BIOTECNOLOGIA AVANZADA TRABAJO FINAL: ESTUDIO DE CASO.

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Presentado por: NIDIA LUCELY MESA RAMIREZ Cdigo: 52905254 GRUPO: 201003_5

Tutora: FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA ESPECIALIZACION EN INGENIERIA DE PROCESOS DE ALIMENTOS Y BIOMATERIALES Bogot, 04 de Diciembre de 2010

INTRODUCCIN

Aqu, bajo este templo donde el vino sabe rezar aromas y sabores; aqu, donde inspirados ruiseores gorjearon su verso a lo divino; aqu, donde el pincel de los pintores aqu, donde el silencio se hace trino y la palabra pmpanos de amores; se hace abrazo floral, beso taurino. Aqu, donde se escribe la alegra, donde cabe en un vaso el universo y el corazn se suea palmo a palmo; aqu, mosto cordial de la poesa, el vino se recita como un verso y la amistad se reza como un salmo. Tomado de: La Bodega. Jos Mara Fernndez Nieto. El vino parece haber nacido con el hombre, ha sido siempre su alegra y uno de los mayores placeres de los que ha disfrutado, su inspiracin y uno de los principales motores de la cultura occidental. A la luz de conocimientos recientes, sabemos que la vid tanto silvestre como vinfera existe desde la Era Terciaria puesto que se ha encontrado hojas registradas en las piedras y semillas en asentamientos prehistricos, en tumbas, pirmides y en pequeas nforas en las ruinas de ciento de ciudades. Con el siguiente trabajo se pretende analizar la aplicabilidad de la biotecnologa en la industria enolgica. Inicialmente se describe el proceso de produccin del vino e identificando los puntos crticos de control desde la recepcin de materias primas hasta el llenado de las botellas. Posteriormente se resuelven los interrogantes planteados en la gua para el estudio de caso, describiendo las principales caractersticas de la levadura Brettanomyces/Dekkera, identificando en el proceso de la industria enolgica los PCC para su control, as como las tcnicas usadas en su deteccin y eliminacin cuando se ha instalado en la industria vincola. Se analizan resultados obtenido por deteccin de PCR en su estudio. Se presentan otros contaminantes biolgicos en la industria enolgica y sus consecuencias.

JUSTIFICACION

La industria enolgica constituye una fuente importante de ingresos. En el proceso de produccin de vinos, particularmente aquellos de guarda, las levaduras juegan un rol fundamental; sin embargo, una de ellas, Brettanomyces, puede contaminar los caldos destruyendo la produccin. Las levaduras del gnero Brettanomyces o Dekkera (su forma sexuada) son causantes de un desagradable aroma y sabor descrito como spoilage y off-flavor en cervezas y vinos, provocando en algunos casos la prdida del producto vinificado. Las caractersticas de aroma de sus metabolitos causantes se han asociado a la presencia de etilfenoles en cantidades excesivas. En algunos casos tambin se ha notificado alteraciones de la coloracin del vino asociado a la presencia de Brettanomyces, en la cual la concentracin del agente es de 103 o mayor. Por otra parte, Dekkera bruxellensis se ha aislado de bebidas alcohlicas, donde se ha visto que produce compuestos fenlicos (4-etilfenol [4EP] y 4-etilguayacol), a travs de la enzima cianato decarboxilasa, los que seran responsables de las alteraciones aromticas del producto vincola definidos como medicinales, aromas picantes o a clavo, o aromas a perro mojado, adems de la produccin de aminas en vinos rojos En algunos casos, altos niveles de 4EP no se han correlacionado con cantidades apreciables de Dekkera, lo que se explicara por la utilizacin de medios inadecuados y la presencia de flora contaminante, los que actuaran como encubridores de dichas cepas Por esto, el diagnstico temprano y oportuno de este microorganismo reducir prdidas importantes en la industria enolgica; esto se puede hacer mediante tcnicas de ultima tecnologa como el Mtodo de PCR.

PROCESO DE ELABORACION DEL VINO

Definicin La ley nacional 14.878 de Argentina define que solo se considera vinos genuinos a los obtenidos por fermentacin de la uva fresca, elaborados dentro de la zona de produccin. En consecuencia, la ley de nuestro pas niega el nombre de vino genuino a los vinos elaborados con pasas de uva y a los obtenidos de uvas frescas vinificadas fuera de la zona de produccin, y con ms razn an a las bebidas elaboradas con ingredientes distintos de uva fresca, aun cuando el producto terminado, por su composicin qumica y caracteres organolpticos, se identifique con los de vino genuino. Por lo tanto, la nica materia prima legalmente apta para la elaboracin de vino es la uva fresca en su zona de produccin. El trmino vino se aplica a una bebida alcohlica elaborada por fermentacin del jugo, fresco o concentrado, de frutas o bayas. La mayor parte del vino, sin embargo, se obtiene por fermentacin del jugo de uvas frescas y el trmino, a falta de ms aclaraciones, se entiende que responde a esta segunda definicin. La graduacin de los vinos vara entre un 7 y un 16% de alcohol por volumen; la mayora de los vinos embotellados tienen entre 10 y 14 grados. Los vinos dulces tienen entre un 15 y 22% de alcohol por volumen.

Produccin y Tipos de Vinos

El principio que gua la elaboracin del vino es sencillo. Las uvas recin recogidas son prensadas para que liberen su zumo (llamado mosto), que es rico en azcares fermentables. Las levaduras transportadas por el aire, o la adicin de levaduras seleccionadas al mosto, provocan la fermentacin de ste. Los principales productos de la fermentacin son alcohol etlico y dixido de carbono. Este ltimo es liberado en forma de

gas. La fermentacin se interrumpe normalmente cuando todos los azcares fermentables han sido transformados en alcohol y dixido de carbono, o cuando la concentracin del primero supera la tolerancia de las levaduras. El mosto es ahora vino. Existen, no obstante, muchas variantes de este proceso. Las principales entran en juego para producir vinos blanco, tinto y rosado, vinos espumosos y vinos dulces. Otras variantes se usan para mejorar la calidad de los vinos anteriormente mencionados. El jugo de la mayora de las uvas, incluido el de la mayora de las uvas rojas, es incoloro. Las uvas blancas se prensan inmediatamente despus de su recogida o vendimia y el jugo se separa de la piel antes de la fermentacin para obtener vino blanco. (Tratadas de igual modo, la mayora de las uvas rojas tambin producen vino blanco) Por el contrario, no es posible hacer vino tinto con uvas blancas. Para hacer vino tinto, las uvas rojas se aplastan y el mosto pasa parte o la totalidad del periodo de fermentacin y, en muchos casos, un periodo de maceracin previo o posterior a la fermentacin, en contacto con las pieles u hollejos. Toda la materia colorante, adems de mltiples compuestos saborizantes y taninos, se encuentran en los hollejos donde son liberados por los procesos de fermentacin y maceracin. Esta liberacin se intensifica a menudo por tcnicas de activacin mecnica y/o enzimticas. El vino rosado suele hacerse empleando uvas rojas que slo permanecen en contacto con los hollejos durante un breve periodo de tiempo. Con menor frecuencia se obtiene mezclando vinos tinto y blanco. El vino espumoso (el que contiene dixido de carbono disuelto, que se libera en forma de burbujas cuando se abre la botella) se elabora siguiendo una serie de mtodos diferentes. El ms barato y simple es la carbonatacin, una tcnica muy utilizada en la fabricacin de bebidas refrescantes: se bombea dixido de carbono en el vino, que se embotella a presin. El ms primitivo es el embotellado del vino antes de finalizar la fermentacin, y produce un vino ligeramente espumoso, a veces ligeramente dulce, con sedimento. La temperatura, en especial la temperatura de fermentacin, es una variable importante. La mayora de los vinos blancos se fermentan hoy en fro empleando algn tipo de refrigeracin para preservar su frescura y su aroma. Los vinos tintos, por el contrario, se hacen fermentar a temperaturas ms elevadas, a menudo a la temperatura ambiente de la

poca de la vendimia. Se cree que las temperaturas ptimas de fermentacin se encuentran entre los 9 y los 18 C en el caso de los vinos blancos, y entre los 20 y los 30 C en el de los tintos. La refrigeracin se usa tambin para estabilizar los vinos antes del embotellado. En general, cuanto menos se mueva fsicamente el vino, mayor ser su calidad. Con todo, entre las manipulaciones de mejora de la calidad, hay que incluir las diversas formas de maceracin que se aplican a los vinos tintos para darles color, sabor y contenido en taninos (en ocasiones se hace lo contrario: los vinos tintos ligeros, afrutados, se producen a menudo por fermentacin de la uva entera, tambin llamada maceracin carbnica, en la que las uvas rojas no son ni aplastadas ni maceradas, sino que fermentan enteras en un entorno anaerobio). Las heces del vino, depsitos de sedimentos, aaden a ste sabores deseados, y stas pueden agitarse tras la fermentacin para aumentar la absorcin de sabores por parte del caldo. La clarificacin de mostos o vinos puede lograrse por mecanismos fsicos como la aplicacin de la fuerza centrfuga, as como por efecto de la gravedad. La filtracin es un medio importante para clarificar y estabilizar el vino, aunque empleada en exceso puede resultar daina para su calidad. Los principales aditivos empleados en la elaboracin del vino son, en las regiones vincolas ms frescas, el azcar o mosto rectificado, que debe aadirse al mosto para incrementar el contenido final en alcohol (lo que recibe el nombre de chaptalizacin); en las regiones vincolas ms clidas hay que aadir acidez al mosto para mejorar el equilibrio del producto final (ajuste de acidez). Otras adiciones incluyen el tanino, productos para clarificar el vino y esquirlas de roble (como saborizante). Todos los vinos tintos y algunos blancos experimentan, tras la fermentacin primaria, una transformacin bacteriolgica llamada fermentacin malolctica, que puede garantizarse aadiendo bacterias lcticas al mosto en fermentacin o al vino. El tipo de depsito en el que se almacena el vino afecta tambin a su sabor. Algunos contenedores, como los tanques de acero inoxidable, son neutros, y se emplean para los vinos en los que slo se desea obtener el sabor de la uva fermentada; por contraste, los recipientes de madera, y en especial los pequeos de madera nueva, se utilizan para modificar y mejorar el sabor del vino. El sabor de todos los vinos cambia con el tiempo. La mayora de ellos se deterioran y deben consumirse tan pronto como sea posible. Los vinos de mayor precio, por otra parte,

tanto los blancos como, con mayor frecuencia, los tintos, mejoran con el almacenamiento, generalmente en botella. Los periodos ptimos de almacenamiento son muy variables, pero slo una exigua minora de vinos mejora con un almacenamiento de ms de diez aos. La ltima etapa de la produccin del vino comprende el envasado, el tapado, el etiquetado y el embalaje.

Operaciones Comunes a Todas las Vinificaciones

Cosecha

Una vez que la uva ha alcanzado la maduracin deseada se realiza la recogida de la uva. Es importante realizar una seleccin del fruto sano separndolo del daado

Transporte

Es un momento delicado que debe realizarse de la forma menos agresiva, evitando que el grano de uva sufra presiones excesivas y se rompa, provocando fermentaciones tempranas, ya que por lo general se realiza a granel.

Pesada

Los tipos de bsculas que se instalan en los establecimientos vitivincolas deben ser de una precisin tal que podamos controlar perfectamente el Kg. Y de un largo tal que permita pesar equipos (camin y acoplado). La relacin uva vino es de 1,250 kg/L

Descarga

Se realiza sobre la "tolva de recepcin", una especie de pirmide truncada invertida, que ir acumulando la uva sobre una cinta "sin fin" que la transportar a la estrujadora. En la tolva se analiza el fruto para determinar su estado sanitario y su contenido en azcares y cidos

Molienda

Tiene por objeto romper el grano de uva para lograr la liberacin del mosto, que al ponerse en contacto con las levaduras (naturales o agregadas), en ptimas condiciones inician la fermentacin. La molienda va acompaada del derasponado. La molienda puede ser reemplazada por el prensado, que se hace en grandes prensas tipo Vasln, Wilmes, Buccolini, etc. El prensado se utiliza generalmente en la elaboracin de vinos blancos de calidad. La estrujadora rompe por presin el grano, pero lo justo para que no se rompan las partes duras del racimo (pepitas, raspones y hollejos) y contaminen el mosto. La pasta viscosa resultante se trasladada mediante diversos mtodos a las prensas, evitando que entre en contacto con el aire para evitar una fermentacin prematura de la fermentacin.

Figura 1. Proceso de molienda

Fuente: http://www.oni.escuelas.edu.ar/olimpi99/tierradebuenosvinos/vinoelab.htm

Sulfitado

Es una operacin que se debe realizar inmediatamente despus de la molienda. El mtodo tradicional de la incorporacin de SO2, es el de agregarlo en la vasija de fermentacin luego de su encubado. Lo ideal sera incorporarlo despus de la molienda. En la actualidad existen sulfitadores que incorporan mediante una bomba dosificadora el SO2, en solucin acuosa, en la caera que conduce el mosto a la vasija de fermentacin. Las propiedades del SO2 son: antioxidante, estimulante, solubilizante, defecante,

antienzimtico, acidificante, bactericida, selectivo; lo que hace de este aditivo una sustancia irremplazable en la fermentacin. Las dosis normales de SO2, en la fermentacin, son de 5 a 15 g/hL (150 mg/L), el lmite legal del SO2 es 210 mg/L

Encubado

Consiste en colocar la uva molida en la vasija fermentadora, y ponerla en condiciones para que inicie una ptima fermentacin, por lo cual deben hacerse los controles y las correcciones necesarias, como son: sulfitado, correccin de la acidez, agregado o no del pie de cuba, control de temperatura, control de grado Baum, etc.

Pie de cuba

Consiste en seleccionar las mejores levaduras indgenas del medio. El pie de cuba se puede lograr mediante seleccin de: 1- Levaduras indgenas o 2- Incorporacin de preparados de levaduras seleccionadas.

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Levaduras indgenas

Consiste en cosechar anticipadamente una cantidad de uva, encubarla en ptimas condiciones, a fin de que se multipliquen las levaduras ms aptas. Cuando este se encuentra en plena fermentacin, se incorpora en proporciones variables de acuerdo al criterio tcnico, al resto de la uva en proceso de vinificacin.

Levaduras seleccionadas

A la uva recin molida, dispuesta en ptimas condiciones se le incorporan preparados de levaduras seleccionadas, que dominan rpidamente el medio y de esa forma, podemos obtener con seguridad el pie de cuba de las levaduras o levaduras que deseamos sembrar.

Fermentacin

Es un proceso por el cual los azcares se transforman en alcohol, CO2 y otros que se encuentran en menor cantidad y que se conocen con el nombre de productos secundarios de la fermentacin, debido a la actividad enzimtica producida por las levaduras. Este proceso biolgico se produce con una importante liberacin de energa, debe ser controlado, a fin de que las levaduras se encuentren en un medio adecuado para desarrollar su actividad; la concentracin de azcares, la temperatura, la acidez, el pH, el desprendimiento de CO2, el alcohol, son factores que inciden sobre la actividad de las levaduras, y que deben ser controlados y regulados a fin de que en el proceso se desarrollen normalmente. La cantidad de azcar necesaria para producir un grado de alcohol (1% en vol.), es de 17.5 g/L, lo que equivale a 1 Be. (Baum). Las levaduras pueden metabolizar a los azcares de dos formas: oxidativamente y fermentativamente.

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En la primera las levaduras transforman los azcares en CO2, y H2O y pequeas cantidades de alcohol, aprovechando esta energa para multiplicarse. En la segunda las levaduras escasamente se multiplican y producen grandes cantidades de alcohol. Glucosa CO2 + alcohol + H2O 40 Cal/mol

De las 40 caloras liberadas, 14.6 son utilizadas por las levaduras para su metabolismo; la diferencia, es decir, 25.4 caloras se liberan en forma de calor, provocando el calentamiento del mosto.

Refrigeracin

Como hemos visto, la fermentacin de 180 g de azcar por litro, corresponda a una elevacin de la temperatura de 25,4C, que en la prctica se reduce a unos 10 a 15 C. Si suponemos que la temperatura promedio al ingreso de la uva, oscila entre los 25 y 29C, y que la temperatura de fermentacin es de alrededor de los 30C; es necesario enfriar el mosto de fermentacin de 2 a 11 C/L.

Descube

Consiste en la separacin del lquido de la fase slida. El momento del descube lo determina el tcnico, en base a la concentracin de azcar y a la temperatura de fermentacin. El mayor o menor tiempo de fermentacin, as como la mayor o menor maceracin que haya sufrido el vino, determinar que ste sea ms o menos suave, de color ms o menos intenso, debido a la extraccin de sustancias tnicas y colorantes de hollejo. De todas formas, podemos decir que el momento adecuado para el descube, es cuando existe una concentracin azucarina de 5 B.

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El inconveniente que surge es que si se consume totalmente el azcar, debido a la disminucin de la densidad y al desprendimiento de C02, y el sombrero se puede sumergir provocando dificultades en el descube. Nunca debe disminuir a menos de 2 B, para evitar riesgos de que baje el sombrero. El mosto tiene una densidad superior a 1, mientras que el vino, por la transformacin de los azcares en alcohol, tiene una densidad inferior a 1.

Extraccin De Los Orujos

Consiste en extraer del interior de la vasija el orujo que ha quedado luego del descube. Esta operacin, generalmente se hace en forma manual, mediante carros o tornillo sin fin. Es por eso que las vasijas de fermentacin deben tener una puerta lo suficientemente grande, como para permitir la entrada de un operario y, de una, dos o ms tapas, de acuerdo con el tamao de la vasija a fin de permitir una buena ventilacin para desplazar el CO2 y las sustancias voltiles de la fermentacin, para que no dificulte el trabajo del personal.

Prensado

Consiste en la extraccin del lquido que se encuentra embebido en el orujo. Esta operacin se realiza mediante prensas continuas o discontinuas y prensas neumticas. Las prensas continuas estn compuestas por un tornillo sin fin y una malla perforada, con una tapa regulable a la salida de la misma. Las prensas discontinuas pueden ser mecnicas o hidrulicas, esta ltima es la ms utilizada. El vino que se obtiene del prensado se identifica como vino prensa y generalmente se mantiene separado del resto del volumen, y se le realizarn tratamientos especficos y luego se lo corta proporcionalmente con el resto, para hacer los cortes de libre circulacin, o se les da otro destino, como el de ser enviados a la

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destilera. El vino prensa es rico en sustancias tnicas y en alcohol metlico, por ello no se lo destina directamente al consumo. El lmite de alcohol metlico establecido por nuestra legislacin es de menos de 0,35 mL/L

Trasiego

Una vez efectuado el descube el vino contina fermentando, esta vez en forma ms tranquila; esta fase de la fermentacin se conoce con el nombre de fermentacin lenta, y consiste en la transformacin de los ltimos gramos de azcar en alcohol, y una vez que va finalizando se va produciendo la precipitacin de partculas, entre ellas tejidos vegetales, sales tartricas, partculas extraas. Lo que constituye las borras y es necesario de separar del vino lo antes posible a fin de que stas no le comuniquen gustos extraos, ni sustancias, que puedan ser elementos nutritivos para otros microorganismos (utolisis de las levaduras), en el primer trasiego. Una vez terminada la fermentacin lenta, el primer trasiego se hace lo antes posible dentro de los 7 o 10 das; luego se puede efectuar un segundo y un tercer

trasiego antes de la clarificacin. El ltimos de estos debera efectuarse una vez que el vino a sufrido los efectos benficos del fro, es decir a fines del invierno

Clarificacin

Consiste en incorporar al vino una sustancia de estado coloidal, que por razones fsico-qumicas, coagula en forma recproca con otras sustancias del vino y al precipitar provoca la limpidez por accin mecnica o fsico-qumicas. Los principales clarificantes utilizados en enologa son minerales, orgnicos y de sntesis industriales entre los que

podemos mencionar: bentonita, gelatina, casena, hemoglobina, albmina, etc. Para cada tipo de vino existe un clarificante adecuado; por ejemplo: para la clarificacin de tintos debera utilizarse gelatina, porque coagula en forma recproca con el tanino, eliminndolo y por otro lado arrastra muy poco calor. Para vinos blancos se debera utilizar

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casena, porque arrastra mucho color y no produce sobre encolado (exceso de clarificante). El clarificante ms usado es la bentonita que se la utiliza indiferentemente para cualquier vino comn.

Filtracin

Consiste en hacer pasar un lquido turbio a travs de un lecho poroso, donde quedan retenidas las partculas que hacen el turbio. Esto se logra a travs de diferentes medios. Por dos efectos mecnicos y fsico qumicos las partculas son retenidas porque simplemente su tamao es mayor a los de los poros del lecho, en el mecnico. En el fsico-qumico, las partculas que cargadas estrictamente son retenidas por efecto de cargas de diferente signo. Entre los filtros ms usados, podemos citar los filtros aluvionales, los filtros de placa, los filtros de prensa y los filtros al vacio. Los primeros para lograr la limpidez del vino, en algunos casos se logran una adecuada eliminacin de microorganismos. Los segundos, de placa, se los utiliza como filtros esterilizantes, generalmente antes del embotellado. Los filtros de prensa se los utiliza exclusivamente para filtrar borras.

Defectos que puede presentar el vino

El vino cido o agrio es descartado como vino, o considerado como vino malo. La acidez de un vino puede estar causada por dos factores: Inmadurez de la uva al momento de producir el vino. Esta se detecta a travs de un sabor a trtaro (cido). Este defecto puede ser remediado dejando aejar la botella. La acidez causada por una mala vinificacin no puede ser remediada, y se detecta por un gusto a vinagre. (que en definitiva es la utilizacin que se le da a ese tipo de vinos defectuosos). Un vino pasado es reconocido por un cambio en su color y por tornarse acuoso.

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Los vinos rosados tienen un periodo en el que generan un olor nauseabundo, llamado periodo de mareo de la botella, el que desaparece pasado cierto tiempo (semana o meses). El ltimo defecto que puede presentar el vino, se origina en malos corchos, donde estos degeneran el sabor de la bebida.

PUNTOS CRITICOS DE CONTROL EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Aunque sistema el sistema HACCP siempre estuvo relacionado con la prevencin de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), actualmente se est implementando cada vez ms con otra finalidad, que no es la de asegurar la inocuidad, sino la de cuidar la calidad comercial de los productos. En el vino como alimento, debido a sus caractersticas de contenido alcohlico, pH, etc., deber controlarse, desde el punto de vista organolptico, el crecimiento de levaduras indeseables y de bacterias lcticas y acticas por contaminaciones, debido a la falta de higiene en el rea de produccin. Desde el punto de vista de la inocuidad deber evitarse la posibilidad de que se presenten peligros sanitarios de tipo fsico-qumico, como restos de fitosanitarios, detergentes y desinfectantes procedentes del lavado del equipo y o botellas y oxidaciones debidas a aireaciones. Mediante la aplicacin del sistema HACCP se pueden no slo prevenir y eliminar estos peligros, sino tambin proporcionar al proceso un sistema de control.

PCC en la Elaboracin del Vino

A continuacin se presenta un cuadro con las diferentes fases del proceso de la industria enolgica con la descripcin de los puntos crticos de control. Ha de tenerse presente que todas las fases que constituyen el diagrama de flujo deben estar debidamente controladas, aunque no constituyan un punto crtico de control dentro del proceso productivo.

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Figura 2. PCC en la elaboracin del vino

Fuente: Federacin espaola del vino

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Figura 3. PCC en la elaboracin del vino (Continuacin)

Fuente: Federacin espaola del vino

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Elaboracin

Presencia de Etilenglicol, Dietilenglicol, Propilenglicol

En aquellas bodegas que utilizan soluciones glicoladas como parte integrante de sus sistemas de refrigeracin, puede aparecer etilenglicol, dietilenglicol, propilenglicol en los productos, en el caso de que se produjera algn tipo de fuga en los mismos.. Existe un riesgo toxicolgico en el caso de la aparicin de etilenglicol y dietilenglicol dada su toxicidad. Este riesgo no existe en el caso del propilenglicol que no es txico. La vigilancia de este punto crtico consistir en el control cromatogrfico sistemtico de los vinos que han estado sometidos a ese riesgo. El mantenimiento adecuado y sistemtico de las instalaciones implicadas ser la accin preventiva a implantar. Asimismo, es aconsejable utilizar como refrigerante nicamente el propilenglicol y no sustancias txicas como el etilenglicol o el dietilenglicol. Si a pesar de la prevencin, el modo de fallo ocurriera, deber procederse a la reparacin de la instalacin y a la destilacin del vino afectado. Se debern llevar los registros de los resultados analticos del vino y del mantenimiento efectuado, para demostrar que el punto crtico est bajo control.

Estabilizacin y Correcciones

Restos de ferrocianuro

Es sabido que ciertos vinos requieren un tratamiento con ferrocianuro potsico, al objeto de conseguir su estabilidad frente a ciertas quiebras metlicas. En los casos en los que se haya efectuado este tratamiento, deber comprobarse que el vino est exento de ferrocianuro tanto en solucin como en suspensin. Como medida preventiva, el tratamiento debe correr a cargo de un tcnico autorizado, que fijar las dosis de ferrocianuro y su correcta aplicacin. En el caso de que el modo de fallo ocurriera, si el ferrocianuro est en

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suspensin, se filtrar el vino para eliminarlo y se comprobar su ausencia posteriormente. Si est en solucin, se mezclar con otros vinos con alto contenido en hierro con el fin de combinarlo y posteriormente se filtrar y comprobar. Todos los resultados analticos de las comprobaciones debern ser registrados.

Incorporacin al vino de productos txicos por equivocacin

El manejo de productos txicos siempre supone un riesgo. Como medidas preventivas, estos productos deben estar correctamente identificados con el fin de no confundirlos con cualquier materia prima o auxiliar e incorporarlos al proceso productivo, debiendo guardarse en almacenes separados6. A ttulo de ejemplo y sin nimo de ser exhaustivos, estas sustancias pueden ser lubricantes, disolventes, detergentes, etc, que se hayan alojado en recipientes que no son los originales y que no se identifican claramente. Otras acciones preventivas que nos ayudan a evitar este modo de fallo son auditar peridicamente los almacenes de tal forma, que se detecte lo antes posible el uso indebido de estos productos y por supuesto mantener aisladas estas sustancias de tal manera que se deba Ir ex profeso a por ellas. Obviamente la accin a tomar ser rechazar la partida afectada. Los registros de los resultados de los controles y las auditoras deben guardarse, as como de las incidencias que tengamos.

Embotellado

Contaminacin microbiolgica

Este punto de control ser crtico en aquellas empresas que embotellen productos con una riqueza en azcares tal, que la contaminacin microbiolgica pueda producir la fermentacin de esos azcares y como consecuencia de la presin interior producida en la botella, llegar al estallido de la misma En el caso de los vinos tranquilos, la contaminacin

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microbiolgica, puede provocar un enturbiamiento de los mismos. El lmite crtico deber ser fijado en cada empresa de acuerdo con las especificaciones de sus productos y su propia experiencia. Las tres acciones preventivas descritas en el cuadro comparativo van encaminadas a garantizar el producto, asegurando el correcto funcionamiento del proceso. Muy especialmente para prevenir problemas microbiolgicos, deben elaborarse instrucciones de limpieza de las lneas de embotellado con el fin de asegurar esta. La produccin afectada deber ser descorchada y reprocesada. Tanto los resultados de los controles microbiolgicos, como los registros que se deriven del control de la integridad de los filtros y de la limpieza de circuitos deben ser registrados.

Presencia de cristales u otros cuerpos extraos en el vino

Los cristales y otros cuerpos extraos que puedan aparecer en el vino son normalmente debidos a su presencia en las botellas antes del llenado o a su incorporacin durante el mismo. Los controles en la recepcin de las botellas, as como el efectuado en las lneas de produccin son fundamentales para detectar este fallo. Contar con proveedores capaces de proporcionar botellas en las debidas condiciones y mantener adecuadamente las lneas de produccin, evitando roturas en bocas, presencia de insectos, etc, son medidas tendentes a eliminar estas causas potenciales de fallo. Se recomienda tambin, como medida preventiva, el enjuagado de botellas previo a su uso. Como siempre, es necesario el registro de los controles establecidos y del mantenimiento ejercido.

Aparicin de residuos de productos de limpieza de mquinas

El empleo de diversos productos es prctica habitual en la limpieza de las bodegas. La supervisin diaria de la lnea de produccin tras la limpieza, est obligada con el fin de garantizar la ausencia de residuos en el vino.

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Brettanomyces/Dekkera EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Descripcin

Brettanomyces, al contrario de las levaduras responsables de la fermentacin del mosto, se caracteriza por una actividad fermentativa baja y crecimiento lento. En condiciones de cultivo sobre medio slido forma colonias al cabo de siete a diez das. Crece en medios de cultivo habituales de crecimiento de levaduras (MEA, YPD), sin embargo, cuando se desea aislarlo de mosto o vino es necesario emplear medios de cultivo diferenciales que impidan el crecimiento de otros microorganismos, mucho ms activos que Brettanomyces y que ocultan o impiden el desarrollo de las colonias de Brett. La morfologa celular de Brettanomyces es ojival o cilndrica, con gemacin multipolar en reproduccin vegetativa. Una de las caractersticas de este gnero es su tamao celular variable y la formacin de filamentos. En vinos se observan siempre clulas mucho ms pequeas que en medio de cultivo y son frecuentes estas formas filamentosas que ayudan a la adherencia del microorganismo a las superficies, por ejemplo de las barricas. Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia fisiologa del microorganismo. En efecto, la biosntesis de fenoles voltiles se realiza a partir de cidos hidroxicinmicos y en vinos tintos el contenido de estos compuestos es mayor. Adems, al ser una levadura de crecimiento muy lento, la alteracin se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre todo, la crianza del vino, habitual en los vinos tintos de gama alta. En las barricas de madera el microorganismo tiene a su disposicin todo el sustrato y tiempo suficiente para realizar su actividad. La naturaleza porosa de la madera y su difcil limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso despus del lavado de la barrica. Adems, D. bruxelliensis tiene la capacidad de degradar uno de sus componentes, la celobiosa Junto con la formacin de fenoles voltiles, Brettanomyces produce elevadas cantidades a de cido actico y tiene la capacidad de sintetizar, en condiciones especiales,

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tetrahidropiridinas que se identifican con el "gusto a ratn". Tambin se le atribuye la produccin de isovalrico y otros cidos grasos que confieren gustos a rancio y de ciertas esterasas, acentuando la prdida de aromas afrutados del vino. Por todo ello, el gnero Brettanomyces/Dekkera es uno de los ms temidos agentes microbianos de los vinos.

Figura 4. Sntesis de etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera ssp

Fuente: http://www.acenologia.com/ciencia78_2.htm

Brettanomyces es un microorganismo ubicuo, con poblaciones escasas pero repartidas en suelo, cortezas de arboles y sustratos azucarados (frutos miel). Su deteccin en uvas y mostos es poco frecuente debido sobre todo a la gran competencia existente con otros microorganismos mucho ms activos. No obstante, se han detectado focos en viedos particulares. Su aislamiento es frecuente en materiales de bodega, mangueras, depsitos, suelos, siempre asociado a higiene deficiente. Pero donde es ms habitual su presencia es en las barricas y tinas de madera. El desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces se inicia despus de la fermentacin alcohlica. En este momento, y a partir del reducido nmero de clulas procedentes del viedo que durante la fermentacin alcohlica no han tenido la oportunidad de multiplicarse debido a su escasa competitividad respecto a S. cerevisiae, inician su desarrollo en un vino poco o nada protegido (ausencia de sulfuroso). Dependiendo del arranque ms tardo de la fermentacin malolctica, la poblacin ser mayor, y aunque luego se corrija con sulfuroso, mayor la probabilidad de presentar clulas viables capaces de desarrollar la alteracin posteriormente.

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Diagrama de Flujo del Proceso

Figura 5: Descripcin del proceso enolgico y control de Brettanomyces/Dekkera

PCC Brettanomyces/Dekkera

PCC Brettanomyces/Dekkera

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Mtodos para la deteccin de Brettanomyces/Dekkera

Mtodo de ELISA

La tcnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotomtricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal (luminiscentes, cascadas enzimticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc..

Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sndwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno.

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Figura 6. Conjugacin del anticuerpo o antgeno

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm

2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.

Figura 7. Unin del anticuerpo o del antgeno a la fase solida

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm

3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el

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caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno frio frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno.

Figura 8. Formacin de una o ms capas de complejos inmunes sobre la fase solida

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisa3.jpg

4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. En el esquema se muestra la reaccin asociada a un ELISA directo.

Figura 9. Reaccin entre la enzima fijada y el sustrato: Formacin complejo coloreado

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisa3.jpg

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Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas): Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido).

ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de sel debida a la unin de dos o ms anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos.

ELISA 'sandwich': (ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

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El Mtodo de Cromatografa para Realizar Perfil de cidos Grasos

La determinacin de los perfiles de cidos grasos mediante cromatografa de gases, es una tcnica que permite una rpida y exacta identificacin de los microorganismos, estos cidos grasos son cidos orgnicos de cadena larga que estn presentes en el extracto de clulas bacterianas y su composicin es caracterstica en cada especie, lo cual permite la diferenciacin entre ellas. Para realizar la caracterizacin de las cepas por esta tcnica, se determinan sus perfiles de cidos grasos y los de cepas patrones y los picos se identifican mediante la comparacin de sus tiempos de retencin con los de una mezcla patrn Esta tcnica ha sido empleada exitosamente en la identificacin de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae, as como en sistemtica y ecofisiologa

El Mtodo de PCR

Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total. El mtodo se basa, en su forma ms simple en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucleridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

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Figura 10. Pasos en el mtodo de PCR

Fuente: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucletidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre

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ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

Figura 11. Amplificacin exponencial del gen en PCR

Fuente: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Una vez finalizada la reaccin se habr logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento gnico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado utilizando las tcnicas clsicas de clonado llevara varios das de tedioso trabajo. Por otra parte, la tcnica PCR es el mtodo de deteccin de secuencias de ADN ms sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco.

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Representacin Grafica de Brettanomyces/Dekkera

Figura 12. Microfotografa de cultivo de Dekkera/Brettanomyces. a) variabilidad morfolgica y de tamao celular. b) forma filamentosa

Fuente: http://www.agrovin.com/agrv/pdf/documentacion/articulos/Brettanomyces_Dekkera_controldeteccion_bodega.pdf

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Es fcil eliminar Brettanomyces/Dekkera, una vez instalada en la industria vincola?

Brettanomyces es un microorganismo ubicuo, con poblaciones escasas pero repartidas en suelo, cortezas de arboles y sustratos azucarados (frutos miel). Su deteccin en uvas y mostos es poco frecuente debido sobre todo a la gran competencia existente con otros microorganismos mucho ms activos. No obstante, se han detectado focos en viedos particulares. Su aislamiento es frecuente en materiales de bodega, mangueras, depsitos, suelos, siempre asociado a higiene deficiente. Pero donde es ms habitual su presencia es en las barricas y tinas de madera. El desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces se inicia despus de la fermentacin alcohlica. En este momento, y a partir del reducido nmero de clulas procedentes del viedo que durante la fermentacin alcohlica no han tenido la oportunidad de multiplicarse debido a su escasa competitividad respecto a S. cerevisiae, inician su desarrollo en un vino poco o nada protegido (ausencia de sulfuroso).

Figura 13.

Dinmica de las poblaciones levaduras fermentativas bacterias lcticas y

Brettanomyces desde la entrada de uva hasta vino terminado. FA: fermentacin alcohlica, FML: fermentacin malolctica.

Fuente: http://www.agrovin.com/agrv/pdf/documentacion/articulos/Brettanomyces_Dekkera_controldeteccion_bodega.pdf

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Dependiendo del arranque ms tardo de la fermentacin malolctica, la poblacin ser mayor, y aunque luego se corrija con sulfuroso, mayor la probabilidad de presentar clulas viables capaces de desarrollar la alteracin posteriormente. Durante la crianza, procedentes del vino o de las propias barricas ya contaminadas, las poblaciones aumentan de mansera lenta pero sin competencia. Aqu se originan los principales riesgos. Es destacable sealar que no hace falta un gran nmero de clulas para desarrollar la alteracin, y que por encima de 1000 clulas/ml la calidad organolptica del vino est seriamente comprometida

Mtodos de Eliminacin de Brettanomyces/Dekkera

Cuando el vino no manifiesta sensorialmente la alteracin y el contenido de fenoles voltiles es inferior a 400 g/l, el objetivo prioritario es detener el desarrollo de Brettanomyces y por tanto el aumento de la concentracin de fenoles voltiles. Para ello se deben corregir los niveles de sulfuroso libre en cantidad suficiente y acorde con el pH, por encima de 0,8 ppm de SO2 molecular.

Utilizacin tradicional de dixido de azufre

La adicin de dixido de azufre en forma de gas o de solucin salina ha sido siempre una de las bases para proteger el vino frente a alteraciones microbianas, as como para desinfectar los recipientes de madera. En efecto, la combustin del azufre elemental en el aire produce dixido de azufre utilizado en forma gaseosa y en grandes concentraciones, y que permite actuar sobre la superficie y sobre los primeros milmetros de madera provocando una acidificacin mortal del contenido intracelular de los microorganismos. Tradicionalmente, el dixido de azufre gaseoso puede producirse por la combustin de una mecha (azufre sobre una trama metlica o textil), o de pastillas de azufre compactado sobre una carga mineral (silicatos, fibra de vidrio) u orgnica (madera, fibras textiles plsticas)

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colocadas en el interior del recipiente vaco. Tambin puede introducirse directamente en forma gaseosa a partir de gas industrial liquificado. El dixido de azufre acta sobre la superficie y sobre la microporosidad que est en contacto directo con el vino; el exceso de dixido de azufre se disuelve parcialmente en el vino en el momento del llenado del recipiente por emulsin gaseosa, o se evacua al exterior por el desplazamiento de volmenes.

Utilizacin de ozono

El ozono (O3) es un gas con propiedades oxidantes muy potentes muy utilizado para la desinfeccin. A causa de su vida relativamente corta, el ozono siempre se genera in situ mediante un generador de ozono. El ozono se produce a partir del oxgeno como resultado directo de una descarga elctrica. Esta descarga rompe la molcula estable de oxgeno y forma dos radicales de oxgeno y calor. Estos radicales se combinan con molculas de oxgeno para formar el ozono. El ozono no es ms que un desinfectante, no posee propiedades de limpieza. Teniendo en cuenta su modo de accin, es indispensable emplearlo sobre superficies perfectamente limpias para poderlas desinfectar. El ozono constituye una tcnica perfectamente eficaz para el tratamiento en fro de las cubas de acero inoxidable, de resinas epoxdicas, de las canalizaciones, de las cadenas de embotellado

Otros Contaminantes Biolgicos en la Industria Enolgica

Levaduras

Las levaduras del gnero Pichia y Hansenula son levaduras oxidativas comunes en la crianza en barricas; producen etanal, que puede formar velos en recipientes vaciados. La presencia de levaduras con un fuerte poder de fermentacin pertenecientes a los gneros Saccharomyces (especie bayanus), Saccharomycodes (especie ludwigii) o

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Zigosaccharomyces (especie baillii) puede causar graves problemas de re-fermentacin de los vinos azucarados debido sobre todo a su resistencia al dixido de azufre.

Bacterias

Las particulares condiciones de oxidacin de la crianza en madera permiten siempre el mantenimiento de poblaciones bacterianas aerobias significativas (Acetobacter sp.). La actividad metablica de estas bacterias es limitada mientras la presin parcial de oxgeno en el vino es dbil. A la inversa, si se producen trasiegos o por evaporacin natural (consumo) del vino entra aire, la reactivacin de la cadena respiratoria de las bacterias es rpida y produce fcilmente cido actico por oxidacin del alcohol etlico. La crianza prolongada de vinos en madera en presencia de Acetobacter ms o menos quiescente puede no traducirse en una formacin importante de acidez voltil, pero a menudo se acompaa de una acumulacin de acetato de etilo. Ms all de 180 a 200 mg/L, la nitidez aromtica del vino se ve afectada con la aparicin de un carcter acescente desagradable. Las bacterias del gnero Lactobacillus y Pediocococcus en vinos tintos de pH elevado (pH > 3,8), el dixido de azufre activo (molecular) puede no presentar dosis suficientes. En estas condiciones, los grmenes lcticos anaerobios pueden atacar los residuos de azcares en C6 o C5 para formar cido actico, aldehdos (glioxal, piruvaldehdo) y productos acetonicos (acetona, diacetilo, butanodiona) no deseables. El ataque al cido ctrico por parte de las bacterias lcticas, incluida Enococcus, puede por s slo generar entre 200 y 300 mg/L de cido actico fcilmente. La degradacin del glicerol del vino por estos mismos grmenes puede causar la enfermedad del amargor asociada a la sntesis de propenal (acrolena), pero esta alteracin es poco habitual. En cambio, mucho ms habitualmente, ciertas cepas de estas mismas bacterias pueden producir a partir de este mismo sustrato cantidades bastante grandes de cido lctico. En estas condiciones, la acidez total aumenta rpidamente sin que vare la acidez voltil, de modo que a partir de 2 a 2,5 g/L se produce un importante endurecimiento del vino en el momento de la cata. Finalmente, incluso cuando la fermentacin malolctica no produce ninguna desviacin y muy habitualmente en vinos de pH elevado (pH > 3,9), se registran aumentos, a veces impresionantes, de las

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concentraciones de aminas bigenas en el transcurso de la maduracin. Estas sustancias, producidas por la degradacin de ciertos cidos aminados, no suelen producir desviaciones detectables en la cata. En cambio, algunos pases, como Suiza o los Pases Bajos, discuten la importacin de vino con un contenido en histamina superior a 10 y 3,5 mg/L, respectivamente.

Desarrollo de mohos

El desarrollo de mohos se limita normalmente a situaciones de conservacin prolongada de los recipientes de madera vacos y en ambientes hmedos. En estas condiciones, los mohos del gnero Mucor y Pennicilium, muy frecuentes en bodegas, pueden originar olores muy caractersticos. Como origen de estas desviaciones pueden identificarse diferentes compuestos. El metil-isoborneol, el fenchol, la fenchona y a veces la geosmina son molculas terpnicas que suelen ser responsables de los defectos alcanforado y terroso. El octenol-3 y la octenona-3 pueden comunicar olores achampionados. En presencia de fuentes de los precursores adecuados, tambin es posible la formacin de cloro (TCA) y de bromoanisoles (TBA) con la aparicin de olores a moho, a corcho.

Por qu las muestras procedentes de superficies con mosto se cubren con bacterias u hongos?

Porque en el mosto se encuentran bacterias u hongos procedentes de la fermentacin y de la reaccin denominada fermentacin malolctica las cuales bajo condiciones adecuadas (Nutrientes, Tiempo, Temperatura y Oxigeno) que favorezcan su crecimiento empiezan a proliferar sobre la superficie en contacto directo con el mosto. Por tal razn son muy importantes las prcticas de higiene y desinfeccin para eliminar el riesgo de aumento de poblaciones de microorganismos sobre las superficies formando biopelculas que ocultan la

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presencia de otros microorganismos de inters. La presencia de las innumerables bacterias y hongos que proliferan en zonas con restos de mosto imposibilita el aislamiento tradicional de colonias para analizar la presencia de levaduras contaminantes.

Deteccin por PCR de Brettanomyces/Dekkera en Uvas

Figura 14. Resultados

Fuente: Gua Trabajo final

Anlisis

Como en 6 de las 8 muestras tomadas se detect la presencia de Brettanomyces/Dekkera, en 1 no se detect, y en la restante se encontr un resultado negativo (incluso en el control positivo), puede afirmarse que hay presencia de inhibidores, los cuales impiden obtener conclusiones para esta ltima muestra y no puede descartar la presencia de Brettanomyces/Dekkera en esta muestra. El control positivo tiene 105 clulas y el resultado arrojado en la primera reaccin es +, lo que me indica que hay ms de 1000 clulas de esta

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levadura en la muestra analizada, y el control negativo arrojo resultados negativos para las dos reacciones, por lo tanto garantizo que el equipo est realizando lecturas correctas.

YPD

Est constituido por extracto de levadura, peptona bacteriolgica y glucosa. el tratamiento de incubacin con YPD durante 6 das sirve para el crecimiento exponencial de las levaduras ya que es un medio rico en nutrientes que favorecen el crecimiento de estos microorganismos.

Deteccin por PCR de Brettanomyces/Dekkera en Instalaciones

Figura 15. Resultados

Fuente: Gua Trabajo final

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Anlisis

La presencia de las innumerables bacterias y hongos que proliferan en zonas con restos de mosto imposibilita el aislamiento tradicional de colonias para analizar la presencia de levaduras contaminantes, aunque este procedimiento ha permitido constatar su presencia. Como en 20 de las 50 muestras tomadas se detect la presencia de Brettanomyces/Dekkera, en 12 no se detect, y en las 18 restantes se encontraron resultados negativos (incluso en el control positivo), puede afirmarse que hay presencia de inhibidores, los cuales impiden obtener conclusiones para estas ltimas.

Deteccin por PCR de Brettanomyces/Dekkera en las Moscas

Figura 16. Resultados

Fuente: Gua Trabajo final

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Anlisis

En la figura anterior se observa que 3 de las 4 muestras procesadas dan positivo para Brettanomyces/Dekkera, razn por la cual puede pensarse que la mosca Drosophila colabora con la difusin del contaminante. sta explicacin se consolida an ms, al revisar los resultados anteriores, en los cuales se confirma la presencia de las levaduras tanto en las uvas como en las instalaciones de vendimia.

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CONCLUSIONES

La deteccin rpida de Brettanomyces/Dekkera en el proceso de elaboracin de los vinos permitira al enlogo y al productor tomar medidas de prevencin y eliminarla antes de la aparicin del carcter fenolado caracterstico de la alteracin provocada por esta levadura. Al contrario que el mtodo microbiolgico tradicional y los mtodos no especficos, la biologa molecular (PCR) ofrece soluciones de deteccin con elevados niveles de rapidez, sensibilidad y especificidad.

La tcnica ms exacta para deteccin de Brettanomyces/Dekkera es la tcnica de PCR, ya que con la Tcnica de ELISA obtengo resultados presuntivos, los cuales debo confirmar y con la tcnica de perfil de cidos grasos por cromatografa de gases no diferencio entre clulas vivas y muertas El diagnstico de la presencia de Brettanomyces/Dekkera debe permitir determinar el nivel de riesgo en que se encuentra el vino y cmo evoluciona dicho riesgo con el tiempo, ya que el riesgo vara segn el nivel de contaminacin. En el caso de la cerveza, la fermentacin es generada por la accin de la levadura Saccharomyces cerevisiae, siendo utilizada a gran escala para la produccin de bebidas alcohlicas.

En ocasiones se tiende a definir muchos puntos como PCC, generando con esto retrabajos y prdidas de tiempo y esfuerzos; por tanto la etapa de la definicin y evaluacin de PCC es fundamental el HACCP. Para el caso de control de Brettanomyces/Dekkera en la industria enolgica se deben establecer antes de pasar el vino a barrica, antes de ser embotellado el vino y fermentaciones lentas

En los anlisis realizados de PCR Brettanomyces/Dekkera est presente en numerosas partes de las instalaciones especialmente en la zona de recepcin, conduccin y prensado de la uva. Aunque no resultaron positivos los anlisis en los

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depsitos de desfangado, estos valores no son significativos ya que la particular composicin del mosto inhibe el PCR, y de hecho en 6 de los 8 anlisis realizados no se obtuvo positivo en el control al que expresamente se aaden levaduras contaminantes, por lo que no se puede excluir la presencia de

Brettanomyces/Dekkera en estos depsitos.

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