P E RUSSELL
Independent Consultant
Gog Magog House
263A Hinton Way
Great Shelford
Cambridge CB2 5AN, UK
Resumen
Introducción
Definición del termino “línea base”
Cuando es necesario una línea base?
Cuales son las alternativas a una línea base normal?
Línea base y la química de los fungicidas
Procedimientos de muestreo, números de muestra y dosis de aplicación
Ejemplos ilustrados de líneas base
Unión de datos a partir de otros cultivos y localidades
Procedimientos de experimentación molecular
Detectando cambios a partir de la línea base
Uso de dosis discriminatorias
Líneas base y procedimientos reguladores en Europa
Apéndice 1. Determinando un método de ensayo, procedimientos y parámetros de
evaluación
Apéndice 2. Una nota sobre la detección de la resistencia y el tamaño de muestreo
Apéndice 3. Riesgos y errores
Resumen
La construcción de líneas base es ahora una principal tarea tomada por los científicos
que trabajan en la industria de protección de cultivos y forma una parte del proceso
de registro para todos los pesticidas. Esta publicación, escrita con un énfasis en este
proceso regulador, será de mayor valor para el sector comercial y los Funcionarios
Reguladores preocupados en examinar el componente de Evaluación del Riesgo de
Resistencia de los nuevos Expedientes de Registro. Es, sin embargo, igualmente
relevante para los científicos en el sector público que se deseen embarcar en estudios
de manejo de la resistencia.
INTRODUCCIÓN
Este aspecto ha sido reconocido por las autoridades reguladoras en Europa, con la
intención de proteger el ambiente y ayudar al usuario, mediante el aseguramiento de
que los nuevos productos sean introducidos con una estrategia adecuada de manejo
de la resistencia. Dentro de este esquema, se requiere de la provisión de datos para
línea bases de sensibilidad para el registro de nuevas moléculas y el re-registro de las
moléculas ya establecidas.
La palabra “línea base” tiene muchos usos en el lenguaje mundial pero todos ellos
incluyen el concepto de que es un punto de referencia para ser usado en un proceso de
toma de decisiones. La “línea base” en un campo de tenis, por ejemplo, define el área
de la cancha de tal forma que las pelotas se consideren “adentro” ó “afuera” de la
jugada dependiendo de de que lado de la línea “base” ellas caen. Para la
investigación y manejo de la resistencia a fungicidas una “línea base” puede ser
definida como:
El uso principal de las línea bases es como una herramienta para el establecimiento
de, y el subsiguiente monitoreo de, las estrategias de manejo de resistencia al
fungicida. El termino línea base es aplicado universalmente a nuevos compuestos a
partir de química nueva pero cuando se aplica a moléculas para las que, por
cualquier razón, no es posible encontrar una población que nunca haya sido expuesta
al tipo de químicos asociados con la nueva molécula, pueden usarse frecuentemente
los términos “perfil de sensibilidad” ó aún “perfil de introducción pre-mercado”. Para el
propósito de este documento, los términos son intercambiables, dependiendo de la
circunstancia.
Por definición implícita, la línea base no es solo un punto de dato sino que es
construido al muestrear un número de poblaciones ó individuos y al establecer la
variabilidad entre ellos. La línea base, sin embargo expresada visualmente,
matemáticamente ó de ambas formas, ilustrara esta variabilidad.
entonces hay un claro peligro de que haya posible resistencia y de que deben tomarse
estrictas medidas anti-resistencia antes de la introducción al mercado. La línea base
producida seguirá siendo valida, pero el futuro énfasis del monitoreo comercial debe
descansar en la evaluación del desarrollo verificado de segmentos resistentes en el
tiempo, y posiblemente en la investigación de estrategias alternativas para el manejo
a la resistencia.
Los fungicidas son introducidos al mercado con blancos específicos para controlar.
Cada uno de estos blancos, en teoría, requiere que se le establezca una línea base de
tal forma que las estrategias de uso del producto puedan ser monitoreadas y pueda
ser detectada la posible resistencia. Sin embargo, la experiencia sugiere que algunos
blancos son muy propensos a desarrollar resistencia, otros son menos propensos y en
algunos casos no ha habido ninguna evidencia real de desarrollo de resistencia a la
fecha. Las consideraciones comerciales también tienen influencia.
Patógenos de alto y bajo riesgo:
Tabla 1. Fitopatógenos aceptados que muestran un alto riesgo de desarrollar resistencia a fungicidas.
Patógeno Cultivo Enfermedad
Botryotinia fuckeliana varios, especialmente uva moho gris
_(Botrytis cinerea)
Erysiphe gruminis trigo/cebada mildeo polvoso
Mycosphaerella fijiensis banano sigatoka negra
Phytophthora infestans papa tizón tardío
Plasmopara vitícola uva mildeo mohoso
Pseudoperonospora cubensis y cucurbitáceas mildeo mohoso
relacionados
Pyricularia orizae arroz quemado del arroz
Sphaerotheca fuligenea y cucurbitáceas mildeo polvoso
relacionados
Venturia spp. manzano, pera roña
En contraste, varios patógenos son considerados que presentan un bajo riesgo debido
a que la resistencia generalizada no es un problema ó ha sido desarrollada de manera
lenta. En algunos casos esto se debe indudablemente al patrón de uso del producto.
Esto no significa que ellos nunca mostraran resistencia significante a los fungicidas
en el futuro, sino que puede ilustrar una falta general de mecanismos para hacerse
resistente en la práctica a través de cualquiera una propiedad inherentemente
biológica del hongo (por ejemplo su epidemiología) ó por el patrón de uso de los
productos diseñados para controlarlo.
La Pauta de la EPPO (EPPO, 2002) no enlista estos y las decisiones sobre las línea
bases de producción deben hacerse en base a revisiones de casos individuales. Los
ejemplos son dados en la Tabla 2. Al usar esta lista debe mencionarse que la EPPO
incluye a Gibberella fujikuroi y Ustilago necator en la Tabla 1, mientras que la FRAC
ve que ellos deben incluirse en la Tabla 2. La razón para esta diferencia de
aproximación surge del hecho de que hay muy pocos datos laboriosos para clasificar
los patógenos en grupos aparte de la experiencia histórica y la opinión así como los
riesgos planteados por los patógenos.
Tabla 3. Fitopatógeno de importancia comercial menor para los que una línea base puede no ser
justificable por razones comerciales.
Patógeno Cultivo Enfermedad
Alternaria spp. Varios manchas foliares
Fusarium spp. y Varios fusariosis
relacionados
Hemileia vastatrix Café roya
Phytophthora spp. (del Varios damping off
suelo)
Pythium spp. Varios damping off
Rhizoctonia spp. Varios pudriciones de pie y raíz
Rhynchosporium secalis cebada manchado
foliar/escaldado
Sclerotinia spp. Varios enfermedades de
sclerotinia
Tilletia spp. cereales caries hedionda
Ustilago spp. cereales añublo
En algunos casos no puede ser posible establecer una línea base usando
procedimientos de bioensayos. Esto puede ser por razones comerciales como se dieron
arriba, ó debido a que no hay disponibles muestras no expuestas ó tal vez aún por
dificultades biológicas. En tales circunstancias nosotros podemos aún necesitar un
punto de referencia en contra del cual comparar el desempeño del producto como
parte de la campaña de monitoreo. Esto puede hacerse al usar eficazmente los datos:
Una vez que se han hechos las decisiones acerca de la producción de líneas base
basadas en consideraciones comerciales, los siguientes factores a considerar están
basados en la química del nuevo fungicida.
La situación más clara respecta a un nuevo fungicida a partir de una nueva área de
la química, pero también debe considerarse un nuevo fungicida a partir de química
ya establecida. También es deseable construir una línea base para una molécula que
ha sido usada por algún tiempo. En ambos de los últimos casos es posible que ya se
halla llevado a cabo un cambio en la sensibilidad de la población antes de que la
investigación sea ejecutada y los resultados deben ser considerados de acuerdo con
eso.
Esta situación puede ser similar a aquella de la de una nueva molécula a partir de
una química establecida a condición de que la molécula que está siendo considerada
provenga de un área de la química que ya ha sido investigada.
Varios autores han considerado la mejor manera para medir y muestrear las
enfermedades vegetales. Tales procedimientos están generalmente diseñados para
establecer la incidencia de las enfermedades vegetales y el daño (perdida) que causen.
Las mediciones de la incidencia pueden ser hechas más de una vez por temporada.
Muchos de los parámetros considerados en tales estudios son también aplicables a los
procedimientos involucrados en el establecimiento de las líneas base de sensibilidad.
Hay, sin embargo, diferencias en los objetivos y en la aproximación al problema
acerca de la mejor manera para conducir la medición. La medición de la incidencia de
una enfermedad a fin de producir información acerca de su distribución especial
requiere del conocimiento de la epidemiología del patógeno y por lo tanto de los
patrones de distribución espacial que pueden esperarse. Cuando se establece una
línea base, el conocimiento del patrón de distribución espacial será de mayor
importancia que la incidencia de la enfermedad. Los procedimientos y patrones de
muestreo pueden ser comunes, pero con una diferencia en los objetivos de manera
que el establecimiento de la línea base parece parece muestrear y evaluar diferentes
poblaciones fungosas en el lugar y no el predominio de propagulos fungosos ó el grado
de daño causado por ellos.
Procedimientos de muestreo
Para el establecimiento de una verdadera línea base, las muestras deben ser
obtenidas a partir de áreas y cultivos que no hayan sido tratados con el fungicida, ó
con un fungicida con el que muestre resistencia cruzada, cualquiera en la temporada
de la prueba ó en temporadas anteriores. Pueden presentarse excepciones cuando se
desea producir una línea base en retrospectiva y son validas cuando no ha habido un
caso de resistencia a condición que se acepte que pudo haber sucedido algo de
selección contra los individuos más sensibles, a pesar de que no haya efecto en el
desempeño en el campo del fungicida. En los casos donde la línea base está siendo
construida para un nueva molécula a partir de química ya establecida para la que ya
se conoce resistencia puede ser aconsejable construir la línea base usando muestras
referencia a partir de colecciones establecidas de cultivos a condición que tales
muestras puedan considerarse como no haber sido expuestas antes a esa área de la
química.
Típicamente para esporas llevadas por el aíre e.g., Erysiphe graminis en cereales, es
bastante probable que muestras de igual sensibilidad sean más ampliamente
dispersadas especialmente si el muestreo es conducido durante la activa fase
epidémica. Muy al principio de la temporada esto puede ser menos probable. En tales
circunstancias la flora del aire contendrá generalmente más variabilidad que la
encontrada en un área restringida del suelo y el muestreo puede ser hecho usando
aparatos especializados diseñados para muestrear grandes volúmenes de aíre.
Claramente una línea base construida a partir de 5 puntos es improbable que sea de
mucho uso a menos que los individuos en la muestra representen la variación de toda
la población. Considere el hecho de que esto no se realizara hasta que más de 5
aislados hayan sido probados! Similarmente, una línea base construida a partir de
500 puntos puede ser excelente pero no siempre necesaria. Para la mayoría de los
casos es probable que una línea base no se defina adecuadamente con menos de 20
puntos y es más probable que 50 puntos den una imagen razonable. Las líneas base
que cubren amplias áreas geográficas probablemente requieran más puntos de datos
que aquellas dirigidas a lugares específicos. La precisión con que tales desviaciones a
partir de la línea base puedan ser detectadas dependerá de la precisión de su
producción original.
Debe tenerse cuidado si la línea base termina abruptamente con una proporción
grande de la población en una categoría de dosis (alta) en particular ya que es
bastante posible que el procedimiento de muestreo no haya incluido los limites de la
población ò las brechas entre las dosis de aplicación más altas son muy altas. Las
dosis de aplicación seleccionadas para la evaluación deben cubrir el rango normal
“sensible” de respuesta del aislado e incluir una aplicación que proporcione control
total, pero debe también permitir una evaluación precisa de la forma de la respuesta
de sensibilidad. Las dosis de aplicación usadas in-vitro tendrán con toda probabilidad
poca relación a aquellas usadas en el campo debido a que la sensibilidad fungosa in-
vitro es invariablemente mayor que aquella en el campo. Para algunos métodos in-
vivo las dosis de aplicación en campo pueden ser aplicables.
Ejemplos de líneas base teóricas son dados abajo para ilustrar la influencia del
número de puntos de datos. Los ejemplos son mostrados como gráficos de líneas pero
pueden igualmente ser producidos usando histogramas.
En contraste, la figura 2 muestra una línea base muy irregular derivada a partir del
tamaño de muestra y el criterio de prueba.
Dese cuenta como la forma de la línea base se ha vuelto más suave con un extremo
final claro. La distribución de los puntos es más confiable y los cambios en el patrón
pueden ser más fácilmente detectados.
La Figuras 1-3 han ilustrado el uso de 10 dosis de aplicación. La Figura 4 ilustra que
puede suceder si el número de dosis de aplicación es reducido, usando los datos a
partir de la Figura 2.
En la Figura 4 dese cuenta como la forma general de la curva es más suave pero una
comparación con la Figura 2 ilustra que esto es debido a que la variabilidad en la
respuesta a la dosis de aplicación se ha escondido. La línea base producida de este
modo no es satisfactoria debido a que no hay un claro extremo final y la respuesta
está mostrando muy poca variación a lo largo de las dosis de aplicación. Solo si el
subsiguiente monitoreo muestra un desplazamiento grande en la sensibilidad hacia la
mayor dosis de aplicación y una subsiguiente perdida de los aislados más sensibles, la
distribución será de algún valor.
Esto ilustra un hecho obvio, pero frecuentemente ignorado. Como el número de las
dosis de aplicación se incremente, particularmente si los intervalos entre ellos son
pequeños, la forma de la línea base estará relacionada al número de aislados
probados, siendo producidas generalmente distribuciones más uniformes donde la
relación numero de muestras/dosis de aplicación es baja.
Las curvas de frecuencia pueden haber sido expresadas como curvas de frecuencia
acumuladas como se muestra en la Figura 5 para los mismos datos mostrados en la
Figura 3.
La línea base tiene uso para un área restringida como un distrito local, ó país, ó
continente (e.g., Europa) ó es de uso global? Si los proyectos comerciales limitan el
desarrollo del producto a un país particular es claro que la línea base debe
concentrarse en ese país en primer instancia pero si esos proyectos son hechos para
expandir el conocimiento deben cambiar los proyectos de introducción del producto.
Como utilizaremos los recursos usados en la construcción de la línea base? Al
considerar un país individual, es razonable asumir que las respuestas de sensibilidad
son iguales para todo el país? Podemos nosotros asumir que una línea base producida
para un país e.g., Inglaterra, se aplicara a otro, e.g., Francia? La respuesta a esta
pregunta puede tener serias consecuencias relacionadas a la cobertura del muestreo
para la línea base. Para obtener una línea base verdadera para un país, los aislados
muestreados deben ser representativos de toda la variabilidad poblacional presente
en ese país. Los sesgos en el muestreo deben ser ausentes. De este modo será
imprudente creer que las muestras derivadas a partir de un campo representaran un
país y una mejor estrategia será construir la línea base a partir de muestras en
campos para diferentes áreas del país. Si el tamaño de la muestra del campo
individual es adecuado será posible determinar si ó no existen diferencias regionales
en el país, y sí no las hay, reunir los datos para una línea base general del país. La
experiencia a la fecha indica que para una nueva molécula a partir de una nueva
química los perfiles de sensibilidad de las poblaciones en un país individual son
probablemente similares y que la principal preocupación es asegurar que las
muestras probadas ilustren los extremos de la variabilidad en la población. Este
concepto puede expandirse para considerar una línea base individual para diferentes
países, pero con la siguiente cláusula: Solo puede ser razonable esperar que una línea
base a partir de un área se aplicará a otra área si todas las condiciones de crecimiento del
cultivo y desarrollo del patógeno son tan idénticas como sea posible. Puede de esta forma
ser bastante razonable asumir que una línea base establecida para un patógeno
cereal en Inglaterra puede también ser aplicable para Francia del norte ó Alemania
donde las condiciones del cultivo son similares. No puede ser razonable usar una
línea base desde Europa como un punto de referencia para e.g., Australia o Nueva
Zelanda.
Hay, sin embargo, maneras de establecer si tales patrones de datos comunes pueden
ser usados y de ese modo evitar la innecesaria duplicación del esfuerzo en la
construcción de las líneas base (ver “Unión de datos a partir de otros cultivos y
localidades”).
Los siguientes ejemplos han sido elegidos para ilustrar diferentes aproximaciones de
compañías de protección de cultivos para la producción de líneas base en la practica
durante la fases de desarrollo de moléculas individuales.
Nueva química
Ejemplo 1. Distribución de frecuencia: famoxadone y Plasmopara viticola
Este es un ejemplo de una línea base que puede permitir que las salidas del patrón
respuesta sensitivo esperado sean fácilmente identificadas. Los detalles completos
son dados por Genet & Vincent (1999).
La Figura 7 muestra una línea base construida como una curva de frecuencia
acumulativa para la sensibilidad de Botrytis cinerea al fungicida anilinopirimidina
pyrimethanil. Al momento de construcción las poblaciones fungosas habían sido
expuestas a los fungicidas anilinopirimidinas y era razonable esperar que el perfil de
sensibilidad fuera representativo de variación natural. Las muestras venían de las
principales áreas de cultivo de la vid de Francia. Debido al gran tamaño del
muestreo (>600) fue posible establecer que no habían diferencias regionales de tal
forma que los datos fueron combinados para dar una línea base para “toda Francia”.
Los datos fueron generados usando un método de microtitre plate que media la
germinación y el subsiguiente crecimiento de las esporas fungosas en un medio
definido para un rango de varias concentraciones. A partir de estos datos, se
calcularon los valores IG50.
Dese cuenta que las dosis de aplicación fueron dibujadas a una escala logarítmica. La
distribución muestra que hay una baja proporción inicial de la población que es
controlada a muy bajas concentraciones de pyrimethanil, la población controlada
luego aumenta rápidamente como la concentración del fungicida aumenta. Hay una
pequeña proporción de la población que no es controlada hasta que el fungicida
alcanza valores concentración mayores, pero no hay aislado que sobreviva a
concentraciones de 100 ppm.
El propamocarb ha sido usado por muchos años en el mercado hortícola para control
de Pythium y Phytophthora spp. del suelo y algunos mildeos vellosos foliares sin
problemas de resistencia antes de ser introducido para el control de Phytophthora
infestans en papa. Debido a esta historia, se había concluido que el riesgo de
desarrollar resistencia era bajo, especialmente si era introducido en mezclas con
moléculas establecidas de bajo riesgo, multisitio. Sin embargo, P. infestans es un
patógeno de alto riesgo y la posibilidad de desarrollar resistencia no puede ser
ignorada. Se estableció una línea base (Figura 8) junto con una campaña de
monitoreo de la sensibilidad como para del programa de gestión del producto. El
método usado fue virtualmente idéntico al método del disco foliar flotante
desarrollado para las fenilamidas. El criterio evaluado fue el desarrollo de lesiones
esporulantes en los discos foliares de papa, y se calculo el grado de esporulación
medio para cada serie de discos foliares usando el siguiente sistema de grados:
Grado Criterio
0 Esporangióforo ausente
1 1-4 esporangióforos por disco
2 5-12 esporangióforos por disco
3 Esporulación moderada, solo visible bajo microscopio binocular
4 Esporulación abundante visible a simple vista
Los datos, presentados aquí en forma de histograma, ilustran el perfil de sensibilidad
y pueden ser fácilmente convertidos a una línea de regresión si se requiere un análisis
matemático.
El método analítico elegido fue el establecer los valores EC50 de la población para
varias poblaciones europeas y, así usar un aislados referencia estándar, calcular el
“Factor de Resistencia, RF” como la relación de la probada EC50 poblacional con la
EC50 del aislado referencia estándar. Al usar este cálculo relativamente sencillo fue
posible detectar cambios posibles en la sensibilidad de la población con el tiempo.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9.
Los datos en la Figura 9 muestran que hubo una clara diferencia en la sensibilidad de
las poblaciones del mildeo en toda Europa, estando las poblaciones más sensibles en
el sur.
En algunos casos puede no ser económicamente viable construir una línea base para
un uso específico. El uso de datos de eficacia como un sustituto puede ser
considerado una opción pero hay casos donde esto no es deseable, particularmente
con químicas nuevas y patógenos muy importantes. En tales circunstancias es
posible usar la “unión de datos” para permitir que una línea base previamente
establecida sea usada en una nueva situación. Los siguientes ejemplos ilustraran los
principios:
Para un patógeno principal es lógico que la línea base sea construida para áreas
donde el uso del producto será probablemente intensivo. Como ejemplo, para los
fungicidas de cereales los principales mercados pueden centrarse en Francia,
Alemania y el RU y es razonable que una línea base sea establecida cualquiera
conjuntamente ó individualmente para estos países. Pero las enfermedades de los
cereales pueden también aparecer en otros países europeos y puede ser deseable tener
una línea base aplicable para esos países extra. Es posible usar la línea base
establecida para ese país extra? La respuesta más probablemente es “si”, pero
necesita ser comprobado mediante la unión de datos.
Debe tener cuidado, sin embargo, al usar esta aproximación. En el ejemplo de arriba
no hay grandes diferencias entre los aislados dentro de los países individuales. Si
tales diferencias han sido encontradas esto puede indicar diferencias entre
poblaciones locales, lo que, si son lo suficientemente grandes crearan problemas en la
interpretación de datos durante las subsiguientes operaciones de monitoreo.
Pero B. cinerea también causa el moho gris en una amplia variedad de otros cultivos
e.g., fresa, pimienta, tomate, vara. La justificación económica para producir líneas
base específicas del cultivo para tales cultivos es cuestionable pero es posible usar la
misma aproximación de “unión de datos” como se uso para las nuevas áreas
geográficas. Las muestras deben hacerse a partir del nuevo cultivo y el perfil de
sensibilidad de un rango de aislados ser comparado con la línea base de sensibilidad
establecida para el cultivo principal. Al contemplar que los aislados se ajustan a la
línea base establecida debe ser posible usar con confianza la línea base establecida
para el nuevo cultivo.
Tal aproximación fue usada cuando se establecieron líneas base para la sensibilidad
de B. cinerea a pyrimethanil para uva y tomate. Se estableció una extensa línea base
para las uvas de Francia y Suiza, no encontrándose diferencias entre los países. Los
aislados a partir de tomates de España se ajustaron bien a la distribución para uva,
aunque es un grupo que mostró menos variación que los aislados de la uva y
presentaron una diferente respuesta promedio. En general, sin embargo, y ya que los
datos a partir del tomate se contuvieron completamente dentro de los datos de
distribución para uva, se concluyo que el rango de respuestas de sensibilidad
encontrado a partir de las uvas puede ser tomado cono una buena señal de la
variación de la población que probablemente se presente en el tomate. Se hicieron
aproximaciones similares (no publicadas) para establecer que la línea base para la
uva era también aplicable para las fresas.
Tal vez el ejemplo más ampliamente publicado del uso de técnicas moleculares en el
establecimiento de una línea base y el subsiguiente monitoreo del desarrollo de la
resistencia es dado por el grupo de fungicidas QoI, incluyendo los derivados de las
estrobilurinas azoxystrobin, kresoxim-methyl, trifloxystrobin, pyraclostrobin,
picoxystrobin, fluoxastrobin, la oxazolidinediona famoxadone y la imidazolinona
fenamidone.
• La línea base que está siendo usada debe ser apropiada en términos del
cultivo, patógeno y región geográfica.
• Los métodos usados deben ser idénticos a aquellos usados para establecer la
línea base.
• Los procedimientos de recolección, transporte, almacenamiento, purificación
y preparación del inóculo deben corresponder a aquellos usados para la línea
base.
• Se deben de obtener detalles completos de la historia del muestreo tales como
el régimen de tratamiento en esa temporada y temporadas previas, y la
historia del cultivo.
• Se requieren de datos sobre el desempeño del fungicida en el control del
patógeno de tal forma que la eficacia puede ser comparada con la sensibilidad.
Una vez que estos criterios se han reunido es posible proceder con el ensayo de
monitoreo y revisar si ha habido un cambio en la sensibilidad.
Se debe tener extremo cuidado en llegar a conclusiones ya que es muy fácil concluir
que han ocurrido cambios cuando no es así. Los siguientes ejemplos ilustran esto:
Ejemplo de datos a partir del programa de monitoreo para quinoxyfen y E. graminis
son mostrados en la Figura 11. Los datos de la línea base original fueron publicados
por Hollomon et al (1997). Se recolectaron esporas en una trampa de esporas a chorro
montada en carro en varias regiones de Europa en cada año y se evaluaron la
sensibilidad usando hojas de trigo rociadas con un rango de concentraciones de
quinoxyfen. La EC50 de cada aislado fue calculada usando un análisis de probit. Para
validar las comparaciones entre años, se incluyeron aislados referencia estándar que
representan una población no tratada de inicios de los 1970. Los datos mostraron que
se presentaron diferencias entre años, con 1998 y 1999 mostrando un aparente
incremento en la sensibilidad como una los valores EC50 disminuyeron. Sin embargo,
también se presentaron diferencias en los aislados referencia, y así se pudo atribuir a
la variación experimental. Es claro que no hay desviación para los patrones de
sensibilidad vistos en comparación a los aislados referencia. Sin una consideración
cuidadosa de todos los datos y la inclusión de los aislados referencia, pudo haber sido
difícil entender que estaba sucediendo.
• En 1995, el año cuando se estableció la línea base, fueron tratadas una serie
de parcelas usando la acordada estrategia manejo de la resistencia. Los datos
mostraron claramente que el perfil de sensibilidad fue idéntico entre las dos
series de datos i.e., no se desarrollo resistencia como un resultado de la
estrategia de manejo.
• En 1996, el perfil de sensibilidad parece moverse a la izquierda, un posible
indicio de un desplazamiento a mayor sensibilidad. Sin embargo, mientras
que tal fenómeno no es imposible, su asocio con el tratamiento a fungicidas es
ilógico. Puede, por lo tanto, cualquiera ser un ejemplo de la variabilidad en
los procedimientos de experimentación de un año al siguiente ó un ejemplo de
verdaderos cambios en la sensibilidad en la población de un año a otro sin
influencia del tratamiento químico.
• En 1997 el perfil de sensibilidad mostró una aparente disminución en la
sensibilidad ya que la línea se movió a la derecha. Dese cuente, sin embargo,
que el valor máximo de IG50 no ha cambiado. Esto pudo haber sido
interpretado como un desplazamiento hacia una sensibilidad menor, pero
teniendo en mente la variabilidad vista en 1996 no fue considerado probable y
se pensó que se debía a la variabilidad natural en la población de B. cinerea.
Esto fue apoyado por observaciones en la eficacia del producto en el campo;
sin haberse observado problemas.
• Las conclusiones a partir de 1997 fueron apoyadas por los subsiguientes
monitoreos de datos para 1998, 1999, y 2000. Todas estas distribuciones
mostraron respuestas similares a la línea base de 1997 aunque hubo algo de
variación alrededor. De este modo no hubo razón para sospechar un cambio
en la sensibilidad.
Que puede estar preocupando si una imagen con patrón disruptivo emerge durante la
producción de la línea base antes de que el producto haya alcanzado el mercado. En
estas circunstancias pueden hacerse varias preguntas, la más importante de las
cuales es si ò no el segmento aparentemente resistente de la población es
verdaderamente resistente. Los ensayos adecuados deben ser diseñados para
responder a esta pregunta. Puede también suceder que el segmento aparentemente
resistente es de “resistencia intermedia” ò puede ser clasificada como “menos
sensible”. De nuevo, esto necesitara ser establecido.
Si el patrón de resistencia no es disruptivo sino continuo (Figura 15), puede ser más
difícil el hacer una demarcación entre las categorías sensibles y resistentes debido a
que los individuos en la población probablemente muestren un rango más amplio de
respuestas. Esto plantea una dificultad en la interpretación y clasificación de las
respuestas de los aislados que muestren crecimiento en el rango de 40-49% debido a
que tales aislados no son completamente sensibles pero, de acuerdo al criterio
establecido, no son resistentes. El ignorar su respuesta y registrarlos como
“sensibles” puede ser visto como el ignorar información valiosa debido a que ellos
pueden representar un indicio de un movimiento de toda la población hacia un
estado más resistente. Por esta razón puede ser valioso dividir el rango “sensible” en
divisiones ulteriores. Las subdivisiones luego se vuelven en ulteriores seudo-líneas
base y se puede obtener información valiosa al monitorear la evolución de esta
distribución en el tiempo.
Esto fue bien recibido por la industria pero planteo algunos problemas. Las
directivas publicadas no dieron guías al solicitante para registro sobre que
información era requerida para apoyar la aplicación y similarmente no dieron guías a
los reguladores sobre que información esperar, ni como interpretarla cuando se
suministre. Esta situación condujo a que se le pidiera a la European and
Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) que produjera una Pauta
para que la usen los solicitantes y reguladores a fin de ayudarles a construir el
expediente e interpretarlo respectivamente. Una revisión del proceso por el que se
produjo esta Pauta es dado por McNamara & Smith (2000). La Pauta ahora ha sido
revisada y extendida como un resultado de retroalimentación de la original. Ya que
el suministro de datos de una línea base de sensibilidad es una parte significante del
proceso, se presenta aquí un resumen de los requerimientos reguladores:
Tal vez el factor más importante a caer en cuenta es que la responsabilidad esta en el
solicitante para producir el análisis y para justificar las conclusiones y las estrategias
propuestas de manejo de la resistencia. El proceso requiere que el solicitante
considere varios aspectos que afecten el riesgo de usar el producto en un cultivo
particular para controlar una plaga particular bajo condiciones particulares. Si se
consideran los factores de riesgo si algún manejo de resistencia, entonces tiene que
proponerse y justificarse una estrategia de manejo. Los detalles completos sobre los
pasos involucrados están contenidos en la Pauta pero implican una evaluación de:
Riesgo inherente:
Este es un factor de riesgo que está generalmente más allá de nuestro control y aplica
a ambos la plaga a ser controlada y el riesgo del ingrediente activo. Muchos
patógenos e.g., mildeos polvosos de cereales, tizón tardío de la papa., moho gris (B.
cinerea) son bien conocidos por ser capaces de desarrollar rápidamente resistencia. La
introducción de un nuevo activo para su control automáticamente generará
preocupación. Para los nuevos activos en todas las disciplinas, pero especialmente
para el control de enfermedades de plantas, la historia ha mostrado como nosotros
debemos esperar un riesgo moderado a alto de desarrollo de resistencia en ausencia de
estrategias de manejo. Ya que muy pocos datos actuales pueden ser disponibles en el
momento del registro de un nuevo activo para una nueva química, debe ser prudente
considerar toda la nueva química que muestra un riesgo potencial de desarrollo de
resistencia. Estos factores de riesgo necesitan ser considerados y explicados en el
expediente de registro, extraídos de la experiencia histórica donde sea aplicable.
Riesgo agronómico
Modificadores
Los modificadores pueden considerarse como cualquier medio por el que el riesgo no
aceptable del uso no restringido del producto es reducido a un nivel aceptable. Ellos
incluyen:
• Reducir el número de aplicaciones del producto
• Vender el producto como una mezcla coformulada con una pareja sin
resistencia cruzada ó recomendar la aplicación de mezcla en el tanque con una
pareja sin resistencia cruzada.
• Recomendar programas específicos de aplicación que incluyan parejas sin
resistencia cruzada. Esto tiene varias formas:
o Recomendar alternancia con otros productos sin resistencia cruzada
o Recomendar restricciones en el número de aplicaciones consecutivas
(en bloques) con un nuevo producto
• Recomendar sincronizaciones específicas en la aplicación de la aspersión para
evitar excesiva presión de selección para la resistencia
• Cualquier combinación de las de arriba
Por supuesto, los diferentes modificadores pueden ser usados en diferentes ambientes
ó para el mismo sistema de plaga-cultivo, y no se espera que la misma estrategia
modificadora se aplique a todos los cultivos en que el producto será usado.
Datos de apoyo
APENDICE 1.
Una vez que se toma la decisión de establecer una línea base usando procedimientos
de bioensayo, se debe desarrollar una técnica apropiada para crear la línea base. La
técnica debe también ser apta de ser usada en las subsiguientes operaciones de
monitoreo que investiguen el posible desarrollo de resistencia. Si para cuando se
desarrolle la resistencia, es posible que se hayan desarrollado métodos más directos
en ese momento, sin embargo el mismo método podrá ser usado para identificar los
aislados tolerantes.
Experimentación in-vitro
Patógenos no obligados
Si los patógenos pueden ser cultivados fácilmente en agar artificial ú otro medio es
razonable para la investigación empezar basando en este medio los procedimientos
para el establecimiento de la dosis respuesta. La mayoría de las técnicas involucran
el uso de un medio de agar “sólido” ya que es fácil observar los parámetros de
crecimiento fungoso en la superficie, sin embargo son posibles técnicas usando medio
líquido. Sin embargo, no todos los hongos no obligados ó fungicidas son apropiados
para estas técnicas. Hongos como V. inaequalis pueden dar problemas debido a su
lento crecimiento mientras que también se debe tener cuidado de asegurarse que las
propiedades fisicoquímicas del fungicida sean apropiadas para obtener las
concentraciones requeridas del fungicida en el medio prueba. Donde los fungicidas
sean incorporados en agar ó en otro medio y la preparación tenga que ser esterilizada,
debe tenerse cuidado de asegurarse que el procedimiento de esterilización no afecte al
fungicida. El fungicida puede ser añadido antes del autoclave si es posible, de lo
contrario debe añadirse justo antes del inicio de la prueba usando las apropiadas
técnicas estériles. El medio de agar que contiene al fungicida puede ser preparado en
lotes grandes y almacenado antes de usarlo para verterlo en platos Petri prueba a
condición de que se hayan hecho pruebas para asegurar que los fungicidas no se
degrade en el almacenamiento. Cuando se use un lote que se haya almacenado este
debe ser mezclado eficientemente para asegurarse de la dispersión del fungicida en
todo el medio. El producir un lote de platos Petri que contengan el medio prueba y
su almacenamiento por más de siete días antes de su uso no es recomendable debido a
que es posible que el fungicida migre a través del agar y de este modo conduzca a
concentraciones falsas en las capas superficiales. Tal fenómeno se encontró para
prochloraz y PDA(no publicado).
Son posibles varias técnicas que incluyan la inhibición del crecimiento micelial,
ensayos de germinación de esporas, y ensayos de elongación del tubo germinativo.
La elección dependerá de las propiedades biológicas y físico-químicas del fungicida
acopladas con la información disponible sobre su modo fisiológico y/ó bioquímico de
acción. Por ejemplo, un ensayo de germinación de esporas no será aplicable para un
fungicida que no actúa en esta parte del ciclo de vida del hongo, un medio rico en
nutrientes no será la mejor elección para un patógeno que actúa por inhibición
enzimática si los nutrientes proporcionados en el medio evaden el modo de acción del
fungicida (por ejemplo pyrimethanil). Las condiciones específicas usadas en los
procedimientos prueba pueden solo ser determinadas por experimentación, con la
fundamental preocupación de ser repetible. A este punto puede también ser necesario
decidir si la línea base respuesta será establecida usando aislados individuales de
esporas ó con una población de esporas ó aislados de masas miceliales. Cada técnica
tiene sus partidarios y se pueden hacer argumentos científicos convincentes para
cada método. Es posible que las consideraciones prácticas conduzcan la selección de
la técnica.
Dese cuenta que los valores de sensibilidad obtenidos en las pruebas en placas de
agar pueden ser influenciados por el medio prueba. Un valor EC50 determinado en un
medio de agar puede no repetirse si se corre la misma prueba en otro medio.
Si a las esporas se les permite desarrollarse el ensayo puede estar basado en el micelio
resultante, en donde los datos del caso pueden estar basados en ensayos de
crecimiento radial. Para aislados de masas miceliales, el método normal involucrara
la evaluación del % de inhibición del crecimiento micelial comparado al hongo
cultivado en ausencia del fungicida prueba. Las mediciones del crecimiento son
normalmente hechas en diámetros de dos colonias a ángulos rectos entre cada una y
se calcula el radio promedio por colonia. Si el inóculo es un plug micelial a partir de
una placa no tratada, este debe ser ubicado con la superficie micelial hacia abajo
para asegurar el contacto con el medio prueba. Debe hacerse el examen del plug
antes de tomar cualquier medición para asegurarse que el crecimiento fungoso que
está siendo registrado esta creciendo actualmente en el medio prueba y no en el techo
del plug “invertido”:
Patógenos obligados
Para patógenos obligados la experimentación in-vitro está restringida a las
observaciones en esporas, excepto el caso de Phytophthora infestans donde las pruebas
de crecimiento micelial son posibles.
Experimentación in vivo
Los procedimientos in vivo serán necesarios para esos patógenos obligados para los
que es imposible idear un procedimiento prueba in-vitro. Puede también ser deseable
usar procedimientos in-vivo para patógenos no obligados si el uso de técnicas in-vitro
es considerado inapropiado.
En general, el uso de técnicas in-vivo es más fácil para patógenos no obligados que
para patógenos obligados debido a que el transporte, almacenamiento y la
subsiguiente preparación de las muestras antes de la prueba no involucran el uso de
plantas vivas. Las muestras pueden ser aptas de ser transportadas y almacenadas
como lesiones en material vegetal seco ó, subsiguiente al aislamiento en medio
artificial, almacenadas como cultivos hasta que se requieran para la experimentación.
Parámetros de evaluación
Los valores MIC son obtenidos directamente a partir de las evaluaciones de la dosis
de aplicación con el debido cuidado de conducir las pruebas con la replicación
adecuada para reducir el error experimental. Los valores EC50 ó EC90 pueden ser
determinados a partir de los datos de las respuestas a las dosis de aplicación
mediante la aproximación estadística (recomendado) ó mediante el uso de una
representación gráfica y la estimación del 50% ó 90% de puntos a partir de la gráfica.
Cualquier método que sea usado debe tenerse cuidado de asegurarse de que el
estimado sea razonable; el uso de un valor estimado EC50 ó EC90 que caiga fuera del
rango de dosis usado seguramente no será recomendado, particularmente cuando las
dosis de aplicación están en una escala logarítmica.
APÉNDICE 2
Cómo estas connotaciones pueden ser ilustradas por los siguientes sencillos ejemplos:
En esta situación la probabilidad de declarar que todos los 50 aislados son sensibles,
i.e., no encontrar ninguna resistencia, es de: 0.9950 = 60.5%
La Tabla muestra que cuando la resistencia está a un nivel bajo es muy difícil
detectarla sin tamaños de muestra grandes. Sin embargo, tales situaciones pueden
ser evitadas al usar muestras reunidas. En estos casos, los no son probados
individualmente sino probados como poblaciones que contienen muchas esporas. Lo
racional detrás de esto es que en una muestra de 100 esporas, si ellas son probadas
juntas como una muestra individual, si solo una de ellas es resistente la prueba puede
dar un resultado positivo. La experimentación de varias muestras en masa
incrementa de este modo en gran parte las posibilidades de detectar la resistencia.
Tal proceso no dará una medida absoluta de la frecuencia de la resistencia en la
población en un punto individual en el tiempo pero puede ser usado para medir su
desarrollo en el tiempo.
APENDICE 3
RIESGOS Y ERRORES
Los siguientes comentarios son a partir de la experiencia del autor y son dados como
una guía para cualquier individuo ó laboratorio que pretenda establecer una línea
base y las subsiguiente campaña de monitoreo de la sensibilidad.
Desviación de un protocolo
Entre más sencillo el método, será el mejor, a condición de que genere datos
confiables. Pero tenga cuidado. Recuerde que los métodos puedan ser copiados por
otros laboratorios ó tal vez está usted copiando un método usted mismo. Considera
que cualquier desviación del método establecido puede producir cambios en un perfil
de datos y conducir a conclusiones falsas, e.g., la declaración de un cambio en la
sensibilidad cuando nada ha ocurrido ó aún una declaración de no cambio cuando ha
sucedido en realidad el cambio. Como ejemplo, muchos métodos in vitro usan PDA
para medio de crecimiento. Hay muchas fuentes de PDA, variando desde polvos
disponibles comercialmente hasta recetas diseñadas para permitir al científico
preparar medios a partir de papa y agar. El perfil de sensibilidad de un hongo
probado en una forma de PDA probablemente diferirá de aquel derivado a partir de
pruebas en otra forma. Esto puede suceder muy frecuentemente cuando el PDA se
ha hecho in situ a partir de ingredientes al natural. Tal practica producir medios de
diferentes estados nutricionales que se traducirán en variabilidad en los niveles de
respuesta sensibilidad entre lotes del medio. Esta mejor definir un medio particular
pre-preparado e.g., Oxoid ó Difco y usarlo para todas las pruebas.
En contra de lo que pueda parecer, esto puede suceder. La experiencia muestra que
es mejor tener todo el trabajo conducido por el mismo técnico ó científico, ó grupos
del mismo, tanto como sea posible. Las diferencias en los resultados no pueden ser
tan grandes como aquellas creadas por una desviación a partir de los protocolos
establecidos, pero pueden ser suficientes para causar preocupación. Es difícil explicar
el por que estas diferencias se presentan. Ellas son más probablemente debidas a
ligeras diferencias en la interpretación de un protocolo y de los procedimientos
experimentales. Ellas pueden ser controladas al usar los aislados referencia estándar
y, donde sea posible, un periodo de trabajo en grupo de tal forma que tales
diferencias puedan ser identificadas y corregidas.
Esta es una extensión de los puntos dados arriba. Hay una equivocación común de
que un laboratorio puede dedicarse a un ejercicio de monitoreo de la resistencia y
usar otras líneas base publicadas por otros laboratorios. Tal procedimiento es
altamente peligroso y es casi seguro que conduzca a conclusiones faltas. Debido a las
diferencias en la interpretación de los procedimientos prueba, las diferencias en las
condiciones del laboratorio y los procedimientos de evaluación, tal vez aún las
diferencias en los datos obtenidos del fungicida prueba (ingrediente activo ó
producto formulado) pueden no ser parte de la población de datos que han sido
publicados. El único modo de evitar problemas es generar una línea base para un
laboratorio particular ó intercambiar aislados referencia de tal forma que los
laboratorios individuales puedan usar la “unión de datos” para permitir
comparaciones validas.
Un ejemplo de los problemas que pueden presentarse es dado para un estudio hecho
para la evaluación de la sensibilidad de Tapesia spp. al prochloraz para los entonces
Schering Agrochemicals. Tomaron parte cuatro centros de investigación en el estudio:
Schering Agrochemicals en Chesterford Park, Plant Breeding Institute (antes de
comercialización), IACR-Rothamsted y ADAS. Cada organización proporciono seis
aislados de Tapesia spp. para la experimentación en todos los laboratorios. Se acordó
un protocolo estándar y se suministraron todos los materiales prueba a partir de un
lote común. En teoría todos los laboratorios debían haber producido resultados
idénticos, haciéndose la debida concesión a variación experimental. Este no fue el
caso. Cuando los datos fueron reunidos y analizados fue claro que había diferencias
numéricas significantes en los valores de sensibilidad encontrados entre laboratorios.
Sin embargo, la clasificación de los aislados fue la misma independiente del
laboratorio. La prueba también uso tres diferentes medios de prueba: PDA, agar
malta y Czapek Dox. Se encontraron grandes diferencias en los valores de
sensibilidad generados para estos medios. Los aislados fungosos fueron
(numéricamente) más sensibles cuando se probaron con Czapek Dox y menos
sensibles cuando se probaron en agar malta. Los datos para PDA estaban en la
mitad de estos extremos.
La lección era clara: era poco fiable usar los datos de sensibilidad generados a partir
de un laboratorio para compararlos con los datos de línea base generados por otro
laboratorio, pero las decisiones sobre la sensibilidad relativa de los aislados probados
dentro de un laboratorio individual fueron validas y consistentes entre los
laboratorios.
Cuando sea posible, las investigaciones deben ser ejecutadas para que aseguren que
los métodos usados in vitro se correlacionen bien con las pruebas hechas en plantas.
N. del T. Este artículo fue publicado de manera libre por la FRAC, y no es el interés
ocasionarle daño a los autores ó a esa institución. Esto es un mero hobbie… ESTO
NO ESTA REVISADO POR NADIE, ojo con eso….
http://geocities.com/minnanonokogaku/