Plantas como

PESQUISA

Biorreatores
Utilizao de plantas transgnicas como reatores biolgicos para produo de protenas
Fotos cedidas pelos autores

Doutoranda em Gentica e Biologia Molecular (UNICAMP) eapariz@unicamp.br

Eneida Abreu Parizotto

Doutorando em Gentica e Biologia Molecular (UNICAMP) pdelucca@unicamp.br

Paulo Cezar De Lucca

Mestranda em Gentica e Biologia Molecular (UNICAMP) jungmann@unicamp.br

Letcia Jungmann

Edson Luis Kemper

Doutor em Gentica (UNICAMP)

Doutora em Cincias Biolgicas (UFSCar) Ps-doc do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Gentica (CBMEG, UNICAMP) chiesse@unicamp.br

Alba Chiesse da Silva

Doutor em Bioqumica Pesquisador do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Gentica (CBMEG, UNICAMP) aleite@unicamp.br 12 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Adilson Leite

desenvolvimento de plantas transgnicas com novas caractersticas considerado uma das mais importantes aplicaes da tecnologia do DNA recombinante. Atravs dessa tcnica, as plantas podem ser geneticamente modificadas, basicamente com duas finalidades: a) melhoramento de suas caractersticas agronmicas e qualidades nutricionais; b) uso das plantas como reatores biolgicos para a produo de biomolculas. Inicialmente, as plantas transgnicas visavam apenas ao melhoramento agronmico por meio da introduo de genes capazes de conferir resistncia a herbicidas e a ataques de insetos e microorganismos. Atualmente, as plantas transgnicas esto sendo tambm exploradas para o desenvolvimento de alimentos que apresentem contedo balanceado de aminocidos, ou ainda que sejam enriquecidos em leos insaturados e vitaminas (Gander & Marcellino, 1997; Binsfeld, 2000; Carneiro et al., 2000). As plantas, assim como os animais transgnicos, podem ser empregadas como biorreatores para a produo de protenas, carboidratos e lipdios em larga escala. Adicionalmente, alteraes genticas que determinam modificaes em vias metablicas das plantas podem ser empregadas na produo de polmeros ou compostos orgnicos de baixo peso molecular. O nmero de compostos produzidos por meio dessas abordagens tem aumentado consideravelmente, sendo que a viabilidade do uso das plantas como biorreatores j foi demonstrada para a produo de carboidratos, cidos graxos, polipeptdios utilizados como frmacos, enzimas de uso industrial e plsticos biodegradveis (Goddijn &

Pen, 1995; Hood & Jilka, 1999). Por que usar plantas como biorreatores? As plantas apresentam vantagens em potencial em relao aos sistemas baseados em fermentao microbiana, clulas animais e animais transgnicos. Protenas heterlogas expressas em bactrias geralmente retm o resduo de metionina, derivado do sistema de traduo, na sua extremidade aminoterminal. Nas protenas expressas em eucariotos, entretanto, essa metionina geralmente faz parte de sinais de endereamento especficos, que so retirados quando essas protenas so introduzidas no compartimento celular para o qual foram endereadas. Alm disso, a fermentao bacteriana freqentemente resulta na produo de agregados insolveis, e so necessrios gastos significativos para solubilizar esses agregados e recuperar a estrutura da protena nativa. Por outro lado, o processo de fermentao em si requer grandes investimentos de capital. Ao contrrio dos sistemas bacterianos de expresso de protenas, os sistemas eucariticos permitem o processamento e a modificao dos produtos. O sistema de expresso eucaritico mais antigo e mais utilizado baseia-se na utilizao de leveduras, sendo as espcies Saccharomyces cerevisae e Pichia pastoris as mais utilizadas (Torres & Moraes, 2000). Esses sistemas so to econmicos quanto os bacterianos, mas as protenas sintetizadas so freqentemente hiperglicosiladas e, quando produzidas em altos nveis, so instveis e insolveis. Outros sistemas eucariticos utilizados para a produo de protenas

heterlogas so as culturas de clulas de insetos e de mamferos infectadas por vrus recombinantes. Esses vrus apresentam o gene que codifica a protena de interesse controlado por um potente promotor viral (Fraser, 1992). Esses sistemas so capazes de secretar protenas corretamente enoveladas e podem promover modificaes ps-traducionais. Por outro lado, tm como desvantagens o requerimento de meios de cultura complexos, de condies especiais para a manuteno das clulas, e de reatores sofisticados, que encarecem bastante o processo. Animais transgnicos tambm podem ser utilizados para a expresso de protenas heterlogas em larga escala. Um dos sistemas descritos baseia-se na secreo de protenas heterlogas no leite de caprinos, ovinos e bovinos. Nesse sistema, a expresso da protena de interesse controlada por promotores que atuam nas clulas de glndulas mamrias. Devido limitao da produo em fmeas em fase de lactao, mtodos alternativos tm sido propostos, nos quais a protena heterloga secretada na urina (Kerr et al., 1998) ou no fluido seminal (Dyck et al., 1999) de animais transgnicos. Os sistemas baseados em animais transgnicos so, no entanto, mais caros que os sistemas baseados em plantas, e a aceitao do produto por parte do pblico consumidor menor quando este tem origem animal. As plantas apresentam vias de modificao e processamento ps-traducionais, e os custos da produo de protenas heterlogas em plantas geralmente so menores que os dos demais sistemas. Por essas razes, o uso de plantas como biorreatores para a produo de protenas heterlogas estse tornando economicamente importante. A avidina, glicoprotena encontrada em ovos de aves, rpteis e anfbios, e utilizada na produo de reagentes para imunoensaios, constitui a primeira protena heterloga produzida em plantas j comercializada (Sigma) (Hood et al., 1997). As diferentes estratgias utilizadas para a produo de protenas heterlogas em plantas Basicamente, duas diferentes estratgias podem ser utilizadas para a

Figura 1: Representao esquemtica das diferentes estratgias utilizadas na produo de protenas heterlogas em plantas. Do lado esquerdo, esto representadas as etapas envolvidas na produo de protenas heterlogas em plantas pelo emprego de vrus carreadores. O gene que codifica a protena de interesse inserido em um vetor viral que utilizado na infeco de plantas. Aps o desenvolvimento das plantas, os tecidos infectados so utilizados como fonte para extrao de vrus recombinantes. Os extratos virais podem ser utilizados para a amplificao da produo, atravs da infeco de novas plantas. Do lado direito, esto representadas as etapas envolvidas na produo de protenas heterlogas em plantas transgnicas e transplastmicas. O gene que codifica a protena de interesse inserido em um vetor de transformao apropriado. Alm do gene de interesse, geralmente inserido tambm um gene seletivo, codificador de uma protena que confere resistncia a um antibitico ou a um herbicida. A integrao simultnea dos dois genes limitar o desenvolvimento de clulas no transformadas, durante a etapa de seleo. A partir do tecido selecionado, so regeneradas plantas nas quais a integrao do gene de interesse avaliada por meio da tcnica de PCR e de hibridao com sondas especficas. A presena do produto de expresso do gene de interesse investigada atravs de testes bioqumicos e imunoensaios com anticorpos especficos. Essas anlises permitem a seleo das linhagens que apresentam maior rendimento, que sero multiplicadas e utilizadas no desenvolvimento de mtodos de extrao e purificao, e subseqente caracterizao estrutural e funcional da protena heterloga.
produo de protenas heterlogas em plantas. Uma delas baseia-se na utilizao de vrus contendo RNA simples fita, que ocorrem naturalmente nas plantas. O gene que codifica a protena de interesse inserido no genoma do vrus, geralmente fusionado regio estrutural de um gene que codifica uma protena da capa viral. Depois de infectar a planta, o vrus promove sua replicao e a expresso de seus genes incluindo o gene que codifica a protena heterloga. A expresso desse gene transitria, pois ele no integrado ao genoma da planta. Esta, por sua vez, funciona como um veculo para a amplificao das partculas virais (Fig. 1). A protena recombinante recuperada atravs do processamento da protena da capa viral, que purificada a partir de extratos dos tecidos infectados. Opcionalmente, as partculas virais quimricas purificadas podem ser utilizadas diretamente na formulao de va
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cinas orais e nasais que os corpsculos lipdi(Beachy et al., 1996). cos e as protenas associaA segunda estratdas, devido sua baixa gia consiste em introdensidade, so facilmente duzir o gene que codipurificados por flotao fica a protena de inteaps centrifugao em resse no genoma da baixa rotao. planta por meio de tcA secreo de protenicas de transformao, nas heterlogas em exsuenvolvendo, portanto, datos de razes, a rizosea obteno de plantas creo, constitui outro sistransgnicas. O desentema especial de enderevolvimento de uma amento. Borisjuk et al. srie de tcnicas de (1999) demonstraram a transformao permieficincia desse sistema tiu a obteno de planatravs da expresso de tas transgnicas da maialtos nveis da protena oria das plantas cultiverde fluorescente de gua vadas. Descries deviva (GFP), da fosfatase talhadas das tcnicas alcalina de placenta humais utilizadas podem mana, e de uma xilanase ser encontradas em bacteriana. Os sistemas de Brasileiro & Carneiro rizosecreo permitem o (1998). A integrao desenvolvimento de proestvel permite a excessos de produo basepresso permanente do ados em cultivo hidropFigura 2: Comparao da tecido-especificidade dos progene e sua transfernnico e cultura in vitro de motores PCaMV e PGKaf. cia prognie da planrazes de plantas transgta transformada (Fig. nicas. Culturas de razes Para a realizao desse ensaio foram construdos plasmdios 1). Enquanto a estratso especialmente teis onde os promotores do gene que codifica o transcrito 35S do gia mediada por vrus para a obteno de produvrus do mosaico da couve flor (PCaMV) e do gene que codifica determina geralmente tos naturais cujas fontes a -kafirina (protena de reserva de sorgo) controlam a a expresso apenas em so plantas difceis de culexpresso do gene reprter codificador da -glicoronidase folhas, a integrao tivar ou que esto em pro(GUS). Sementes de milho seccionadas longitudinalmente permanente apresenta cesso de extino (Shanks foram bombardeadas com os plasmdios e, aps 48 horas, a maior versatilidade, & Morgan, 1999). A fitoratividade enzimtica de GUS foi revelada com a adio do permitindo que a exremediao de solo e gua substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glicorondio (Xgluc). presso seja direcionarepresenta outra importanOs pontos azuis, indicativos da atividade de GUS, aparecem da para os diversos te e promissora aplicao nos diversos compartimentos da semente (EB, embrio; EN, rgos, tecidos e compara os sistemas de rizoseendosperma; P, pericarpo) bombardeada pelo plasmdio que partimentos das plancreo. apresenta o promotor P35SCaMV (imagem da esquerda), tas. As protenas heterloenquanto que na semente bombardeada com a construo A orientao da gas podem ainda ser procontendo o promotor PGKaf, os pontos azuis so observados expresso para os diduzidas em cloroplastos apenas na regio do endosperma (imagem da direita). O versos compartimentos de plantas, transformadas ensaio demonstra que, ao contrrio do promotor P35SCaMV, das plantas transgniatravs da introduo dos o promotor PGKaf apresenta tecido-especificidade, sendo cas realizada atravs genes codificadores das ativo apenas no endosperma. da utilizao de proprotenas de interesse no motores tecido-especprprio DNA do cloroplasficos e de sinais de to, por meio de tcnicas direcionamento intracelulares. Essa ca- estratgia foi utilizada na produo de de biobalstica e posterior integrao pacidade tem sido explorada no de- encefalina inserida na albumina 2S de por recombinao homloga (Fig. 1). senvolvimento de sistemas de produ- Arabidopsis thaliana (Vandekerckho- Para diferenciar essas plantas das plano capazes de simplificar o armazena- ve et al., 1989), e do anticoagulante tas transgnicas com modificaes no mento do material colhido e os proces- hirudina inserido em oleosina (Par- DNA nuclear, as plantas assim obtidas sos de extrao e purificao das pro- menter et al., 1995). Os sinais presentes so denominadas de transplastmicas. tenas recombinantes. Alguns sistemas nas protenas 2S e oleosina endeream O grande nmero de cloroplastos prebaseiam-se na insero do polipept- a expresso das protenas recombinan- sentes nas clulas das folhas (aproxidio em protenas carreadoras. O direci- tes para corpsculos proticos e lipdi- madamente 100 por clula) determina onamento da protena sintetizada, nes- cos de sementes, respectivamente. A grande amplificao gnica, podendo se caso, realizado pelo peptdio sinal grande vantagem do sistema baseado resultar em altos rendimentos na propresente na protena carreadora. Essa no uso de oleosinas reside no fato de duo da protena recombinante. A
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Figura 3: Expresso de hGH em tabaco transgnico. (A) Representao esquemtica do cassete utilizado na expresso do hGH. O esquema mostra a regio que codifica o hGH, modificado atravs da substituio do peptdio sinal natural por um peptdio equivalente originrio de uma protena de reserva de planta. A expresso do gene modificado regulada pelo promotor PGKaf e pelo sinal e stio de poliadenilao do transcrito 35S do vrus do mosaico da couve flor (335S). (B) Western blot de extratos proticos de diferentes tecidos de tabaco transgnico. Amostras de extratos dos tecidos indicados, contendo 50 g de protena solvel, foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida 14% na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS). Aps a eletroforese, as protenas foram transferidas para a membrana, onde a presena de hGH foi revelada pela utilizao de anticorpo especfico. Para indicar a posio da migrao do hGH, foram utilizados 50 ng de Saizen, hGH comercial da Serono. A presena de banda indicadora de hGH apenas no extrato de semente confirma a tecido-especificidade nesse sistema de produo do hormnio recombinante. (C) Western blot de extrato protico obtido a partir de sementes de milho transgnico. O rendimento na produo de hGH recombinante (0,6% da protena solvel) foi estimado pela comparao das quantidades do hormnio presentes em diferentes alquotas do extrato de semente com diferentes quantidades do hGH padro (Saizen). O extrato foi preparado a partir de 100 mg de farinha de sementes maduras em 1,0 ml de tampo de extrao.

transformao de cloroplastos apresenta ainda vantagem em relao conteno biolgica, posto que o genoma plastidial raramente transmitido via plen. Recentemente, Staub et al. (2000) descreveram a obteno de rendimentos superiores a 7% da protena total solvel para a produo de hormnio de crescimento humano (hGH) em cloroplastos de tabaco. Entretanto, grande parte do hGH recombinante produzido apresentou um resduo do aminocido prolina na regio N-terminal no lugar do resduo de fenilalanina presente na mesma regio do hormnio natural. Esse resultado indica que a estratgia utilizada no processamento, catalisado pela protease especfica para ubiquitina, que produzida simultaneamente com a protena de fuso ubiquitina-hGH, no apresentou a eficincia desejada em cloroplastos. Portanto, apesar do alto rendimento de expresso descrito, esse sistema requer aperfeioamento adicional na etapa de processamento ps-traducional das protenas recombinantes. Plantas transgnicas na produo de peptdios e protenas de interesse farmacutico A expresso de protenas usadas como frmacos em plantas constitui uma alter-

nativa para processos, muitas vezes caros e que nem sempre so capazes de suprir a demanda desses produtos. Vandekerckhove et al. (1989) realizaram um dos trabalhos pioneiros nesse ramo, onde o neuropeptdio leu-encefalina (um analgsico opiide) foi produzido em Brassica napus (canola), como parte de uma protena de reserva da semente, a albumina 2S. Outras protenas usadas como frmacos j foram sintetizadas em plantas, como o fator de crescimento epidrmico, eritropoietina, interferon, protena C humana, glucocerebrosidase, entre outras (Goddijn & Pen, 1995; Cramer et al., 1996). As plantas transgnicas tambm esto sendo testadas para a produo de antgenos vacinais. Enquanto os sistemas baseados na amplificao de vrus em plantas apresentam capacidade de expressar apenas pequenos domnios antignicos fusionados s protenas da capa viral, plantas transgnicas podem expressar antgenos de maior complexidade estrutural, sem perda de suas propriedades imunognicas originais. Diversas abordagens tm sido usadas para obteno de vacinas a partir de plantas, sendo as vacinas comestveis as mais promissoras, pela reduo nos custos e faci-

lidade de administrao, uma vez que dispensariam todos os recursos necessrios para a produo e distribuio das vacinas (Langridge, 2000). Buscando demonstrar que protenas produzidas em plantas transgnicas so capazes de induzir resposta imune nos animais, Mason et al. (1992) introduziram, em tabaco, o gene codificador da protena de superfcie do vrus da hepatite B (HBV), ligado a um promotor constitutivo. Imunoensaios revelaram a presena da protena viral em extratos das folhas transformadas, indicando a viabilidade da expresso de antgenos exgenos em plantas para uso em vacinas. Posteriormente, Thanavala et al. (1995) demonstraram que a protena viral obtida nos extratos das folhas transformadas era capaz de induzir resposta imune in vivo. A mesma estratgia foi utilizada tambm na produo dos antgenos vacinais bacterianos toxina termolbil (LT) de Escherichia coli enteropatognica (Haq et al., 1995), e toxina colrica (CT) de Vibrio cholerae (Arakawa et al., 1998). Haq et al (1995) demonstraram a formao espontnea de estruturas pentamricas LT-B idnticas s naturais, em batatas transgnicas. Os antgenos recombinantes produzidos em batatas foram capazes de produzir resBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 15

posta imune e proteo parcial em camundongos (Mason et al., 1998) e no homem (Tackett et al., 1998). Anticorpos ou imunoglobulinas so protenas multimricas complexas, que requerem, para a sua produo, sistemas eucariticos de expresso. A produo de anticorpos em plantas pode ter aplicaes in situ ou ex situ (Whitelam & Cockburn, 1996). As aplicaes in situ compreendem aquelas em que o anticorpo age como um reagente na prpria clula, modulando a atividade de um antgeno, ou ainda, promovendo imunizao intracelular contra patgenos. Os anticorpos apresentam uma grande variedade de aplicaes ex situ, tais como controle de poluio ambiental, produo de reagentes industriais, sensores moleculares, reagentes para diagnsticos, soros contra toxinas e venenos, imunizao passiva contra agentes infecciosos, contraceptivos, terapias contra cncer, entre outras. A maioria dessas aplicaes requer grandes quantidades de anticorpos, sendo sua utilizao limitada pelo rendimento dos sistemas de produo. As plantas transgnicas, alm de apresentarem altos rendimentos de produo, constituem at o momento, o nico sistema de expresso capaz de produzir anticorpos completos funcionais. Esse fato foi efetivamente comprovado atravs da produo de um anticorpo do tipo IgA em tabaco (Ma et al., 1995). Com esse objetivo, esses pesquisadores produziram quatro diferentes plantas de tabaco transgnicas, cada uma expressando uma das quatro cadeias polipeptdicas que compem um anticorpo monoclonal do tipo IgA. Atravs de cruzamentos sucessivos entre essas plantas, obtiveram plantas capazes de expressar, simultaneamente, as quatro cadeias polipeptdicas e de produzir uma imunoglobulina funcional. Devido capacidade de ligao do anticorpo original com uma adesina da bactria Streptococcus mutans, o anticorpo recombinante, produzido em larga escala em plantas, dever ser utilizado na imunizao passiva contra crie, pela sua adio em dentifrcios. Produo de hormnio do crescimento humano em sementes de plantas transgnicas As protenas recombinantes, de maneira geral, devem ser processadas imediatamente aps a colheita, devido
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alta atividade proteoltica da maioria dos tecidos vegetais. As sementes, por sua vez, apresentam tecidos especializados que permitem o armazenamento de protenas por longos perodos, sem a ocorrncia de degradao. Alm disso, o emprego de promotores semente-especficos impede que haja expresso generalizada da protena na planta, de modo que seus processos metablicos bsicos no so significativamente afetados. Com o objetivo de explorar as vantagens da produo em sementes, foi desenvolvido, em nosso laboratrio um, cassete de expresso onde a expresso do gene codificador da protena de interesse controlada pelo promotor de -kafirina. A -kafirina, uma protena de reserva de sorgo, acumula-se em grande quantidade na semente, onde constitui fonte de nitrognio e enxofre durante a germinao (Leite et al., 1999). Conforme demonstram os experimentos de expresso transiente mostrados na Figura 2, enquanto o promotor constitutivo derivado do transcrito 35S do vrus do mosaico da couve flor (P35ScaMV) dirige a expresso do gene reprter gus para os diversos compartimentos da semente de milho, o promotor de -kafirina estimula essa expresso especificamente no tecido de reserva, o endosperma. O cassete de expresso baseado no promotor de -kafirina foi inicialmente testado na produo de hormnio do crescimento humano (hGH) em sementes de tabaco transgnico (Leite et al., 2000). Com essa finalidade, a seqncia de cDNA codificadora do hGH foi inserida na extremidade 3' da seqncia promotora (Fig. 3A). Na hipfise, o hGH produzido na forma de um pr-hormnio que apresenta um peptdio sinal em sua extremidade amdica. O peptdio sinal responsvel pelo endereamento da protena para o retculo endoplasmtico (RE) determinando, dessa forma a secreo do hormnio. Apesar da existncia de evidncias de que sinais de endereamento de animais so funcionais em plantas, no intuito de maximizar seu processamento na semente o peptdio sinal original do hGH foi substitudo por um peptdio sinal equivalente originrio de uma protena de reserva de Coix lacryma-jobi, um cereal filogeneticamente relacionado ao milho (Leite et al., 1999). A anlise de extratos proticos dos

diversos rgos do tabaco transformado com o cassete de expresso demonstrou a produo do hormnio recombinante especificamente nas sementes (Fig. 3B). O seqenciamento da regio amdica do hGH purificado a partir das sementes indicou a presena de resduos idnticos aos encontrados no hormnio natural. Esse resultado demonstra que o peptdio sinal adicionado, de maneira similar ao peptdio sinal original, pde ser reconhecido como um sinal de endereamento, tendo sido adequadamente processado. Posteriormente, ensaios de ligao a receptores especficos mostraram que o hormnio produzido em sementes de tabaco apresenta propriedades similares s da protena nativa, dando uma clara indicao de sua funcionalidade (Leite et al., 2000). O nvel de expresso do hGH recombinante obtido em sementes de tabaco resultou um rendimento de produo de, aproximadamente, 0,16% das protenas solveis da semente. O baixo rendimento deve-se possivelmente ao fato de um promotor originrio de uma planta monocotilednea ter sido usado no controle da expresso de genes em tabaco, uma planta dicotilednea. Corroborando com essa hiptese, resultados obtidos recentemente por nosso grupo demonstram rendimentos superiores (cerca de quatro vezes) em sementes de milho transgnico. Estimativas baseadas nesse rendimento indicam a possibilidade de se produzir, aproximadamente, 250 g de hGH a partir de uma tonelada de semente de milho transgnico (Fig. 3C). A baixa complexidade protica que caracteriza o endosperma, aliada reduzida solubilidade em gua da maioria de suas protenas, deve facilitar o desenvolvimento de processos industriais de extrao e purificao do hGH produzido em sementes de milho transgnico. Com o objetivo de comparar o rendimento da produo de hGH recombinante em sementes de diferentes espcies de plantas, a mesma construo utilizada na transformao de tabaco e de milho est sendo testada em soja. Os experimentos com soja transgnica esto sendo realizados em colaborao com os pesquisadores Dr. Elbio L. Rech e Dr. Francisco J. L. Arago, da EMBRAPA-Recursos Genticos e Biotecnologia (Braslia, DF). Esse trabalho abriu perspectivas para a expresso de outros frmacos de

interesse econmico em sementes e, utilizando o mesmo sistema de expresso, nosso grupo est trabalhando atualmente em projetos que visam expresso de insulina humana e de um anticorpo em sementes de tabaco transgnicas. Agradecimentos Os autores agradecem o suporte tcnico dado por Camilla Abbehausen, Daniela Stancato e Eduardo Kiyota, e o trabalho dos alunos de iniciao cientfica Flvia Enara Furquin, Mrio del Gidice Paniago e Sylvia Morais de Sousa. Adilson Leite recebe bolsa de Produtividade em Pesquisa do CNPq. Eneida A. Parizotto recebe bolsa do CNPq, Paulo C. De Lucca, Letcia Jungmann e Alba C. da Silva recebem bolsa da FAPESP. Este trabalho recebe apoio financeiro da FAPESP atravs do Projeto Temtico PTE: 99/02198-3. Bibliografia Arakawa, T.; Chong, D.K.X.; Langridge, W.H.R. Efficacy of a food plantbased oral cholera toxin B subunit vaccine. Nature Biotechnology 16: 292297, 1998. Beachy, R.N.; Fitchen, J.H.; Hein, M.B. Use of plant viruses for delivery of vaccine epitopes. Annals of New York Academy of Sciences 796: 43-49, 1996. Binsfeld, P.C. Anlise diagnstica de um produto transgnico. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, 12: 16-19, 2000. Borisjuk, N.V.; Borisjuk, L.G.; Logendra, S.; Petersen, F.; Gleba, Y.; Raskin, I. Production of recombinant proteins in plant root exudates. Nature Biotechnology 17: 466-469, 1999. Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. Manual de Transformao Gentica de Plantas. Braslia, Embrapa-SPI/Embrapa Cenargen, 1998. Carneiro, A.A.; Carneiro, N.P.; Carvalho, C.H.S.; Vasconcelos, M.J.V.; Paiva, E.; Lopes, M.A. Milho transgnico. Melhoria da qualidade nutricional do gro. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 15: 42-46, 2000. Cramer, C.L.; Weissenborn, D.L.; Oishi, K.K.; Grabau, E.A.; Bennett, S.; Ponce, E.; Grabowski, G.A.; Radin, D.N. Bioproduction of human enzymes in transgenic tobacco. Annals of New York Academy of Sciences 792: 62-71, 1996.

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