Traduo do Artigo Deteco rpida e simples de um antgeno mycobacterium circulantes no soro de pacientes com tuberculose pulmonar usando um anticorpo

monoclonal e Fast-DotELISA

Abstrato objetivos: Imunoensaios vrias foram estabelecidas para a deteco de Mycobacterium tuberculosis (MTB) antgenos em soro, saliva e lquido cefalorraquidiano dos doentes tuberculosos utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais levantadas contra diferentes antgenos de micobactrias. Alguns destes ensaios exibir tanto alta sensibilidade e especificidade para a deteco destes antgenos. No entanto, esses ensaios requerem equipamentos especiais e altamente caro e os procedimentos exigem longos perodos para a sua concluso. Assim, a justificativa deste estudo foi estabelecer e avaliar Fast-Dot-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (FD-ELISA), como um teste rpido, barato e de campo aplicveis para a deteco de antgeno de micobactria em soro de pacientes com TB pulmonar. Projetos e mtodos: Este estudo incluiu trs grupos: grupo I: 175 pacientes com TB pulmonar tuberculosa prova com expectorao Ziehl-Neelsen (ZN) para BAAR e cultura de escarro (todos os casos foram cultura positiva para MTB), Grupo II: 65 pacientes com outras doenas de TB pulmonar, carcinoma brnquico (17 pacientes), asma brnquica (29 pacientes) e doena pulmonar obstrutiva crnica (19 pacientes), grupo III: 50 indivduos saudveis. Grupos II e III serviu como grupo controle negativo. O alvo antgeno mycobacterium foi identificado em ambos os antgenos extrato bruto mycobacterium e soro de pacientes com TB pulmonar, utilizando a tcnica de blotting ocidental e anti-TB anticorpo monoclonal (mAb-TB20) e, em seguida, estimou-se nas amostras de soro de todos os grupos estudados como um ndice de tuberculose, com um recm-desenvolvido FDELISA. resultados: O alvo antgeno mycobacterium foi identificado em 20 kDa de massa molecular em bruto antgenos mycobacterium extrato, assim como no soro de pacientes com TB pulmonar. Desenvolvidos FD-ELISA detectado o antgeno mycobacterium no soro de 159 dos 175 pacientes com TB pulmonar, com uma sensibilidade de 90,8% e 93,0% de valor preditivo positivo (VPP). Alm disso, identificou 12 casos de falso fracamente positivo de 115 amostras de grupos de controle negativos (7 de 65 TB no-pacientes e 5 de 50 indivduos saudveis) com uma especificidade de 89,6% e 86,6% de valor preditivo negativo (VPN). Padronizao da FD-ELISA utilizando uma diluio em srie do antgeno purificado mycobacterium indicou que o teste foi capaz de detectar 1,8 mg / ml como uma menor concentrao de antgeno detectvel.

concluses: A recm-desenvolvida FD-ELISA um ensaio simples, rpido e altamente sensvel para a deteco de antgeno micobactria em pacientes com TB pulmonar. Alm disso, todas as etapas foram realizadas temperatura ambiente e sem a necessidade de utilizar equipamentos caros, e isso pode melhorar a aplicao deste teste em programas de rastreio de tuberculose. Mais estudos so necessrios para confirmao da FD-ELISA reprodutibilidade luz pacientes infectados TB pulmonar e em uma grande populao. Palavras-chave: tuberculose pulmonar; antgeno TB; anticorpo monoclonal; blotting ocidental; Dot-ELISA introduo Tuberculose (TB) continua sendo uma das doenas mais mortais do mundo. No ano de 2007, a Organizao Mundial de Sade (OMS) informou que, embora a taxa na qual as pessoas desenvolveram TB em 2005 foi de nvel ou mesmo diminudo ligeiramente em relao a 2004, o nmero real de casos de tuberculose continuou a aumentar lentamente. A razo para esta diferena que a populao mundial est se expandindo. O ritmo em que novos casos de tuberculose desenvolvido em 2005, entretanto, foi ligeiramente inferior ao crescimento da populao global. O nmero de casos em 2005 foi de 8.787.000, ante 8.718.000 em 2004. Estima-se que 1,6 milho de pessoas morreram da doena em 2005 [1]. O diagnstico padro de tuberculose ainda depende da deteco de BAAR por baciloscopia (Ziehl-Neelsen) e cultura de MTB na mdia apropriada. No entanto, a tuberculose nem sempre apresentam os sinais clssicos radiolgicos que permitem um diagnstico fcil, especialmente em casos extra-pulmonares. Os mtodos laboratoriais tradicionais utilizados para complementao de diagnstico tm os seus limites, como a baixa sensibilidade da mancha-cido nos pacientes paucibacilares, o tempo necessrio para o cultivo (6-8 semanas), com crescimento indetectvel em apenas 10% a 20% do casos e os altos custos envolvidos em mtodos de deteco molecular, como PCR [2], [3] e [4]. Por isso, esforos tm sido feitos para encontrar melhor diagnstico e campo de procedimentos aplicveis. Muitos estudos tm se concentrado na deteco de anticorpos especficos para antgenos MTB diferentes que indicam doena ativa. Como um teste sorolgico rpido deve ser econmico e bem-sucedida nos casos em que os mtodos clssicos no so suficientes. De acordo com as recomendaes da OMS, para substituir o "padro ouro", a cultura bacteriana, um teste sorolgico deve possuir uma sensibilidade de mais de 80% e especificidade de mais de 95% [5]. Nas tentativas de desenvolver um teste sorolgico, antgenos de micobactrias, como 38 kDa [6], o antgeno de 30 kDa [7], 16 kDa [8], LAM [9], A60 [10], Mtb81 [11] e 55 kDa [12] tm sido caracterizadas, purificadas e independentemente testado com soros obtidos de pacientes com tuberculose. No muito tempo atrs, a pesquisa focada em baixo peso molecular-antgenos que so especficas e potencialmente til para o diagnstico da tuberculose, tais como os antgenos, 23/24 kDa, 19 kDa, 14 kDa (16 kDa); Mtb 8 e ESAT- 6 (de 6 kDa MW antgeno secretado) [13] e [14]. A deteco de antgenos circulantes mycobacterium utilizando anticorpos monoclonais especficos (mAbs) tem demonstrado ser uma abordagem promissora para a deteco de

infeco ativa. Muitos dos ensaios baseados na deteco de antgeno exibir tanto as especificidades alta e alta sensibilidade [12], [15], [16], [17] e [18]. No entanto, requerem equipamentos especiais e altamente caro, e os procedimentos exigem longos perodos de tempo para a sua concluso para que eles no podem ser facilmente adaptadas para uso em campo. O ensaio de dot immunobinding, um tipo de teste de imunodiagnstico, est se tornando amplamente utilizado em aplicaes simples em pesquisas qualitativas e j foi relatado para uso na deteco de tuberculose [12] e [19]. Uma srie de modificaes tm sido descritos em esforos para produzir um formato de ensaio mais campo-aplicvel. No presente estudo, procurou-se estabelecer uma FD-ELISA para deteco de baixo peso molecular do antgeno mycobacterium no soro de pacientes com tuberculose pulmonar utilizando anticorpos anti-TB pulmonar monoclonal (TB20-mAb). A sensibilidade do FD-ELISA foi avaliado com amostras de pacientes com TB pulmonar comprovada cultura, ea especificidade foi avaliado com amostras de indivduos notuberculosa. Materiais e mtodos populao de estudo soros humanos Todas as amostras foram coletadas aps obteno do consentimento informado dos pacientes. (a) pacientes. 175 pacientes com diagnstico confirmado de tuberculose pulmonar no Hospital Universitrio Mansoura foram selecionados para o estudo. Cinqenta e cinco pacientes foram esfregao e cultura positiva para BAAR e 120 pacientes com baciloscopia positiva foram negativos e cultura. A idade mdia dos pacientes foi de 37 anos (intervalo: 18-73 anos). Todos os pacientes apresentaram quadros clnicos e radiolgicos suspeitos de TB pulmonar como unilateral ou bilateral infiltrados pulmonares, com ou sem cavidades pulmonares. (b) os grupos de controle. No-tuberculosa pacientes (grupo controle) includos soros de 65 pacientes com outras doenas pulmonares como pacientes com carcinoma brnquica (n = 17) diagnosticada clinicamente, radiolgico e fibroptic broncoscpio, pacientes com asma brnquica (n = 29) diagnosticada clinicamente, radiolgico e espirometria e crnica doena pulmonar obstrutiva crnica (DPOC) pacientes (n = 19). Outro grupo controle que incluiu soros de doadores de sangue saudveis (n = 50), sem sintomas prvios da doena pulmonar foi utilizado. O grupo controle saudvel foi documentada por um exame geral de sade. Radiografias seu peito estavam normais, sem sintomas respiratrios foram indicados. Micobactrias A cepa MTB empregado neste estudo foi isolado de uma amostra de escarro obtido de um paciente com tuberculose. As bactrias foram cultivadas em meio LwensteinJensen, a 37 C por 30 dias. Confirmao das espcies foi realizada utilizando ensaios microbiolgicos. Bactrias cultivadas em meio Lwenstein-Jensen foram inoculadas em

meio lquido Sauton. Aps a incubao a 37 C durante 5 semanas, a suspenso bacteriana foi transferida para um frasco de 1 litro contendo 250 ml de Sauton meio lquido e incubados a 37 C por mais 10 semanas, sem agitar. Antgenos brutos mycobacterium extrair Aproximadamente 2,0 g de bactrias molhada foi colhido por centrifugao a partir da superfcie da cultura lquido, lavadas e ressuspendidas em tampo fosfato salino pH (PBS) contendo 7,4 fenil-metil-sulfxido de fluoreto (PMSF), etileno-diamino-tetracido actico (EDTA) e dithiothertol (TDT) nas concentraes finais de 1 mM cada um. Os bacilos foram submetidos a sonicao por 1 hora a 80 Hz, usando um celular Vibra TM sonicador 72.405 (bioblock Cientfica) no gelo e, posteriormente, centrifugado a 10.000 g por 30 min a 4 C. Protenas foram precipitadas pela adio de sulfato de amnio (80% de concentrao final) para o sobrenadante e ressuspenso em soluo salina aps centrifugao a 10.000 g por 30 min a 4 C. Aps dilise por 24 h contra fisiolgica, usando um saco de dilise (Sigma) com um corte de 12-14 kDa, o teor de protena foi determinada pelo mtodo de Lowry et al. [20].

TB-anticorpo monoclonal (TB20-mAb) Um anticorpo monoclonal anti-MTB (TB20-mAb) foi gerado pelo estabelecimento de rato hibridoma. Em resumo, as fmeas puras camundongos BALB / c foram imunizados com suspenso de MTB. A fuso foi feito com clulas do bao dos animais imunizados e P3-X63-AG8-U1 clulas de mieloma mouse. Hibridomas foram selecionados para anticorpos contra antgenos bacterianos TB bruto por ELISA indireto. Uma das linhas de clulas altamente reativos (TB20-mAb) foi injetado via intraperitoneal em camundongos BALB / c e ascite foram coletadas, centrifugadas para remover os detritos e armazenado a - 20 C at o uso.

SDS poliacrilamida-eletroforese em gel (SDS-PAGE) Cinqenta microgramas por via de extrato bruto TB mycobacterium e diludo amostras de soro de ambos os pacientes com TB pulmonar e indivduo saudvel foram carregados em gel de poliacrilamida 12% verticais de placas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acordo com o mtodo de Laemmli [21]. Gis foram corados com colorao de prata de acordo com o mtodo de Morrissey [22]. Marcador de peso molecular Prestained na faixa 14,0-94,0 kDa foi usado (Sigma).

Western blot A SDS-PAGE-fracionada extrair mycobacterium e soro de ambos os pacientes MTB indivduo saudvel e foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose (NC) (0,45 mM, Sigma), conforme descrito por Towbin et al. [23]. Eficincia de transferncia foi monitorada, verificando a presena de bandas prestained baixo peso molecular marcador na membrana. Aps a transferncia, a membrana foi bloqueada por 2 h em 0,05% PBS / Tween (PBS-T20) que contenha 2% de leite desnatado em um shaker,

lavados em PBS-T20 e corte em tiras de 5 milmetros de largura. As tiras foram incubadas em diludo TB20-mAb (1 / 100 em PBS-T20) por 18 horas a 4 C com agitao. Aps lavagens adicionais, as manchas foram incubadas por 2 h temperatura ambiente com anti-mouse IgG conjugado com fosfatase alcalina (1 / 500 em tampo de bloqueio) com agitao. Depois de mais um ciclo de lavagem, as manchas foram desenvolvidos, adicionando duas ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato-Nitro Blue Tetrazolium (BCIP-NBT) soluo de substrato pr-misturado (Sigma). Lavar o blot em gua destilada a reao parou. Ento o filtro foi seco e mantidas no escuro. Todas as incubaes foram realizadas sob agitao constante.

Cromatografia de afinidade Colunas de imunoafinidade foram preparados pela ligao covalente do TB20-mAb aos grnulos sepharose (CNBR ativado sepharose 4B; Pharmacia, Uppsala, Sucia), como descrito por Cuatrecasas [24]. Imunoafinidade purificao do antgeno mycobacterium foi conseguido da seguinte forma: 5 mg extrato bruto mycobacterium foi exposto a TB20-mAb contas durante a noite com agitao constante a 4 C eo material no ligado foi removido. Aps a lavagem com 10 volumes de coluna de PBS pH 7,2, o material ligado foi eluda com 0,1 M tampo glicina pH 2,4 e dialisado contra PBS pH 7,2 por 24 h. O teor de protena foi medida pelo mtodo de Lowry [20], em seguida, liofilizado e armazenado a - 20 C at sua utilizao. FD-ELISA O FD-ELISA foi realizada utilizando um Manifold Hybri-Dot (Bethesda Research Laboratories, Richmond, CA) para deteco de antgeno de MTB no soro de pacientes com o grupo MTB pulmonar e amostras de soro dos grupos controle negativo (pacientes no-MTB pulmo e saudvel indivduos), de acordo com os mtodos descritos por Attallah et al. [12] com algumas modificaes. Em primeiro lugar, o filtro NC (Sigma) foi lavado em um banho de gua destilada e embebidas em um banho de PBS, para cada 1 min. Ento, o filtro de NC foi sobreposto em um papel de filtro presoaked em PBS e mantidos no coletor. Cinquenta microlitros de uma amostra de soro diludo (1 / 100) em PBS foi adicionado a cada poo, e depois de suco, o filtro de NC foi lavado em 0,3% PBS-T20 por 1 min em um agitador. Bloqueio de stios de ligao inespecfica no filtro foi feito com 2% de leite desnatado em PBS-T20 por 15 min em um agitador. Aps a remoo da soluo de bloqueio, o TB20-mAb foi adicionado em uma diluio de 1 / 100 em PBS-T20 por 5 min com agitao contnua. Aps lavagem em PBS-T20 por 2 min, anti-IgG de rato conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) foi adicionado na diluio de 1 / 500 em tampo de bloqueio por 5 min com agitao contnua. O filtro foi lavado com PBS-T20 por 2 min. Um produto insolvel roxo foi desenvolvido aps a adio da soluo de substrato NBT-BCIP pr-misturado (Sigma) por cerca de 2 min. A reao foi interrompida com gua destilada, eo filtro foi seco e mantidas no escuro. Controle positivo para o ensaio foi o antgeno purificado do mycobacterium. Controles negativos foram reagentes em branco e albumina de soro bovino (BSA) como uma protena no-especfica. FD-ELISA permite uma leitura semi-quantitativa da mancha

colorida, resultando em caso de deteco de antgeno (ou seja, um resultado positivo do teste). A cor prpura que foi produzido variadas em sua intensidade de fraca a forte. Controles positivos com estas intensidades de cores diferentes foram utilizados. Um ponto incolor foi produzido, no caso de um resultado negativo do teste. A cor resultante para a amostra testada foi ento comparada e relacionada com a cor de um dos controles positivos e negativos a olho nu.

Resultados Identificao do antgeno mycobacterium usando TB20-mAb O alvo antgeno mycobacterium foi detectado e identificado no extrato bruto e mycobacterium em amostras de soro de pacientes com tuberculose pulmonar, utilizando TB20-mAb pela tcnica de Western blotting. Uma amostra de soro de indivduos saudveis foi usado como controle negativo. Todas as amostras foram resolvidos em gel de poliacrilamida 12% e corados com colorao pela prata (Fig. 1, faixas 1, 2, 3). Os polipeptdeos separados foram electrotransferred em um filtro de NC e da imunorreao foi realizada utilizando-TB20-mAb e alcalina fosfatase imunocolorao. O resultado mostrou que uma banda, afiada e intensa immuoreactive foi observado em uma massa molecular de 20 kDa no extrato bruto mycobacterium, bem como no soro de pacientes com MTB pulmonar e nenhuma reao foi observada no soro de indivduos saudveis, como mostrado na fig. 1 (faixas 4, 5, 6, respectivamente).

Fig. 1. Sliver gis de poliacrilamida corados (12%), mostrando prestained marcadores de peso molecular padro (lane St), extrato bruto antgenos micobacterianos (pista 1), soro de paciente com tuberculose pulmonar (pista 2) e soro de indivduos saudveis (faixa 3). Western blotting anlise para identificao de TB20-mAb antgeno alvo no extrato bruto antgenos micobacterianos (faixa 4), soro de paciente com tuberculose pulmonar (faixa 5) e soro de indivduos saudveis como controle negativo (faixa 6). Immunoblotting foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal diludo (TB20-mAb). A ligao do TB20-mAb foi detectada usando uma cabra diludo anti-mouse IgGfosfatase alcalina conjugada e NBT / BCIP sistema de substrato. FD-ELISA para deteco de antgeno de Mycobacterium Em contraste com a convencional bacteriolgicos e outros mtodos imunolgicos clssica, o FD-ELISA necessrios apenas 30 minutos para executar em laboratrio, sem a necessidade de usar qualquer equipamento caro. Padronizao da FD-ELISA utilizando uma diluio da srie do antgeno purificado do Mycobacterium indicou que o teste foi capaz de detectar 1,8 mg / ml como a menor concentrao de antgeno detectvel (Fig. 3).

Fig. 3. Fast-dot-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (FD-ELISA) para anlises de concentraes de srie do purificadas por afinidade antgeno TB para determinar o limite mnimo de deteco utilizando TB20-mAb imunocolorao e fosfatase alcalina. Observou-se que FD-ELISA foi capaz de detectar at 1,8 mg / ml de antgeno TB. Amostras de soro de 175 pacientes com TB pulmonar, 65 pacientes no-tuberculosa de pulmo (17 carcinoma brnquica, asma brnquica 29 e 19 pacientes com DPOC) e de 50 indivduos saudveis, serviram como controle negativo, foram submetidos a FDELISA para deteco de antgeno mycobacterium usando TB20-mAb. O resultado mostrou diferentes graus de positividade para o antgeno mycobacterium acordo com a intensidade da cor blot comparao com fundo branco dos controlos negativos, como mostrado na figura. 4. Os resultados FD-ELISA foram classificados, de acordo com a leitura visual das manchas coloridas, em: (++++), (+++), (++), (+) e negativo (fundo branco), de acordo com a concentrao de antgenos de micobactrias nas amostras de soro como mostrado na figura. 4 e Tabela 1. Os dados FD-ELISA mostrou que o teste detectou 159 de 175 pacientes com TB pulmonar com sensibilidade de 90,8% e 93,0% de valor preditivo positivo (VPP). Em grupos controle negativo, o FD-ELISA detectou sete casos de falso fracamente positivo em 65 pacientes no-tuberculosa de pulmo (3.0 de 17 pacientes com carcinoma brnquico, 3 dos 29 pacientes com asma brnquica e 1.0 de 19 pacientes com DPOC) . No grupo de indivduos saudveis, o controle, o ensaio detectados cinco casos de falso fracamente positivo de 50 indivduos saudveis, estes resultados revelaram uma especificidade 89,6% e 86,6% de valor preditivo negativo (VPN). A eficincia global do FD-ELISA para deteco de antgeno de MTB foi 90,3% (Tabela 1 e Tabela 2).

Fig. 4. Triagem aleatria de pacientes com tuberculose pulmonar utilizando FD-ELISA tcnica e TB20-mAb para a deteco de antgeno de micobactrias em diferentes amostras de soro. O ensaio permite uma leitura semi-quantitativa; pontos fracos (1 + ou 2 + intensidade de cor) so considerados pontos fracamente positivo e escuras (3 + ou 4 + intensidade de cor) so considerados muito positivos. H1 local representa o antgeno purificado TB (controle positivo). Spots forma H2 a H7 representam os controles negativos (H2 para um branco do reagente, H3 para soro albumina bovina como uma protena no-especfica, H4 e H5 para amostras de soro formar duas individuais de controle saudvel, H6 e H7 para amostras de soro de duas organizaes no-tuberculosa

pacientes do pulmo). O resto da placa ilustra diferentes amostras de soro de vrios pacientes com TB pulmonar. Tabela 1. Semi-quantitativo do antignio estimativa mycobacterium utilizando FD-ELIS

Studied groups

Negative cases

Positive cases

Semi-quantitative detection of TB antigen color intensity 1+ 2+ 3+ 4+ 30 (17.1%) 39 (22.3%) 56 (32.0%) 34 (19.4%) 2 (3.1%) 0 0 0 0 0

Group 1 (n = 16 (9.2%) 175)a

159 (90.8%)

Group 2 (n = 58 (89.2%) 7 (10.8%) 5 (7.7%) 65)b Group 3 (n = 45 (90.0%) 5 (10%) 50)c 5 (10%)

(1 +, 2 + intensidade de cor) so considerados fracamente positivo, enquanto que (3 +, 4 + intensidade de cor) so considerados muito positivos. um Pulmonar Mycobacterium tuberculosis grupo de pacientes. b Non-Mycobacterium tuberculosis de pulmo grupo de pacientes. c grupo de indivduo saudvel (grupo controle negativo). Tabela 2. Avaliao de FD-ELISA para deteco de antgeno alvo 20 kDa MTB

Assay FDELISA

Sensitivity (%) 159 / [159 + 16] 90.8%

Specificity 103 / [103 + 12] 89.6%

PPV (%)

NPV (%)

Efficiency (%) [159 + 103] / 290 90.3%

159 / [159 + 103 / [103 + 12] 16] 93.0% 86.6%

Sensibilidade = nmero true / positivo (nmero real positivo + nmero falso negativo). Especificidade = nmero verdadeiro negativo / (nmero de verdadeiros negativos + nmero falsos positivos). Valor preditivo positivo (VPP) = nmero true / positivo (nmero real positivo + nmero falsos positivo). valor preditivo negativo (VPN) = nmero true / negativo (nmero de verdadeiros negativos + nmero falsos negativos) Eficincia. = (nmero de verdadeiros positivos + nmero real negativo) / nmero total. Discusso Porque os mtodos convencionais de diagnstico so baixas na sensibilidade demorado, ou ambos, o diagnstico presuntivo de doenas mycobacterium geralmente baseada nos achados clnicos, tais como persistente tosse, febre e perda de peso. Embora teste tuberculnico e achados radiolgicos podem ajudar, o diagnstico deve ser confirmado

pelo isolamento e identificao do agente etiolgico [25]. A micobactria ensaios de deteco de antgeno so promissores nesse sentido. Os resultados preliminares foram publicados sobre os testes de diagnstico para a tuberculose com base na deteco de antgenos de mycobacterium no lquido cefalorraquidiano [19], [26] e [27], o soro [12], [28] e [29] escarro e [30] e [31]. Os autores relataram taxas de sensibilidade de 45% para 88% e especificidade de 91% a 100%. No entanto, desde ento, pouco tem sido publicado sobre este assunto, sugerindo que estes testes no fez jus sua promessa original. Qualquer teste que para substituir microscopia direta ou cultura bacteriana deve oferecer vantagens em termos de velocidade e facilidade de uso e de preferncia ter uma maior sensibilidade. Em reas de alta prevalncia de tuberculose, a maior necessidade para novas ferramentas de diagnstico que resultam em reduo da carga de trabalho de laboratrio. A deteco de antgenos circulantes mycobacterium utilizando anticorpos monoclonais especficos (mAbs) tem demonstrado ser uma abordagem promissora para a deteco da infeco TB ativa [12], [15], [16], [17] e [18]. Um anticorpo monoclonal (MAbIII604) especfico para TB fenlicos glicolipdeo (PGL-TB), um antgeno de M. tuberculosis especfico, foi produzido por Cho et al. [16] e utilizado na deteco do antgeno. MAbIII604 reagiu com o antgeno PGL-TB, mas no com glicolipdeos fenlicos outros M. leprae, M. bovis e M. kansasii, indicando a especificidade do anticorpo monoclonal para PGL-TB [16]. Cummings et al. [18] produziu um murino de anticorpos monoclonais contra M. tuberculosis, um anticorpo monoclonal, HB28, demonstrou alto nvel de reatividade especfica para M. tuberculosis. Ocidental blot demonstraram reatividade a uma nica protena de 65 kDa tuberculose M. na parede celular extrair e filtrado de cultura, HB28 mAb parece reconhecer uma protena 65 kDa de M. tuberculosis, que abundante por M. tuberculosis, mas no com outras espcies nas condio determinada cultura. Attallah et al. [12] produziu um anticorpo monoclonal IgG (TB-55 mAb) desenvolvido contra um antgeno 55 kDa nico no soro de TB pulmonar como determinado por SDS-PAGE e Western blotting. No presente estudo, uma IgG anticorpo monoclonal designado como TB20-mAb desenvolvidos contra um antgeno reconhecido MTB 20 kDa nico em soros de pacientes com TB pulmonar, bem como no extrato bruto mycobacterium conforme determinado por SDS-PAGE e tcnica de blotting ocidental, de modo que o TB20-mAb pode ser usado como uma sonda para diagnstico sorolgico de pacientes com TB pulmonar infectado. Ns estabelecemos FD-ELISA como um rpido, sensvel, ensaio, especficas de imunodiagnstico para a deteco de pacientes com tuberculose pulmonar. Esta tcnica baseia-se principalmente na deteco de um antgeno 20 kDa mycobacterium no soro de pacientes com tuberculose pulmonar utilizando IgG de rato TB20-mAb. Desenvolvidos FD-ELISA mostrou maior sensibilidade, especificidade e acurcia geral (90,8% e 89,6%, 90,3%, respectivamente) para a deteco do antgeno mycobacterium. Attallah et al. [12] descreveram dot-ELISA para deteco de um maior peso molecular (55,0 kDa) antgeno TB usando TB-55 anticorpo monoclonal, o seu ensaio mostrou sensibilidade de 90% para a deteco deste antgeno no soro de indivduos com TB extra-pulmonar e 87 % de sensibilidade em soros de indivduos com TB pulmonar, com uma especificidade de 97% entre os indivduos de controle [12].

A deteco de antgeno de 20 TB kDa pelo nosso ensaio desenvolvido deu especificidade satisfatria (89,6%) quando comparado com os valores de especificidade obtidos em outros estudos com outros antgenos, como A60 (88,4%), 55 kDa (97%), 38 kDa (95 %), 16 kDa (100%) e 12 kDa (97%) [12], [32], [33] e [34]. Os casos de falsos positivos mostraram pelo grupo de controle pode ser explicado como esses pacientes podem infectar com algumas bactrias carregando alguns antgenos que compartilharam antigenicidade semelhante com TB20. O limite inferior de deteco para o desenvolvimento FD-ELISA foi at 1,8 mg / ml utilizando uma diluio em srie da afinidade antgeno mycobacterium purificada (20 kDa). Mastrioanni et al. [35] aplicaram um mtodo dot blot em seu estudo de 38 pacientes com MTB. Eles usaram anti-M. bovis BCG anticorpos em seu estudo e sua anlise detectou antgenos de micobactrias em uma concentrao de 100 ng / ml [35]. Desenvolvidos FD-ELISA estabelecida em nosso laboratrio um rpido, barato, sensvel e especfico para o diagnstico sorolgico da tuberculose pulmonar. Mais importante, ele pode ser facilmente realizado em um laboratrio de rotina clnica e no exige equipamentos sofisticados. Os aspectos tcnicos do ensaio pode ser realizado de maneira muito simples e um grande nmero de amostras de soro (96 amostras de soro) podem ser executados em cerca de 30 min apenas. Alm disso, todas as medidas foram feitas temperatura ambiente e os resultados podem ser facilmente interpretadas por exame visual da folha de membrana de nitrocelulose. Consideramos, portanto, esta abordagem seja mais adequado para laboratrios de pases em desenvolvimento onde a tuberculose pulmonar ainda prevalente.