Isolasi dan Identifikasi Bakteri Escherichia Coli Pada Sampel Feses

1. Pengambilan Dan Penanganan Sampel

 Penampung yang digunakan bersih (plastik, kaleng, gelas), volumenya cukup,
tertutup rapat (gunakan tutup yang berulir), penampung dilengkapi dengan stick.
 Spesimen langsung ditampung didalam penampung, atau ditampung diatas kertas
atau plastik yang bersih kemudian langsung dipindahkan ke dalam penampung
menggunakan stick
2. Tahap Pra-Analitik
Alat dan Bahan
 Pengambilan dan Penanganan Sampel
 Identifikasi bakteri E.coli dengan metode kultur adalah:
Alat
 Mikroskop
 Slide (gelas objek)
 Petridish
 Tabung reaksi
 Pipet tetes
 Ose bulat
 Ose jarum,
 Lampu spirtus,
 Korek api.
 Inkubator,
 Rak tabung,
 Rak pewarna-
 Tabung durham,
 Kapas,
 Oven.
Bahan
 Media yang digunakan dalam identifikasi bakteri E coli adalah sehagai
berikut
1. Media Bouillon (media pemupuk)
2. Media Mac Conkey (media differensial)
3. Media Eosin Methylen Blue (media selektif)
  Media biokimia reaksi
1. Media KIA
2. Media IMVIC
3. Media SIM
4. Media urea
5. Media gula-gula
a) Glukosa
b) Laktosa
c) Sukrosa
d) Maltosa

Reagensia Reagensia yang digunakan dalam bakteri E coli adalah:

1. Larutan NaCI 0,85%
2. Larutan covak
3. Larutan methyl red
4. Larutan KOH
5. Larutan alfa naftol
6. Pewarnaan gram
a) Gram I (gentian violet)
b) Gram II (lugof)
c) Gram III (alkohol)
d) Gram IV (safranin)

Sumber : bakteriologi praktikum teknologi laboratorium medik, ECG

3. Tahan Analitik
 Prosedur penanaman pada media pemupuk:
 1. Siapkan alat dan bahan
2. Panaskan ose bulat sampai dari ujung sampai pangkal, biarkan dingin
3. Ambil suspensi kuman dengan menggunakan ose bulat dimasukkan ke
dalam media Bouillon
4. Panaskan lagi ose bulat sampai membara
5. Inkubasi media Bouillon selama 24 jam pada suhu 37 ° C

 Prosedur pemindahan suspensi bakteri dari media Bouillon ke media MC dan

EMB,
Penanaman media MC dan media EMB:
1. Siapkan alat dan bahan
2. Panaskan bulat sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan
dingin
3. Ambil suspensi kuman dengan mengguniakan ose bular
4. Goreskan pada media MC dan media EMB dengan cara zig zag
5. Panaskan lagi ose bular sampai membara
6. Inkubasi media MC dan media EMB yang sudah ditanam kuman selama
24 jam pada suhu 37 C.

 Prosedur pewarnaan Gram dan pemindahan dari media MC ke media KIA / TSIA
dengan tujuan mendapatkannya secara kultur murni.
Pewarnaan Gram:
1. Siapkan alat dan bahan
2. Teteskan 1 teres NaCl pada gelas objek
3. Panaskan ose bulat sampai membara, biarkan dingin
4. Ambil suspensi kuman dan campur dengan NaCI buat sediaan
5. Panaskan kembali ose bulat sampai membara, biarkan dingin
6. Keringkan dan fiksasi
7. Warnai dengan Gram (gentian violet) selama I menit, lalu dibilas dengan
air kran
8. Warnai dengan Gram II (lugol) selama menit, lalu dibilas dengan air kran
9. Lunturkan dengan Gram (alkohol) 96% selama 30 detik, lalu dibilas 19.
dengan kran udara.
 10. Warnai dengan Gram IV (safranin) selama 1-2 menit, lalu dibilas dengan
air kran
11. Keringkan
12. Teteskan minyak imersi pada sediaan di gelas objek
13. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 100x.

 Penanaman media KIA / TSIA:

1. Siapkan alat dan bahan
2. Panaskan ose jarum sampai membara dari ujung sampai pangkal, biarkan
dingin
3. Ambil suspensi kuman, goreskan dan ditusuk pada media KIA
4. Panaskan lagi ose jarum sampai membara

 Prosedur penanaman pada media biokimia reaksi dari media KIA / TSIA:
1. Penanaman media IMVIC
a) Panaskan ose jarum sampai membara dari ujung sampai pangkal,
biarkan dingin
b) Ambil suspensi kuman, goreskan dan ditusuk pada media Indol,
MR, Vp, dan sitrat
c) Panaskan lagi ose jarum sampai membara

2. Penanaman media SIM

a) Panaskan ose jarum sampai membara dari ujung sampai pangkal,
biarkan dingin
b) Ambil suspensi kuman, goreskan dan ditusuk pada media SIM
c) Panaskan lagi ose jarum sampai membara

3. Penanaman media urea

a) Panaskan jarum suntik sampai membara dari ujung sampai
pangkal. biarkan dingin
b) Ambil suspensi kuman, goreskan dan ditusuk pada media urea
c) Panaskan lagi ose jarum sampai membara.

4. Penanaman media gula-sula (gula, laktosa, sukrosa, maltosa).

 1. Panaskan ose bulat sampai membara dari ujung sampai pangkal,
biarkan dingin
2. Ambil suspensi kuman, kemudian dikocok pada nmedia gula-gula
(glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa)
3. Panaskan lagi ose bulat sampai membara

4. Uji Sensitifitas Antibiotik

Untuk uji sensitifitas bakteri S.aureus menggunakan metode Plat Kirby-Bauer
Prosedur Kerja Plat Kirby-Bauer
1. Inokulasi tiga tabung kaldu dengan tiga bakteri yang akan diuji. Beri label
dan letakkan pada rak tabung untuk diinkubasi Biarkan diinkubasi selama
kurang lebih 2 jam. Atau
Menggunakan kapas lidi steril untuk mengambil sampel dari setiap tiga
kultur yang akan diuji. Letakkan setiap sampel di dalam sebuah tabung
berisi larutan salin steril dan campurkan hingga terlihat sedikit keruh.
Ketiga kapas lidi ini dapat digunakan untuk langkah 2.
2. Ambil sampel dari kaldu (la) atau larutan salin (lb) menggunakan kapas
lidi steril, putar dan tekan kapas lidi ke dinding bagian dalam tabung di
atas batas cairan untuk menghilangkan sisa cairan, dan buang kapas lidi.
Bakar tabung reaksi dan tutup kembalt.
3. Pegang plat Mueller-Hinton dengan tangan Anda dan tutup seluruh
permukaan plat dengan kapas lidi Anda. Prosedur yang dapat dilakukan
dengan tahapan yang sama seperti mempersiapkan "halaman"
menggunakan uji sensitivitas Metode populer untuk memproduksi
halaman pada plat yang lebih besar adalah sebagai berikut
a. Lakukan apusan bagian tengah plat dan teruskan apusan dengan
pola zigzag menjauhi Anda tumpang tindih dengan area
sebelumnya dan sentuh bagian pinggir plat saat Anda melakukan
(Gbr 10 11).
b. Putar plat 90 derajat dan ulangi prosedur yang suma Setelah
langkah ini selesai, seperempat plat akan tertutup dua kali dan
setengah plat sekali (Gbr 10.12)
c. Putar plat 90 derajat sekali lagi dan ulangi prosedur Sekarang
setengah plat akan ter- tutup dua kali dan seperempat plat sekali
(Gbr.
d. Ulangi prosedur terakhir kali Sekarang seluruh plat telah tertutup
dua kali.
e. Gerakkan kapas lidi dua kah lingkaran dalam plat yang
pengawasan agar untuk memastikam setiap milimeter persegı dari
agar tertutup oleh lapisan tipis dan rata dari bakteri (Gbr 10 14)
 Cotatan Seluruh permukaan plat harus tertutup untuk memastikan
hasil yang akurat Biarkan larutan kaldu dan larutan menyerup
4. ke dalam agar (1 sampai 2 menit) dan meletakkan cakram antimikroba
secara merata di atas permukaan plat dengan dispenser atau pinset
5. Jika dispenser digunakan untuk meletakkan cakram pada plat,
memperlihatkan Anda menekan setiap cakram dengan bantuan ose steril
atau pinset untuk memastikan kontak yang efektil dan tepat pada agar lika
dispenser mengakibatkan disket menempel ke bagian tepi agar pasangan
jatuh ke bawah. biarkan mendingin, lalu ambil cakram t ersebut dan
letakkan pada agar dengan benar
6. Setelah selesa. Beri labet setiap plat dan letakkan plat-plat tersebut di
dalam nampan inkubator dalam terbalik

5. Tahap Pasca-Analitik
 Pengamatan makroskopik
 Isolasi Pada Media Diferesial Mac Conkey ( MC ) Dan Media EMB

 Hasil Pengamatan Bakteri Pada Media Mac Conkey

Media Mc :
- Dengan Bentuk Besar
- Berwarna Merah
- Konsistensi Semimukoid
- Fermentasa Laktosa +
 Media EMB :
- Koloni Besar
- Warna Metalic Sheen
- Konsistensi = Mukoid
- Fermentasi = Laktosa Dan Sukrosa +

 Pengamatan mikroskopik
Hasil pewarnaan gram
- Bentuk : Batang Pendek ( Cocobacil )
- Warna : Merah
- Susunan : Menyebar
- Sifat : Gram Negatif ( - )
 Pengamatan kimia
Hasil Pada MC Di Tanam Pada Media KIA / TSIA :
- Lereng : Asam
- Dasar : Asam
- H2S : -
- Gas : +

 Hasil media IMVIC

a) indol
Hasilnya Positif : Terbentuk Cincin Merah
b) MR
Hasil merah : terbentuk cincin merah

c) VP
Hasilnya Negaif : Tidak Terbentuk Cincin Ungu
 d) Simon sitrat
Hasilnya Negatif : Tidak Perubahan Warna Menjadi Biru

Hasil media urea

Hasilnya Negatif : Tidak Terjadi Perubahan Warna Menjadi Merah Muda

Media SIM (motility)

Hasilnya Positif : Ditandai Dengan Adanya Pergerakan Kuman
 Hasilnya Media Gula – Gula :

a) Glukosa : ( + )
b) Laktosa : ( + )
c) Maltosa : ( + )
d) Sukrosa : ( + )
e) Manosa : ( + )

 Uji resistensi
 Hasil pengujian aktivitas antibiotik terhadap E. coli menunjukkan bahwa seluruh
antibiotik menunjukkan sensitivitas terhadap bakteri uji. Aktivitas antibakteri dari
Chlorampenicol, Amoxicillin dan Tetracyclin hanya pada konsentrasi 0.1 g/mL
dan 0.01 g/mL. Ampicillin menunjukkan aktivitas antibakteri sampai pada
konsentrasi 0.001 g/mL. Aktivitas antibakteri terbaik diperoleh dari Ciprofloxacin
yang menunjukkan aktivitas antibakteri sampai pada konsentrasi 0.00001 g/mL.
Secara umum, Ciprofloxacin merupakan antibakteri yang paling baik digunakan
untuk E. coli. Hasil penelitian ini sesuai dengan Drug Information Portal (2008)
yang menyatakan bahwa Ciprofloxacin merupakan agen antimikroba yang dapat
mengobati beberapa infeksi yang disebabkan oleh E. coli, Klebsiella pneumoniae,
S. saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, S. aureus dan Salmonella typhi.
Todar (2008) mengatakan bahwa Ciprofloxacin merupakan antibiotik kelas
fluoroquinolones dan diperoleh secara sintetis. Ciprofloxacin efektif melawan
bakteri Gram negatif dan Gram positif dengan cara menghambat proses replikasi
Deoksiribosa Nucleat Acid (DNA / Asam nukleat deoksiribosa). Menurut
Wikipedia (2008a), ciprofloxacin merupakan nama internasional umum untuk
antibiotik sintetis yang diproduksi dan dijual oleh Bayer A.G. dengan nama
produk yaitu Cipro, Ciproxin an Ciprobay. Ciprofolxacin bersifat bakteriosidal
(dapat membunuh bakteri) dan menghambat replikasi DNA dengan mengikatkan
diri pada sebuah enzim yang disebut DNA gyrase (sebuah tipe II topoisomerase)
yang menyebabkan keretakan ganda pada kromosom bakteri. Kerusakan ini bisa
terjadi karena enzim yang diikat oleh antibiotik ini diperlukan untuk memisahkan
DNA yang direplikasi

6. Interpretasi Hasil
Interpretasi hasil
 Pengamatan makroskopik
- Mac conkey
(ink. 370C selama 24 jam)
 Koloni kecil
 Warna merah
 Fermentasi laktosa (+)
 Konsistensi mukoid
 - media EMB
(ink. 370C selama 24 jam)
 koloni kecil
 warna methalic sheen
 fermentasi laktosa dan sukrosa (+)
 onsistensi semi kukoid

 pemeriksaan mikroskopik
- pewarnaan gram
 bentuk batang pendek (cocobacil)
 warna merah
 susunan menyebar
 sifat gram (-)

 pemeriksaan biokimia
- media TSIA
(ink. 370C selama 24 jam)
 lereng asam
 dasar asam
 gas positif (+)
 H2S negatif

- Media IMVIC
 Indol (+)
 MR (+)
 VP (-)
 Sitrat (-)

- Media urea (+)

- Media SIM (Motility) (+)
- Media gula gula
 Glukosa (+)
  Laktosa (+)
 Maltosa (+)
 Sukrosa (+)
 Manosa (+)
 Uji Sensitivitas antibiotik

7. Validasi Hasil
Berdasarkan buku “Bakteriologi Praktikum Teknologi Laboratorium Medik” hasil isolasi
dan identifikasi bakteri Escherichia Coli
Berdasarkan buku “Bakteriologi 1” Uji sensitivitas Antibiotik
Berdasarkan buku “ Bakteriologi 2” Pembahasan Bakteri Escherichia Coli
Berdasarkan buku “Praktik Laboratorium Mikrobiologi Edisi 4” Uji sensitivitas
antibiotik metode Kirby-Bauer
Jurnal “The Sensitivity Test of Antibiotics to Escherichia coli was Caused The Diarhhea
on Underfive Children in Manado City” Uji sensitivitas bakteri E.coli
8. Jelaskan mengapa pasien yang masuk dengan diagnosa trauma luka kemudian
setelah beberapa hari mengalami diare disertai panas?

9. Daftar Pustaka
Kurniawan, Fajar Bakti; Indra Taufik Sahli. 2017. Bakteriologi: Praktikkum Teknologi
Laboratorium Medik. Jakarta: EGC.

Kuswiyanto. 2015. Bakteriologi 1: Buku Ajar Analis Kesehatan. Jakarta: EGC

Kuswiyanto. 2016. Bakteriologi 2: Buku Ajar Analis Kesehatan. Jakarta: EGC

Sumampow Oksfriani. 2018. The Sensitivity Test of Antibiotics to Escherichia coli was
Caused The Diarhhea on Underfive Children in Manado City. JCPS: Vol 2 No 1

Pollack Robert. 2016. Praktikum Laboratorium Mikrobiologi Edisi 4. Jakarta: EGC