la presencia de una pared bacteriana delgada de peptidoglucano (Gram-negativa) y esto se ve por su capacidad de retener el colorante bsico (cristal violeta) unido al mordiente (lugol) y de resistir la decoloracin de un solvente orgnico (alcohol-acetona). A aquellas clulas que pierden su coloracin, se les agrega un medio de contraste que es igualmente un colorante bsico (safranina).

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
1. Gamazo C, LpezGoi I, Daz R. Observacin de microorganismos. Manual prctico de microbiologa. Tercera edicin, Barcelona: Masson, 2005: 15-37. 2. Cortes, JA. (04-09-11). Preparacin de un frotis bacteriano. Disponible en:

http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm 3. Llop Hernndez, Alina M.D., Valds-Dapena Vivanco, Ma . Margarita M.D. Ph.D., Zuazo Silva, Jorge L. M.D., y col. Microscopia y coloraciones. En: Casanovas N, eds. Microbiologa y Parasitologa Mdicas. Edicin primera, La Habana: Ciencias Mdicas, 2001: 19-28

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