536 1070 1 SM
536 1070 1 SM
ZIMOGRAFI BAKTERI ASAL PANTAI kekerabatan antar spesies bakteri. Keunggulan PCR
PAPUMA PENGHASIL ENZIM dalam hal kecepatan, spesifisitas dan sensitifitasnya
FIBRINOLITIK SEBAGAI ANTI dalam mendeteksi suatu mikroorganisme, menjadikan
teknik ini sebagai‘method of choice’ (Koesharyani et
ATHEROTHROMBOSIS
al., 2003).
1 Untuk mengetahui berat molekul dari enzim yang
Pananjung, A.S,1Novanda asri I, 2M Mirza berpotensi sebagai fibrinolitik di analisis dengan uji
Nuryady,1Evi Umayah Ulfa* zymografi.Zimografi adalah teknik elektroforesis
1 untuk menetapkan aktivitas enzim secaraInsitu.Metode
Fakultas Farmasi, 2Jurusan Biologi FMIPA,
zimografi bersifat mudah, sensitif, dan kualitatif dalam
Universitas Jember
Email: eviulva@gmail.com menganalisa aktivitas enzim (Leber & Balkwill
1997).Sementara itu, elektroforesis dengan teknik
zimografi juga bertujuan mendeteksi aktivitas enzim
proteolitik secara langsung.
Abstract
2. METODE
Atherotrombosis is a disease caused by a blood clot
(thrombus) in a blood vessel, and it can be the leading cause Penelitian ini dilakukan dilaboraturium biologi
of death in the world. Atherotrombosis disease can be Fakultas Farmasi, Laboraturium mikrobiologi dan
overcome with thrombolytic agents, one of which is a biomol Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
fibrinolytic enzyme but it has a expensive price, so we Alam, laboraturium mikrobiologi Fakultas Tehnologi
needto looking for a new fibrinolytic agent in this case the Pertanian Universitas Jember, dan Laboraturium
bacteria, from Papuma coastal. This research is a follow-up Biosains Politeknik Negeri Jember. Penelitian ini
from past research, to identify the bacteria from papuma by
dilaksanakan pada bulan februari - juli 2014.
using 16S rRNA, and to know the Enzyme activated by using
Zymografi.The result of this research is, the bacteria
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini
identification by 16S rRNA is similar with Microbacterium adalah Media Nutrient Broth, Bacto agar, PBS, skim
testaceum with similarity percentage is about 97%. This milk, Agarose, TEMED, APS, Buffer Sampel, Buffer
bacteria is positive fibrinolityc bacteria it can showed by the loading, Primer 27F, 907R, 533F, dan 1492R, EtBr,
result of Zymografi test, there is a one white band on Lisozim, TBE, Taq Polimerase, PCR Master mix,
zymografi gel, and because the protein marker on zymografi Akrilamid, membran dialisis, dan Amonium sulfat.
gel is unseen, so we just used the qualitative observation. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah
cawan petri steril, jarum inokulasi, lampu Bunsen, labu
Keywords:Atherotrombosis, fibrinolitic, 16s rRNA, Bacteria Erlenmeyer, gelas objek, gelas penutup, tabung reaksi,
Identification, Zimografi. rak tabung reaksi, pipet, mikropipet dan tip, 1 set alat
isolasi dna genom, PCR, Running elektroforesis, SDS
PAGE, sentrifuse, LAF, magnetic stirrer, 1 set alat
1. PENDAHULUAN
zymografi.
Atherotrombosis adalah penyakit yang
disebabkanoleh terjadinya pembekuan darah (trombus) Isolasi genom
pada pembuluh darah sehingga menyebabkan Isolasi genom dilakukan dengan metode lisis
terjadinya oklusi.Penyakit ini merupakan penyebab alkali dengan enzim lysozim. Koloni tunggal dari dari
kematian utama di dunia.Penyakit atherotrombosis ini media LB padat ditumbuhkan pada media LB cair dan
dapat diatasi dengan agen trombolitik, salah satunya diinkubasi pada shaker ± 16 jam pada suhu ruang (±
adalah enzim fibrinolitik.Mekanisme kerja enzim 370C). Kultur cair yang diambil 1000 µl dan
fibrinolitik yaitu menghidrolisis fibrin yang dimasukkan dalam eppendorf dan disentrifus selama 5
menyebabkan bekuan darah (Escobar et al., 2002). menit, 40C pada 13.000 rpm kemudian diambil
Enzim fibrinolitik yang digunakan saat ini memiliki peletnya. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali. Pelet
harga yang mahal (Arunachalam dan Aiswarya, 2011). yang diperoleh diresuspensi dengan 350µl buffer STE
Agen fibrinolitik umumnya merupakan bakteri, kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 40C, pada
sehingga dilakukan eksplorasi bakteri perairan yang 5000rpm. Pelet ditambahkan dengan 25µl enzim
memiliki aktivitas fibrinolitik dari pantai papuma lysozim kemudian divortex dan inkubasi pada 37
Jember. ºCselama 1jam.Ditambahkan 200µl buffer lisis dan
Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yaitu, 100µl PCI lalu resuspensi dan sentrifugasi pada
untuk mengidentifikasi isolat bakteri penghasil enzim 13.000rpm, 4ºC selama 10 menit.Lapisan atas yang
fibrinolitik dengan menggunakan analisis rangkaian diperoleh ditampung dalam eppendorf baru dan dicatat
volumenya. Supernatan ditambahkan Na Asetat
1
sebanyak 0,1 kali volume yang diperoleh dan Etanol 2 Penentuan aktivitas enzim dan bobot molekul (BM)
kali volume. Resuspensi dan inkubasi pada -20 selama dengan zimografi
2jam.Sentrifugasi pada 13.000rpm, 4 ºC selama 10 Analisis zimografi dilakukan untuk mengetahui
menit.Selanjutnya ditambahkan dengan 500µl etanol band protein manakah yang memiliki kemampuan
70%. Resuspensi dengan cara membolak-balik untuk menghidrolisis substrat. Sebelum analisis
kemudian sentrifugasi 13.000rpm, 4 ºC selama 10 zimografi dilakukan produksi enzim dan presipitasi
menit. Supernatan dibuang dan dikeringkan lalu enzim menggunakan amonium sulfat.
ditambahkan 50µl buffer TE. Produksi ekstrak kasar protein dari isolat bakteri
Kualitas DNA genom dapat dilihat melalui asal pantai papuma jember dilakukan pada waktu
elektroforesis. mendekati puncak fase logaritmik yaitu jam ke-36.
Ekstrak protein kasar hasil dari produksi selama waktu
PCR DNA pengkode 16S rRNA 36 jam, dipresipitasi dengan Amonium Sulfat
Isolat bakteri yang terlihat pita DNA genomnya menggunakan konsentrasi 80%.
diamplifikasi dengan menggunakan primer DNA Larutan enzim yang dihasilkan dari proses
pengkode 16s rRNA yaitu 27F (5’ AGA GTT TGA sentrifugasi dengan ammonium sulfat masih
TCM TGG CTC AG 3’), 533F (5’ GTG CCA GCM mengandung garam, sehingga perlu dimurnikan lebih
GCC GCG GTA A 3’) dan 907R (5’ CCG TCA ATT lanjut. Proses pemurnian selanjutnya adalah dialisis.
CMTTTG AGT TT 3’), 1492R (5’ GGT TACCTT Dialisis dilakukan untuk menghilangkan molekul-
GTT ACG ACT T 3’) (Lane,1991). PCR dilakukan molekul yang berukuran kecil dari enzim (dalam hal
dengan mereaksikan 15 µl aquabidest steril, 25 µl 2x ini adalah ammonium sulfat). Enzim yang telah
PCR Master mix (Qiagen Kit), 1,25µl forward primer diendapkan, dilarutkan dengan larutan buffer fosfat 50
(10 pmol/µl, konsentrasi akhir 0,25 pmol/µl),1,25 µl mM pH 7.4. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam
reverse primer (10 pmol/µl, konsentrasi akhir 0,25 kantong selofan dan disuspensikan dengan buffer yang
pmol/µl) dan 2 µl ekstrak DNA.Suhu denaturasi 98°C sama, didialisis selama semalam pada kondisi dingin.
dalam 5menit dan 95 °C dalam 35 detik ; annealing Dialisat yang diperoleh selanjutnya di tentukan
dengan suhu 55°C selama 35 detik dan elongasi pada aktivitasnya dengan zimografi. Penentuan aktivitas
suhu 72°C dalam 90 detik. Total siklus 35 kali. enzim dan BM enzim dilakukan menggunakan metode
zimografi. Mekanismenya sama seperti SDS-PAGE
Purifikasi DNA Hasil PCR hanya saja pada gel pemisah ditambahkan suatu
Purifikasi hasil PCR dilakukan melalui substrat yaitu kasein, yang akan berpolimerisasi
pemotongan gel agarose yang mengandung pita DNA dengan akrilamida. Komposisi gel elektroforesis yaitu
hasil PCR. Pemotongan gel ditimbang sebanyak 100 dengan gel penahan sebesar 4% dan gel pemisah 10%.
mg kemudian dimasukkan dalam eppendorf 1,5 ml dan Sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel, sampel
ditambahkan 200 µl buffer NT. Sampel diinkubasi dicampur dengan bufer sampel (rasio 1:4).
selama 5-10 menit pada 50°C kemudian divortex Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt dan
dengan kuat. Sampel dimasukkan dalam kolom 50 A selama 1,5 jam. Setelah pemisahan
NucleoSpin Extract II yang sebelumnya telah elektroforesis, enzim direnatirasi kembali dalam
ditempatkan pada tabung koleksi (2ml) kemudian larutan Tween 20 2,5% v/v sambil digoyangkan
sentrifugasi. Kemudian µl buffer NT3 (buffer pencuci) selama satu jam. Digesti dilakukan dalam buffer fosfat
ditambahkan ke dalam kolom NucleoSpin Extract II 50Mm pH 8.0 pada suhu 60ºC, 30 menit.Selanjutnya
dan disentrifugasi pada 11.000 x g selama 1 menit gel diwarnai dengan larutan pewarna 10 menit dan
sampai semua buffer pindah ke tabung koleksi. dilunturkan dengan larutan peluntur berulangkali
hingga didapatkan pita enzim proteolitik berwarna
Analisis data sekuen DNA pengkode 16S rRNA putih dengan latar gel biru.
BLAST NCBI
Penentuan urutan DNA murni (sekuensing) 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
dilakukan dengan mengirimkan DNA hasil purifikasi Isolat bakteri yang digunakan pada penelitian ini
dari produk ke Laboratorium Biomolekuler Fakultas memiliki aktivitas proteolitik dan aktivitas fibrinolitik
Sainstek UIN Malang. Bioedit software ( Tom HALL , yang diuji menggunakan metode fibrin plate assay dan
Ibis Theraupetics) digunakan untuk analisis data kasar diperoleh dari Pantai Papuma Jember. Kemampuan
hasil sekuensing dan selanjutnya data yang telah diolah dalammenghidrolisis protein dan fibrin
di dicocokkan dengan data di gene bank mengindikasikan bahwa isolat bakteri tersebut mampu
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/yang akan menunjukkan menghasilkan enzim fibrinolitik. Kemampuan
kekerabatan spesies tersebut secara genetic menghasilkan fibrinolitik ini dapat dimanfaatkan
(Philogenetic Tree). dalam pencarian agen fibrinolitik dari mikroorganisme
asal perairan Indonesia. Karena pentingnya isolat
2
tersebut sebagai agen fibrinolik maka isolat tersebut Hasil PCR dengan menggunakan primer 1 dan 2
perlu dikarakterisasi lebih lanjut. Karakterisasi disini pada kondisi denaturasi 98°C dalam 5menit dan 95 °C
adalah mengidentifikasi isolat dengan memanfaatkan dalam 35 detik ; annealing dengan suhu 55°C selama
sekuen 16S rRNA sebagai kunci identifikasi dan uji 35 detik dan elongasi pada suhu 72°C dalam 90 detik.
Zymografi untuk menguji aktivitas isolate bakteri. menunjukkan bahwa DNA pengkode 16S rRNA
berhasil diamplifikasi dengan produk PCR berkisar
Isolasi DNA genom 900 pb. Hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA
isolasi DNA genom sebagai templat dengan terlihat jelas dan tidak ada mixing bands (pita yang
menggunakan metode lisis alkali yaitu menggunakan tercampur), selanjutnya dilakukan pemurnian produk
enzyme lysozyme. Prinsip metode ini yaitu isolasi hasil PCR.
DNA genom dilakukan dengan cara melisiskan sel
dengan enzyme lysozyme diharapkan sel akan pecah Purifikasi DNA Hasil PCR
dan DNA genom keluar dari sel. Hasil isolasi DNA Purifikasi DNA hasil PCR menggunakan PCR
genom yang ditunjukkan pada gambar 5.1 clean – up Gel Extraction Nucleospin® Extract II.
memperihatkan adanya satu pita DNA yang Tahapan purifikasi dilakukan sesuai dengan prosedur
menujukkan adanya DNA genom hasil isolasi. yang terdapat dalam metode.Purifikasi bertujuan
memurnikan produk PCR yang diperoleh dari pengotor
yang mungkin ada pada produk PCR. Hasil purifikasi
WU 01
kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa.
Purifikasi hasil PCR 16S rRNA ditunjukkan pada
gambar 1.3
P1 P2 M
4
elektroforesis. Tebal tipisnya pita protein yang Collen, D., & Lijnen, H. R. 1994. Staphylokinase a
terbentuk pada hasil elektroforesis menunjukkan Fibrin-Specific Plasminogen Activator with
kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai Therapeutic Potential. Blood, 84 (3): 680-686.
berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita Djaja, S., Suwandono, A & Soemantri,. 2003. Pola
yang sama. Hal ini sesuai dengan prinsip pergerakan penyakit penyebab kematian di perkotaan dan
molekul bermuatan, yaitu molekul bermuatan dapat pedesaan di Indonesia, Studi Mortalitas Survei
bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik. Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) 2001. J
Molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan Kedokter Trisakti. 22(2).
terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) 2001. J Kedokteran
berdekatan (Sudarmadji, 1996). Trisakti. 22(2).
Meyrath, J. & Volavsec, U. 1975. Production and
Microbial Enzyme,in Food Processing edited by
4. KESIMPULAN Reed G. New York: Academic Press.
Meyrath, J. & Volavsec, U. 1975. Production and
Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan Microbial Enzyme,in Food Processing edited by
bahwa DNA pengkode 16S rRNA isolat bakteri Reed G. New York: Academic Press.
fibrinolitik asal pantai Papuma Jember berhasil Setiawan, A. 2013. “Skrining Agen Fibrinolitik Isolat
diisolasi dan di tentukan urutan DNAnya. Hasil Bakteri dari Perairan Pantai Papuma Kabupaten
komparasi dengan data di gene bank spesies tersebut Jember,” Tidak Dipublikasikan. Skripsi. Jember:
berkerabatdekat dengan spesies bakteri Biologi FMIPA Universitas Jember.
Microbacterium testaceumdengan tingkat kesamaan Setiawan, A. 2013. “Skrining Agen Fibrinolitik Isolat
gennya 97%, dan dari hasil pohon filogenetik memang Bakteri dari Perairan Pantai Papuma Kabupaten
bakteri ini berkerabat dekat dengan beberapa spesies Jember,” Tidak Dipublikasikan. Skripsi. Jember:
dari genus Microbacterium. Hasil Zimografi Biologi FMIPA Universitas Jember.
menunjukkan adanya pita putih pada gel yang World Health Organization. 2008. The World Health
mengindikasikan bakteri tersebut memproduksi enzim Report 2008: Primary Health Care Now More
pendegradasi substrat (protein). Than Ever. Geneva: WHO Library Cataloguing-
Proses identifikasi dengan menggunakan 16S in-Publication
rRNA harusnya dilakukan pengulangan sekuensing World Health Organization. 2008. The World Health
minimal tiga kali untuk meminimalisir terjadinya Report 2008: Primary Health Care Now More
kesalahan pembacaan urutan basa nukleotida dari Than Ever. Geneva: WHO Library Cataloguing-
sekuen DNA pengkode 16S rRNA yang diteliti. Juga in-Publication
perlu dilakukan pengujian fenotiping, dan biokimia
untuk dapat mendukung hasil diatas. Untuk pengujian
zimografi hendaknya menggunakan marker yang
spesifik untuk pengujian zimografi, sehingga setelah
dilakukan pengujian dapat dilakukan pengamatan
secara semi kuantitatif.
UCAPAN TERIMAKASIH
5. REFERENSI