Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina
Medicina

Práctico N° 11 y 12
“Cromatografía de Filtración
en gel”

Integrantes: Scarlet Rissi

Helga Silva
Jhonattan Soto

Ramo: Bioquímica

Carrera: Medicina (II)

Profesores: BQ. Javier Grandón

BQ. Mirna Muñoz
BQ. Reginald Del Pozo

Concepción, 23 de Noviembre de 2007

Introducción
 Nuestro conocimiento de la estructura y función de cualquier molécula, proviene
de su estudio individual. Para poder estudiarla con cierto detalle, es necesario separarla
del resto de los componentes del fluido analizado y debe de disponerse de técnicas que
permitan determinar sus propiedades.

Tal como hemos dicho anteriormente, si queremos averiguar si una molécula

posee tal o cual característica, podemos basarnos en esta misma característica para
separarla del resto. Es así, como entre las innumerables técnicas destaca la
cromatografía en columna.

La cromatografía es una de las técnicas más versátiles. Es capaz de separar por

carga eléctrica, por afinidad a un anticuerpo específico o simplemente por su tamaño,
como es el caso de este práctico.

Utilizaremos específicamente la cromatografía de filtración en gel para separar,

desde una muestra de bilis, sus dos componentes principales, micelas y vesículas, y
determinar si existen proteínas asociadas a alguno de estos transportadores

Objetivos:

• Conocer en la práctica, la utilización de la cromatografía

• Aprender conceptos de cromatografía tales como V0, Elusión, etc.
• Calibrar correctamente una columna de cromatografía
• Reconocer transportadores de colesterol
• Comprobar si hay relación entre proteínas y transportadores de colesterol

Materiales
Columna cromatográfica de 40 x 1 cm con bio-gel 5m (exclusión: 60 – 5000
KD)
 Colector de fracciones
Bomba peristáltica
Ultracentrífuga
Repipeteador
Tubos de ensayo libres de fosfato
Tubos ependorff
Gradilla
Bloque metálico
Espectrofotómetro
Vórtex

Reactivos

Muestra de bilis humana

Ac. Tricloroacético 20%
Dietileter:etanol 2:1 v/v
Reactivo alcalino: - 50mL Na2CO3 2%
- 1mL CuSO4 1%
- 1mL Na-K-Tartrato 2%
Reactivo de folin: reactivo de folin-ciocalteu:H2O (1:1 v/v)
Buffer de elución: Tris 20mM, NaCl 140 mM, NaN 0,03%
Estándar BSA 1mg/mL
Agua destilada
Azul de dextrano

Método
Preparación de la columna:
El primer paso de este práctico, consiste en montar las tres partes principales de
este sistema, para ello prepararemos el gel dejándolo sedimentar y luego remplazaremos
el sobrenadante con igual volumen del buffer de elución. Con la bomba de vacío,
desgasificaremos el gel para que el aire no interfiera con nuetra medición. Una vez
compactado nuestro gel, lo introduciremos lentamente en la columna de vidrio. Lavar la
columna con buffer de elución (3 volumenes aprox)

Calibración del gel:

Utilizaremos la manguera de perfusión para introducir azul de dextrano. Se deja
eluir el azul completamente y luego se miden los tubos de elución en espectrofotómetro
contra un blanco a 660nm. El tubo que tiene la primera marca de subida en la
concentración, corresponde al V0 (en el caso de este práctico es el nº 14). El último tubo
que contenía azul de dextrano, corresponde al Vt. Una vez determinados estos
volúmenes, podemos utilizar nuestra muestra

Separación de vesículas y micelas

Lo primero que necesitamos para cualquier cromatografía, es preparar la muestra
que queremos analizar, para ello centrifugamos 5mL de bilis nativa durante 60 mins a
28500 RPM. El sobrenadante de este tubo, corresponde a la fase isotrópica de la cual
incubaremos una alicuota a 37ºC para detectar determinar su tiempo de nucleación.
Para la corrida cromatográfica, tomamos 0,5 mL de la bilis centrifugada y la sembramos
a través de la bomba peristáltica, cuidando de no contaminar el buffer de elusión.
Recogemos unos 50 tubos con 1 mL, hasta que halla eluido toda la muestra biliar.
Luego de esto, procederemos con distintas técnicas a determinar la concentración de
fosfolípidos y proteínas independientemente.

Determinación de fosfolípidos. (Reacción de Fiske y Subbarow)

IMPORTANTE: Utilizar tubos de vidrio LIBRES DE FOSFATO

Agregar una muestra de 50 µL de cada tubo eluido a un tubo de ensayo. Agregar

1mL de agua y 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado para mineralizar la muestra.
Calentar los tubos durante 3 horas a unos 180ºC. Luego de enfriarse, agregar 2 gotas de
peróxido de hidrógeno y calentar a 180ºC durante otras 2 horas hasta que las muestras
se vuelvan transparentes. Enfriar antes de agregar 4,5 mL de molibdato de amonio, lo
cual formará fosfomolibdato de amonio, que tiene una coloración azul y es detectado a
830nm. Agregar 200µL de reactivo de Fiske.Calentar a 100ºC durante 8 mins para luego
enfrias y leer en el espectrofotómetro a 830 nm.

Determinación de proteínas totales ( Método de Lowry modificado)

Agregar 100µL de cada fracción de elución a un micro tubo independiente.
Agregar TCA 20% para precipitar las proteínas de la muestra. Incubar esta solución
durante al menos 12 horas a 4ºC. Pasado el tiempo, se debe centrifugar esta muestra a
5000g durante 10 mins. Se formará un pelet de proteínas adherido al fondo del tubo.
Resuspender con 1,5 mL de dietileter: etanol, agitar, centrifugar y repetir. Finalmente,
evaporar el resto. Resuspender nuevamente, esta vez usando 100µde NaOH. Incubar a
37º durante 30 mins para disolver las proteínas. Tomar 30 µL para realizar el
procedimiento de Lowry. Adicionar 70 µL de NaOH para completar un volumen final
de 100 µL en todos los tubos. Utilizando un repipeteador, agregar 1mL de reactivo
alcalino a cada tubo. Luego de 10 mins, agregar el reactivo de Folin. Dejar reposar
durante 30 ins, par que se lleve a cabo la reacción y finalmente leer en
espectrofotómetro a 750 nm

Resultados
I) Azul de Dextrano. Determinación de Vo y V t
 Fracción Abs
33 0,044
34 0,029
35 0,014
Los siguientes datos son los obtenidos por los
procedimientos: 36 0,012
37 0
38 0,003
39 0
40 0
41 0
42 0,002
Fracción Abs Fracción Abs 43 0,007
9 0 21 0,11 44 0
10 0,002 22 0,131
11 0,005 23 0,146
12 0,004 24 0,148
13 0,012 25 0,155
14 0,005 26 0,156
15 0 27 0,164
16 0,052 28 0,15
17 0,345 29 0,139
18 0,279 30 0,113
19 0,137 31 0,087 Con los datos obtenidos
20 0,109 32 0,069 podemos estimar Vo y Vt

Abs v/sFraccion
0,4

0,35

0,3

0,25
Absorción

0,2

Abs v/s Fraccion

0,15

0,1

0,05

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Fracción
Vo= 15 Vt= 37

II) Concentración v/s fracción de fosfolípidos y proteínas

Fosfolípidos

St Abs Cuerva de calibración fosfolípidos

0,00 0
0,00 0 1,2
y = 0,2283x - 0,0123
0,25 0,059 1
R2 = 0,9932

Absorbancia
0,25 0,064 0,8
0,50 0,109 0,6
0,50 0,068 0,4
1,00 0,211 0,2
1,00 0,220 0
2,00 0,401 0 1 2 3 4 5

2,00 0,423 Concentración (m M)

4,00 0,878
4,00 0,957

Del gráfico anterior podemos apreciar la relación de las absorbancias con las
concentraciones de los distintos estándares. Como nos han pedido realizar finalmente un
gráfico que relacione concentración con absorción, tomaremos un valor de la curva de
calibración de fosfolípidos para así sacar la concentración correspondiente a la
absorbancia en fosfolípidos.

Para una absorción X la concentración equivalente es de 3 mM, según la

ecuación de la curva obtendríamos un X de:

Y= 0, 2283x – 0,0123 → y = 0,2283· (3) – 0, 0123 = 0,6726

A partir de este dato, que a una absorbancia de 0,6726 de fosfolípidos nos da una
concentración de 3 mM, por regla de tres simple sacaremos las otras concentraciones de
fosfolípidos a partir de su absorbancia.

Ej
ABS []
0,6726 → 3
0,014 → X

X = 3 · 0,014 = 0,0624
0,6726

Proteinas

0,6
y = 0,9236x + 0,0133
0,5
R2 = 0,9767
Absorbancia

0,4

Proteínas 0,3

0,2

0,1

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentración (mM)
 St Abs
0,00 0
0,00 0
0,1 0,153
0,1 0,102
0,2 0,182
0,2 -
0,3 0,308
0,3 -
0,4 0,353
0,4 -
0,5 0,515
0,5 0,446
Con las proteínas seguimos el mismo procedimiento para obtener las concentraciones
con respecto a la absorbancia.

Y= 0,9236x + 0,0133 Y= 0,9236· (0,2) + 0,0133 = 0,19802

Ej X = 0,2 · 0,006 = 0,0060
ABS [] 0,19802
0,19802 → 0,2
0,006 → X

[ ] (fosf) [ ] (prot)
Fracción Abs (fosf) Abs(prot)
mM mM
11 0,000 0 0,000 0
12 0,000 0 0,000 0
13 0,000 0 0,000 0
14 0,001 0,0044 0,000 0
15 0,000 0 0,000 0
16 0,014 0,0624 0,000 0
17 0,013 0,0579 0,000 0
18 0,022 0,0981 0,000 0
19 0,007 0,0312 0,000 0
20 0,012 0,0535 0,000 0
21 0,026 0,1159 0,006 0,006
22 0,030 0,1338 0,004 0,004
23 0,044 0,1962 0,013 0,013
24 0,052 0,2319 0,000 0
25 0,055 0,2453 0,020 0,0201
26 0,058 0,2586 0,017 0,0171
27 0,054 0,2408 0,044 0,0444
28 0,073 0,3256 0,070 0,0706
29 0,084 0,3746 0,091 0,0919
30 0,137 0,6110 0,576 0,5817
31 0,261 1,1641 0,334 0,3373
Fracción Abs (fosf) [ ] (fosf) Abs (prot) [ ] (prot)
32 0,308 1,3737 0,331 0,3343
33 0,238 1,0615 0,281 0,2838
34 0,134 0,5976 0,184 0,1858
35 0,076 0,3389 0,036 0,0363
36 0,060 0,2676 0,001 0,0010
37 0,035 0,1561 0,000 0
38 0,006 0,0267 0,000 0
39 0,000 0 0,000 0
40 0,004 0,0178 0,000 0
41 0,000 0 0,000 0
42 0,041 0,1828 0,000 0
43 0,000 0 0,000 0
44 0,000 0 0,000 0
45 0,015 0,0669 0,000 0
46 0,000 0 0,000 0
 1,6

1,4

1,2
Concentración (mM)

1
Serie1
0,8
Serie2
0,6

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40 50
Fracciones

Discusión
En la primera parte de este laboratorio realizamos la calibración del gel. El
primer paso de esta parte no la llevamos a cabo nosotros, ya que la columna fue llenada
previamente, por lo que se asume que no hubo errores en la técnica, y que, por tanto, los
resultados obtenidos no tendrán errores debido a problemas con el gel. Además, el gel
no había sido utilizado previamente, así que no debería tener fallas que afectaran el flujo
de la muestra a examinar.
Como la técnica de calibración es desarrollada por una máquina que controla el
volumen de las fracciones y el flujo de la muestra (entre otros), tampoco deben
considerarse errores humanos en esta parte, pero si en la medición de absorbancia de las
fracciones. Aquí puede haber errores en las cubetas en las que medimos, o problemas
con el espectrofotómetro. En nuestro caso, una de las mediciones de las fracciones
resultó equivocada debido a la posición de la cubeta en la máquina, por lo que tuvimos
que realizar la medición de nuevo.
 En la segunda parte del laboratorio corrimos una muestra de bilis en el gel
previamente calibrado. En este caso los errores probables serian los mismos de
absorbancia de la parte anterior.
Por otra parte, determinamos una relación entre proteínas y micelas. Esto no se
sabe porque puede ser, quizá la bilis analizada presente alguna patología. También
podría ser que las proteínas se relacionen a las micelas mediante uniones por carga u
otras no covalentes.

Conclusión
Según los resultados obtenidos, podemos decir que:
La muestra de bilis examinada contenía una pequeña cantidad de vesículas. Por
el contrario, encontramos una concentración considerable de micelas.
Existe una relación entre las micelas y las proteínas encontradas en la bilis, ya
que ambos se encuentran en las mismas fracciones, y tienen su pick dentro de las
mismas. Sin embargo, no sabemos que tipo de relación hay entre ellas.
El manejo de los materiales y el desarrollo del método de esta técnica deben ser
llevados a cabo meticulosamente, ya que cualquier error se evidencia en los
gráficos de manera considerable.

Bibliografía
Lehninger, Albert, “Principios de Bioquímica”, 1995, Ediciones Omega, S.
A., Barcelona

Guía de trabajos prácticos, Carrera Medicina 2007.