Metabolismo de Nucletidos: Biosntesis y Degradacin Los nucletidos participan como tales en multitud de funciones claves en el metabolismo celular y los

polmeros de nucletidos, los cidos nucleicos, son los depositarios de la herencia celular. 1. Los nucletidos son compuestos ricos en energa que dirigen los procesos metablicos (fundamentalmente la biosntesis) en todas las clulas. 2. Tambin actan como seales qumicas, vnculos esenciales de los sistemas celulares, capaces de responder a estmulos extracelulares (hormonas, factores de crecimiento). 3. Componentes estructurales de una serie de cofactores enzimticos e intermediarios metablicos. Los cidos nucleicos, cido desoxirribonucleico (DNA) y cido ribonucleico (RNA) son los depositarios moleculares de la informacin gentica: La estructura de cada protena, y en ltimo trmino de cada componente celular, es producto de la informacin programada en la secuencia de nucletidos de los cidos nucleicos. En el DNA celular se encuentra especificadas las secuencias de aminocidos de todas sus protenas y las secuencias de nucletidos de todas las molculas de RNA. - Un segmento de DNA que contiene la informacin necesaria para la sntesis de un producto biolgico funcional (protena o RNA) recibe el nombre de gen. - Una clula normal posee miles de genes y en consecuencia no resulta sorprendente que las molculas de DNA tiendan a ser muy largas. La nica funcin del DNA parece ser el almacenamiento de informacin biolgica. - Varias clases de RNA celular: * RNA ribosmicos (rRNA): componentes de los ribosomas (sntesis de protena) * RNA mensajeros (mRNA): cidos nucleicos que transportan la informacin desde un gen (pocos genes) hasta el ribosoma (sntesis de protenas) * RNA de transferencia (tRNA): molculas adaptadoras que traducen con fidelidad la informacin contenida en el mRNA en secuencias especificas de aminocidos * Otros RNAs: microRNAs Estructura general de nucletidos Tres componentes bsicos: - Base nitrogenada - Una pentosa - Un fosfato

Bases purnicas y pirimidnicas

Bases y pentosas: son compuestos heterocclicos (en las pentosas se utiliza el signo prima ()) La base se une por el N1 en pirimidinas y N9 en purinas a travs de un enlace N-glucosdico (H2O: OH de la pentosa y un H de la base)

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Nuclesidos = Azcar + Base (sin Fosfato)

Nucletidos = Azcar + Base + Fosfato

Nomenclatura

Funciones de los nucletidos Nucletidos como portadores de energa qumica (ATP y en menor medida GTP) Nucletidos como cofactores y coenzimas: incorporacin de adenina (NAD+ y NADP+ son coenzimas que participan en una amplia gama de reacciones enzimticas de oxido-reduccin: Mecanismo de reduccin de los ribonucletidos por rNDP reductasa) Nucletidos como segundos mensajeros y reguladores de otras funciones (AMPc)

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Sntesis de nucletidos

Biosntesis de novo de nucletidos

Sntesis de ribonucletidos de purina

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Biosntesis de novo de un anillo purnico: desde PRPP hasta IMP PRPP: Fosfo-ribosil-1-pirofosfato IMP: Inosina 5'-monofosfato (cido inosinico; inosinato)

Puntos importantes 1. Sntesis de novo de bases purnicas ocurre directamente sobre la ribosa. 2. La adicin de un grupo amino en la primera reaccin causa que el carbn anomrico rote desde la posicin en PRPP a la posicin 5-fosforibosilamina (PRA) 3. Los grupos aminos son donados por la glutamina a travs de reacciones catalizadas por la enzima amidotransferasa. 4. Los carbonos (nicos) son adicionados desde 10-formil-tetrahidrofolato en una reaccin catalizada por la enzima transformilasa. 5. Molculas de glicina y fumarato se usan para construir la estructura del anillo. 6. La va completa es regulada alostricamente por AMP, ADP, GMP, y GDP, todos los cuales inhiben PRPP-amidotransferasa, la primera enzima en la va. Biosntesis de novo de un anillo purnico: desde IMP hasta guanilato y adenilato (GMP y AMP)

Enzimas A1: Adenilsuccinato sintetasa A2: Adenil succinato ligasa G1: IMP deshidrogenasa G2: XMP-glutamina amidotransferasa

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Sntesis de ribonucletidos de pirimidinas

Biosntesis de novo de pirimidinas: Aspartato hasta Citidina 5-trifosfato (CTP)

Biosntesis y metabolismo de los desoxirribonucletidos - La mayora de las clulas contienes de 5 a 10 veces ms RNA que DNA - Los dNTPs se utilizan casi exclusivamente para la biosntesis de DNA - El DNA es qumicamente distinto del RNA por el azcar y la identidad de una de las bases pirimidnicas - La biosntesis de desoxirribonucletidos transcurre en dos procesos que ocurren a nivel del nucletido: o La conversin de ribosa en desoxirribosa o La conversin de Uracilo en Timina

Sntesis los Deoxirribonucletidos Los ribonucletidos son los precursores dede desoxirribonucletidos
O O P -O O O POCH 2 -O H H OH O H

Base
H

NADPH

NADP-

O O P -O

O O POCH 2 -O H H OH O H

Base
H

Ribonuclosido difosfato reductasa

OH

2'

Ribonuclosido difosfato

Deoxiribonuclosido difosfato

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EJ: Adenosina difosfato (ADP) ----> 2-desoxiadenosina difosfato (dADP) La ribonucletido reductasa (rNDP) cataliza la conversin de todos los ribonucletidos

El DNA contiene Timina, mientras que el RNA contiene Uracilo, por qu? La citosina de desamina espontneamente y forma uracilo Las enzimas de reparacin del DNA reconocen la mutacin y reemplazan el uracilo por citosina Las enzimas no pueden distinguir entre un uracilo original y uno proveniente de citosina La naturaleza ha resuelto el problema sustituyendo, en el DNA, los uracilo por su forma metilada: timina

Catabolismo de nucletidos

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Catabolismo de nucletidos purnicos a cido rico Producto de excrecin en diferentes organismos: Acido rico (primates, aves, reptiles, insectos), Alantoina (la mayora de los mamferos), Alantoato (peces con esqueletos), Urea (anfibios, peces cartilaginosos), Amonio (invertebrados marinos) Vas metablicas de nucletidos y enfermedades

- La guanina y la hipoxantina se recuperan a travs de la va de recuperacin de nucletidos (Hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa HGPRT) cidos nucleicos y Replicacin Rutas de informacin a travs de procesos de replicacin, transcripcin y traduccin El DNA almacena la informacin gentica (Watson y Crick 1953)

Estructura del DNA Dos cadena helicoidalaes dextrgiras enrolladas en torno a un mismo eje Esqueleto hidroflico, desoxirribosas y fosfatos se hallan en el exterior de la hlice Bases purnicas y pirimidnicas apiladas al interior de la hlice Cada base se aparea con una base de la otra cadena y se sitan en el mismo plano Los pares de bases se encuentran unidos por enlaces de hidrgeno Las cadena son antiparalelas (enlace fosfodister 5-3) Estructura Primaria, Secundaria y Terciaria de los cidos Nucleicos 1. La estructura primaria corresponde a su estructura covalente y a la secuencia del nuclesido monofosfato (frecuentemente como la secuencia de bases que ellas contienen). 2. La estructura secundaria se refiere a la forma que los cidos nucleicos asumen de acuerdo de su estructura primaria: B-DNA, A-DNA, y Z-DNA son todas formas de estructura secundaria. B-DNA corresponde a la forma predominante en el ambiente acuoso de la clula.
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3. La estructura terciaria se refiere al plegamiento de gran escala en un polmero linear, el cual es de mayor orden respecto del observado en la estructura secundaria. La estructura terciaria es la forma tri-dimensional del plegamiento de la cadena completa. El DNA puede adoptar diferentes estructuras H-DNA. Estructura poco habitual que se encuentra en regiones de polipirimidina - polipurina dan origen a un ordenamiento en triple-hlice. Aparecen en regiones donde se inicia o regulan procesos importantes en el metabolismo del DNA (replicacin, recombinacin, transcripcin).

Horquilla

Cruciforme

Triple Hlice

Genes y regiones intergnicas: Genoma Centrmero: punto de unin de las protenas que fijan el cromosoma a los microtbulos del huso mittico (compuestos por nmero importante de secuencias repetitivas: DNA satlite). Telmeros: secuencias que estabilizan el extremo de cromosomas eucariticos lineales; ~ 100 pb de secuencia repetida (x e y entre 1-4)

Cromatina y Estructura Nuclear Cromosomas: cuerpos claramente definidos en el ncleo en periodo previo a la mitosis. Cromatina: Se observa en clulas que no estn en divisin, siendo amorfo, disperso y desordenado alrededor del ncleo. Cromatina: fibras que contienen protena y DNA (nuclena Miescher) en masa similar y una pequea cantidad de RNA. DNA de la cromatina se encuentra asociado a protenas bsicas (Arg, Lis) llamadas histonas. Las histonas empaquetan y ordenan el DNA en estructuras denominadas nucleosomas, que son las unidades fundamentales de la organizacin del DNA.

Reglas fundamentales de la replicacin La replicacin del DNA es semiconservativa La replicacin comienza en un punto de origen y, normalmente, transcurre en forma bidireccional

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La sntesis de DNA ocurre en direccin 5 3 y es semidiscontinua

Elongacin de una cadena de DNA El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Sin embargo, las DNA polimerasas no inician la sntesis (slo polimerizan), por lo que se requiere de un cebador (oligonucletido de RNA) Todas las DNA polimerasas requieren de un molde Las DNA polimerasas tambin realizan correcciones en el DNA Metabolismo del RNA Las molculas de RNA no solo son portadoras y expresan informacin gentica sino tambin actan como catalizadores. Con la excepcin de los genomas de RNA de ciertos virus, todas las molculas de RNA se forman a partir de informacin contenida en el DNA: transcripcin. 3 clases principales de RNA: RNA mensajero (mRNA): secuencias que codifican para aminocidos de uno o ms polipptidos codificados en un gen o conjunto de genes en un cromosoma RNA de transferencia (tRNA): adaptador que lee la secuencia codificada en el mRNA y transfiere el aminocido adecuado a la cadena polipeptdica en crecimiento durante la sntesis proteica. RNA ribosmico (rRNA): se asocia con protenas para formar la maquinaria de sntesis proteica, conjunto denominado ribosoma. Diferencias entre replicacin y transcripcin: Replicacin: se copia el cromosoma entero para dar origen al DNA hijo que es idntico al DNA parental. Transcripcin: Selectiva; se transcribe slo el DNA de un gen(es) determinado(s), correspondiente a la informacin celular necesaria en un momento cualquiera. Sntesis de RNA dependiente de DNA El RNA es sintetizado por RNA polimerasas dirigidas por DNA Requiere: DNA templado, ribonucletidos (ATP, GTP, UTP y CTP), adems de Mg2+ (Zn2+) No requiere cebador (primer), pero la transcripcin se inicia solo en secuencias denominadas promotores Formacin de sper enrollamientos producto de la apertura de la hebra de DNA: accin de la Topoisomerasa La velocidad de sntesis es -> 50 nucletidos por segundo

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La sntesis del RNA se inicia en promotores La sntesis del RNA termina en regin de poli-A

Inhibicin de la transcripcin del DNA Actinomicina D: Intercalacin del anillo peptdico cclico en el surco menor. Secuencia sombreada se inserta en secuencias ricas en G C (bacterias y eucariontes). Acridina: Mecanismo similar por intercalacin en el DNA. Rifampicina: Se une especficamente a la subunidad beta de las RNA polimerasas bacterianas (inhibe el inicio de la transcripcin). a-amanitina: Bloquea la sntesis de RNA inhibiendo a la Pol-II y Pol-III (a concentraciones elevadas). Amanita phalloides

Maduracin del RNA Los intrones transcritos en el RNA se eliminan por corte y empalme (splicing), existen 4 tipos: Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y cloroplastidiales que codifican rRNA. Grupo II: transcritos primarios de mRNA de mitocondrias y cloroplastos. - Grupos I y II no necesitan cofactores de alta energa como ATP (emplean transesterificacin) Grupo III: transcritos primarios de mRNA nuclear (grupo ms numeroso). Grupo IV: transcritos primarios de tRNA. Requiere de ATP y de una endonucleasa. Mecanismo de splicing en intrones del grupo I: requerimiento exgeno de nuclesido o nucletido de Guanina: autocorte y empalme. No requiere de un complejo proteico particular, se utiliza un nucletido para favorecer el splicing. La clula reconoce que hay intrones y que debe eliminarlos, a travs de la identificacin de una secuencia consenso. Por ejemplo, en la zona de unin entre el 5 exn y el 3 intrn, hay una secuencia (Uracilo y Adenina) reconocida como el sitio de comienzo de eliminar el intrn. En este caso es una Guanina que hace el ataque a esta unin. El hidroxilo de la guanosina ataca el enlace fosfodister entre el Uracilo y la Adenina, se abre la cadena y la guanosina se une a la Adenina, el hidroxilo del Uracilo queda libre para hacer el ataque sobre la unin del exn 3. Se elimina el intrn y se unen los exones.

Mecanismo de splicing en intrones del grupo II: adenilato dentro del intrn: autocorte y empalme. Existe el mismo tipo de reaccin que en el grupo I. Se denomina autocorte porque no hay ningn tipo de protena que este favoreciendo el splicing. Lo diferente en este caso es que en el intrn hay una Adenina que es reconocida por una Guanina del extremo 3 del mismo intrn y el tipo de reaccin es exactamente la misma que antes. La guanosina, en vez de estar fuera del RNA, est dentro y forma una estructura de lazo con el intrn. Ahora el hidroxilo del Uracilo del extremo 5 del exn queda libre y puede atacar a otro Uracilo, se libera el lazo del intrn y se unen los dos exones.

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Mecanismo de splicing en intrones del grupo III: ocurre un mecanismo similar a la eliminacin de intrones del grupo II (formacin de lazo); sin embargo no experimentan autocorte y empalme. Ahora existen protenas y molculas de RNA que favorecen el proceso de splicing, llamados spliceosoma. El splicing requiere de la participacin de complejos RNA y protenas especializados que contienen molculas de snRNA (small nuclear RNA o RNA nuclear pequeo). Intervienen 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 y U6) que forman complejos con protenas denominados ribonucleoprotenas (snRNP), cuya funcin es reconocer las secuencias iniciales y finales del intrn, y a partir de la unin de las ribonucleoprotenas a la secuencias del intrn se va a empezar el mismo proceso que antes con el grupo I y II, formndose un lazo con el intrn que posteriormente es degradado. Utilizan secuencias altamente conservadas en el lmite intrn - exn. Spliceosoma: snRNP U1 + snRNP U2, U4, U5, U6

Proceso de maduracin del RNA Formacin del transcrito primario y su modificacin durante la maduracin del mRNA en una clula eucarionte. El casquete 5 se aade antes de que se complete la sntesis del transcrito primario. La poliadenilacin ocurre principalmente luego del splicing. Todos los procesos ocurren en el ncleo.

Adicin del Casquete 5 Protege el comienzo del RNAm, agregando un nucletido modificado, la 7-Metil-guanosina, en el extremo 5 del RNAm transcrito primario mediante un enlace 5'-fosfato 5'-fosfato en lugar del habitual enlace 3',5'-fosfodister. Es crtico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma.
Adicin de cola poli(A) al transcrito primario de RNA de eucariontes La RNA polimerasa sintetiza ms all del segmento que contiene la informacin del sitio de corte (5-AAUAAA). a. Complejo entre endonucleasa y poliadenilato polimerasa se fijan a esta secuencia seal. b. El RNA es cortado de 11 a 30 nt por el lado 3 de la seal AAUAAA. c. La poliadenilato polimerasa sintetiza una cola de 20 a 250nt empezando con el sitio de corte.

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Maduracin del RNA

Maduracin diferencial del RNA da origen a mltiples productos a partir de un gen: Poliadenilacin y/o splicing alternativos

Los rRNA y tRNA tambin sufren un proceso de maduracin. Durante la eliminacin de intrones, se producen diferentes subunidades que van a formar la estructura final de protenas y ribosomas, los que se sintetizan en el ncleo de clulas eucariontes, especficamente en el nuclolo (zona ms densa, donde se forman los RNA prerribosmicos). En el caso de las clulas procariontes; de un mismo transcrito primario puede haber formacin de rRNA y tRNA, lo que se da slo en procariontes. Pero en ambos es similar, hay metilacin del rRNA y ruptura de ste para eliminar los intrones. En el caso de los tRNA la maduracin se da gracias a ribonucleasas. Cortan en el extremo 5 y en el 3, y se hace un agregado de una secuencia CCA en el extremo 3, sitio de unin del aminocido y tambin lleva un splicing. A parte de los nucletidos que conocemos, el tRNA tambin est formado por nucletidos modificados mediante metilacin, desaminacin, reduccin. Ribozimas: Corresponden a intrones con auto splicing del grupo I y II, donde una secuencia de RNA elimina otra secuencia de RNA. No es una protena, sino que un RNA que est funcionando como una enzima.
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Maduracin del tRNA en bacterias y eucariontes

La mayora de las clulas tienen entre 40 50 tRNAs diferentes. El tRNA proviene de precursores ms largos (corte 5 y 3). Dos o ms tRNAs pueden estar codificados en el mismo transcrito (maduracin diferencial).

Corte por ribonucleasas (RNasa). Adicin del trinucletido CCA en el extremo 3 de los tRNA (tRNA nucleotidiltransferasa) La enzima tRNA nucleotidiltransferasa cataliza la formacin de los tres enlaces fosfodister al mismo tiempo, tiene mltiples sitios activos que fijan de manera separada cada uno de los nuclesidos precursores. RNasa P: complejo RNA-protena (M1 RNA, 377 nt); RNA corta el transcrito y la protena estabiliza el complejo. Sntesis de RNA y DNA dependientes de RNA Retrovirus: Virus con genoma de RNA (hebra simple; ca. 10.000 nt) Molculas importantes para tecnologa del DNA recombinante. Perspectiva evolutiva. Transcriptasa inversa: copia la molcula de RNA a una hebra de DNA, complementaria al RNA vrico; degrada la cadena de RNA en el hbrido y la reemplaza por DNA. Generalmente se produce integracin en el genoma del husped (estados durmientes o de latencia y activo en replicacin).

Ampliacin del dogma central de la biologa molecular

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Sntesis de protenas y cdigo gentico En qu parte de la clula se sintetizan las protenas? En el citosol. Porqu luego de la sntesis de aminocidos, estos quedan activados? Quedan en una forma activa para que despus puedan integrarse en la cadena peptdica que va a dar lugar a la protena, formando un complejo con los tRNA. De qu modo se traduce la informacin gentica contenida en el lenguaje de 4 letras de los cidos nucleicos al lenguaje de 20 letras de las protenas? Mediante codones formados por los nucletidos del DNA, donde combinaremos tres de stos para formar un codn (triplete). Existen 64 posibles combinaciones que estn ordenadas en el cdigo gentico, cada una de ellas determina qu aminocido se agregar a la cadena polipeptdica. Cdigo gentico de los aminocidos de acuerdo a la secuencia de mRNA (5 -> 3). Note que todos los aminocidos excepto Met y Trp tienen ms de un codn. Codn de inicio: AUG (pro y eucariontes), adems codifica Met en la cadena peptdica. Codn de trmino: UAA, UAG y UGA no codifican para ningn aa conocido y sealan el fin de la sntesis de una cadena proteica. Mutaciones sin sentido en E. coli: se encuentran como resultado de mutaciones de un nucletido que determinan una cadena terminada en forma prematura. Cdigo gentico degenerado: un aa puede ser especificado por ms de un codn.

Los RNA de transferencia reconocen codones mediante apareamiento antiparalelo de bases entre el codn del mRNA y el anticodn del tRNA. El tRNA proviene de precursores ms largos (corte 5 y 3). Dos o ms tRNAs pueden estar codificados en el mismo transcrito (maduracin diferencial). Corte por ribonucleasas. Adicin del trinucletido CCA en el extremo 3 de los tRNA (tRNA nucleotidiltransferasa) Sntesis de protenas: tRNA Fases principales de la sntesis de protenas 1.- Activacin de los aminocidos: Cada uno de los 20 aa se une a un tRNA especfico. Tiene lugar en el citosol (no en los ribosomas), requiere de ATP. Reaccin catalizada por aminoacil-tRNA sintetasas (Mg2+) especfica para cada aa y tRNA correspondiente(s). 2.- Inicio: Formacin del complejo de iniciacin (GTP y factores de inicio) * Fijacin de los factores de inicio a la subunidad ribosmica menor. * El mRNA portador del cdigo del polipptido a sintetizar se fija a la menor de las dos subunidades ribosmicas principales. * El aminoacil-tRNA iniciador se aparea con el codn de inicio AUG del mRNA.

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3.- Elongacin: La cadena polipeptdica se alarga mediante las uniones covalentes de aa sucesivos, transportados al ribosoma y posicionados correctamente por el apareamiento entre el tRNA y el mRNA. Hidrlisis de 2 molculas de GTP. 4.- Trmino y liberacin: Codn de trmino en el mRNA indica en qu momento est completa la cadena polipeptdica. Desprendimiento del polipptido gracias a la ayuda de factores de liberacin. 5.- Plegamiento y maduracin. El polipptido se pliega para adoptar su forma 3D adecuada. Modificaciones posttraduccionales.

Aminoacilacin de un tRNA por aminoacil-tRNA sintetasas (activacin de un aminocido)

Direccin de la sntesis de protenas

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Activacin de un aminocido En el tRNA, en la secuencia CCA, especficamente en el hidroxilo terminal de la Adenina, se une el aminocido a travs de su grupo carboxilo (activndose). La enzima que promueve la unin entre el RNAt y el aminocido es la Aminoacil-RNAt sintetasa, existiendo una por cada aminocido Iniciacin Una cadena polipeptdica tiene en sus extremos un grupo amino y un grupo carboxilo, el crecimiento de la cadena comienza por el extremo amino en direccin al carboxilo terminal. El primer aminocido que incluyamos en la cadena polipeptdica, va a ser el aminocido N-terminal y el ltimo ser C-terminal. Esto es en forma general, porque luego en la maduracin de la protena, muchos pptidos N-terminal generalmente se remueven, no conservando siempre los mismos aminocidos que se incorporaron de forma inicial. Procariontes: En el ribosoma tenemos 2 subunidades, la 50S y la 30S, para que se d la iniciacin de la sntesis se formar un complejo de iniciacin. Existen 3 factores de iniciacin: IF-1, IF-2, IF-3 El IF-1 e IF-3 se unen la subunidad ribosmica menor, evitando que la subunidad mayor se pegue a sta subunidad, luego el RNAm se fija a sta misma subunidad y determina la iniciacin de la sntesis. En el RNAm hay una secuencia que se denomina de Shine-DalgRNAo, la cual es reconocida por el RNAr de la subunidad menor, formndose una unin entre el RNAm y el RNAr. Despus de esta unin se busca el primer AUG y este es el que va a reconocer la bacteria como el iniciador de la traduccin.

El RNAr de la subunidad menor se va a hibridizar con el RNAm, luego que se reconoce el primer AUG, codn iniciador, se debe unir el RNAt que est llevando formilmetionina, lo trae el IF-2 que est unido a GTP. Una vez que se unin el RNAt a travs de su anticodn, al codn de iniciacin, se hidroliza el GTP, liberando GDP + Pi y todos los factores de liberacin. Recin ah se puede formar el complejo entre la subunidad menor y mayor. En la subunidad menor se reconocen 2 sitios, uno que se llama sitio A (aminoacilo) y el sitio P (peptidilo). Normalmente en el sitio P, se encuentra la cadena naciente y se desprenden los RNAt descargados y en el sitio A, donde se une el aminoacil-RNAt, va a venir un aminocido que se va a unir al pptido que se est formando. Slo en el inicio tenemos un aminocido unido en el sitio peptidilo, que en este caso es la formilmetionina. En el caso de los eucariontes todo es ms complicado, tienen varias protenas que favorecen la iniciacin y el proceso que viene posteriormente, que es la elongacin.

Elongacin Ya tenemos formado el ribosoma con sus dos subunidades, la 30S y la 50S. Se dice que el ribosoma es 70S y que tiene un hilo, la formilmetionina. Necesitamos 3 factores de elongacin: EF-Tu, EF-Ts y EF-G EF-Tu: transporta el RNAt con el aminocido correspondiente al sitio aminoacilo libre. EF-Ts: regenera la unin a GTP del factor EF-Tu para que despus podamos transportar otro aminocido, es un ciclo.
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Una vez que ingres el RNAt con el aminocido que est en segundo lugar, el grupo amino del nuevo aminocido ataca el grupo carboxilo del aminocido que esta inicialmente en la cadena, producindose la unin peptdica transitoria por la enzima peptidil transferasa, una ribozima (23S) que est en la subunidad mayor del ribosoma. Se produce una translocacin corrindose el RNAm, provocando la correcta unin del pptido, quedando el RNAt descargado en el sitio P y libre el sitio A. Para la translocacin se requiere el factor EF-G, llamado tambin translocasa y GTP, los cuales producen el corrimiento de la hebra de RNAm

Trmino y liberacin Debemos tener un codn que nos indique un lugar en donde no se une ningn aminocido; hay 3 codones que indican el trmino de la sntesis. Para estos codones no hay un RNAt que se una al sitio A, unindose inmediatamente tres factores de terminacin o liberacin a este sitio: RF1: reconoce UAG y UAA; RF2: reconoce UGA y UAA; RF3: no se sabe que reconoce. stos van a promover la hidrlisis del enlace peptidil-RNAt terminal, introducen agua en vez de otro aminocido por la peptidil transferasa, lo que va a producir la liberacin del pptido y disocindose despus el ribosoma, que se recicla para otra sntesis de protenas. En los eucariontes existe un solo factor de terminacin eRF que reconoce todos los codones stop. Maduracin Una protena recin sintetizada se encuentra en forma inactiva porque tenemos protenas para diferentes funciones, sufriendo una serie de procesos de modificacin post-traduccional. El polipptido se pliega para adoptar su forma 3D adecuada. Regulacin de la expresin gnica La expresin de un gen en forma constante, aparentemente no regulada, es conocida como expresin gnica constitutiva o de housekeeping (ejemplo: enzimas que participan en las vas metablicas centrales, protenas chaperonas, etc). Los genes que aumentan su expresin dependiendo de los requerimientos celulares se conocen como genes inducibles y el proceso que da lugar al incremento en la expresin se conoce como induccin (ejemplo: enzimas de reparacin del DNA en respuesta a altos niveles de dao) Por otro lado, el fenmeno que permite apagar la expresin de ciertos genes se conoce como represin. Existen 3 tipos de protenas que regulan la expresin gnica: Factores de especificidad: modifican la especificidad de la RNA polimerasa (factor s de la RNA polimerasa de E. coli). Represores: se unen a un sitio especifico del promotor (operador) y bloquean el acceso de la RNA polimerasa. Activadores: se unen en la vecindad del promotor y aumentan la interaccin de este con la RNA polimerasa.

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La RNA polimerasa se une al DNA e inicia la transcripcin en sitios especficos del DNA denominados promotores:

Modelos tpicos de regulacin del inicio de la transcripcin Regulacin Negativa: Tenemos una protena unida al promotor que es represora, porque bloquea la entrada de la RNA polimerasa. En este caso, el represor puede ser eliminado a travs de un inductor por regulacin alostrica, cuando el inductor se une al represor, se inhibe la represin, porque ste cambia su conformacin y libera el promotor. Otro tipo de represin, es cuando el represor est unido al metabolito para poder estar unido al DNA, entonces, slo en presencia de ese metabolito el represor se unir al DNA (metabolito acta como un co-represor) y bloquearn la transcripcin. Regulacin Positiva: el activador se encuentra unido a una zona cercana al promotor, acta como tal cuando est unido sin el ligando. Si el ligando se une al activador, elimina la activacin de la expresin gnica. En resumen, el activador en ausencia del metabolito funciona como activador, de pronto este metabolito se une al activador e inhibe su unin al DNA, inhibiendo de alguna manera la accin del activador. Tambin existe la posibilidad de que el activador no funcione en ausencia del metabolito, o sea, NO se une al DNA sin el metabolito. Modelo clsico de un opern: Conjunto formado por el grupo de genes, el promotor y las secuencias adicionales implicadas en la regulacin de la transcripcin gnica (operador, donde se une el represor y la secuencia reconocida por el activador)

Opern Lac La bacteria usa como fuente de C la glucosa. Hay situaciones en que la glucosa no est presente en el medio, Entonces la bacteria tiene otras alternativas. Por ejemplo, puede usar la lactosa; La bacteria degradar la lactosa para obtener glucosa, pero para poder hacerlo necesitara enzimas que le permitan degradar la lactosa. Si la bacteria no tiene glucosa en el medio, sintetizar protenas que metabolizan la lactosa. Galactsido permeasa: permite el transporte de lactosa desde el medio extracelular al interior de la clula. -Galactosidasa: degrada la lactosa en galactosa y glucosa. Transacetilasa: cuando la b-galactosa no est completamente metabolizada, esta enzima forma un compuesto que luego puede ser exportado de la clula.

Tambin lo que est involucrado en la regulacin de este Opern Lac es una protena represora que va a reprimir la sntesis de estos genes estructurales.
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Nomenclatura LAC Z: codifica -galactosidasa LAC Y: codifica galactsido permeasa LAC A: codifica transacetilasa Tambin est el gen que codifica para la sntesis del represor, codificado con un promotor diferente. Falta glucosa, hay lactosa Mientras no haya lactosa en el medio, el represor estar unido al promotor y no se podr sintetizar el RNAm. Si hay lactosa en el medio y no glucosa, la clula sintetizar las enzimas que degradan la lactosa, pero tenemos el represor que se une en la zona del promotor. Entonces en presencia de lactosa, un inductor se une al represor, cambindole la conformacin, as ya no se puede unir a su sitio operador en la zona del promotor, activando la transcripcin. Hay glucosa y lactosa Se prevalece el uso de la glucosa frente a la lactosa, porque es el metabolito final; se debe inhibir la expresin de las tres enzimas an cuando haya lactosa en el medio. Cuando hay de las dos, la alolactosa (anlogo de la lactosa) se une al represor, activando la expresin; pero al haber glucosa la clula debe reprimir la degradacin de lactosa. Normalmente la expresin gnica del Opern Lac se da cuando tambin est unido un activador, es decir, cuando est el activador y la lactosa se dan las dos condiciones para que se produzca la expresin gnica: el activador se une al AMPc (niveles altos cuando la glucosa est baja), se unen en conjunto cerca del promotor del Opern Lac, activan la sntesis de estos genes. Al haber lactosa y altos niveles de AMPc, la lactosa elimina el represor y el AMPc activa la sntesis de los genes. Cuando hay alta glucosa, bajo AMPc, el activador no va a estar funcionando; aunque tengan lactosa, no va a haber regulacin gnica.

Tecnologa del DNA Recombinante o Ingeniera Gentica Clonar: Hacer copias idnticas (se refiri a clonamiento de clulas) se lleva a cabo en 5 procedimientos generales: 1. 2. Seleccin de molcula de DNA pequea capaz de autorreplicacin (plsmidos o DNA vricos: vectores de clonacin). Mtodo para trasladar desde el tubo de ensayo a la clula husped (ofrece la maquinaria necesaria para la replicacin). 3. Mtodo para seleccionar o identificar aquellas clulas husped que contienen el DNA recombinante. 4. Mtodo para cortar el DNA en una localizacin precisa (endonucleasas de restriccin: tijeras moleculares). 5. Mtodo para unir covalentemente dos fragmentos de DNA (ligasas). DNA recombinante: molcula de DNA compuesta con segmentos de DNA de una o ms fuentes. Plsmidos/vectores: Plsmidos son molculas de DNA extra cromosmico circular o lineal, que se replican de manera independiente del DNA cromosmico y que estn presentes generalmente en bacterias. Tienen la misma estructura tpica de doble hlice del DNA cromosmico, pero no forman parte del DNA genmico. Se encuentran en casi todas las bacterias, codificando genes que confieren resistencia a metales y antibiticos. Se utilizan en ingeniera gentica porque pueden ser manipulados fcilmente en el laboratorio. La presencia en el plsmido de uno o ms genes, que confieren resistencia a antibiticos a las bacterias, permite seleccionar clones recombinantes de estas bacterias. Actualmente existen muchos tipos de plsmidos, la mayora de ellos modificados. Todos estos plsmidos de clonacin modernos son vendidos por diferentes compaas biotecnolgicas y su aplicacin es de amplio espectro.
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Para ser funcional contienen: A.- Origen de replicacin (Ori) que permite copiar el vector en el interior de la bacteria transformada. B.- Genes que confieran resistencia a antibiticos u a otra actividad enzimtica, lo que permite la identificacin de las bacterias que portan dicho plsmido. C.- Secuencia de DNA con sitios de corte nico para diferentes enzimas de restriccin, denominada Sitio de clonamiento mltiple o MCS (del ingls Multiple Cloning Site). Transformacin de Bacterias La transformacin consiste en introducir una molcula de DNA exgena, en este caso un plsmido, al interior de la bacteria mediante diferentes tcnicas. Genes proporcionados por el plsmido sirven como marcadores de seleccin de las bacterias transformadas. Los genes ms utilizados son los de resistencia a antibiticos, como la ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol y la kanamicina. Enzimas de restriccin Tambin conocidas como endonucleasas Cortan DNA a partir del reconocimiento de secuencias especficas. El sitio de reconocimiento es una secuencia denominada palindrmica (secuencias que se leen igual en ambas direcciones) Al cortar el DNA pueden generar dos tipos de extremos: 1. cohesivos o pegajosos (sticky end) 2. extremos parejos (blunt end) Algunos usos Confeccin de mapas de restriccin de un plsmido. Generacin de fragmentos de DNA, los que introducidos en plsmidos apropiados permiten la generacin de molculas de DNA recombinante DNA recombinante Unin covalente de un fragmento de DNA a un plsmido genera una molcula de DNA recombinante. Generalmente el plsmido y fragmento de DNA (o producto de PCR) son digeridos con la misma enzima de restriccin, generando extremos compatibles que se unen covalentemente utilizando la enzima DNA ligasa. Anlisis de DNA por electroforesis Fragmentos de DNA pueden ser separados en base a su tamao en geles de agarosa (matriz porosa). cidos nucleicos migran en un campo elctrico por tanto, son susceptibles de ser separados por electroforesis. cidos nucleicos tienen grupos fosfatos que se cargan negativamente (-) en presencia del buffer de carga y corrida (pH 7.0). Para visualizar las bandas de DNA hay que teir el gel. Por ejemplo, con bromuro de etidio (BrEt), el cual se intercala en la doble hebra del DNA y emite luz cuando se le excita con luz ultravioleta (UV). PCR La reaccin de PCR se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin de la doble cadena de DNA por efecto del calor 2 Hibridacin de los oligonucletidos cebadores (primers) a la zona 3 especfica de cada una de las hebras del DNA 3 Sntesis-Extensin del primer por accin de la DNA polimerasa

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