Efek kertas penuh inhibitor limpa tyrosine kinase pada perkembangan dari nefritis lupus

pada tikus
Maki Kitai sebuah, Noboru Fukuda a, b, *, Takahiro Ueno sebuah, Morito Endo c, Takashi Maruyama
sebuah, Masanori Abe sebuah, Kazuyoshi Okada sebuah, Masayoshi Soma d, Koichi Matsumoto sebuah
divisi
dari Nephrology Hipertensi dan Endokrinologi, Departemen Kedokteran, Nihon University School of Medicine, Tokyo, Jepang
b Pusat Penelitian Universitas Nihon, Tokyo, Jepang c
Fakultas Ilmu Kesehatan Manusia, Hachinohe Gakuin University, Hachinohe, Aomori, Jepang d
Divisi Kedokteran Umum, Departemen Kedokteran, Nihon University School of Medicine, Tokyo, Jepang
articleinfo
sejarahPasal: Diterima 8 Januari 2017 Diterima dalam bentuk direvisi 13 Februari 2017 Diterima 22 Februari 2017 Tersedia
online 25 Maret 2017
Keywords: Syk Lupusreseptor nefritis Fc 3BP2 p38MAP kinase
abstrak
reseptor The Fc(FCR) memiliki peran penting dalam patogenesis glomerulonefritis autoimun. Oleh karena itu kami meneliti efek
dari Syk inhibitor pada perkembangan lupus nefritis dan SH3 domain protein 2 dan p38MAP signalings kinase yang mengikat
pada tikus. NZB / tikus F1 W, model lupus nefritis, menerima Syk inhibitor R406. Western blotting dan imunohistokimia
mengungkapkan bahwa R406 memperlakukan ment signifikan tertunda penampilan proteinuria, histologis ditingkatkan sclerosis
glomerulo- mereka dan menghambat meningkatkan ekspresi dari MCP-1 dan mRNA TGF-b1 dan nefrin dan podocin protein di
ginjal. Pengobatan ditekan fosforilasi 3BP2 dalam sel darah putih dari limpa dan secara signifikan menghambat fosforilasi
p38MAPK di ginjal tetapi tidak mempengaruhi ekspresi Fc reseptor neonatal. Temuan ini menunjukkan peran penting dan
mekanisme-mekanisme reseptor FCG I dan III dalam pengembangan glomerulonefritis autoimun dan menyarankan aplikasi yang
mungkin dari inhibitor Syk sebagai obat baru untuk glomerulonefritis tersebut.
© 2017 Penulis. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier atas nama Jepang Farmakologi Society. Ini adalah sebuah artikel akses
terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi (http://creativecommons.org/ lisensi / by-nc-nd / 4.0 /).
1. Pendahuluan
sistemik lupus eritematosus (SLE) adalah penyakit autoimun yang ditandai oleh produksi autoantibodi terhadap beragam self-
antigen yang menginduksi kerusakan jaringan. Lupus nefritis adalah salah satu komplikasi klinis yang paling penting dari SLE.
Pembentukan kompleks imun antara badan-badan autoanti- dan self-antigen telah dikaitkan dengan lupus nefritis.
Pengendapan kompleks imun di dalam ginjal akan mengaktifkan monosit / makrofag dengan berinteraksi dengan reseptor FCG I
dan III, memulai sebuah kaskade inflamasi sitokin dan kemokin. Reseptor Fc telah terbukti memainkan peran penting dalam
pengembangan berbagai kekebalan penyakit kompleks-dimediasi.
3E5
Tikus dengan gangguan ditargetkan dari reseptor Fc gamma umum chain (FcRr), yang kurang reseptor FCG I dan III ditunjukkan
1,2
harus benar-benar dilindungi dari perkembangan lupus nefritis.
5
Ini adalah hipotesis bahwa subunit gamma dari ceptors FCG ulang I dan III adalah penentu utama pematangan dan Singkatan:
protein 3BP2, domain SH3 mengikat; Blnk, protein kapal B-sel;
ekspresi permukaan reseptor. Karena peran penting
DAB, 3,30-diaminobenzidin; EMT, epitel-to-mesenchymal transdifferentiation; ERK, ekstraseluler-sinyal-diatur kinase; Reseptor
FCR, Fc; FcRn, Fc reseptor neonatal; Grb2, faktor pertumbuhan reseptor yang terikat protein 2; JNK, c-Juni N-terminal kinase;
HE, hematoxylin dan eosin; Itam, berbasis tirosin aktivasi motif; LAT,
 subunit gamma di upregulation reseptor FCG I dan III, telah ada minat yang besar dalam pengembangan bahan kimia yang
mengatur gen FcRr. Rantai FcRg menginduksi aktivasi T-sel; p38MAPK, p38MAP kinase; PAS, asam periodik Schiff; PIP3,
aktivasi platelet setelah multi-pembentukan pada
membran fosfatidilinositol-3,4,5-trisphosphate; SLE, lupus eritematosus sistemik;
terkait glikoprotein dengan mengikat dengan kolagen
atau bisa ular. UCHL-1, ubiquitin c-terminal hidrolase-1.
* Penulis yang sesuai. Divisi Nefrologi Hipertensi dan Endokrinologi, Departemen Kedokteran, Nihon University School of
Medicine, 30-1, Oyaguchi Kami-cho, Itabashi-ku, Tokyo 173-8610, Jepang.
Aktivasi trombosit oleh kolagen dimediasi melalui jalur yang sama dengan reseptor kekebalan tubuh, dengan reseptor kekebalan
berbasis tirosin aktivasi motif (ITAM) urut pada FCG dan alamat E-mail: fukuda.noboru@nihon-u.ac. jp (N. Fukuda).
tyrosine kinase Syk memainkan peran penting. Peer
review di bawah tanggung jawab Jepang Farmakologi Society.
6
Jurnal Ilmu Farmakologi 134 (2017) 29e36
Isi daftar tersedia di ScienceDirect

Journal of Farmakologi Ilmu

jurnal homepage: http://dx.doi.org/10.1016/j.jphs.2017.02.015
www.elsevier.com/locate/jphs1347-8613 / © 2017 Penulis. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier atas nama Jepang
Farmakologi Society. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
 Syk, yang terdiri dari 635 asam amino, berisi domain terminal SH2 N- di terminal amino dan C-terminal domain kinase.
Aktivasi Syk pada reseptor membran plasma terjadi melalui pengikatan domain SH2 dari Syk untuk 2 fosfat phorylated residu
tirosin yang hadir dalam reseptor terkait transmembran adapter dari Itam.
7,8
Perekrutan Syk untuk dual-terfosforilasi Itam memicu aktivasi Syk dan
mengaktifkan transduksi sinyal hilir, yang akhirnya memicu berbagai respon seluler.
9
sinyal Sebagai hilir untuk Syk, protein adaptor seperti linker untuk aktivasi T-sel (LAT),
kapal B-sel protein (blnk), dan SH3 domain mengikat protein 2 (3BP2), protein efektor, seperti fosfolipase Cg, Vav ,
phosphatidyli- nositol-3,4,5-trisphosphate kinase, menargetkan Syk. Dalam penelitian terbaru, 3BP2 ditemukan terfosforilasi oleh
Syk, dan kemudian menerjemahkan sinyal diaktifkan dengan protein efektor.
10
Baru-baru ini dilaporkan bahwa pemberian oral Syk inhibitor efektif
ditingkatkan edema bersama pada hewan model rheumatoid arthritis.
11
Selain itu, Syk inhibitor telah dilaporkan meningkatkan perkembangan lupus nephritis atau ulonephritis glomer-.
12e14
demikian, diharapkan Syk inhibitor akan obat-obatan standar untuk glomerulonefritis autoimun termasuk
lupus nefritis.
Neonatal Fc reseptor (FcRn) telah dilaporkan meningkat dalam glomeruli (dibandingkan dengan glomeruli normal) oleh
beberapa jenis glomerulonefritis autoimun kronis, termasuk lupus nephritis, IgA nefritis, glomerulonefritis progresif cepat, dan
glomerulonefritis membranosa.
14
Gan et al juga didemonstrasikan bahwa stimulasi serum kelinci pada MPC5 garis sel
podosit meningkatkan ekspresi FcRn dengan peningkatan fosforilasi p38MAPK dan ubiquitin c-terminal hydrolase- 1 (UCHL-1),
yang dihambat oleh penindasan FcRn.
15,16
Temuan ini menunjukkan bahwa FcRn menginduksi cedera podocytes oleh UCHL-1 melalui p38MAPK.
Dengan demikian, FCR memiliki peran penting dalam patogenesis glomerulonefritis autoimun. Penghambatan spesifik FCR
diharapkan dapat memberikan alternatif untuk kortikosteroid dan obat-obatan imunosupresif. Dalam studi saat ini, kami meneliti
efek dari Syk inhibitor pada perkembangan lupus nefritis pada tikus, dengan fokus pada transduksi sinyal 3BP2 dan p38MAPK.
2. Bahan dan metode
2.1. Pertimbangan etis
penyelidikan kami serupa dengan Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium Hewan: Edisi Kedelapan. Etika
panitia Nihon University School of Medicine memeriksa semua protokol penelitian yang melibatkan penggunaan hewan hidup.
2.2. Pemberian oral inhibitor Syk di NZB / W tikus F1
Perempuan NZB / tikus F1 W diperoleh dari Jepang SLC (Hamamatsu, Jepang). NZB / tikus F1 W dari 16 minggu usia
menerima R406 (5 mg / kg, secara lisan;. ChemScene, LLC, Monmouth Junction, NJ, USA), Syk inhibitor, di 0,5% metil
selulosa, dua kali sehari selama 20 minggu. Dosis R406 yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan perkiraan asupan 5
mg / kg / hari, yang secara efektif menghambat nallings sig- FCR.
13
Tikus kontrol menerima 0,5% metil selulosa (dua kali sehari, secara lisan) selama 20 minggu. Setiap 2 minggu,
urin dikumpulkan selama 24 jam dalam kandang metabolik untuk mengukur ekskresi protein urin. Setelah administrasi R406
selama 20 minggu (pada 36 minggu usia), darah dikumpulkan dari dalam hati dengan jarum suntik; ginjal dan limpa kemudian
dihapus dengan anestesi isoflurane.
M. Kitai et al. / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 30
2.3. The morfologi dan immunohistological analisis
Tiga-mikrometer-tebal bagian parafin dari korteks ginjal diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE), dan Schiff asam
periodik (PAS). Deparaffinized bagian 5-mm sebentar diinkubasi dengan 3% H
2
O
2
dan kemudian dengan antibodi primer selama 60 menit, dibilas dengan Tris-buffered saline yang mengandung
0,1% Tween 20, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 30 menit. Antibodi utama untuk analisis imunohistokimia
adalah sebagai berikut: anti-antibodi IgG (kambing anti-IgG, 1:. 500; Sel Signaling, Danvers, MA, USA), anti-komplemen C3
antibodi (kambing pelengkap anti-tikus C3, 1:. 1000; Cappel, Aurora, OH, USA), anti-nefrin antibodi (kelinci antibodi anti-
nefrin, 01:40; Abcam, Tokyo, Jepang), anti-podocin antibodi (kelinci anti-podocin antibodi , 1: 100; SigmaeAldrich, St. Louis,
MO, USA), antibodi anti-FcRn (kelinci FcRn antibodi, 1:. 100; Santa Cruz, CA, USA).. Antibodi primer dilarutkan dalam PBS
yang mengandung 1% BSA dan 0,25% Triton-X 100. Setelah mencuci sampel tiga kali selama 10 menit dengan PBS, mereka
diinkubasi dengan antibodi sekunder: Alexa 488 (atau 594) kambing anti-kelinci ( atau mouse) antibodi IgG (1: 1000; Life
Technologies) di PBS selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah immunofluorescence pewarnaan, sel-sel dicuci dengan PBS dan
inti ternoda dengan 1 mg / ml DAPI di PBS selama 10 menit pada suhu kamar. Untuk C3 pewarnaan, bagian diinkubasi dengan
horseradish peroxidase-conjugated anti-biotin solusi pelabelan (ABC Elite Kit, Vector) selama 30 menit pada 22 C, diikuti
dengan pencucian dan inkubasi dengan 3,3'-diaminobenzidin (DAB) solusi (Wako Junyaku , Tokyo, Jepang). Counterstaining
kemudian dilakukan sebelum pemeriksaan di bawah mikroskop cahaya.
2.4. Penentuan ekspresi mRNA
RNA total diekstraksi dari korteks ginjal dengan Maxwell
®
Tissue LEV RNA total Pemurnian Kit (Promega, Fitchburg, WI, USA.), Sesuai dengan instruksi pabrik. RNA total (1 mg)
terbalik ditranskripsi menjadi cDNA dengan random 9-mers dengan Kit Takara RNA PCR (AMV) Ver. 3.0 (Takara Bio, Ohtsu,
Jepang). A real-time PCR kuantitatif dilakukan dengan cDNA diencerkan menggunakan FastStart TaqMan Probe Guru (Roche
Applied Science, Penzberg, Jerman) dan SYBR Pilih Guru Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA.) Dalam ABI 7500
detektor urut ( hidup Tech- nologies), sesuai dengan instruksi pabrik. Semua assay-on-demand primer dan probe (MCP-1, TGF-
b1, endothelin- 1, nefrin, dan podocin) yang dibeli dari Life Technologies. Data PCR real-time dianalisis dengan kurva standar
dan dinormalkan 18S RNA ribosom dengan set primer spesifik (50 dan 30 primer: 50-CGGCTACCACATCCAAGGAA-30 dan
50-GCTGGAAT- TACCGCGGCT-30). Koefisien korelasi untuk kurva standar semua> 0,90.
2.5. BlottingBarat
Korteks ginjalbenar-benar homogen dengan Tris $ HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,02% natrium azida, 100 mg / mL phenyl-
metilsulfonil fluoride, 1 mg / ml aprotinin dan 1% Triton X-100. Sampel disonikasi selama 2 menit, disentrifugasi pada 16.000
AG selama 10 menit pada 4 C, dicampur dengan 400 ml metanol dan 100 ml roform chlo-, dan disonikasi lagi selama 2 menit.
Setelah sentrifugasi pada 16.000 AG selama 10 menit pada 4 C, supernatan diuapkan. Mereka kemudian ditangguhkan dalam 100
ml PBS dan disonikasi selama 3 menit. Sampel protein (10 mg) dielektroforesis pada NuPAGEþ 10% BiseTris gel (Life
Technologies) dan ditransfer ke membran poliviniliden difluorida (Millipore, Bedford, MA, USA). Membran diinkubasi semalam
dengan kelinci anti-nefrin antibodi (1:20; Abcam), kelinci anti-podocin antibodi (1: 140; SigmaeAldrich), dan
kelinci FcRn antibodi (1: 150; Santa Cruz). Membran dicuci tiga kali dengan Tris-buffered saline yang mengandung 0,2% Tween
20. protein yang immunocomplexed diidentifikasi oleh reaksi dengan peroksidase terkonjugasi untuk mencapai suspensi yang
seragam dalam 500 ml buffer lisis (anti-kelinci imunoglobulin [1: 5000; Abcam]), kemudian disempurnakan deteksi
chemiluminescent (GE dengan kesehatan perawatan Bio-Ilmu, Pittsburgh, PA, USA.) dilakukan.
2.6. Fosforilasi 3BP2 atau p38MAPK
Sel darah putih yang diambil dari spesimen limpa beku dengan RIPA penyangga (Santa Cruz) yang mengandung inhibitor
fosfatase. Sel-sel dicuci dengan PBS dan segaris dengan 0,5 ml / baik lisis penyangga (50 mM TriseHCl, pH 8,0, 150 mM NaCl,
0,02% natrium azida, 100 mg / ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mg / ml aprotinin, dan 1% Triton X -100). Lisat dipanaskan
pada 95 C selama 5 menit. Protein dipisahkan dengan elektroforesis pada 12,5% SDSepolya- gel crylamide dan dihapuskan ke
membran PVDF. Antibodi primer baik p-Tyr HRP antibodi (1: 200; Santa Cruz) dan 3BP2 antibodi (1: 100; Santa Cruz) atau
kelinci phospho-p38MAPK antibodi (1: 1000; Sel Signaling). Inkubasi dilakukan selama 12 jam pada 4 C. Setelah mencuci tiga
kali di 0,1% Tween-20 di TBS, membran diinkubasi dengan kambing anti-kelinci horseradish peroksidase terkonjugasi antibodi
(1: 2000; Santa Cruz, karena 3BP2) atau anti kelinci immunoglobulin (1: 5000; Abcam, karena p38MAPK) pada suhu kamar
selama 1 jam. Setelah mencuci tiga kali dalam 0,1% Tween- 20 di TBS, membran dikembangkan dengan penambahan hidrogen
peroksida dan LumiGLO chemiluminescent reagen (Sel Signaling) dan terkena pada film-film autoradiographic untuk 5e15 menit
pada suhu kamar.
M. Kitai et al. / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 31
Gambar. 1. Efek pengobatan R406 pada protein urin dan fungsi ginjal pada tikus NZB / W F1. Sebuah inhibitor Syk, R406 (5 mg
/ kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada 16-minggu-NZB / tikus F1 W tua selama 20 minggu. (A) Perubahan
proteinuria pada tikus kontrol dan tikus R406-diobati. (B) Perubahan berat badan. (C) Perubahan volume urine. (D) Perbandingan
kadar kreatinin serum dalam kontrol dan tikus R406-diobati. Syk inhibitor R406 (5 mg / kg, dua kali sehari, secara lisan)
diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20 minggu (n 1/4 6). * P <tikus kontrol 0,05 vs.
2.7. Analisis statistik
Nilai mewakili mean ± SE. T-test siswa digunakan untuk data berpasangan. Sebuah ANOVA dua arah dengan prosedur
Bonferroni / Dunn sebagai post-test juga digunakan. Nilai P <0.05 dianggap menunjukkan signifikansi statistik.
3. Hasil
3.1. Efek dari Syk pengobatan inhibitor terhadap ekspresi protein urin dan fungsi ginjal dari NZB/ W tikus F1
tikus kontrolNZB / W F1 menunjukkan peningkatan proteinuria dari hari 105. oral R406 (5 mg / kg) secara signifikan ditekan
( P <0,05) ekspresi kemih protein hari 126 (Gambar. 1A). Tidak ada perbedaan dalam bobot tubuh dan volume urin dari kontrol
dan R406-diperlakukan tikus (Gambar. 1B dan C). Kadar serum kreatinin lebih tinggi pada tikus NZB / W F1 36-minggu-tua.
Pemberian oral R406 (5 mg / kg) secara signifikan menunjang ditekan (P <0,05) tingkat serum kreatinin dalam NZB / W tikus F1
(Gambar. 1D).
3.2. Efek dari Syk pengobatan inhibitor pada degenerasi dan deposisi IgG dan C3 pada ginjal NZB / W tikus F1
Analisis histologis (HE dan PAS pewarnaan) dari imens ginjal spec- menunjukkan ditandai perubahan sklerotik dan
segmental dari glomeruli, proliferasi mesangial , dan infiltrasi phils eosino- pada tikus NZB / W F1 36-minggu-tua. Pemberian
oral R406 signifikan ditekan degenerasi patologis dari
NZB / W F1 tikus ginjal (Gambar. 2). Pewarnaan imunohistokimia menunjukkan peningkatan deposisi IgG dan C3 dalam sel-sel
mesangial glomerulus tikus NZB / W F1 36-minggu-tua. Deposisi di korteks ginjal NZB / W F1 tikus 36-minggu-tua ini ditindas
oleh pengobatan dengan R406 (Gambar. 3).
3.3. Efek dari Syk pengobatan inhibitor terhadap ekspresi molekul inflamasi di ginjal dari NZB / tikus F1 W
Untuk menyelidiki efek dari Syk pengobatan inhibitor pada molekul inflamasi di ginjal, kami mengevaluasi ekspresi dari
MCP- 1, TGF-b1 dan endothelin-1 mRNA pada ginjal NZB / tikus F1 W menggunakan real-time PCR. Tingkat ekspresi dari
MCP-1, TGF-b1 dan endotelin-1 mRNA pada ginjal NZB / tikus F1 W R406-diperlakukan secara signifikan lebih rendah
dibandingkan dengan tikus kontrol (P <0,05;. Gambar 4AeC).
3.4. Efek dari Syk pengobatan inhibitor pada penanda podosit di ginjal dari NZB / W tikus F1
blotting Barat mengungkapkan bahwa ekspresi nefrin lebih tinggi (tidak signifikan secara statistik) dengan pengobatan R406
dibanding kontrol (Gambar. 5A), dan secara signifikan meningkatkan ekspresi podocin di ginjal dari NZB / tikus F1 W (P <0,05;.
Gambar 5B). Analisis imunohistokimia menunjukkan bahwa nefrin dan podocin pewarnaan dalam glomeruli dari R406-
diperlakukan NZB / tikus F1 W ditingkatkan dibandingkan dengan kontrol tikus (Gambar. 6).
3.5. Efek dari Syk pengobatan inhibitor pada fosforilasi 3BP2 dan p38MAPK di leukosit dari limpa NZB / W tikus F1
Western blotting menunjukkan bahwa fosforilasi 3BP2 di leukosit dari limpa R406-diperlakukan NZB / tikus F1 W secara
signifikan lebih rendah di dibandingkan dengan kontrol tikus (P <0,05;. Gambar 7A). Fosforilasi p38MAPK di leukosit dari
limpa R406-diperlakukan NZB / tikus F1 W secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kontrol tikus (P <0,05;. Gambar
7B).
3.6. Efek dari Syk pengobatan inhibitor terhadap ekspresi FcRn di ginjal dari NZB / W tikus F1
Ekspresi FcRn mRNA (sebagaimana ditentukan oleh real-time PCR) (Gambar. 8A) dan ekspresi protein FcRn (sebagaimana
ditentukan
Gambar. 2. efek pengobatan R406 pada degenerasi korteks ginjal di ginjal dari NZB / tikus F1 W. sebuah inhibitor Syk, R406 (5
mg / kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada 16 minggu -tua NZB / tikus F1 W selama 20 minggu. The cortexes ginjal
kontrol dan tikus R406-diperlakukan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE) dan asam periodik Schiff (PAS). Skala bar 1/4
50 mm.
M. Kitai et al / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 32
..oleh Western blotting) (Gambar 8B) pada ginjal R406-diperlakukan NZB / tikus F1 W lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol
tikus; Namun, perbedaannya tidak bermakna secara statistik. Immunohisto- pewarnaan kimia menunjukkan tidak ada perbedaan
dalam pewarnaan FcRn pada ginjal kontrol dan R406-diperlakukan NZB / tikus F1 W (Gambar. 8C).
4. Diskusi
Telah dilaporkan bahwa hubungan lintas belakang NZB / tikus F1 W dengan FcRg (A / A) sepenuhnya menghilangkan
nefritis lupus, menunjukkan terjadinya lupus nefritis tergantung pada FcRg.
17
Dalam percobaan ini, tikus NZB / W menunjukkan sclerosis glomerulo- dengan seberkas kepatuhan kapsul Bowman, proliferasi
mesangial dan infiltrasi seluler di interstitium dan pengendapan IgG dan C3. Temuan ini cukup mirip dengan temuan
pathohistological ginjal di nefritis lupus manusia. Reseptor FCG tipe I dan III telah dilaporkan memiliki peran penting dalam
perkembangan lupus nefritis.
18
Setelah ligan mengikat FCR, kinase tirosin, Lyn, diaktifkan untuk mengikat motif
Itam, yang mencakup dua residu tirosin.
19,20
Kemudian Lyn memfosforilasi g subunit dari Itam, dan kinase tirosin, Syk, diaktifkan
oleh fosforilasi tersebut. Syk yang diaktifkan mengaktifkan beberapa jalur hilir.
21
Jadi Syk adalah molekul sentral dalam signaling oleh subunit FcRg umum.
6e9
R406 sangat menghambat aktivasi Syk dengan mengikat saku ATP-mengikat.
22
Dalam penelitian ini, maka kami meneliti efek dari pemberian oral inhibitor Syk,
R406, pada patogenesis lupus nephritis di NZB / tikus F1 W.
Dalam percobaan ini, pemberian oral R406 tertunda penampilan proteinuria dan ditekan peningkatan kreatinin plasma di NZB
/ tikus F1 W. Sejak Syk menginduksi transduksi sinyal FcRg sebagai subunit umum dari tipe I dan III FCR, R406 yang
merupakan SYC inhibitor meningkatkan patogenesis lupus nefritis dengan penindasan tipe I dan III FcRg.
20
Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa penghambatan pada
FCR signaling dapat menekan patogenesis glomerulonefritis autoimun.
Sebuah analisis histologis ginjal menunjukkan ditandai sclerosis dan segmental perubahan dari glomeruli, proliferasi
mesangial, dan infiltrasi seluler di NZB / tikus F1 W. Pemberian oral R406 signifikan ditekan degenerasi patologis dari ginjal
pada tikus NZB / W F1. R406 juga menekan ekspresi
Gambar. 3. Efek pengobatan R406 pada pengendapan IgG dan C3 pada ginjal NZB / tikus F1 W. Sebuah inhibitor Syk, R406 (5
mg / kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20 minggu. Sebuah analisis
imunohistokimia dilakukan untuk mendeteksi IgG dan melengkapi C3 dalam kontrol dan tikus R406-diobati. Skala bar 1/4 50
mm.
Ara. 4. Efek dari Syk inhibitor terhadap ekspresi molekul inflamasi di ginjal dari NZB / tikus F1 W. Sebuah inhibitor Syk, R406
(5 mg / kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20 minggu. RNA total
diekstraksi dari korteks ginjal. A real-time PCR kuantitatif dilakukan untuk mendeteksi ekspresi MCP-1 (A), TGF-b1 (B), dan
endothelin-1 (C) mRNA. Data mewakili mean ± SEM (n 1/4 6). * P <0,05 vs Control.
Ara. 5. Efek pengobatan R406 pada penanda podosit di ginjal dari Tikus NZB / W F1. Sebuah inhibitor Syk, R406 (5 mg / kg,
dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20 minggu. Ekspresi (A) nefrin dan (B)
podocin protein dari korteks ginjal kontrol dan R406-diperlakukan tikus ditentukan oleh Western blotting. Data mewakili mean ±
SEM (n 1/4 6). * P <0,05 vs Control.
M. Kitai et al. / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 33
Gambar. 6. Efek pengobatan R406 pada immunostaining dari nefrin dan podocin dalam glomeruli dari NZB / tikus F1 W. Sebuah
inhibitor Syk, R406 (5 mg / kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20
minggu. Sebuah analisis kimia immunohisto- dilakukan untuk mendeteksi nefrin dan podocin di kontrol dan R406- diperlakukan
tikus. Skala bar 1/4 10 mm.
MCP-1, TGF-b1 dan endotelin-1 mRNA dalam ginjal dari NZB / tikus F1 W. Karena MCP-1 adalah kemokin, yang dikenal
untuk berkontribusi migrasi makrofag, penindasan infiltrasi selular mungkin terkait dengan penghambatan MCP-1 oleh R406.
22
Dalam perkembangan lupus nephritis, proteinuria dan albuminuria menimbulkan generasi yang cepat dari hidrogen
peroksida dalam sel tubulus proksimal, bersama dengan aktivasi faktor-kB nuklir, dan upregulation dari endotelin-1 dan TGF-b1.
23
TGF-b1 adalah faktor utama dalam promosi epitel-to-mesenchymal
transdifferentiation (EMT), yang menginduksi fibrosis ginjal.
23,24
pengobatan R406 menekan ekspresi MCP-1, TGF-b1 dan endo
Thelin-1 mRNA dalam ginjal dari NZB / tikus F1 W. Dengan demikian, Syk hibitors in mungkin menekan proteinuria dan
fibrosis ginjal melalui penghambatan TGF-b1 dan endotelin-1 pada lupus nefritis.
Dalam percobaan ini, kami meneliti efek R406 pada cedera podosit karena lupus nephritis pada tikus NZB / W F1.
Munculnya proteinuria pada glomerulonefritis dikaitkan dengan cedera dari proses podosit kaki di membran basal glomerulus.
25
Penurunan tingkat protein dari nefrin dan podocin telah dilaporkan dalam nephritises terkait dengan sindrom
nefritik, termasuk nefropati perubahan minimal, focal
Gambar. 7. Efek pengobatan R406 pada fosforilasi 3BP2 dan p38MAPK dalam sel darah putih dari limpa dari NZB / tikus F1 W.
Sebuah inhibitor Syk, R406 (5 mg / kg, dua kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk
20 minggu. Sel darah putih yang diambil dari spesimen limpa beku dengan RIPA buffer yang mengandung inhibitor fosfatase.
Antibodi primer baik p-Tyr HRP antibodi dan 3BP2 antibodi atau phospho-p38MAPK antibodi. Membran diinkubasi dengan
kambing anti kelinci horseradish peroksidase terkonjugasi antibodi untuk 3BP2 atau p38MAPK dan dikembangkan dengan
penambahan hidrogen peroksida. (A) fosforilasi 3BP2 dan (B) fosforilasi p38MAPK di korteks ginjal kontrol dan tikus R406-
diobati. P-3BP2: terfosforilasi 3BP2, t-3BP2: Jumlah 3BP2, P-p38MAPK: terfosforilasi p38MAPK, t- p38MAPK: Jumlah
p38MAPK. Data mewakili mean ± SEM (n 1/4 6). * P <0,05 vs Control.
M. Kitai et al. / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 34
Gambar. 8. Efek dari R406 terhadap ekspresi FcRn di ginjal dari tikus NZB / W F1. Sebuah inhibitor Syk, R406 (5 mg / kg, dua
kali sehari, secara lisan), diberikan kepada NZB / tikus F1 W 16-minggu-tua untuk 20 minggu. (A) Ekspresi FcRn mRNA
ditentukan oleh real-time PCR. (B) Ekspresi protein FcRn ditentukan oleh Western blotting. Data mewakili mean ± SEM (n 1/4
6). * P <0,05 vs Control. (C) Immunostaining untuk FcRn dalam glomeruli kontrol dan tikus R406-diobati. Skala bar 1/4 10 mm.
glomerulosklerosis segmental, nefropati IgA dan lupus nefritis.
26
Dalam percobaan ini, Western blotting dan imunohistokimia menunjukkan penurunan ekspresi nefrin dan podocin
protein dalam ginjal dari NZB / tikus F1 W dengan glomerulonefritis. Pengobatan R406 meningkatkan penindasan ekspresi
nefrin dan podocin protein dalam NZB / W ginjal F1 tikus, menunjukkan bahwa perbaikan glomerulonefritis autoimun dengan
R406 dikaitkan dengan ment improve- dari cedera podosit.
Salah satu peran dari 3BP2 adalah untuk mentransfer sinyal diaktifkan dari Syk terfosforilasi ke protein efektor. 3BP2
terutama dinyatakan dalam sel B; Namun sel T dan sel mast juga mengungkapkan 3BP2. Setelah fosforilasi Syk di sel B, tirosin
183 mengikat langsung ke PLC-g dan Vav. The SH2 domain C-terminal mengikat langsung ke blnk (untuk mentransfer sinyal
diaktifkan) dan Lyn pada waktu yang sama (untuk mengerahkan umpan balik positif untuk Syk).
27
Di periments mantan hadir, fosforilasi 3BP2 di WBC diekstrak dari limpa dari
NZB / tikus F1 W R406-diperlakukan dibandingkan dengan yang dari NZB / W tikus kontrol F1. Hasil ini menunjukkan bahwa
pencegahan lupus nefritis oleh Syk penghambatan dikaitkan dengan phorylation fosfat dari 3BP2.
Baru-baru ini dilaporkan bahwa FcRn kontribusi untuk cedera podosit di glomerulonefritis autoimun.
28,29
Pada glomerulonefritis, peningkatan FcRn di glomeruli
menginduksi cedera podosit dengan meningkatkan UCHL-1 melalui tion fosforilasi dari p38MAPK.
30
Meskipun hubungan antara FcRn dan Syk belum jelas, aktivasi Vav dan faktor pertumbuhan reseptor yang
terikat protein 2 (Grb2) oleh Syk merangsang lecular triphosphatases rendah mo- guanosin berat badan, Rac dan Ras, yang
mengaktifkan jalur dari extracellular- sinyal-diatur kinase (ERK), c-Juni N-terminal kinase (JNK) dan p38MAPK. Selain itu,
KAPAL dikaitkan dengan jalur p38MAPK dan JNK.
31
Dengan demikian, Syk berinteraksi dengan p38MAPK melalui
pasangan ini dari jalur. Dalam percobaan ini, pengobatan R406 tidak mempengaruhi ekspresi FcRn mRNA dan protein pada tikus
NZB / W F1, menunjukkan bahwa penghambatan Syk tidak mempengaruhi ekspresi FcRn. Di sisi lain, pengobatan R406 ditekan
fosforilasi p38MAPK di R406-diperlakukan NZB / tikus F1 W, menunjukkan bahwa aktivasi p38MAPK tidak melalui jalur
FcRn. Syk menginduksi transduksi sinyal hilir melalui protein adaptor (seperti LAT, blnk dan 3PB2) dan protein efektor (seperti
Vav, PLC-g dan PI3K). Dengan demikian, penjelasan hubungan antara Syk dan p38MAPK diharapkan akan berguna untuk
menjelaskan efektivitas inhibitor Syk di glomerulonefritis pengobatan.
Studi klinis telah mengungkapkan bahwa inhibitor Syk yang effec tive untuk meningkatkan rheumatoid arthritis dan idiopatik
purpura cytopenic thrombo-.
32
Dalam penelitian ini, kami mengkonfirmasi efektivitas inhibitor Syk dalam meningkatkan lupus nephritis
di NZB / W tikus F1 dan sebagian mengklarifikasi mekanisme yang mendasari efek ini. Temuan dari penelitian ini
mengungkapkan bahwa ceptors FCG ulang I dan III memainkan peran penting dalam pengembangan glomerulonefritis autoimun
yang disebabkan dan menyarankan bility KEMUNGKINAN yang Syk inhibitor dapat digunakan sebagai obat baru untuk
glomerulonefritis.
Konflik pernyataan bunga
Para penulis mengkonfirmasi bahwa mereka tidak memiliki kepentingan bersaing.
Pengakuan
Kami mengakui dukungan dari penelitian ini oleh hibah keuangan dari Program MEXT-didukung untuk Strategis Penelitian
M. Kitai et al. / Jurnal Farmakologi Ilmu 134 (2017) 29e36 35
Foundation di Perguruan Tinggi Swasta, 2014-2018 (S1411018). The Thors au- terima Akiko Tsunemi untuk dukungan teknis
nya percobaan kami.
Referensi
1. Ebling F, Hahn BH. Subpopulasi dibatasi antibodi DNA di ginjal dari tikus dengan lupus sistemik. Perbandingan antibodi
dalam serum dan ates elu- ginjal. Arthritis Rheum. 1980; 23: 392e403. 2. Teramoto K, Negoro N, Kitamoto K, et al. Analisis
microarray glomerulus
ekspresigendi murine lupus nefritis. J Pharmacol Sci. 2008; 106: 56e67. 3. Clynes R, Ravetch JV. Antibodi sitotoksik memicu
peradangan melaluiFc.
reseptor Kekebalan. 1995; 3: 21e26. 4. Hazenbos WL, Gessner JE, Hofhuis FM, et al. Gangguan IgG-tergantung anafilaksis
dan reaksi Arthus di Fc RIII gamma (CD16) tikus kekurangan. Munity im-. 1996; 5: 181e188. 5. Takai T, Li M, Sylvestre D,
Clynes R, Ravetch JV.rantai penghapusan FCR gamma
Hasilcacat sel efektor pleiotropic. Sel. 1994; 76: 519e529. 6. Poole A, Gibbins JM, Turner M, et al. Reseptor Fc gamma-rantai
dan tirosin kinase Syk penting untuk aktivasi trombosit mouse dengan kolagen. EMBO J. 1997; 16: 2333e2341. 7. de Mol NJ,
Catalina MI, Dekker FJ, Fischer MJ, Heck AJ, Liskamp RM. Fleksibilitas protein dan ligan kekakuan: studi termodinamika dan
kinetik ITAM- ligan berdasarkan mengikat Syk tandem SH2. Chembiochem. 2005; 6: 2261e2270. 8. Hughes CE, Finney BA,
Koentgen F, Lowe KL, Watson SP. N-terminal SH2 domain dari Syk diperlukan untuk (hem) Itam, tapi tidak integrin, sinyal di
trombosit tikus. Darah. 2015; 125: 144e154. 9. Ma TK, McAdoo SP, Tam FW. Limpa tyrosine kinase: pemain penting danpo-
target terapi tentialpada penyakit ginjal. Nefron. 2016; 133: 261e269. 10. Shukla U, Hatani T, Nakashima K, Ogi K, Sada K.
Tyrosine fosforilasi 3BP2 mengatur aktivasi reseptor sel B dari NFAT. J Biol Chem. 2009; 284: 33719e33728. 11. Podolanczuk
A, Lazarus AH, Gagak AR, Grossbard E, Bussel JB. Tikus dan laki-laki: sebuah studi percontohan open-label untuk pengobatan
thrombocytopenic purpura kekebalan tubuh dengan inhibitor Syk. Darah. 2009; 113: 3154e3160. 12. Bahjat FR, Pine PR,
Reitsma A, et al. An orally bioavailable spleen tyrosine ki- nase inhibitor delays disease progression and prolongs survival in
murine lupus. Arthritis Rheum. 2008;58:1433e1444. 13. Smith J, McDaid JP, Bhangal G, et al. A spleen tyrosine kinase inhibitor
reduces the severity of established glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 2010;21: 231e236. 14. McAdoo SP, Reynolds J,
Bhangal G, et al. Spleen tyrosine kinase inhibition at- tenuates autoantibody production and reverses experimental autoimmune
GN. J Am Soc Nephrol. 2014;25:2291e2302. 15. Raghavan M, Bjorkman PJ. Fc receptors and their interactions with immuno-
globulins. Annu Rev Cell Dev Biol. 1996;12:181e220. 16. Gan H, Feng S, Wu H, et al. Neonatal Fc receptor stimulation
induces ubiquitin c-terminal hydrolase-1 overexpression in podocytes through activation of p38 mitogen-activated protein kinase.
Hum Pathol. 2012;43:1482e1490. 17. Clynes R, Dumitru C, Ravetch JV. Uncoupling of immune complex formation and kidney
damage in autoimmune glomerulonephritis. Ilmu. 1998;279: 1052e1054. 18. Zuniga R, Markowitz GS, Arkachaisri T, Imperatore
EA, D'Agati VD, Salmon JE. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between
the composition of immune deposits and Fcgamma re- ceptor type IIA alleles. Arthritis Rheum. 2003;48:460e470. 19. DeFranco
AL, Richards JD, Blum JH, et al. Signal transduction by the B-cell
antigen receptor. Ann NY Acad Sci. 1995;766:195e201. 20. van der Poel CE, Spaapen RM, van de Winkel JG, Leusen JH.
Functional char- acteristics of the high affinity IgG receptor, Fcgamma RI. J Immunol. 2011;186: 2699e2704. 21. Siraganian RP.
Mast cell signal transduction from the high-affinity IgE receptor.
Curr Opin Immunol. 2003;15:639e646. 22. Yokoyama H, Wada T, Furuichi K. Chemokines in renal fibrosis. Contrib
Nephrol.
2003;139:66e89. 23. Ferraccioli G, Romano G. Renal interstitial cells, proteinuria and progression of
lupus nephritis: new frontiers for old factors. Lupus. 2008;17:533e540. 24. Chatziantoniou C, Dussaule JC. Insights into the
mechanisms of renal fibrosis: is it possible to achieve regression? Am J Physiol Ren Physiol. 2005;289: F227eF234. 25.
Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Takagi M, Kodama F, Tomino Y. The role of
podocytes in proteinuria. Nephrology (Carlton). 2007;12(suppl 3):S15eS20. 26. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, et al.
Expression of podocyte-associated mol- ecules in acquired human kidney diseases. J Am Soc Nephrol. 2003;14: 2063e2071. 27.
Kaur M, Singh M, Silakari O. Inhibitors of switch kinase 'spleen tyrosine kinase' in inflammation and immune-mediated
disorders: a review. Eur J Med Chem. 2013;67:434e446. 28. Akilesh S, Huber TB, Wu H, et al. Podocytes use FcRn to clear IgG
from the glomerular basement membrane. Proc Natl Acad Sci US A. 2008;105: 967e972.
29. Olaru F, Luo W, Suleiman H, et al. Neonatal Fc receptor promotes immune
complex-mediated glomerular disease. J Am Soc Nephrol. 2014;25:918e925. 30. Kinugasa S, Tojo A, Sakai T, et al. Selective
albuminuria via podocyte albumin transport in puromycin nephrotic rats is attenuated by an inhibitor of NADPH oxidase. Kidney
Int. 2011;80:1328e1338.
M. Kitai et al. / Journal of Pharmacological Sciences 134 (2017) 29e36 36
31. Kalesnikoff J, Baur N, Leitges M, et al. SHIP negatively regulates IgEþ antigen- induced IL-6 production in mast cells by
inhibiting NF-kappa B activity. J Immunol. 2002;168:4737e4746. 32. Bajpai M. Fostamatinib, a SCyk inhibitor prodrug for the
treatment of inflam-
matory diseases. IDrugs. 2009;12:174e185.