METODOS DE ESTUDIO DE
BACTERIAS Y VIRUS
DIAGNOSTICO
INTRODUCCION
Uno de los propósitos de la Microbiología médica es
trabajar en asociación con la clínica para brindar un
diagnóstico y un manejo adecuado de las enfermedades
infecciosas de los pacientes, así como prevenir la
diseminación de la infección a otros individuos. En
general es importante documentar la presencia de
infección, determinar su naturaleza específica, y orientar
la terapéutica adecuada temprano en el curso de la
enfermedad.
La buena calidad de esta labor lleva implícita
actividades propias de laboratorio pero también otras.
1. Criterio de selección de exámenes a solicitar
por los clínicos,
2. recolección, rotulado y transporte de las
muestras,
3. evaluación de las muestras y tests de
laboratorio,
4. procedimientos que conducen a verificar los
resultados,
5. apropiado uso de los resultados por los médicos
para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades
infecciosas.
Existen una gran variedad de métodos que se utilizan
para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones
microbianas. Estas incluyen examen directo, aislamiento
por cultivo, detección de antígenos y ácidos nucleicos, y
tests serológicos para detectar la respuesta en anticuerpos
del individuo a la infección.
No hay un único abordaje que llene las necesidades
de diagnóstico microbiológico, por lo que debe
implementarse una combinación de métodos. La elección
de los mismos dependerá de diferentes factores que
incluyen el conocimiento de las patogénesis de los
agentes sospechados, el estado de la enfermedad y la
disponibilidad y utilidad de los diferentes métodos para
la infección particular en cuestión.
ESTRATEGIA DE LA ELECCION DE LOS
METODOS
El laboratorio de Microbiología deberá tener a
disposición del clínico todos los tests necesarios para el
diagnóstico y la atención de la población de pacientes a
servir. Pero no todos los tests pueden realmente ser
realizados por el laboratorio; éste deberá decidir cuáles
realizará, cuáles enviará a un laboratorio de referencia y
cuál laboratorio usará.
Gabriela Algorta
Las necesidades de los pacientes dictarán el número
y variedad de métodos que el laboratorio ofrecerá.
Basado en estudios numéricos históricos y predictivos de
los tests solicitados, el laboratorio puede discontinuar
tests poco utilizados, que resultan caros y de poca
calidad. Por otra parte, antes de decidir implementar un
nuevo test diagnóstico éste deberá ser seleccionado.
El conocimiento de la población deberá influir esta
decisión, ya que un test varía en cuanto a su eficiencia
para detectar un resultado positivo en relación con la
prevalencia de esta enfermedad en la población.
Comúnmente las medidas de performance de un test
incluyen sensibilidad, especificidad y valores predictivos
positivo y negativo.
Inherente a la determinación de sensibilidad y
especificidad de un test es el concepto del "gold
standard" o patrón de oro, contra el que el test se
compara. No siempre esto es realizable. Existen, por
ejemplo, nuevos tests de detección de antígenos como
son los ensayos para virus respiratorio sincicial que
pueden ser más sensibles e igual de específicos que el
cultivo convencional. En tales circunstancias no debe
juzgarse la performance de un test contra métodos
standard.
Estando las condiciones dadas para una comparación
con standards, la sensibilidad y la especificidad de un
método es independiente de la población de pacientes a
testar. De esta forma los laboratorios no necesitan
realizar grandes estudios de evaluación de nuevos tests y
utilizarán evaluaciones llevadas a cabo por
microbiólogos competentes y respetados y publicados en
literatura científica. La elección de un test a realizar
deberá basarse en la performance publicada y la utilidad
detectada por el laboratorio, de acuerdo a la prevalencia
percibida desde el laboratorio de la enfermedad en
cuestión en la población a atender.
Es conveniente definir en este momento sensibilidad
y especificidad.
La sensibilidad de un test diagnóstico puede tener
definiciones diferentes: puede explicar la habilidad de un
test para detectar muy pequeñas cantidades de lo
analizado (por Ej.: Anticuerpos). Una segunda definición
es la habilidad de un test para detectar casos positivos
(ausencia de falsos negativos). Otra definición es la
probabilidad de que un test sea positivo cuando la
enfermedad está presente.
La especificidad de un test es la habilidad de este
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para identificar correctamente a todos los negativos
(ausencia de falsos positivos). Otra definición es la
probabilidad de que un test sea negativo cuando la
enfermedad no está presente.
Por otra parte, la eficacia de un test es la habilidad
general de detectar correctamente todos los positivos y
todos los negativos. Es una combinación de sensibilidad
y especificidad y da una idea de la eficacia total de un
test.
Aunque citaremos frecuentemente ejemplos de
bacterias o virus, en este capítulo nos referiremos
fundamentalmente a las muestras y los métodos de
estudio de las bacterias; en otro capítulo se hace especial
referencia a los métodos aplicados en Virología.
RECOLECCION Y TRANSPORTE DE LAS
MUESTRAS
La utilidad de un procedimiento analítico está
directamente influida por la calidad de la muestra.
La primera apreciación a realizar es si la muestra es
representativa de la enfermedad que se considera. Por
ejemplo: si el paciente tiene una neumonía es incorrecto
realizar un exudado faríngeo para aislar el germen causal
porque las muestras respiratorias altas no son
representativas de infecciones del aparato respiratorio
inferior, los gérmenes que causan estas infecciones son
habitantes normales de la flora de la nasofaringe.
Tampoco es correcto en enfermos con otitis media
buscar el germen en el exudado nasal, por las mismas
razones. En las neumonías se puede aislar el germen de
la sangre, ya que son enfermedades que pueden cursar
con bacteriemia, o del líquido pleural si está presente. En
otitis media se puede aislar el germen del líquido del
oído medio por punción de la membrana del tímpano.
Los materiales provenientes de sitios normalmente
estériles son siempre muestras excelentes, cuando las
tomas se realizan en condiciones adecuadas.
Para estudio de gérmenes anaerobios, nunca se deben
recoger muestras contaminadas con flora, en general, los
gérmenes anaerobios forman parte de la flora normal y
su aislamiento en muestras recogidas en contacto con
piel o mucosas son de imposible interpretación.
En la recolección de las muestras el médico debe
tener en cuenta que para hacer una toma es fundamental
la transmisión adecuada de las indicaciones y que estas
sean racionales para que aquellos que las deban realizar
sepan y entiendan lo que deben hacer (personal de
enfermería, técnicos de laboratorio, etc.). En la selección
de qué muestra se debe realizar, debe considerarse la
representatividad como ya fue mencionado.
Por otra parte, debe siempre prepararse el sitio de
extracción de la muestra. Si se realiza una punción,
desinfección correcta de la piel; si es un estudio de orina,
limpieza de la región y recolección de la mitad de la
micción, etc.
Las muestras se recogerán en recipientes estériles,
con tapa de rosca, serán bien rotuladas con los datos del
paciente y la información de las características de la
muestra (líquido pleural, pus de absceso de muslo,
exudado faríngeo, etc.).
Luego de extraída la muestra, debe ser enviada al
laboratorio para su procesamiento. En general se acepta
que el tiempo que transcurra entre la toma y su
procesamiento en el laboratorio no debe exceder las 4 hs.
Existen formas de conservar las muestras cuando
debe transcurrir un período de tiempo más largo. La
utilización de medios de transporte para la conservación
de muestras extraídas con hisopo, es de uso corriente en
nuestro medio. Cuando se sospecha Neisseria
gonorrhoeae en exudado uretral o Shigella sp en
materias fecales, por ejemplo, es necesario proteger estas
muestras frente a la desecación o cambios de pH que se
producen naturalmente, debido a la interacción de los
diferentes componentes en muestras con flora.
Es importante destacar en este momento que es
frecuente recibir materiales inadecuados -por diferentes
razones- para estudio microbiológico. Describiremos
algunas de estas solicitudes no racionales:
- Hemocultivos: - muestras únicas
- más de tres muestras en 24hs
Las muestras únicas de sangre dificultan la
interpretación, en el laboratorio, al aislar gérmenes de la
flora normal de piel y no poder evaluar si se trata de una
contaminación en el momento de la extracción de la
muestra o dicho germen se encuentra en el origen de la
enfermedad del paciente.
- Muestras seriadas
Para la mayoría de las muestras no debe realizarse
tomas seriadas que recargan innecesariamente el trabajo
del laboratorio y no aportan nuevos datos de interés.
- Muestras inadecuadas de heridas o secreciones
respiratorias.
Si estas muestras presentan un predominio de células
epiteliales sobre el resto de la población celular, no son
representativas del estudio que se pretende.
- Otras muestras como:
- muestras de objetos y superficies
inanimados
- exudados de lesiones de boca
- contenido intestinal
- abscesos perirectales
- colostomías
- exudados de lesiones de decúbito
- puntas de sondas vesicales o catéteres
- pleurales.
Entre los requisitos para una correcta recolección de
las muestras debe tenerse en consideración:
- Estas deben realizarse previo al inicio de la
antibióticoterapia. Un ejemplo demostrativo es la
realización de la punción lumbar en meningitis aguda
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supurada. En esta grave situación, luego del diagnóstico
clínico, se realiza en primer lugar la punción para
diagnóstico citoquímico y bacteriológico y luego, sin
esperar los resultados, se inicia el tratamiento.
Posteriormente, con los resultados obtenidos en las
mejores situaciones, se podrá ajustar la terapéutica o
adoptar otras conductas que se encuentren pertinentes.
- La muestra se dirigirá a buscar el germen en el
sitio donde este se halle y se buscará que la muestra se
encuentre exenta de contaminación externa, para lo que
el técnico deberá brindar al paciente la instrucción
necesaria.
- Se deberá tener en cuenta la etapa de la
enfermedad; por ejemplo para aislar Salmonella typhi en
la fiebre tifoidea, se podrá hacerlo de la sangre en los
primeros días de enfermedad, pero a medida que avanza
el tiempo, esta posibilidad se aleja y habrá que recurrir a
otras muestras tales como materias fecales que tienen
menor significación clínica.
- La muestra deberá tener un volumen suficiente para
su procesamiento y ser recogida en recipiente rotulado y
limpio por fuera. Es imperativo el que sea acompañada
de datos clínicos.
- El envío debe realizarse en forma rápida
preservando la muestra de temperaturas extremas y
desecación. Para ello se utilizan medios de transporte
como ya fue mencionado. Los hisopos son de diferentes
materiales: algodón, Alginato, etc. Existe la posibilidad
de que algunos de ellos sean tóxicos para algunas
especies bacterianas y se desaconseja su uso para algunas
muestras. En general, los hisopos de algodón son de uso
generalizado, teniendo en cuenta que pueden contener
ácidos grasos no saturados inhibitorios para N.
gonorrhoeae, por lo que se recomiendan de Alginato de
Calcio o de Dacron para muestras uretrales.
METODOS CONVENCIONALES Y RAPIDOS
TRADICIONALES Y NO TRADICIONALES
El cultivo y la identificación de los patógenos
específicos a partir de los materiales recogidos de los
pacientes en los que se sospecha que tengan una
infección es todavía la mejor herramienta diagnóstica
disponible, aunque no es la más rápida. En algunos casos
esto resulta difícil, y, a veces, es imposible, por ejemplo
en rickettsiosis o en sífilis.
En esos casos debe recurrirse a la serología u otros
métodos, ya sea por que no se conocen las condiciones
necesarias para su cultivo in vitro por los riesgos que
implica la manipulación de estos microorganismos.
Se dispone en la actualidad de técnicas para detectar
y cuantificar diversos marcadores específicos de
enfermedades infecciosas.
Por un lado, técnicas inmunológicas para
cuantificación de inmunoglobulinas específicas o
detección de antígenos en tejidos; por otro, el más
espectacular avance que es el comienzo de la
introducción de la genética molecular en el laboratorio
clínico.
MICROSCOPIA PARA EL DIAGNOSTICO DE
LABORATORIO DE LAS 4 ENFERMEDADES
INFECCIOSAS
El microscopio de luz es una de las herramientas más
útiles en el diagnóstico. Aun hoy día con el desarrollo de
métodos rápidos -muchos de los cuales requieren
instrumentos complicados o reactivos caros- la simple
visualización microscópica de muestras clínicas es
todavía la más rápida y específica forma de orientar un
diagnóstico clínico.
En el capítulo práctico de morfología y estructura
bacteriana se describen en detalle los diferentes métodos
microscópicos. Basta recordar la utilidad del examen en
fresco para la visualización de algunas bacterias (Ej.:
campo oscuro para Treponema) y las muestras fijadas y
coloreadas por coloraciones simples o diferenciales,
como son las coloraciones de Gram o de Ziehl-Neelsen.
Microscopía de fluorescencia
Con los mismos principios de óptica, las diferencias
están relacionadas con la generación y transmisión de luz
útil para la excitación de colorantes fluorocromos o de
fluorescencia natural de los microorganismos.
Algunos microorganismos producen luz luego de
haber absorbido luz ultravioleta. Otros lo hacen luego de
haber tomado un fluorocromo, por ejemplo: bacterias
ácido-alcohol resistentes.
Por último, otros producen luz, luego de la unión del
antígeno a un anticuerpo conjugado previamente con un
colorante fluorescente, por ejemplo: Chlamydia, virus
respiratorio sincicial.
Microscopía electrónica
Utiliza electrones en lugar de luz. Se utiliza en el
diagnóstico de agentes virales de gastroenteritis, pero es
caro para uso rutinario.
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATOGENOS
VIRALES
El cultivo es todavía el patrón de oro ("gold
standard") y permanecerá como herramienta importante
de diagnóstico. Permite, además, identificar el
microorganismo aislado y realizar estudios de
sensibilidad a los antimicrobianos.
Para el microbiólogo el dilema es decidir cuál o
cuáles de los microorganismos aislados en una muestra
clínica están involucrados en la enfermedad en cuestión.
Son pocos los microorganismos a los cuales el
término "patógeno" puede aplicarse invariablemente,
definiendo patógeno aquel microorganismo que siempre
que se encuentra está causando una enfermedad
infecciosa. La mayoría pueden integrar la flora del
huésped y ésta es dinámica en su composición. Por lo
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tanto, es interesante definir los sitios estériles y los que
poseen flora, no existiendo categorías claras que
delimiten entre especies patógenas e inocuas. Las
conclusiones se basarán en los criterios establecidos para
un buen procesamiento del material.
Como regla general, la elección de métodos y medios
de cultivo se ajusta a la naturaleza y origen de la muestra
y a los interrogantes que se pretende responder.
Por ejemplo: Pus de absceso drenado. ¿Qué
microorganismos están presentes como agentes causales?
Se supone que cualquier microorganismo presente puede
ser el agente causal y que el tratamiento dirigido hacia él
debe resultar beneficioso. La estrategia debe ser:
recuperar cualquiera y todos los medios de cultivo y
enriquecimiento.
En contraste con este enfoque abierto, algunos
cultivos se realizan para determinar si un patógeno
particular está presente o no.
Por ejemplo: Exudado faríngeo. ¿Qué
microorganismos están presentes como agentes causales?
S. pyogenes. La estrategia debe ser: único agente tratable
y cultivable. El método: se debe utilizar medios de
cultivo sólo para S. pyogenes.
De esto se desprende que existe una variedad muy
importante de medios de cultivo con propósitos
diferentes.
Por un lado tenemos medios simples que permiten el
desarrollo de microorganismos con una gran capacidad
metabólica, que de pocos nutrientes son capaces de
extraer todo lo necesario para multiplicarse. Por el
contrario, existen medios complejos que agregan
diferentes sustancias necesarias a algunos
microorganismos. También los medios de cultivo pueden
definirse como determinados, aquellos que tienen su
composición químicamente definida, o aquellos no bien
definidos.
Para el cultivo pueden utilizarse medios de cultivo
diferenciales que ponen en evidencia alguna
característica metabólica de algún grupo de bacterias.
También pueden utilizarse medios selectivos que
inhiban el desarrollo de algunos microorganismos,
permitiendo el desarrollo particular de otros.
Por último, los medios de enriquecimiento son
medios líquidos que facilitan el desarrollo de algunos
microorganismos inhibiendo flora asociada y
modificando la relación cuantitativa entre estos. El
aislamiento posterior en medios sólidos permite la
recuperación de estas bacterias.
En el laboratorio clínico al realizar estos cultivos
debe tenerse en cuenta su sensibilidad para las diferentes
muestras. No es lo mismo el diagnóstico de infección
urinaria por medio del urocultivo (técnica de muy buena
sensibilidad) y la sensibilidad del cultivo de esputo para
el diagnóstico de neumonía, técnica de muy baja
sensibilidad.
Otro elemento importante a tener en cuenta es la
valoración de resultados positivos. ¿El germen aislado de
un sitio normalmente estéril es un contaminante? ¿forma
parte de la flora normal de otros sitios en el huésped? Un
ejemplo interesante es cuando se realiza una única
muestra de hemocultivo y se aísla S. epidermidis; se trata
de un aislamiento de sangre, sitio normalmente estéril, de
un germen habitante normal en la piel del ser humano. Es
imperativo en estas situaciones tener más de una muestra
para poder interpretar estos resultados y definir si es una
contaminación accidental o el microorganismo aislado es
el responsable del proceso patológico.
Por último, el aislamiento del germen permitirá
completar el estudio con la identificación de éste y
realizar los estudios necesarios para determinar la
sensibilidad del mismo a los antimicrobianos.
METODOS ALTERNATIVOS
Otros métodos pueden utilizarse en forma alternativa
a los cultivos. Ellos tienen ventajas y desventajas con
respecto a éstos.
La especificidad puede ser imperfecta. Otra gran
desventaja es la incapacidad de estudiar aún más el
patógeno en cuestión, como lo permite el tener el germen
aislado. Por otra parte, pueden ser más sensibles,
permitiendo llegar a un diagnóstico con cultivos
negativos. Además se realizan en un tiempo menor.
Inmunoquímicos
Estos ensayos se basan en la detección de anticuerpos
(Ac) específicos que permiten señalar a determinado
microorganismo como presente en una infección. La otra
posibilidad es la detección de antígenos (Ag) solubles en
los materiales patológicos. Son todas reacciones de tipo
Ag-Ac.
La especificidad de los antisueros de uso corriente en
el laboratorio suele ser muy variada. En general, los
microorganismos son un mosaico de antígenos
expuestos. Desde el punto de vista de su especificidad
podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas. Por
ejemplo: supongamos que dos bacterias A y B son
diferentes. Que la bacteria A presenta en su superficie 3
Ag diferentes. Que la bacteria B posee un Ag idéntico a
A, un Ag propio y único y un Ag con reacción cruzada
con A.
Un antisuero policlonal contra la bacteria A
reconocerá a A en todos sus Ag, pero también
reconocerá a B por el Ag idéntico y por aquel con el que
tiene reacción cruzada.
Si pensamos en un antisuero monoespecífico contra
el Ag en que B tiene reacción cruzada con A, también
reconocerá las dos bacterias. Por reconocimiento
específico y por reacción cruzada.
Por último, un Ac monoclona sólo reconocerá a A,
ya que no hay posibilidades de reacción cruzada.
Es importante destacar que, en general, todas las
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pruebas mejoran en especificidad y sensibilidad con la
utilización de Ac monoclonales y su utilización debe ser
valorada junto a necesidades, costos, etc.
Existen técnicas diferentes para la detección de Ag o
de Ac. En este capítulo sólo las nombraremos, ya que
están descriptas en otros.
Todas se basan en diferentes formas de poner en
evidencia una reacción Ag-Ac.
La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue de las
primeras en utilizarse. Se basa en la carga negativa que
presentan los Ag bacterianos en medio alcalino cuando
son sometidos a una corriente eléctrica, los Ac
permanecen neutros. Esta técnica es poco utilizada en la
actualidad por ser menos sensibles a las desarrolladas
posteriormente y de mayor costo económico.
Otras técnicas muy utilizadas y de sencilla
realización son las que se basan en aglutinación de
partículas: la aglutinación de Látex o la coaglutinación,
que utiliza S. aureus y su proteína A fijadora de
inmunoglobulinas.
Las técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) utilizan Ac
unidos a enzimas que catalizan reacciones colorimétricas
son de uso corriente.
Las técnicas inmunomicroscópicas que utilizan la
fluorescencia (IF) se describieron oportunamente; son
también utilizadas para la detección de Ag o Ac.
Mención aparte debe realizarse de la técnica de
Western blot, que reconoce componentes proteicos de un
microorganismo separados por electroforesis. Permite la
detección de Ac específicos para cada uno de los
componentes. Se utiliza para HIV y se describe en otro
capítulo.
La interpretación de los tests serológicos que
detectan Ac tienen como concepto central el aumento del
título.
El título de Ac es la recíproca de la mayor dilución
del suero del paciente, en que los Ac son aun detectables.
Los pacientes con cantidades grandes de Ac tienen
títulos altos, ya que los Ac serán detectables aun a
diluciones muy altas del suero.
Los pacientes con respuesta humoral íntegra
aumentarán el título de Ac durante la enfermedad. Se
debe, por lo tanto, realizar 2 extracciones de suero con
un intervalo de 2 semanas para poder detectar las
modificaciones en el título, que para ser significativas
deben ser cuatro veces mayores (2 diluciones). En
algunas infecciones se pueden necesitar períodos de
tiempo mayores para evidenciar los cambios. Una forma
alternativa es la detección de IgM específica.
Como método directo, la detección de antígenos es
de uso corriente en el laboratorio para el diagnóstico de
agentes de meningitis, para la detección de Ag de S.
pyogenes en la faringe y para numerosos virus (CMV,
VRS y otros virus respiratorios).
Como método indirecto para la detección de
anticuerpos contra el patógeno se utiliza, sobre todo en
Brucelosis y Fiebre Tifoidea, en infecciones por
Chlamydia o Mycoplasma y en infecciones virales
(Hepatitis, HIV).
Diagnóstico de las infecciones basado en los ácidos
nucleicos
En los últimos años ha ganado aceptación en el
laboratorio clínico el uso de técnicas basadas en la
hibridización de los ácidos nucleicos. La combinación
del reconocimiento de fragmentos de ácidos nucleicos
por medio de sondas y la amplificación previa continúan
en desarrollo.
En general, el ADN nativo (blanco) es
desnaturalizado por calor, y a él se agrega la sonda
consistente en un fragmento de ADN marcado. Se
permite una nueva unión, donde la sonda de ADN
hibridizará con el ADN blanco si hay homología,
permitiendo, gracias al marcado, la emisión de una señal.
El marcado puede ser con radioisótopos o con
sustancias trazables con enzimas, en forma similar a
como fue descripto para los tests inmunoenzimáticos.
La utilidad de estas técnicas estará dada por las
condiciones de trabajo y de la sonda elegida que si es
específica dará mejores resultados.
Esto se puede combinar con la fragmentación del
ADN con endonucleasas, la separación de los
fragmentos por electroforesis, la transferencia de los
geles a membranas y la posterior hibridización con
sondas marcadas (Southern blot).
La amplificación previa de los fragmentos a hibridar
por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), aumenta notablemente la sensibilidad de las
técnicas de detección de ADN.
Aunque todavía costosos, estos métodos de
Microbiología Molecular, ya tienen su espacio en el
laboratorio clínico. Son útiles en la investigación de
importantes patógenos bacterianos como
Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia spp,
Mycoplasma, así como la detección de genes de
resistencia a algunos antibióticos, por ejemplo,
meticilino resistencia de S. aureus y betalactamasas de
N. gonorrhoeae. En Virología han introducido
importantes cambios en el diagnóstico de enfermedades
tales como la encefalitis herpética.
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