Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio de tipo II

Descoberta Sistemas de modificao restrio Como actuam Aplicaes

Lise de bactrias aps infeco fgica

Sistemas de Restrio-Modificao
X

X Y

Modificao e restrio de um vrus, controlado pelo hospedeiro

Modificao do DNA METILAO

1) Modificao do DNA- METILAO

2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenosil metionina)

SAM
ATP CH3 activo

Metionina
CH3

S-adenosil-homocistena

Homocistena

H2O

Exemplo de metilao

Metilaes mais frequentes

m6A-

N6-metiladenina m5C- C5-metilcitosina m4C- N4-metilcitosina hm5C- C5-hidroximetilcitosina

Sistemas de Restrio-Modificao
Tipo I- ex sistema EcoKI, que s clivam DNA NO METILADO Tipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NO METILADO Tipo III

Sistemas de Restrio (endonucleases)

McrA- C*CGG McrB- G*C Mrr- C*AC e C*AG S clivam sequncias METILADAS

Sistemas de Modificao (metilases stio-especficas)

Dam Dcm (N6) (C5) G*ATC C*CAGG e C*CTGG

S METILAM

Caractersticas das enzimas dos Sistemas de Modificao-Restrio de tipo I, II e III

Sequncias de reconhecimento das enzimas de restrio

Tipo I EcoAI EcoKI StySPI Tipo II EcoRI BalI PstI Tipo III EcoP151 EcoPI HinfIII CAGCAG AGACC CGAAT
Corte a 24-26 pb a jusante da sequncia de reconhecimento que assimtrica e de 5 a 7 pb

GAGNNNNNNNGTCA AACNNNNNNGTGC AACNNNNNNGTRC

Corte na mais de 1000 pb da sequncia de reconhecimento que bipartida e assimtrica

G/AATTC TGG/CCA CTGCA/G

Corte na, ou muito prximo da sequncia de reconhecimento que PALINDRMICA e de 4 a 8 pb

Locais de corte, se^quncias de reconhecimento, locais de restrio N- A, C, G ou T; R- G ou A

Palndromos
RADAR MADAM IN EDEN IAM ADAM ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5

Endonucleases de tipo II
AccI AluI BamHI EcoRI HaeIII Sau3AI Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A

Type II restriction enzymes

Natureza das extremidades geradas aps corte com as enzimas de restrio, determinada pelo lado da ligao fosfodister onde ocorre o corte

3-OH 5-P

Resultado da digesto do DNA com diferentes enzimas de restrio

Extremidades cegas e coesivas (ou salientes)

Extremidades 5 e 3 projectadas

a 5 do eixo de simetria

a 3 do eixo de simetria

As mesmas extremidades coesivas, produzidas por diferentes enzimas de restrio

Sistema de modificao-restrio das enzimas de tipo II

(Exemplo)

A enzima de restrio cliva na sequncia de reconhecimento:

aactGAATTCtcgac ttgaCTTAAGagctg aactG ttgaCTTAA AATTCtcgac Gagctg

A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferncia de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequncia de reconhecimento
aact G A *A T T C tcgac ttga C T T *A A G agctg

A modificao da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI

Sistema de Modificao-Restrio Tipo I- sistema EcoK

HsdS
Determinante da especificidade de HsdM e HsdR A mutao HsdS elimina a actividade de HsdM e HsdR

HsdM DNA metilase

Metila na sequncia AN6ACNNNNNNGTGC ou GCN6ANNNNNNGTT O DNA isolado numa estirpe hsdM- clivado num hospedeiro HsdR

HsdR Enzima de restrio

A ausncia desta actividade permite a entrada de DNA propagado em estirpes ou fontes que no E. coli

Enzimas de Tipo I ligam-se sequncia alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilao deste

Cliva DNA no metilado

Gentipos e fentipos de mutantes hsd no sistema EcoK

GENTIPO FENTIPO hsdS hsdR hsdM

+ + +

+ + +

+ + + -

r+ m + r- mr- m+ r- m-

A subunidade HsdM indispensvel funo de restrio por HsdR

Sistema de Modificao
Metilao Dam
Metilao Dam: Gm6ATC
(grupo metilo na posio N6 da adenina: N6-metiladenina )

1- Enzimas de restrio de tipo II (ex.), bloqueadas por metilao Dam

ClaI XbaI MboI G*ATCGAT TCTAG*ATC G*ATC

2- Enzimas de restrio de tipo II (ex.), no bloqueadas por metilao Dam

BamHI PvuI Sau3AI GG*ATCC CG*ATCG G*ATC

A negrito- a sequncia de reconhecimento da enzima de restrio de tipo II

Diferentes padres de metilao vs diferentes sensibilidades de clivagem Uma sequncia de DNA pode sofrer diferentes metilaes, adquirindo diferentes padres de metilao, consoante a especificidade das metilases da clula
Ex. Gm6ATC (Dam) GATm5C GATm4C GAThm5C

As enzimas de restrio podem apresentar diferentes sensibilidades aos diversos padres de metilao
Ex: Sau3A1 CLIVA Gm6ATC NO CLIVA GATm5C GATm4C GAThm5C

Enzimas de restrio tipo II, com diferente sensibilidade metilao

DpnII GATC CTAG no CLIVA Gm6ATC CTm6AG CLIVA DpnI GATC CTAG

Sau3AI GATC CTAG

CLIVA Gm6ATC CTm6AG

DpnI s corta sequncia de reconhecimento quando metilada DpnII no metilada Sau3AI metilada e no metilada

CLIVA

DpnI
NO CLIVA S CLIVA

DpnII
NO CLIVA

GATC

GATC

G*ATC

Metilase
As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII tero que possuir padres de metilao adequados proteco da restrio por cada uma destas enzimas

GAT C
Proteco da Restrio

G*AT C

Aplicao das enzimas de restrio de tipo II

DNA cloning

DNA cloning...
One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on:
the gene what is known about it objective

Among the several tools needed for cloning, lets consider:

restriction enzymes vector DNA DNA ligase host cell

Isolating and cloning a DNA fragment

Construction of a recombinant DNA molecule

Reaco de ligao entre duas molculas de DNA

VECTORS
Central component of gene cloning experiments Two types of naturally ocurring DNA molecules: Plamids Bacteriophages Properties Self-replicating Unique restriction enzymes cleavage sites Selectable marker Easy to recover

Marcas importantes de um plasmdio

Marca de resistncia a um antibitico para o qual a estirpe hospedeiro sensvel

Clones de um plamdio recombinante

Bacteria cell transformation

Introduction of recombinant DNA molecules into a host (ex. E. coli) Different procedures: inducing competence (CaCl2, MgCl2, Licl) electroporation

Transformed cells are isolated in SELECTION MEDIA

(a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSFORMATION)

Competent bacterial cells

Recombinant DNA plasmid

SELECTION MEDIA

Recombinant DNA clones

Non-recombinant DNA plasmid. Bacteria cells harbouring this plasmid will grow, but wont be recombinant clones

Ex. ANTIBIOTIC selection of plasmid DNA

(recombinant and non-recombinant)

Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell Cell divides and vectors are passed to progeny Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules

Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules.

Caractersticas dos hospedeiros vs metilao

Ex. DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam
TC G*A G A CT*
G*AT C CT*A G

G*ATC

MboI

GATC CTAG

no cliva sequncias metiladas

G*ATC CT*AG

Sau3AI GATC CTAG

cliva sequncias metiladas

G*ATC CT*AG

Caractersticas dos hospedeiros vs metilao

Ex. DNA humano *CpG

Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrio)

mcrAmcrBCMcrA- Cm5CGG McrBC- Gm5C Gh5C GN4C

Isoesquizmeros
1- Reconhecem a mesma sequncia e clivam nos mesmos locais AccIII
TCCGGA AGGCCT TCCGGA AGGCCT

Extremidades compatveis com XmaI

CCCGGG GGGCCC

BspEI

2- Reconhecem a mesma sequncia mas clivam em locais diferentes

Acc65I GGTACC CCATGG XmaI CCCGGG GGGCCC

KpnI

GGTACC CCATGG

SmaI

CCCGGG GGGCCC

3- Reconhecem a mesma sequncia mas apresentam diferente sensibilidade metilao DpnII e MboI no clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI no cliva G*ATC no metilado e ainda clivam em locais diferentes

Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcrA- e mcrBCe posteriormente cliv-lo com MspI? E com HpaII? Porqu?

MspI e HpaII so isoesquizmeros, mas HpaII bloqueada pela metilao em CG, realizada nos mamferos e pelas enzimas de modificao Dcm. MspI- no sensvel metilao, Dcm ou metilao CpG dos mamferos, ie, Cm5CGG. No entanto no cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG HpaII- no cliva em Cm5CGG,
m4CCGG, m5CCGG,

Cm4CGG e hm5Chm5CGG

Metilao em organismos eucariotas- um outro significado biolgico

Mto varivel consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila- DNA no metilado Geralmente a metilao est associada a mecanismos de silenciamento gnico

REGULAO EPIGNICA Alterao da expresso gnica que no se deve a alteraes na sequncia de DNA, mas a algo que a somar sequncia de DNA, influi a expresso gnica, como seja: - modificao de bases - factores proteicos que se ligam ao DNA