Tincin de Gram.

Esta tincin nos permite diferenciar entre bacterias Gram positivas y Gram negativas. La diferencia entre estos microorganismos estriba en el tipo de pared celular que posee la bacteria.

Materiales: 1. Buscar los agentes y materiales de laboratorio para realizar este ejercicio: Materiales: 1. Mechero 2. Asa 3. Desinfectante 4. Microscopio. Laminilla y cubre-objeto 5. Bandeja para hacer tincin. Agentes: 1. Tinte cristal violet 2. Iodo. Grams iodine 3. Alcohol o descolorizante. 4. Safranina 5. Agua Procedimiento: 1. Limpia bien la laminilla con agua y jabn. Puedes utilizar unas pinzas para calentar la laminilla en el mechero. 2. Desinfecta el asa ( aguja de inocular) en el mechero. Obtn el cultivo con los microorganismos: estos pueden estar en caldo (tubo con lquido) o pueden estar sembrados en agar nutriente (placa Petri con medio que se ve slido). Con el asa (desinfectada) obtn una gota de estos (si los mismos estan en un caldo nutriente) o puedes obtener con la aguja de inocular en punta una pequena muestra del cultivo si estan en agar. Transfiere a la laminilla limpia la muestra del cultivo. Desinfecta el asa nuevamente. OJO: Si las bacterias entan en agar debers hechar un gota de agua estril a la laminilla antes de transferir las bacterias del agar a la laminilla. Paasr la laminilla por la flama varias veces muy rpido y esperar que la muestra se seque. 3. Obtener el cristal violet y aadir una gota a la laminilla, sobre los microorganismos. Espera por un minuto a que seque un poco el tinte. 4. Lava la laminilla con agua. Espera que se seque. 5. Obtener el tinte Grams iodine y colocar una gota sobre la laminilla, sobre los microorganismos. Espera por un minuto a que seque un poco el tinte. 6. Lava la laminilla con agua. Espera que se seque. 7. Obtener el Alcohol o descolorizante y colocar una gota sobre la laminilla, sobre los microorganismos. Espera por un minuto a que seque un poco. 8. Lava la laminilla con agua. Espera que se seque.

9. Obtener la safranina y colocar una gota sobre la laminilla, sobre los microorganismos. Espera por un minuto a que seque un poco. 10. Lavar con agua y esperar que seque. La laminilla esta lista para observarse por microscopio.

TINCION DE GRAM

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

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Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

METODOLOGIA

Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion) Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2 min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infeccin.

Explicacin El cristal violeta(colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo, y acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-prosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-prosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.

Una tincin Gram en la que observamos un mezclado de Staphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negativas

TEORIAS

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos. El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso del desarrollo.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas.

En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

forma

Divisin a lo largo del mismo plano,

Divisin a lo largo

Divisin a lo largo de 3 planos

esfric a: se llama Coco

formando cadenas cortas

de 2 planos diferentes:

2 cocos juntos: Diplococos

Ttradas 4 - 20 en cadenas: Estreptococos regularmente: Sarcinas irregularmente: Estafilococos

Bacilos
grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio

PRACTICA Nm. 3

PREPARACIONES DE EXTENSIONES O FROTIS Y TINCION SIMPLE

I. OBJETIVO

Conocer el procedimiento para preparar extensiones frotis y los diferentes mtodos de tincin, as como su utilidad en el estudio microscpico de los microorganismos.

II. INTRODUCCION

Un procedimiento til para el examen de muestras es el estudio microscpico de preparaciones fijas - extensiones o frotis - preparados a partir de ellas y coloreadas por el mtodo adecuado. Esto permite eliminar el movimiento que presentan los microorganismos en las preparaciones en fresco. La retencin de colorantes de alquitrn de hulla por las bacterias permite su fcil observacin bajo el microscopio. La forma ms comn de preparar un frotis es extender un poco de muestra sobre un portaobjetos desengrasado, con el asa bacteriolgica, pero tambin se puede hacer con un hisopo presionando el portaobjetos sobre la muestra impronta. Dependiendo del tipo de microorganismo o estructura del mismo que se desee observar es el tipo de tincin que se emplea. P. ej. Tincin Simple, Diferencial de Gram, Negativa, para cpsulas (Mtodo de Anthony), para flagelos, para endosporas, para ncleo, para bacterias cido alcohol resistentes (Tincin de Ziehl Neelsen), entre otras.

Los colorantes son productos qumicos sintticos del tipo de la anilina capaces de combinarse con una gran variedad de sustancias impartindoles color. El color es impartido por su estructura qumica. Los colorantes de alquitrn de hulla usan bases de anillos aromticos tales comobenceno, naftaleno o antraceno. Varios grupos qumicos son ligados a los anillos aromticos para impartir los diferentes colores. Los grupos productores del color son llamados cromforos, siendo los ms comunes p-quinona y diazo. Ciertos grupos qumicos llamados auxocromos, tales como los grupos amino ehidroxilo ayudan a fortalecer a los cromforos. Las propiedades cidas o bsicas de los colorantes permiten su fcil clasificacin en: Acidos. Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un ncleo colorante con carga (-), es decir el grupo inico que imparte el color tiene carga negativa, o sea, es un anin. Estos colorantes tien material citoplasmtico, no son muy usados en Microbiologa. Por ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina cida Bsicos. En los que el ion que lleva el color tiene carga (+). Estos colorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los ms usados en microbiologa, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen cido ribonucleico en todo el protoplasma de la clula bacteriana, stas se tien fcilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta. Neutros. Se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la carga elctrica de stos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina. Tincin Simple. Se denomina as, porque solo se utiliza un colorante, generalmente bsico. Con este tipo de coloracin no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. Las tcnicas de coloracin simple pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el

colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tie y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

4 portaobjetos. Gradilla.
Asa bacteriolgica. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Lpiz graso. Papel absorbente. Hisopos. Microscopio. Aceite de inmersin. Cristal violeta. Azul de metileno. Verde de malaquita. Safranina. Cultivo en medio slido. Cultivo en medio lquido.

IV. TECNICA

A. Preparacin de Extensiones o Frotis.

Se debern emplear portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras para evitar interferencias en la observacin.

1. Flamear el portaobjetos para desengrasarlo.

2. Si el cultivo es slido, colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, y con el asa bacteriolgica estril, tomar una pequea cantidad de material, emulsionar y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2.

3. Si la muestra es lquida, tomar directamente el material con el asa estril y extenderlo uniformemente sobre la superficie indicada anteriormente.

4. Dejar secar la extensin al aire.

5. Una vez seca la extensin, fijarla al calor suave, pasando rpidamente el portaobjetos sobre la flama del mechero, sin calentar demasiado, unas 10 veces.

Las extensiones debern ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a travs de ellas y facilitar su observacin.

Preparar 2 extensiones a partir de cada cultivo.

B. Tincin.

1. Cubrir la extensin debidamente preparada con la solucin colorante. 2. Dejar actuar el colorante por 1 minuto. 3. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante.

4. Dejar secar al aire o presionando el portaobjetos entre 2 capas de papel absorbente como papel filtro papel sanitario. 5. Una vez seca la extensin, colocar sobre ella una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con el objetivo de inmersin
TinciN Simple - Presentation Transcript
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Tincin simple Anlisis microbiolgicos Material para la preparacin de la tincin simple -Microscopio -Aceite de inmersin -Colorante: Violeta vegenciana -Mechero bunsen -Portaobjetos -Agua destilada -Muestra -Asa de siembra 1: Se toma un portaobjetos 2: Se le aade al portaobjetos unas gotas de cloruro sodico 3: Esterilizacion del asa de siembra para tomar la muestra 4: Toma de muestra con el asa de siembra esterilizada 5: Dilucion de la muestra en el cloruro sodico que contiene el portaobjetos 6: Secado y fijacion de la muestra en el mechero bunsen 7: Tincion de la muestra fijada y secada con violeta de genciana durante 80 seg. 8: lavado de la muestra con agua destilada despues de los 80 seg. de tincion 9: aadir una gota de aceite de inmersion a la muestra una vez secada 10: poner la muestra en el microscopio, enfocar y observar con el objetivo de 100 aumentos. 11: Observar la muestra 12: Resultados de la observacin del proceso de tincin simple: estreptococos y estafilococo

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructurascelulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, AzulMetileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite verelementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente loscomponentes proteicos, por ejemplo de la clula husped,pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas ( Cryptococcus),sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparececomo un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puedeagregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos