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Los medios de cultivo en microbiologa

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de estractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El gar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

continuar

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos


El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustacnias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido.

Los

medios

solidificados

con

gelatina

tienen

el

gran

inconveniente

de

que

muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que preveer el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores

(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante) continuar Evolucin de los medios de cultivo

La evolucin de los medios de cultivo


Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el

desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos. continuar Tipos bsicos de medios de cultivo

Tipos bsicos de medios de cultivo


atendiendo a su estado fsico:
lquidos semislidos slidos

atendiendo a su utilidad prctica:


Medios para aislamientos primarios: para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen

requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Medios para identificacin:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin) continuar Algunos medios de cultivo de uso habitual

Los medios de cultivo en microbiologa


Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos


El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo


Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo


atendiendo a su estado fsico:
lquidos semislidos slidos

atendiendo a su utilidad prctica:


Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).

Medios para identificacin: diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las

peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin)

Agar sangre (=TSA = Trypticase Soja Agar)


El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio visualizar de eleccin para anaerobios. Permite hemolticas que producen reacciones

muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica de soja) (digeridos con una

trpticos,

digeridos

proteicos

pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. La aportacin de caseina y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y pptidos de cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran varedad de grmenes aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero Candida. Tambn permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. El cloruro sdico proporciona electrolitos esenciales. La adicin de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP. Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemlisis beta, produce un halo transparentealrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma). La produccin de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmsfera de incubacin.

Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmsfera enriquecida en CO2. Si se aade al medio el 0,5% de telurito potsico es muy til par el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos.

formulacin (segn Becton Dickinson): Digerido pancretico de caseina Digerido papaico de haba de soja Cloruro Sdico Agar Factores de crecimiento Sangre desfibrinada de carnero 15.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1.5 g 50.0 ml

Chocolate Polyvitex (= Agar chocolate)


Este medio utiliza la misma base que el gar Sangre. Antiguamente se aadan los hematies a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. El Agar chocolate al es un medio de destinado y

principalmente otros

aislamiento

gonococos Con un

meningococos, pero en el que pueden crecer muchos microorganismos exigentes. medio anlogo a ste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, despus de aadir antibiticos. El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o Hemina termoestable. Otros factores, en particular el factor V (dicotn-adenina nucletido) termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla qumicamente definida: el PolyViteX. El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los grmenes encontrados en patologa humana o veterinaria.

La siembra de lquidos cefalorraqudeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero est particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patgenas y de los Haemophilus.

Aislamiento e identificacin de Haemophilus


Los microorganismos del gnero Haemophilus se cultivan en Agar chocolate con PolyVitex. Como en el caso del gonococo el cultivo es rpido y abundante sobre todo en atmsfera rica en C02. Estos grmenes encuentran en este medio los factores X y V necesarios para su crecimiento. El diagnstico de la serie al respecto puede conducirse de la manera siguiente: Si se siembra en cuatro medios diferentes: Agar Trypcase-soja Agar Agar que no contenga con chocolate ni factor V, ni (factor (factor factor X V) X)

Trypcase-soja

PolyViteX

- Agar chocolate con PolyVitex (factores X y V) El recuadro que se da a continuacin indica los resultados obtenidos en estas condiciones con los principales Haemophilus: H. parainfluenzae crece en Trypcase soja con PolyViteX (V) y en chocolate con PolyViteX (V yX) H. aphrophilus crece Chocolate (X) y en chocolate con PolyViteX (V yX) H. influenzae, H. haemolyticus, H. aegiptius crecen en los 4 medios otras pruebas que ayudan a diferenciarlos: H. aegiptius aglutina hematies humanos (prueba en porta), H. influenzae no los aglutina H. haemolyticus da hemlisis en Agar con 5% de sangre de caballo
fotografa: Dani Val

Agar Mac Conkey


El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgenos entricos. Actualmente existen una gran cantidad de medios diseados para el aislamiento, cultivo e identificain de bacterias entricas. El artculo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contena una descripcin detallada de su composicin y de los diferentes

patrones de crecimiento obtenidos. Su composicin se ha modificado en numerosas ocasiones Se parti de la idea de que las sales Biliares precipitan cidos y que ciertos microorganismos entricos fermentan la Lactosa mientras que otros no lo hacen. La frmula del agar MacConkey II es de 1983 y se dise especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el "swarming" de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciacin entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. La diferenciacin de organismos entricos se lleva a cabo con la combinacin de Lactosa con el indicador Rojo neutro.Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario. LECTURA: colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentacin de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa)

formulacin (segn Becton Dickinson): Digerido pancretico de gelatina Digerido pancretico de caseina Digerido pptico de tejido animal Cloruro Sdico Agar Lactosa Sales biliares Rojo neutro Cristal violeta 17.0 g 1.5 g 1.5 g 5.0 g 13.5 g 10.0 g 1.5 g 0.03 g 0.001 g

Caldo de Tioglicolato

Es el caldo de enriquecimiento ms utilizado en Microbiologa. Contiene 0,075 % de gar para evitar que las corrientes de conveccin transporten el oxgeno de la superficie a toda la masa del caldo. El cido Tiogliclico acta como agente reductor, disminuyendo aun ms el potencial de xido-reduccin del medio. Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseina, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patgenas. Hay distintas frmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de xido-reduccin (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y Hemina.

Agar Schaedler
Schaedler + 5% sangre de cordero. Este medio reductor est particularmente adaptado al cultivo de los grmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, as como la adicin de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes. Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemlisis de los estreptococos puede disminuir. Sembrar lo ms rpidamente posible la muestra a su llegada al laboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio que garantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco). Despus de sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de anaerobiosis o bien en sistema individual.

K-W (Kanamicina-Vancomicina)

Se utiliza para el aislamiento rpido de Bacteroides sp. Contiene 75 g/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayora de los que bacilos inhibe aerobios, a la facultativos de y los anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 g/ml de Vancomicina, mayora microorganismos GramPositivos. Contiene tambin sangre "lacada" de conejo que permite la pigmentacin precoz de los Bacteroides sp pigmentados. Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no crecern en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tincin Gram y confirmar la tolerencia al aire de todos los organismos aislados
fotografa: Dani Val

BBE (=Bacteroides Bilis Esculina)


El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificacin presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores. La mayor parte de las infecciones humanas

producidas por bacterias anaerobias son debidas a grmenes pertenecientes al grupo Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis y B. vulgatus). Es importante una rpida deteccin e identificacin de estos microorganismos ya que se ha observado un incremento de la resistencia a antibiticos mayor que en otros grupos de anaerobios. El agar BBE permite una inhibicin selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall.

La diferenciacin del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrlisis de la esculina con produccin de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato frrico amnico) produciendo una coloracin marrn oscuro-negro rodeando a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis. Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayora de anaerobios excepto los del grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es til para la deteccin de este grupo de microorganismos ya que por lo general son Esculina positivos. Tambin pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos.

formulacin (segn Becton Dickinson): Digerido pancretico de caseina Digerido papaico de haba de soja Cloruro Sdico Agar Factores de crecimiento Esculina Citrato frrico amnico Bilis especial Hemina Vitamina K1 Amikacina 14.5 g 5.0 g 5.0 g 14.0 g 1.5 g 4.0 g 0.5 g 20.0 g 1 ml 1 ml 0.04 gr

fotografa: Dani Val

Agar de Czapek
Es un medio especializado para estudios de hongos. Se utiliza de forma muy especial para estimular las caractersticas diferenciales de Aspergillus spp, lo que facilita su identificacin, y para estimular schenckii. la filamentacin de Sporothrix

fotografa: Dani Val

Agar Salmonella-Shigella (SS)


gar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se dise para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibicin de coliformes sin restringir el crecimiento de otros BGN patgenos. Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas.

Bacteria
Salmonella enteritidis Shigella flexneri Proteus mirabilis Enterococcus faecalis Enterobacter aerogenes
fotografa: Dani Val

Crecimiento
bueno aceptable regular escaso regular

Color de las colonias


incolora incolora incolora incolora crema/rosa

Medios de cultivo de uso habitual


AGAR SANGRE : Medio enriquecido, estndar (ver ms)

AGAR POLIVITEX (chocolate) : Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en medios habituales y para atmsfera de CO2 (ver ms) MAC CONKEY : Selectivo para BGN. Lactosa+indicador (ver ms) MULLER-HINTON : medio slido estndar para antibiogramas con discos y por difusin MULLER-HINTON/SANGRE : ATB bacterias que requieran sangre (Neumo. Strepto) MULLER-HINTON/CHOCO : ATB microorganismos que requieran Factores (Haemophilus) THAYER-MARTIN : selectivo Neisserias patg. (N. lactamica, Gono/Meningo) para atmsfera de CO2 OXIDACION/FERMENTACION (GLUCOSA) : Estudio de utilizacin de Glucosa por los BGN TREE SUGAR-IRON : tubo en pico flauta (base larga, pico corto), para estudiar Oxid/Ferm de Gluc-Lact-Sac, produccin gas y SH2 TIOGLICOLATO : Medio lquido (ver ms) SCHAEDLER : medio bsico enriquecido con sangre. Para ANA (ver ms) KANA-VANCO : Con Kanamicina y Vancomicina. Selectivo para Bacteorides y otros BGN anaerobios. Para atmsfera ANA (ver ms) BBE: Bacteroides Bilis Esculina. Selectivo para Bacteorides. Para atmsfera ANA (ver ms) SABOURAUD : Cultivo de hongos (incubar a T ambiente y a 37 gC) SAB + Cloranfenicol y Actidione : Selectivo hongos patgenos CZAPEK : Medio para Hongos. Identificacin de Aspergillus (ver ms) SALMONELLA-SHIGELLA : medio altamente selectivo para Salmonella y Shigella (ver ms) XLD : Selectivo Salmonella y Shigella SELENITO : Medio lquido de enriquecimiento selectivo para Salmonella-Shigella CIN : Selectivo Yersinia CLED : Medio de recuento urinario. Indicador de fermentacin de Lactosa

GARDNERELLA : Selectivo Gardnerella vaginalis. Contiene sangre humana para valorar hemlisis CAMPY : Cultivo de Campylobacter

INVESTIGACION Y RECUENTRO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA- POSITIVA (COLIFOTMES) Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios, taxonmicos. Pertenecen a la familia enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con prediccin de cido y gas, ms o menos rpidamente en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Son bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo conformes forman parte varios gneros:

Escherichia. Enterobacter. Klebsiella. Citrobacter.

Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin otros ambientes: suelo, plantas, cscara de huevo, cte. Aunque su especificidad como indicadores no son buenos, se suelen usar como ndice de contaminacin fecal por:

Su frecuencia en heces. Su fcil deteccin en el laboratorio. Sus caractersticas semejantes, en algn aspecto, a las de algunos miembros patgenos de la familia Enterobacteriaceae.

Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y por consiguiente, los que ms interesan en el anlisis microbiolgco de alimentos. Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coIi. Sus principales caractersticas son:

Aptitud para desarrollarse entre 435-455C. Capacidad para crecer en presencia de sales biliares. Facultad para producir ndole en agua de peptona.

En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) indican manipulacin y elaboracin deficientes de los alimentos.

INVESITIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS (COLIFORMES) Investigacin y recuento en medio lquido. Para la deteccin de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (conliformes), se aprovechan ciertas caractersticas que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas en presencia de sales biliares. Material:

Tubos de ensayo de 16x160 mm. Gradillas. Pipetas estriles de 10 y 1 ml. Estufa de cultivo.

Medio de cultivo: Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) Composicin: - Peptona 10 g. - Lactosa 10 g. - Bilis de buey 20 g. - Verde brillante 0,0133 g. - Agua destilada 1.000 ml. Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en tubos de ensayo con campana Durham a razn de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 20 minutos. Tcnica Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos cada una. Cada tubo contendr 10 ml de BGBL (vase apartado anterior). a) En cada uno de los tubos de la primera serie, se vierte 1 ml de la dilucin de la muestra al 1: 10. (-1). b) En cada uno de los tubos de la segunda serie, se vierte 1 ml de la dilucin de la muestra al 1: 100 (-2). c) En cada uno de los tubos de la tercera serie, se vierte 1 ml de la dilucin de la muestra al 1: 1.000 (-3). d) Incubar las tres series a 31 + 1C, haciendo lecturas a las 24 y 48 horas. La reaccin es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentacin de la lactosa con formacin de cido y gas en presencia le sales biliares a una temperatura comprendida entre 30-37 'C.

Con el nmero de tubos positivos en cada serie, se recurre a la Tabla del Nmero Ms Probable (NMP), donde se obtendr el recuento por gramo o mililitro de muestra. Tabla del Nmero Ms Probable (NMP) por grano o mililitro utilizando tres series de tres tubos cada una, conteniendo 10 ml de medio lquido y sembrando 1 ml de la dilucin 1:10, 1 ml de la dilucin 1:100 y 1 ml de la dilucin 1:1.000 Tres tubos Tres tubos Tres tubos NMP de 1 ml 1 ml 1 ml grmenes 1:10 1:100 1:1.000 g o ml 000<3 0013 0103 1004 1017 1107 1 1 1 11 1 2 0 11 2009 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64

3 1 0 43 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150 3 2 2 210 3 3 0 240 3 3 1 480 3 3 2 1.100 3 3 3 > 2.400 Investigacin y recuento en medio slida En la tcnica que se describe a continuacin se utiliza el medio selectivo agar biliado rojo neutro cristal violeta (Violet Red Bite Agar: VRBA). Material:

Placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro. Pipetas estriles de 1ml. Estufa de cultivo. Cuenta colonias.

Medio de cultivo (preparacin del medio de cultivo). Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA). Composicin:

Extracto de levadura 3g. Peptona 7g. Cloruro sdico 5g. Sales biliares 10g. Lactosa 5g. Rojo neutro 003g.

Cristal violeta 002g. Agar 15g. Agua destilada 1000g.

Disolver los ingredientes por calentamiento. Mantener en ebullicin dos minutos. Ajustar el pH a 7,4. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Para placas de Petri, se enfriar a 45 'C. Tcnica A partir de 1a serie de diluciones de deciniales (ver pg. 11) y por duplicado, se aade 1 ml de cada dilucin en placas de Petri estriles; a continuacin se vierten unos 15 ml de agar VRBA (vase apartado anterior) atemperado a 47C. Mezclar cuidadosamente. Una vez solidificado el medio en una superficie horizontal se vierten 3-4 ml del mismo medio estril sobre cada placa, formando una capa que evita el excesivo crecimiento y la extensin de las colonias, lo que facilita su recuento. Incubar las placas en posicin invertida a 31 + 1C durante 24 horas. Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben la llora acompaante gram positiva. La fermentacin de la lactosa hace que vire el indicador rojo neutro a un color rojo prpura. Tambin. se produce una precipitacin de las sales biliares. La lectura consiste en contar las colonias rojo prpura rodeadas de una zona de precipitacin de las sales biliares color violeta. Para el recuento se eligen placas que contengan entre 30 y 150 colonias tpicas. El nmero de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilucin de la placa elegida, da como resultado el nmero total de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) por gramo o mililitro de muestra. INVESTIGACION Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI Escherichia coli es husped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente. Por su especificidad, est considerado como un buen ndice de contaminacin fecal. Tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el ambiente extraentrico, por lo que su presencia en los alimentos indica contaminacin reciente. Se destruye a temperatura de pasteurizacin y tambin durante su almacenamiento en fro, sobre todo a temperatura de congelacin. Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patgena; as, por ejemplo, es mucho menos resistente que la Salmonella a las condiciones ambientales y a la accin del fro. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es un germen de forma bacilar, casi siempre mvil, gram negativo. Posee estructura antignica, aunque no suele ser patgeno, existen cepas enteropatgenas para el hombre:

Cepas enterotoxignicas (ECET). Cepas enteroinvasivas (ECEI). Cepas enteropatgenas (ECEP). Cepas enterohemorrgicas (ECEH).

Escherichia coli se ajusta a las siguientes caractersticas:

Prueba Reaccin Movilidad + (casi siempre) Indol + Rojo de metilo + Voges Proskauer Betagalactosidasa + Citrato de Simmoms SH2 Lisina + Urea Fermentacin de la glucosa + Fermentacin de la lactosa + Material:

Tubos de ensayo de 16x 160 mm. Gradillas. Asa de cultivo. Bao mara. Placas de Petri de 90 mm. Pipetas de 1ml. Estufa de cultivo.

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL, ver pg. 18) Agar Levine: Composicin:

Peptona 10g. Lactosa 10g.

Fosfato dipotsico 2g. Eosina 040g. Azul de metileno 0065g. Agar 15g. Agua destilada 1000 ml.

Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 71, distribuir y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Atemperar para preparar placas de Petri. Agua de triptona (Tryptone Water: TW, ver pg 11). Reactivo de Kovacs Composicin:

Paradimetil-amino-benzldehido 5g. Alcohol amlico 75g. Acido clorhdrico puro 25g.

Se disuelve el aldehido en el alcohol calentando a 60C al bao mara. Dejar enfriar y aadir, gota a gota el cido. Se obtiene un lquido de color amarillo dorado que debe conservarse en frasco topacio, al abrigo de la luz y en frigorfico. Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA). Medio de Clark y Lubs (MR-VP). Composicin:

Peptona 7g. Glucosa 5g. Fosfato dipotsico 5g. Agua destilada 1000ml.

Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 69, distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razn de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Reactivo para la prueba de rojo de metilo: Composicin:

Alcohol de 90 65 ml.

Agua destilada 35 ml. Rojo de metilo 020g.

Se disuelve el colorante en el alcohol y se completa con el agua destilada. Reactivos para la investigacin de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer: VP): Composicin:

Reactivo A:

- Alfa-naftol 40g. - Alcohol absoluto 100ml. La solucin se conserva en oscuridad.

Reactivo B:

- Hidrxido potsico 40g. - Agua destilada 100ml. Creatinina. Agar citrato de Simmons: Composicin:

Sulfato magnsico 020g. Dihidrgeno fosfato amnico 020g. Fosfato sdico amnico 080g. Citrato sdico 2g. Cloruro sdico 5g. Azul de bromotimol 008g. Agar 15g. Agua destilada 1000ml.

Disolver por calentamiento hasta ebullicin. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razn de 7 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar solidificar con una inclinacin que permita obtener un fondo de 2-3 cm y una superficie de 4-5 cm. Caldo lauril sulfato (MUG):

Composicin:

Triptosa 20g. Lactosa 5g. Cloruro sdico 5g. Lauril-sulfato sdico 010g. Hidrgeno-fosfato dipotsico 275g. Hidrgeno-fosfato potsico 275g. Triptfano 1g. Metil-umbiferil-glucurmico 010g. Agua destilada 1000ml.

Disolver por calentamineto. Ajustar el pH a 71. Distribuir en tubos con campana Durham a razn de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. TECNICA Para la investigacin y recuento de E. Coli, se parte de los resultados obtenidos en la investigacin de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), de acuerdo con los siguientes pasos: Con asa de siembra se subcultivan todos los tubos positivos (con gas) que se han detectado en la investigacin de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), a otros que contengan 10 ml de caldo lactosado verde brillante (BGBL) con campana Durham. Incubar los tubos sembrados en bao Mara regulado a 44,5 + 0,5C con lectura a las 24 y 48 horas. La temperatura de incubacin es selectiva para Escherichia coli. Se presupone que todo tubo que presente gas despus de la incubacin es Escherichia coli. Para su confirmacin, a partir de los tubos positivos, se hacen siembras sobre agar Levine, con el fin de obtener colonias aisladas fcilmente identificables. Incubar a 44,5 + 1C con lecturas a las 24 y 48 horas. Las colonias de E. Coli sobre agar Levine miden 2-3 mm de dimetro, son planas o ligeramente cncavas, con centros oscuros, casi negros, que ocupan las partes de la colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metlico verdoso; a veces, este brillo metlico no se manifiesta. Para investigar la produccin de indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos con TW. Incubar en bao Mara a 44,5C durante 24 horas. Pasado este tiempo se incorporan 0,5 ml del reactivo de Kovacs a cada tubo. La reaccin positiva se manifiesta por la formacin de un anillo rojo bermelln en la superficie del medio; la reaccin negativa muestra anillo amarillento. Escherichia coli, al desaminar e hidrolizar el triptfano del medio, produce indol, que se pone de manifiesto al aadir el reactivo de Kovacs. Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5C, produccin de indol y crecimiento caracterstico sobre agar Levine, se hace la lectura en la tabla del NMP para obtener el nmero de E. Coli por gramo o mililitro de muestra. Otras pruebas de confirmacin

Normalmente, basta con las pruebas anteriormente expuestas para la investigacin y recuento de E. Coli. No obstante, en ocasiones es necesario realizar ms pruebas de confirmacin como, por ejemplo, las IMVC, previa purificacin de las colonias en agar nutritivo PCA. I = indol M = rojo de metilo V = Voges Proskauer C = citrato Para llevar a cabo las pruebas de rojo de metilo y Voges Proskauer, se siembran dos tubos de medio de Clark y Lubs (MR-VP); por cada colonia que haya que identificar. Incubar a 37C durante 4 das. En uno de los tubos se investiga el rojo de metilo y en otro el acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer). Reaccin del rojo de metilo A uno de los tubos que contienen el cultivo sobre el medio de Clark y Lubs (MR-VP), se aaden 1-2 gotas del reactivo rojo de metilo. En caso positivo, se produce una coloracin roja; en la reaccin negativa, el color es amarillo. E. coli es un organismo rojo de metilo (RM) positivo. Investigacin de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer) Al cultivo obtenido en el otro tubo del medio de Clark y Lubs (MR-VP) se aaden 0,6 ml de reactivo A y 0,2 ml del reactivo B. Agitar la mezcla e intensificar la reaccin con unos cristales de creatinina. Hacer la lectura entre los 15 minutos y las 4 horas posteriores a la terminacin de la prueba. La reaccin positiva se manifiesta por un fuerte color rojo. E. coli es un germen Voges Proskauer negativo. Asimilacin del citrato A partir de un cultivo reciente en PCA de la colonia en estudio, se siembra en estra nica sobre la superficie inclinada de agar citrato de Simmons. Incubar a 37C durante 24 horas. La reaccin es positiva cuando se produce crecimiento en el medio. E. coli es una bacteria citrato-negativa, es decir, no crece sobre agar citrato de Simmons, por no utilizar el citrato como nica fuente de carbono. Escherichia coli responde a las pruebas IMVC de la forma siguiente: Indol (I) = positivo; a veces, negativo Rojo de metilo (M) = positivo Voges Proskauer (V) = negativo Citrato (C) = negativo PRUEBA RAPIDA PARA INVESTIGACIN DE ESCHERICHIA COLI (MUG)

Dentro de la familia Enterobacteriaceae, E. Coli posee, junto con algunas especies de Salmonella y Shigella, la encima B-D-glucuronidasa, que tiene la facultad de romper el sustrato 4-metil-umbelifeeril-B-D-glucurnico (MUG). Esta sustancia, incorporada al medio de cultivo, libera como producto final 4-metil-umberiferona, por accin de la enzima. Este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. Aprovechando esta caracterstica se utilizan medios de cultivo a los que se ha incorporado el sustrato MUG, con la ventaja de poder realizar una prueba rpida para la investigacin de E. Coli. Tcnica en medio lquido Se preparan tres series de tres tubos cada una, cada tubo con 10 ml de caldo lauril sulfato con MUG y campana Durham. A cada uno de los tres tubos de la primera serie se le aade 1ml de la dilucin del alimento al 1:10. A cada uno de los tres tubos de la segunda serie se le aade 1 ml de la dilucin del alimento al 1:100. A cada uno de los tres tubos de la tercera serie se le aade 1 ml de la dilucin del alimento al 1:1000. Incubar las tres series de tubos a 37C durante 24 horas. En la lectura se tendr en cuenta:

Si se ha producido gas en la campana Durham por fermentacin de la lactosa. Si se produce fluorescencia azul/verde por presencia de la enzima B-D-glucuronidasa. Si la reaccin de indol es positiva al aadir el reactivo de Kovacs.

Deben coincidir: la aparicin de gas en la campana Durham, la fluorescencia azul/verde al observar los tubos con luz ultravioleta y la presencia de indol. Para obtener el nmero total de E. Coli por gramo o mililitro, se recurre a la Tabla del NMP. En la investigacin de cepas patgenas de Escherichia coli hay que tener en cuenta que las cepas enterohemorrgicas (ECEH) no dan flluorescencia cuando se investigan por una tcnica MUG, debido a que no poseen la enzima B-D-glucuronidasa. INVESTIGACION DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son grmenes de forma bacilar, gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, mviles o inmviles, que fermentan la glucosa, reducen nitratos a nitritos, son citocromo-oxidasa negativos y crecen en medios que contienen sales biliares. De los integrantes de esta familia, unos fermentan la lactosa y otros no. Incluye los siguientes gneros: No fermentadores de la lactosa Fermentadores de la lactosa Salmonella Escherichia Shigella Enterobacter Edwarsiella Citrobacter

Hafnia Serratia (a veces) Proteus Kelbsiella (excep. Kb. Rhinoscleromatis) Providencia Yersinia Morganella Erwinia (fermenta excepcionalmente) Las Enterobacteriaceae son indicadoras de contaminacin fecal, y su uso como ndice ha adquirido gran aceptacin en Europa. Se utilizan, preferentemente, para sealar la calidad sanitaria de alimentos procesados. Su presencia a niveles altos en estos productos indica elaboracin poco higinica, contaminacin posterior a su fabricacin o ambas cosas. INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN MEDIO LIQUIDO Material:

Pipetas estriles de 1ml. Asa de cultivo. Estufa de cultivo. Cuenta colonias. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Placas de Petri de 90 mm.

Medios de cultivo y reactivos. a) Caldo triptona-soja (Tryptone Soy Broth: TSB). Composicin: - Triptona 17g. - Soja 3g. - Dextrosa 250g. - Cloruro sdico 5g. - Fosfato dipotsico 250g. - Agua destilada 1000ml.

Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 73. Distribuir en matraces de 100 ml a razn de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. b) Caldo EE de mossel simple. Composicin: - Peptona 10g. - Fosfato sdico 650g. - Dextrosa 5g. - Fosfato potsico 2g. - Bilis de buey 20g. - Verde brillante 0125g. - Agua destilada 1000ml. Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 72. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm a razn de 10 ml. Calentar en bao Mara a 100C durante 20 minutos, exactamente. Enfriar inmediatamente en agua del grifo. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. c) Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG). Composicin: - Extracto de levadura en polvo 3g. - Peptona 7g. - Cloruro sdico 5g. - Sales biliares 150g. - Glucosa 10g. - Rojo neutro 003g. - Cristal violeta 0002g. - Agar 12g. - Agua destilada 1000ml. Disolver por calentamiento hasta ebullicin. Ajustar el pH a 73. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Atemperar el medio y preparar placas de Petri. d) Reactivo para la prueba de citocromo-oxidasa: CO Composicin:

- Clorhidratado de N-dimetil-parafenilendiamina 100ml. - Agua destilada 100ml. Esta solucin se usa recin preparada. En el comercio existen discos, tiras y varillas. e) Medio Kliger Iron Agar: KIA Composicin: - Extracto de carne 3g. - Extracto de levadura 3g. - Peptona 20g. - Cloruro sdico 5g. - Sulfato ferroso 030g. - Tiosulfato sdico 030g. - Lactosa 10g. - Glucosa 1g. - Rojo fenol 005g. - Agar 15g. - Agua destilada 1000ml. Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7'4. Repartir en tubos de 16 x 160 mm a razn de 7ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posicin inclinada con un fondo de 3-5 cm. El medio se puede utilizar en el transcurso de 5-6 das despus de terminar su preparacin. f) Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA). TECNICA Preenriquecimiento: Se parte de la suspensin madre del alimento (1:10) en caldo triptona soja (TSB). El matraz que contiene la suspensin se deja a temperatura ambiente durante dos horas, agitando de vez en cuando. Enriquecimiento: A partir de la suspensin madre (1:10) del alimento, se hacen diluciones al 1:100 y 1:1000, utilizando como diluyente caldo TSB. Se preparan tres series de cinco tubos, conteniendo cada uno de ellos 10 ml de caldo de enriquecimiento EE de Mossel simple. Usando distinta pipeta para cada dilucin, se procede de la siguiente forma:

En la primera serie de cinco tubos se aade a cada tubo 1 ml de la dilucin del alimento al 1:10. En la segunda serie de cinco tubos se aade a cada tubo 1 ml de la dilucin del alimento al 1:100. En la tercera serie de cinco tubos se aade a cada tubo 1 ml de la dilucin del alimento al 1:1000.

Agitar para mezclar e incubar todas las series a 37 durante 24 horas. Identificacin de colonias tpicas en medio slido: Agitar para mezclar bien el contenido de los tubos que presenten crecimiento bacteriano. Con asa de cultivo, sembrar sobre la superficie bien seca de agar biliado rojo violeta (VRBG) contenido en placas de Petri. Incubar a 37C durante 24 horas. Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitacin de las sales biliares alrededor de las colonias. Hay que tener en cuenta que esta misma reaccin la dan en este medio las Aeromonas. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de una halo de precipitacin, tambin violeta, se consideran Enterobacteriaceae. Pruebas confirmativas De las colonias tpicas crecidas sobre el medio VRBG, se siembran, como mnimo, dos colonias sobre PCA. Incubar a 37C durante 24 horas. Partiendo de este cultivo se realizan las siguientes pruebas confirmativas:

Prueba de la citocromo-oxidasa

Para la deteccin de esta enzima, se coloca un trozo de papel Whatman de unos 5 cm2 en una placa de Petri vaca. En el centro del papel se depositan tres gotas del reactivo. Con una pipeta Pasteur con la punta cerrada, se toma una porcin del cultivo obtenido sobre agar nutritivo y se extiende sobre el papel impregnado de reactivo, en una zona de 4-5 mm. En la reaccin positiva aparece un color violeta oscuro en la extensin del cultivo. Las Enterobacteriaceae son citocromo-oxidasa negativas.

Prueba sobre agar Kliger (KIA)

El medio lleva incorporados dos azcares: glucosa y lactosa. Tambin contiene sulfato ferroso, que sirve de indicador de SH2 cuando, al reducirse, se transforma en sulfuro, de color negro. En el fondo del tubo se refleja la fermentacin de la glucosa, al virar el medio amarillo por acidificacin. Esta fermentacin puede ir acompaada de desprendimiento de gas, en cuyo caso se cuartea el medio o se separa del tubo. En la zona inclinada del medio se refleja la fermentacin de la lactosa, al virar el medio a amarillo por acidificacin. Se siembra la cepa en estudio con asa de cultivo, en la superficie inclinada por diseminacin y, en el fondo, por picadura. Incubar en estufa a 37C. La lectura de los resultados se har SIEMPRE a las 24 horas:

Fermentacin de la glucosa: fondo amarillo.

No fermentacin de la glucosa: fondo sin cambio (rojo grosella). Fermentacin de la lactosa: superficie inclinada amarilla. No fermentacin de la lactosa: superficie inclinada alcalina (rojo grosella). Gas: burbujas en la masa del medio, entre el medio y el tubo y, a veces, rotura del medio. Produccin de SH2: ennegrecimiento en la zona que separa el fondo de la pendiente o en toda la parte inferior del tubo. Interpretacin del medio Kliger Iron Agar

Microorganismo Fondo Superficie SH2 Enterobacter aerogenes AG A Enterobacter cloacae AG A Escherichia coli AG A Proteus vulgaris AG SC + Proteus morganii A o AG SC Shigella sonmei A SC Salmonella typhi A SC o ALC + Salmonella typhimurium AG SC o ALC + Salmonella enteritidis AG SC o ALC + AG = formacin de cido y gas (amarillo y burbujas). A = formacin de cido (amarillo). SC = sin cambios. ALC = alcalino (rojo). + = produccin de SH2 (ennegrecimiento). - = sin ennegrecimiento. Lectura de resultados: Se calcula el nmero de Enterobacteriaceae totales por gramo o milmetro de alimento consultando la tabla del NMP de tres series de cinco tubos, en los tubos que muestren crecimiento en caldo EE de Mossel, los grmenes sean citocromo-oxidasa negativos y el crecimiento sobre agar Kliger (KIA) corresponda al de las enterobacteriaceae.

Tabla del NMP por gramo o mililitro, utilizando tres series de cinco tubos cada una conteniendo 10 ml de medio lquido y sembrando 1 ml de la dilucin 1:10, 1 ml de la dilucin 1:1000 y 1 ml de la dilucin 1:1000 5 tubos 5 tubos 5 tubos NMP de 5 tubos 5 tubos 5 tubos NMP de 1 ml 1 ml 1 ml grmenes 1 ml 1 ml 1 ml grmenes 1:10 1:100 1:1000 g o ml 1:10 1:100 1:1000 g o ml 0 0 0 0 4 0 0 13 0 0 1 2 4 0 1 17 0 0 2 4 4 0 2 21 0 1 0 2 4 0 3 25 0 1 1 4 4 1 0 17 0 1 2 6 4 1 1 21 0 2 0 4 4 1 2 26 0 2 1 6 4 2 0 22 0 3 0 6 4 2 1 26 1 0 0 2 4 2 2 32 1 0 1 4 4 3 0 27 1 0 2 5 4 3 1 33 1 0 3 8 4 3 2 39 1 1 0 4 4 4 0 34 1 1 1 6 4 4 1 40 1 1 2 6 4 5 0 41 1 2 0 6 4 5 1 48 1 2 1 8 5 0 0 23 1 2 2 10 5 0 1 31 1 3 0 8 5 0 2 43 1 3 1 10 5 0 3 58 1 4 0 11 5 0 4 76

2 0 0 5 5 1 0 33 2 0 1 7 5 1 1 46 2 0 2 9 5 1 2 63 2 0 3 12 5 1 3 84 2 1 0 7 5 2 0 49 2 1 1 9 5 2 1 70 2 1 2 12 5 2 2 94 2 2 0 9 5 2 3 120 2 2 1 12 5 2 4 148 2 2 2 24 5 2 5 177 2 3 0 12 5 3 0 79 2 3 1 14 5 3 1 109 2 4 0 15 5 3 2 141 3 0 0 8 5 3 3 175 3 0 1 11 5 3 4 212 3 0 2 13 5 3 5 253 3 1 0 11 5 4 0 130 3 1 1 14 5 4 1 172 3 1 2 17 5 4 2 221 3 1 3 20 5 4 3 278 3 2 0 14 5 4 4 345 3 2 1 17 5 4 5 426 3 2 2 20 5 5 0 240 3 3 0 17 5 5 1 348 3 3 1 21 5 5 2 542 3 4 0 21 5 5 3 920 3 4 1 24 5 5 4 1600

3 5 0 25 5 5 5 >1600 INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN MEDIO SOLIDO Material:

Pipetas estriles de 1 ml. Asa de cultivo. Placas de Petri de 90 mm estriles. Estufa de cultivo. Cuente colonias. Pipeta Pasteur de punta cerrada.

Medios de cultivo y reactivos:


Tcnica:

Agar biliado-rojo violeta-glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG) Reactivo para la prueba de citocromo-oxidosa (CO). Medio Kliger Iron Agar (KIA). Agar nutritivo (PCA).

Aislamiento en medio slido: a partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado, se deposita 1 ml de cada dilucin en placas de Petri estriles. A continuacin se vierten 15 ml de VRBG atemperado a 4547C. Mezclar cuidadosamente y dejar solidificar sobre una superficie horizontal. El agar solidificado se cubre con 10 ml del mismo estril y se deja solidificar de la misma forma. Incubar en estufa a 37C durante 18-24 horas. Contar las colonias de color rojo violeta rodeadas de un precipitado tambin violeta. Confirmacin de las colonias: sembrar como mnimo dos colonias tpicas sobre PCA. Incubar a 37C durante 18-24 horas. Con el crecimiento obtenido, se realizan las siguientes pruebas:

Prueba de la citocromo-oxidasa. Pruebas de fermentacin, gas y SH2 sobre agar Kliger.

Recuento de colonias: las colonias caractersticas confirmadas se multiplican por el factor de dilucin de la placa y darn el nmero de Enterobacteiaceae totales por grano o milmetro de muestra.