O termo derivado de "en" = dentro e "zima" = levedura.

. As enzimas so molculas de protena bastante grandes e complexas que agem como catalisadoras em reaes bioqumicas. Como as protenas, elas consistem em longas cadeias de amino-cidos unidas por ligaes de peptdeos. Elas so formadas dentro das clulas de todos os seres vivos, plantas, fungos, bactrias, e organismos microscpicos unicelulares. As enzimas so classificadas segundo os compostos nos quais elas agem: - lipases atuam nas gorduras decompondo-as em glicerol e cidos graxos; - catalases decompem a gua oxigenada; - amilases decompem os amidos em acares mais simples; - proteases decompem as protenas; - celulases decompem a celulose; - pectinases decompem a pectina; - xilanases decompem a xilana; - isomerases catalizam a converso da glicose em frutose; - beta-glucanases decompem a beta-glucana; - outras. As enzimas comumente encontradas no trato digestivo so a pepsina, a tripsina e peptidases (que decompem as protenas), lipases e amilases. Como as enzimas agem ? Elas controlam vrias funes vitais incluindo os processos metablicos que convertem nutrientes em energia e em novos materiais para as clulas, alm de acelerar a reao dos processos bioqumicos, tornando-os mais eficientes. As enzimas se conectam s substncias reagentes e enfraquecem certas ligaes qumicas, de modo que menos energia (de ativao) necessria para que as reaes ocorram. Se as enzimas estivessem ausentes, as reaes qumicas seriam lentas demais para dar suporte vida. As enzimas so bastante especficas, decompondo ou compondo apenas certas substncias em certas condies de temperatura, pH e concentrao do substrato (substncia na qual a enzima atua). Algumas transformaes envolvem vrias enzimas

como a da glicose em gua e gs carbnico que leva 25 passos, cada passo com a participao de vrias enzimas. Quando as enzimas so aquecidas, elas aceleram ainda mais as reaes, mas apenas at certo ponto a partir do qual elas se modificam e perdem suas propriedades catalizadoras. Quando a temperatura cai, as enzimas voltam ao seu estado anterior. De onde as enzimas surgem ? As clulas usam a informao dos nossos genes para fabricar protenas, as quais so usadas para vrias funes. A enzima uma dessas protenas. Tambm, as enzimas podem ser encontradas nos alimentos. As clulas possuem de 2000 a 3000 enzimas diferentes em cada uma. Clulas diferentes possuem enzimas diferentes. Como as enzimas atuam na boca ? Quando o alimento mastigado na boca, ele fica reduzido pequenos fragmentos que se misturam com a saliva produzida pelos trs pares de glndulas salivares (partidas, submandibulares e sublinguais). A saliva um lquido neutro ou ligeiramente alcalino, que contm gua, muco e enzimas (amilase salivar ou ptialina). As glndulas submandibulares e sublinguais segregam uma saliva mais grossa que contm a enzima mucina. A outra enzima da saliva a ptialina, que digere parcialmente os amidos e converte-os em maltose (um tipo de acar). A gua umedece o alimento, o muco lubrifica-o e a amilase catalisa a hidrlise do amido (polissacardeo) que o transforma em molculas de acares mais simples (oligossacardeos e monossacardeos). A saliva tambm dissolve algumas molculas que so captadas pelos receptores de sabor nas papilas gustativas da lngua (permitindo o reconhecimento dos sabores). O alimento mastigado e ensalivado fica reduzido uma pasta mole: o bolo alimentar. Como as enzimas atuam no estmago ? O estmago recebe o bolo alimentar e o piloro fechado para que o bolo alimentar no passe imediatamente para o duodeno. O estmago, por meio das glndulas gstricas, libera o suco gstrico que constitudo por gua, cido clordrico (a 0,5% de concentrao), mucos, pelas enzimas pepsina (vrias proteases) e, nos bebs, a renina. O estmago ento se contrai ritmicamente (movimentos peristlticos), o que permite a mistura do bolo alimentar com o suco gstrico. A gua permite que os alimentos se dissolvam ou fiquem em suspenso. O cido clordrico reage com o pepsinognio parar gerar a pepsina, d o grau de acidez ideal para a pepsina atuar e destri muitas das bactrias ingeridas nos alimentos. O muco lubrifica o alimento e protege as paredes do estmago dos efeitos do cido e das

proteases. A pepsina permite a converso das protenas em polipeptdeos e aminocidos e a renina coagula a protena do leite. Quando a digesto estomacal concluda, o piloro vai abrindo e liberando a pasta cida semi-lquida (quimo) do estmago para o duodeno em pequenas quantidades. Os lquidos demoram pouco a passar para o duodeno mas o estmago vai liberando seu contedo meia-hora aps o incio da refeio e s esvaziado de 2 a 3 horas depois, dependendo do tipo do alimento. Como as enzimas atuam no duodeno e no intestino delgado ? O quimo recebido do estmago misturado ao suco pancretico e intestinal (com enzimas proteolticas) e blis, que so lanados no duodeno atravs de canais. O suco pancretico possui diversas enzimas, entre as quais a tripsina (transforma protenas em amino-cidos), a amilase (transforma amido e dextrina em maltose), a maltase (transforma maltose em glicose) e a lipase pancretica (transforma gordura em cidos graxos e glicerina). Algumas glndulas que revestem o intestino segregam as enzimas sacarase (transforma sucrose em glicose e frutose), maltase, lactase (transforma lactose em glicose e galactose), lipase, amilase e erepsina que em parte formam o suco intestinal. A ausncia ou baixa atividade da lactase pode causar vrios graus de intolerncia ao leite. O fgado emite a blis, que apesar de no provocar transformaes alimentares, facilita a digesto diluindo o contedo intestinal, funcionando como antissptico, reduzindo a tenso superficial das gotas ou glbulos de gordura (o que facilita a digesto pela lipase do pncreas e do intestino) e impedindo-as de se aglutinar graas aos sais biliares. A blis uma substncia alcalina de cor verde e amarga e neutraliza a acidez do quimo vindo do estmago. Depois de concluda a digesto intestinal, a massa alimentar fica reduzida a uma pasta semi-lquida de aspecto leitoso (quilo) formada principalmente por gua, sais minerais, glicose, glicerina, cidos graxos e aminocidos, todos prontos para serem absorvidos. Como os nutrientes so absorvidos ? Na membrana mucosa do intestino delgado ficam muitas reentrncias e dobras chamadas villi que aumentam a superfcie de absoro em mais de 600 vezes o que seria se o intestino fosse um simples cilindro. Os produtos da digesto so absorvidos por pequeninas artrias imediatamente sob o epitlio nos villi.

Os amino-cidos, sais minerais e vitaminas solveis em gua so transportados pela corrente sangunea primeiro ao fgado e depois ao resto do corpo para reparar e construir os tecidos e o excesso convertido em uria pelo fgado para ser depois excretado pelos rins. A glicerina e os cidos graxos so captados nos vasos linfticos e novamente reunidos em pequenos glbulos de gordura. Esses glbulos so depois transportados pela corrente sangunea para os tecidos, onde so consumidos em reaes de oxidao e/ou armazenados sob a forma de tecido adiposo. Os acares (sob a forma de monossacardeos) so temporariamente armazenados no fgado como glicognio e liberados como glicose quando necessrio. Existe uma espcie de inteligncia intestinal descrita por Hunt, que nada mais do que a capacidade do delgado em absorver mais ou menos determinado grupo alimentar, de acordo com a necessidade do organismo naquele momento. O que acontece com o que no absorvido ? Os alimentos levam cerca de 4 horas para atravessar o intestino delgado (quase 7 metros). Ao chegar ao intestino grosso (1,2 metros), bactrias presentes ainda segregam algumas enzimas que permitem que algumas substncias resultantes da digesto ainda sejam absorvidas. Vrios tipos de bactrias habitam o intestino grosso e decompem algumas fibras indigerveis, fermentam acares e decompem algumas protenas. Certas bactrias podem sintetizar vitamina K e B. Ainda no est claro o quanto de vitamina B pode ser absorvido pelo intestino grosso, mas metade da quantidade necessria de vitamina K de origem bacteriana. Os alimentos levam de 12 a 18 horas para alcanar o reto. Durante esse tempo a gua absorvida e os dejetos so compactados gradualmente para serem expelidos. So da maior importncia estas etapas da excreo ou eliminao porque no intestino grosso s restam substncias txicas, como o escatol, que se reabsorvidos por um atraso ou retardo no trnsito, como ocorre na priso de ventre, podem gerar aquilo que denominamos de auto-endo-intoxicao, que caracterizada por cansao, desnimo, cefalia, mau hlito, etc. As enzimas atuam fora do organismo ? Enzimas atuam na obteno do lcool a partir dos acares (e dos acares a partir dos amidos), reduzem o nitrognio e o fsforo dos dejetos orgnicos, atuam nos bolos (evitam que solem), aceleram a produo de cerveja, atuam na produo dos queijos e removem a lactose, funcionam em detergentes, atuam em amaciantes de roupa, atuam na produo de couros, atuam na produo de papel, atuam na produo de dextrose, frutose (usados em confeitos e refrigerantes), amaciam o algodo e clareiam o vinho e sucos.

As enzimas so consumidas nos processos ? Depois de a reao se completar, a enzima fica intacta e disponvel para iniciar outra reao. Algumas enzimas so capazes de participar de milhares de reaes em um nico minuto. Em princpio, isso pode continuar indefinidamente, mas na prtica a maioria das enzimas perde a estabilidade e capacidade de catalisar as reaes. H alguma demonstrao prtica da atuao de enzimas ? Sim. Pegue um abacaxi fresco, e um recipiente com gelatina comum. Corte uma fatia do abacaxi e coloque-a em cima da gelatina. Observe o que acontece. Algumas embalagens de gelatina recomendam explicitamente no misturar com abacaxi. O abacaxi contm enzimas que decompem as protenas da gelatina.

PURIFICAO DE LIPASES EM COLUNA DE CROMATOGRAFIA DE TROCA INICA COM LEITO EXPANDIDO AUTORES: PADILHA, G.S. (UNICAMP) ; ALEGRE, R.M. (UNICAMP) ; TAMBOURGI, E.B. (UNICAMP) ; CURVELO SANTANA, J.C. (UNINOVE) ; FERREIRA, J.F. (UNICAMP) RESUMO: Este trabalho objetivou purificar as lipase de Pseudomona cepacia, em uma coluna da adsoro em leito expandido, usando as resinas trocadoras de ons Amberlite IRA 410. A purificao das enzimas se realizou em trs condies de leito expandido (H): uma vez e meia (6 cm), duas (8 cm) e trs (12 cm) vezes a altura inicial do leito fixo (H0 = 4 cm). Na purificao das enzimas, observou-se que na melhor condio um fator de purificao prximo de 80 foi encontrado para uma altura de leito expandido igual a 6 cm, o que corresponde a um grau de expanso igual a um e meio. PALAVRAS CHAVES: lipase, purificao, coluna cromatogrfica INTRODUO: Dentre os diversos produtos biotecnolgicos, as lipases (triglicerol acil-hidrolases E.C. 3.1.1.3) so enzimas lipolticas que hidrolisam ligaes steres de triacilgliceris e sero estudadas neste trabalho. Um importante aspecto das enzimas lipoliticas sua caracterstica de catalisar reaes na interface leo-gua. Muitas das lipases so solveis em gua e agem em substratos insolveis em gua, este fato diferencia as lipases das esterases, j que essas agem em substratos solveis em gua. As lipases so encontradas em diversos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e bactrias. O rpido crescimento celular, em relao aos fungos, uma das vantagens das fontes bacterianas como produtoras destas enzimas, alm de serem consideradas de alto potencial biotecnolgico devido estabilidade em elevadas temperaturas e a solventes orgnicos. Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kDa, atividade tima em pH na faixa entre 6 a 8 e em temperaturas entre 30 e 40 C (Beisson et al., 2000; Borgstrm and Brockman, 1984; Kordel et al., 1991; Pastore et al., 2004). Pastore et al. (2003) obtiveram lipases de Rizopus sp. aps fermentao em meio contendo azeite de oliva. Depois, estas enzimas foram purificadas usando fracionamento com sulfato de amnio e cromatografia em resina SEPHADEX, o fator de purificao ficou prximo de 5 e a recuperao da atividade ficou abaixo dos 3%. Sharma et al. (2002) purificou e caracterizou uma lipase de Bacilus sp. RSJ.1. A purificao se deu em etapas,onde aps a ltima etapa se alcanou um fator de purificao acima dos 200, embora a recuperao da atividade da enzima tenha sido de inferior aos 20%. Outras tcnicas empregadas purificao de lpases so citadas por Saxena et al (2003). Assim, neste trabalho foi realizada a purificao de lipases de Pseudomona cepacia, por processos cromatogrficos de troca inica, usando a tcnica da adsoro em leito expandido.

MATERIAL E MTODOS: Material Microorganismos: cepas de Pseudomona cepacia, obtidas da Fundao Andr Tosello, e mantido a 4C em agar-nutriente. Coluna de adsoro em leito expandido: coluna de vidro, com 1 cm de dimetro interno

e 30 cm de altura, possuindo um pisto que, por ser ajustvel, reduz o espao morto acima do leito quando o mesmo se encontrar expandido. Este pisto tem sua haste perfurada desde a base at seu topo, de forma a permitir a passagem de fluido vindo da coluna. Uma malha de 60 mesh foi posicionada na base da coluna e na base do pisto, para manter as resinas dentro da coluna, evitando as perdas da resina, por sedimentao e por arraste. Partculas: resinas de troca inica Amberlite IRA 410, de dimetro mdio 4,4.10-4 m, massa especfica 1,12 g/cm3 (VETEC, Rio de Janeiro).

Mtodos Purificao das lipases: o leito cromatogrfico foi composto por 2 g da resina de troca inica Amberlite IRA 410. A adsores das enzimas foram realizadas com o sistema em expandido em uma vez e meia (6 cm), duas (8 cm) e trs vezes (12 cm) a altura do leito fixo (4 cm), a temperatura ambiente (22 C) e pH 7. O leito de adsorventes foi prequilibrado na altura de trabalho com uma soluo tampo fosfato (0,07 M), ento, 5 mL da meio fermentado contendo as lipases foram injetados no fluxo. A eluio foi feita pelo uso de uma soluo de NaCl 0,25 M a 14 mL/min de fluxo descendente. Para tal, o pisto foi baixado at 2 cm acima da altura do leito fixo, para s ento ser iniciada a eluio, na qual amostras contendo 5 mL cada, foram coletadas. Determinao das atividades das lipases: preparou-se o substrato conforme metodologia de Soares (2000). A protena total foi medida pelo mtodo de Bradford (1976). RESULTADOS E DISCUSSO: A seguir, nas Figuras 1 e 2 esto apresentadas as curvas de cromatografia caracterstica do meio fermentado passando e adsorvendo no leito de resinas de troca inica expandidas a uma vez e meia, duas e trs vezes a altura do leito fixo, para as protenas e atividade de lpases, respectivamente. Detecta-se a adsoro, passagem e eluio das biomolculas pela anlise das curvas de protenas, bem como, nota-se a presena das lipases por sua curva de atividade enzimtica. Distinguem-se as etapas de adsoro das demais por ser a regio onde nota-se pouco ou nenhuma passagem de protenas, iniciando uma etapa de lavagem do leito, onde todas as biomolculas no adsorvidas so retiradas do meio adsortivo, at que o contedo protico chegue a um valor mnimo e, a na eluio se nota a dessoro das enzimas e protenas adsorvidas na resina (Curvelo Santana, 2006; Kalil, 2000; Santos, 2001). Na condio de grau de expanso igual a uma e meia (1,5) vezes a altura do leito fixo o fator de purificao ficou prximo dos 80, isso aconteceu provavelmente, porque a velocidade do fluido nesta condio foi ideal para promover a exposio completa de toda a rea superficial da resina adsorvente, aumentando a interao partculabiomolcula e, com ela, elevando a adsoro das enzimas (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Biazus et al., 2006; Curvelo Santana, 2006; FernandezLahore et al., 2001; Kalil, 2000; Santos, 2001; Sosa et al., 2001). O fator de purificao e a recuperao da atividade foram maiores que os obtidos por Pastore et al. (2003) e Saxena et al. (2003), entretanto, foi menor que o obtido por Sharma et el. (2002).

CONCLUSES: Observou-se que a resina de troca inica Amberlite IRA 410 e o tampo fosfato foram, bons meios de adsoro e de transporte, de forma que ambos promoveram uma boa afinidade entre a resina e as lipases. A recuperao da atividade e

o fator de purificao da enzima aumentaram com a reduo do grau de expanso do leito, sendo mais alta para uma expanso igual a 1,5 vezes (6 cm) a altura do leito fixo (4 cm), condio essa que promoveu a total recuperao da enzima (acima de 100%)e um fator de purificao prximo a 80. AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem ao CNPq e a CAPES pelo suporte financeiro. REFERNCIAS BIBLIOGRFICA: Amersham Pharmacia Biotech., 1997. EBA Handbook: Principles and Methods. Uppsala, IBSN 91-630-5519-8, p160. BEISSON, F.; TISS, A.; RIVIRE, C.; VERGER, R., 2000. Methods for lipase detection and assay: a critical review, Eur. J. Lipid Sci. Technol, pp. 133-153. BIAZUS, J. P. M.; SEVERO JR., J.B.; SANTANA, J.C.C.; SOUZA, R.R.; TAMBOURGI, E.B., 2006. Study of amylases recovery from maize malt by ionexchange expanded bed chromatography. Process Biochemistry, 41, 1786-1791. BORGSTRM, B. AND BROCKMAN, H., 2004, Lipases, Ed. Elsevier, New York, EUA. BRADFORD, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72. 248-254. CURVELO SANTANA, J. C., 2006. Caracterizao e recuperao das enzimas  e  - amilases por sistema de adsoro em leito expandido. Tese de Doutorado, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas-SP, KALIL, S. J., 2000. Produo de ilunilase por Kluyveromyces marxianus e purificao da enzima por cromatografia de troca inica em coluna de leito expandido. Tese de Doutorado, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas-SP, 132p. KAMIMURA, E. S.; MENDIETA, O.; Sato, H. H.; Pastore, G.M.; Maugeri, F., 1999. Production of lipase from Geotrichum sp. and adsorption studies on affinity resin, Brazilian Journal of Chemical Engineering. Vol. 16, No. 2, p. 103-112. KORDEL, M., HOFMANN, B., SCHOMBURG, D., SCHMID, R., 1991, Extracellular lipase of Pseudomonas sp Strain ATCC 21808: purification, characterization, crystallization and preliminary X-ray diffraction data, Journal of Bacteriology, Vol. 177, No. 15, pp. 4836-4841. PASTORE, G. M.; COSTA, V. S. R.; KOBLITZ, M. G. B., 2003. Purificao parcial e caracterizao bioqumica de lipase extracelular produzida por nova linhagem de Rhizopus sp, Cincia e Tecnologia de Alimentos, Vol. 23, No. 2, pp. 135-140. PENCREACH, G. AND BARRATI, J. C., 1996. Hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in n-heptane by the Pseudomonas cepacia lipase: a simple test for the determination of lipase activity in organic media, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 18, pp. 417-422. RICHARDSON, J. F. AND ZAKI, W. N., 1954. Sedimentation and fluidization: Part I. Tran. Inst. Chem. Engs. 32, 35-53. SANTOS, E. S., 2001. Recuperao e purificao de enzimas usando adsoro em leito expandido. Tese de Doutorado, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas-SP, 152p. SAXENA, R.K.; SHEORAN, A.; GIRI, B; DAVIDSON, W.S., 2003. Purification strategies for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods, 52, 1-18. SHARMA, R.; SONI, S.K.; VOHRA, R.M.; GUPTA, L.K.; GUPTAS, J.K., 2002.

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