9 Espectrofotometria Ultravioleta-Visvel

1.Introduo Terica Chama-se espectrofotometria a qualquer procedimento que utiliza a luz (radiao eletromagntica) para medir a concentrao qumica de qualquer espcie. Radiao eletromagntica nada mais que a radiao existente como luz, as microondas, os sinais de televiso e rdio e os raios X. Estamos constantemente no meio de radiao eletromagntica, principalmente nas radiaes que podemos ver, a luz visvel. Como sabemos, a luz visvel composta por um espectro de cores que vai do vermelho, nas extremidades dos comprimentos de ondas maiores, para o violeta, nas extremidades dos comprimentos de onda curtos. A luz visvel uma parcela muito pequena do espectro eletromagntico. Seus comprimentos de onda variam de 380 nm a 780 nm. Na figura 1, segue o espectro eletromagntico destacando o espectro da luz visvel na Figura 2. A radiao ultravioleta (UV), que provoca as queimaduras pela luz solar, possui comprimentos de onda menores que os da luz visvel, assim como os raios X e os raios (gama) possuem comprimentos de onda ainda menores. Acima do visvel, temos primeiramente a radiao infravermelha (IV) e maiores ainda, temos as microondas e as ondas de rdios (AM e FM). Os espectros de uv-visvel geralmente apresentam apenas algumas bandas de absoro largas se comparadas com tcnicas como espectroscopia de infravermelho que produz muitas banda. A espectroscopia uv-visvel fornece apenas poucas informaes qualitativas para identificao e caracterizao de compostos, mas trata-se de tcnica extremamente til no estudo de substncias que promovem cor.

Figura 1 Espectro da luz

Figura 2 Espectro da luz visvel

Tabela 1: Comprimentos de onda da luz visvel. Cor violeta azul verde amarelo laranja vermelho Comprimento de onda (nm) 390 - 455 455 - 492 492 - 577 577 - 597 597 - 622 622 - 780

Para comparao da cor observada com o espectro obtido, utiliza-se a correlao entre a cor absorvida. A cor observada a complementar da absorvida, conforme tabela 2:

Tabela 2 - Absorbncias e cores complementares Intervalo de Comprimento de Onda Cor Absorvida (nm) 650 - 780 Vermelho 595 - 650 Laranja 560 - 595 Amarelo-verde 500 - 560 Verde 490 - 500 Verde azulado 480 - 490 Azul esverdeado 435 - 480 Azul 380 - 435 Violeta Cor Complementar (ou observada) Azul esverdeado Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

http://members.tripod.com/alkimia/corantes.htm Quando um material interage com a radiao eletromagntica, uma srie de processos pode ocorrer, como disperso, absoro, fluorescncia/fosforescncia e reao fotoqumica. Em geral, quando se utiliza radiao na faixa do UV-Visvel mede-se a absoro da radiao pelas molculas dos compostos qumicos. A absoro de energia quantizada e faz com que ocorra a passagem dos eltrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em um estado mais excitado. Quando esse eltron retorna ao seu estado fundamental, libera exatamente a mesma energia que foi absorvida. Esta energia, quando na regio visvel do espectro eletromagntico, fornece a cor. A relao entre a energia absorvida em uma transio eletrnica e a freqncia (v), o comprimento de onda () dado na equao abaixo: E=h.v = h.c/ Onde: h a constante de Planck que igual a 6,626 x 10-34 J.s c a velocidade da luz que igual a 2,998 x 108 m.s-1 no vcuo E a energia absorvida pela molcula na transio eletrnica entre um estado de menor energia (estado fundamental) e um estado de maior energia (estado excitado). A energia absorvida depende da diferena de energia entre o estado fundamental e o estado excitado. Quanto menor for a diferena, maior ser o comprimento de onda de absoro. A Energia diretamente proporcional freqncia (v) e inversamente proporcional ao comprimento de onda ().

Figura 3: Tipo de excitao provocada pela radiao em molculas orgnicas e inorgnicas. Um espectrofotmetro um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo (Fig. 4). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar atravs da amostra um feixe de luz monocromtica (de um nico comprimento de onda, ou quase). O espectrofotmetro permite-nos saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento de onda.

Figura 4: Espectrofotmetro. A luz dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um prisma ptico e passa atravs da amostra, contida numa cubeta ou clula de espectrofotmetro. 1.1. Espectros de absoro O conjunto das absorbncias aos vrios comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absoro e varia de substncia para substncia. Se uma substncia verde, por exemplo, ento deixa passar ou reflete a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na regio do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de vrias substncias diferentes (Fig. 5).

Figura 5: Espectros de absoro de absoro de diferentes substncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substncia 1, por exemplo, absorve pouco na regio do visvel, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos.

Uma vez que diferentes substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substncias com base no seu espectro. Permite tambm quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a concentrao da substncia, como vamos ver adiante. s vezes uma substncia, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar um espectro de absoro diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar essas mesmas alteraes. Por exemplo, o NADH reduzido absorve a 340 nm, enquanto que a forma oxidada no tem absorbncia significativa a esse comprimento de onda (Fig. 5).

Figura 5: Espectros de absoro do NAD+ e do NADH.

Essas diferenas de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso de reaes que se esteja a estudar, por exemplo, reaes metablicas que envolvam a oxidao do NADH ou a reduo do NAD+.

1.2. Espectrofotometria e quantificao 1.2.1. Princpios de absoro da luz: 1. A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada:

Figura 6: Relao entre a concentrao de uma soluo e a luz absorvida. A soluo 20g/l absorve o dobro da soluo 10g/l.

2. A absoro da luz tanto maior quanto maior for a distncia percorrida pelo feixe luminoso atravs das amostras:

Figura 7: Relao entre a distncia percorrida pelo feixe luminoso e a luz absorvida por uma soluo. A soluo contida na cubeta com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida na cubeta de 1 cm.

Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert:

Normalmente usam-se cubetas com 1 cm de comprimento, de modo que a equao fica:

A= .c
Ou seja, a absorbncia da luz a cada comprimento de onda diretamente proporcional concentrao da soluo contida na cubeta. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentraes muito elevadas da substncia, podendo nesses casos diluir previamente a amostra a medir. 1.2.2. Mtodos colorimtricos Com alguma freqncia necessrio quantificar substncias em misturas complexas, ou que no absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. Nestes casos utilizam-se os chamados mtodos colorimtricos - o composto a quantificar posto em contato com um reagente especfico, de modo a desenvolver uma cor cuja intensidade diretamente proporcional concentrao da substncia na mistura original. Por exemplo, para quantificar protenas numa soluo pura pode medir-se a absorbncia a 280 nm, sendo esta proporcional concentrao de protena. Mas se quisermos saber a concentrao de protena num extrato impuro, este mtodo j no pode ser utilizado, porque outras substncias, como, por exemplo, os cidos nucleicos, tambm absorvem a este comprimento de onda. Neste caso podemos utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as protenas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiao a 540 nm. Para quantificar espectrofotometricamente uma substncia necessrio, obviamente, saber o valor de . Para isso necessrio preparar uma srie de solues do composto a quantificar, de concentrao conhecida, faz-las contatar com o reagente e medir as absorbncias ao comprimento de onda adequado (Fig. 8).

Figura 8: Calibrao de um mtodo colorimtrico. A absorbncia no comprimento de onda escolhido diretamente proporcional concentrao do composto na soluo. No exemplo da Fig. 8, h uma relao linear perfeita entre a concentrao da substncia (expressa em molaridade, M) e a absorbncia ao comprimento de onda de medida. Podemos assim obter uma reta do tipo

A= .c (ou A= .c + b, caso a reta no passe na origem)

em que A a absorbncia ao comprimento de onda de medida, c a concentrao em M e a constante de proporcionalidade. Sabendo esta relao, podemos fazer corresponder uma absorbncia medida, a uma concentrao de substncia na soluo a analisar. Muitas vezes o mtodo s linear at uma certa concentrao da substncia. Nesse caso, utiliza-se a zona em que a relao linear, diluindo a soluo a medir, sempre que necessrio, de modo a que a absorbncia resultante esteja contida no intervalo da reta de calibrao.

9 Espectrofotometria Ultravioleta-Visvel
1. Introduo terica Vide texto avulso 2. Procedimento 2.1 Levantamento da curva de Absoro Ligue o espectrofotmetro e espere 5 minutos para que estabilize. A seguir faa a calibrao do aparelho com o branco cubeta com o solvente - (100% de Transmitncia) e se for necessrio com a cubeta preta para 0% de transmitncia. Coloque a soluo com a espcie a ser analisada no local para medida e inicie o processo de varredura com o menor comprimento de onda possvel. Para Visvel iniciar em 380 nm Para Ultravioleta iniciar em 200 nm Os saltos nos valores do comprimento de onda, podem ser de 1, 2, 3, ou at 5 nm, a critrio do professor. A cada valor de comprimento de onda ajustado no equipamento, faa a medida da Absorbncia e anote os valores numa tabela. Fazendo uso de papel milimetrado ou de uma planilha eletrnica, trace a curva de Absorbncia em funo do comprimento de onda. A determinao do comprimento de onda no qual as prximas medidas sero feitas baseada nessa curva. interessante levantar a curva tambm para o solvente e determinar se existe interferncia em determinados comprimentos de onda. 2.2 Preparao da curva de calibrao Determinado o comprimento de onda para trabalho, deve-se proceder medida da Absorbncia para pelo menos CINCO solues com concentrao conhecida ( interessante que a faixa de amplitude de concentrao dessas cinco solues seja da ordem de 1000 unidades). Esses pontos devem, ser utilizados para traar uma curva e determinar a regio de linearidade na qual pode ser aplicada a Lei de Beer-Lambert. Caso no seja possvel determinar a regio de linearidade com esses dados, uma nova bateria de solues com concentraes adequadas deve ser preparada. Determinada a regio de linearidade da curva, a equao da reta deve ser ento estabelecida e essa equao ser utilizada para a determinao da concentrao de solues desconhecidas. A utilizao das ferramentas estatsticas para a regresso linear, determinao da equao da reta via planilhas eletrnicas ou no, altamente recomendvel. 3 Questionrio

1) 2)

Cite trs outras aplicaes analticas que utilizam diferentes tipos de radiao para a qualificao/quantificao das espcies. Trace a curva de Absorbncia em funo do comprimento de onda para o naftaleno em THF (tetrahidrofurano) e indique qual (is) o(s) comprimento(s) de onda que pode(m) ser utilizado(s) para a elaborao da curva de calibrao. Escreva a frmula estrutural e molecular para o naftaleno e para o THF. Trace a curva para da Absorbncia em funo da concentrao para os pontos avaliados no item 2 do experimento. Determine graficamente e algebricamente a equao da reta para o trecho linear da curva. Considerando que uma amostra de naftaleno com concentrao conhecida apresentou Absorbncia igual a 0,158, qual a concentrao em ppm ?

3) 4) 5) 6)

Obs.: Entregar junto com o relatrio todos os grficos produzidos, bem como o mtodo utilizado para a determinao da equao da reta.