ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ESCHERICHIA COLI

DARI SAMPEL FESES

Hari/Tanggal : Selasa, 23 November 2021

Nama : Andi Wiguna Ainun Mulyani
NIM : PO714203201005

PRODI D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

POLTEKKES KEMENKES MAKASSAR
2021

Nilai TTD
A. Tujuan
Untuk mengisolasi bakteri yang terdapat dalam sampel, lalu
mengidentifikasikan bakteri apa yang terdapat didalam sampel tersebut.
B. Landasan Teori
a. Isolasi dan Identifikasi Escherichia coli
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba
tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu
sel tunggal (Pelczar, 1986).
Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu
untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri
cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang
terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Sutedjo, 1996).
E. coli adalah baktri coliform yang sering ditemukan pada faces manusia dan
hewan berdarah panas. Organisme ini tersebar luas di alam biasanya lazim terdapat
dalam sel pencernaan manusia dan hewan. Dalam Merchant dan Parker (1961)
disebutkan spesies E.coli tidak dapat mengurangi asam sitrat dan garam asam sitrat
sebagai sumber karbon tunggal dan tidak menghasilkan pigmen, tetapi kadang-
kadang menghasilkan pigmen berwarna kuning.
Klasifikasi Escherichia coli :
Divisio : Schizomycota
Kelas : Schizomycetec
Ordo : Eubacteriaceae
Genus : Escherichia
Species : Escherichia coli (Salle, 1961)
E. coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk
spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E.
coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk dalam golongan E.
coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik dan E.coli
Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air
minum tersebut pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat
mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. coli
harus absen dalam 100 ml.
 Escherichia coli adalah spesies yang paling penting dari genus Escherichia
dan merupakan flora normal yang dapat menyebabkan infeksi pada saluran kencing,
luka, bakterimia, septisemia dan meningitis serta infeksi gastrointestinal (Gaani A,
2003).
Sehubungan dengan infeksi pada usus dikenal lima jenis Escherichia coli,
yaitu:
1. Enteropathogenik Escherichia coli (EPEC)
EPEC menyebabkan diare pada bayi atau anak – anak kurang dari 1 tahun dan
jarang pada orang dewasa dengan gejala berupa demam tidak tinggi, muntah,
malaise dan diare
2. Enterotoxigenik Escherichia coli (ETEC)
ETEC menyebabkan diare pada anak – anak dan dewasa di daerah tropis dan
subtropics pada Negara yang sedang berkembang. Infeksi ETEC ditandai
dengan gejala demam rendah dan tinja encer
3. Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)
EIEC menyebabkan diare mirip dengan yang disebabkan oleh shigella, baik
pada anak – anak maupun orang dewasa. Tinja agak encer bahkan seperti air,
mengandung nanah, lender dan darah dengan gejala panas dan malaise
4. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
EHEC dikenal sebagai penyebab diare hemorhagik dan colitis serta hemolytic
uremic syndrome (HUS) yang ditandai dengan jumlah trombosit berkurang,
anemia hemolitik dan kegagalan ginjal. Tinja encer berair, mengandung darah
dan abdomen terasa sakit, kram serta demam rendah atau tanpa demam
5. Enterodherant Escherichia coli (EAEC)
EAEC menyebabkan diare dengan cara menempel kuat pada permukaan
mukosa usus dengan gejala tinja encer berair, muntah, dehidrasi, dan biasanya
sakit pada abdomen.
b. Media Isolasi dan Identifikasi
Media Mac Conkey Agar Plate (MCA) merupakan media selektif untuk isolasi
dan identifikasi bakteri gram negatif. MCA mengandung garam empedu (bite salt)
yang akan membentuk kristal violet sebagai penghambat pertumbuhan bakteri gram
positif dan neutral red sebagai indikator warna. MCA juga mengandung laktosa
sehingga digunakan untuk membedakan bakteri yang menfermentasi laktosa (seperti
bakteri gram negatif) dan yang tidak menfermentasikan laktosa. Koloni yang
menfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh endapan
garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian laktosan menjadi asam yang
akan bereaksi dengan garam empedu. Bakteri yang tidak menfermentasikan laktosa
tidak memperlihatkan perubahan pada media (Dedy Arianda, 2016)
Media Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) adalah medai selektif untuk
bakteri enterobacteria. Kandungan zat warna EMBA yaitu eosin dan methylene blue
menyebabkan bakteri gram positif tidak tumbuh. Jika bakteri E.coli tumbuh pada
media ini akan menghasilkan koloni yang berwarna hijau metalik tengah berwarna
ungu tua. (Dedy Arianda, 2016)
Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) digunakan untu uji Triple Sugar Iron
Agar (TSIA) merupakan rangkaian uji biokimia untuk melihat kemampuan
mikroorganisme dalam memfermentasikan gula yang terkandung di dalam media
TSIA, yakni glukosa, laktosa, dan sukrosa. Media yang digunakan mempunyai dua
bagian, yaitu slant (miring) dan butt (tusuk) (Kismiyati dkk., 2009).
Media Simmon Citrate adlah media yang digunakan untuk uji sitrat yaitu uji
yang dilakukan untuk mendeteksi kemampuan bakteri dalam memfermentasikan sitrat
sebagai sumber karbon yang terkandung pada media, dengan bantuan enzim citrate
permease sehingga menyebarkan sitrat ke dalam sel yang ditandai dengan
terbentuknya perubahan warna pada media.Uji positif ditandai dengan perubahan
warna media menjadi biru dan uji negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan
warna pada media (Anggraini dkk., 2016).
Media gula-gula digunakan untuk pengujian fermentasi karbohidrat dilakukan
untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasi karbohidrat pada media.
Proses fermentasi karbohidrat akan menghasilkan sejumlah besar asam organik yang
berasal dari tiap-tiap jenis gula, yaitu glukosa, laktosa, maltosa, manitol, dan sukrosa.
Media fermentasi karbohidrat merupakan media cair yang berwarna merah. Hasil
positif apabila warna media berubah menjadi kuning (terjadi fermentasi gula-gula)
dan hasil negatif apabila tidak terjadi perubahan warna media (tidak terjadi
fenmentasi karbohidrat) (Ismail dan Fariedah, 2014). Tabung Durham diletakkan
terbalik dalam masing-masing tabung sebagai indikator adanya produksi gas.
Produksi gas ditunjukkan dengan adanya gelembung pada tabung Durham (Leboffe,
2011).
Media Methyl Red digunakan untuk uji MR bertujuan untuk mendeteksi
kemampuan organisme dalam memproduksi dan mempertahankan produk akhir asam
stabil dari fermentasi glukosa. Beberapa bakteri menghasilkan sejumlah besar asam
dari fermentasi. Methyl Red adalah indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH
4,4 atau kurang. (Sridhar, 2006). Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4
(hal ini menunjukkan hasil positif) dan kuning pada pH di atas 6,0. Warna oranye
menunjukkan pH menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj, 2013).
Uji Voges Proskauer (VP) berguna mengetahui reaksi kondensasi diantara
diacethyl. Pertumbuhan bakteri ditandai dengan warna media yang menjadi keruh,
kemudian ditambahkan ke dalam tabung 5 tetes KOH 40% dalam akuades steril dan
12 tetes alpha-napthol 5% dalam ethanol, yang bertindak sebagai katalis. Hasil positif
terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah dan hasil negatif ditandai dengan
tidak adanya perubahan warna merah pada tabung (Sarudji dkk., 2017).
Media Sulfit Indol Motility digunakan untuk uji motility bakteri yang
dilakukan dengan isolat bakteri ditusukkan ke dalam media Sulfide Indol Motility
(SIM) semi padat pada tabung reaksi menggunakan jarum ose tusuk steril. Kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃. (Yulvizar, 2013).
Pada media ini juga menunjukkan hasil terhadap uji indol yang menunjukkan
kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim triptophase yang dapat
menghidrolisis triptophan, yang dilakukan dengan meneteskan cairan kovacks pada
isolat tersebut kemudian mengamati perubahan warna yang terjadi. Hasil positif
ditunjukkan dengan terbentuknya cincin merah pada permukaan bakteri, hasil negatif
ditunjukkan apabila tidak terdapat cincin merah (Kismiyati, dkk. 2009).
C. Alat dan Bahan
Alat
a. Lampu spiritus
b. Ose
c. Nall
d. Objek gelas
e. Pipet tetes
f. Rak tabung
g. Spiritus
h. Korek api
Bahan
a. Sampel feses
b. Media BHIB (Brain Heart Infusion Broth)
c. Media MCA (Mac Conkey Agar)
d. Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
e. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
f. Media SIM (Sulfit Indol Motility)
 g. Media SCA (Simmon Citrate Agar)
h. Media gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa)
i. Media MR (Methyl Red)
j. Media VP (Voges Proskauer)
k. Reagen Kovach
l. Reagen methyl red
m. KOH 10%
n. Alpha-naphtol
D. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Media
Pembuatan Media BHIB (Brain Heart Infusion Broth)
 Alat : Tabung reaksi, batang pengaduk, erlenmeyer, neraca analitik, autoklaf,
pipet pasteur dan lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk BHIB (Brain Heart Infusion Broth), akuades, pengukur pH,
kapas, karet gelang dan kertas.
37 x 40 = 1,48 gr
1000
 Cara kerja :
1) Menimbang bubuk BHIB (Brain Heart Infusion Broth) sebanyak 1,48
gr yang akan digunakan untuk membuat 20 tabung media.
2) Memasukkan bubuk BHIB (Brain Heart Infusion Broth) ke dalam
erlenmeyer.
3) Melarutkan bubuk BHIB (Brain Heart Infusion Broth) menggunakan
akuades hingga volumenya mencapai 40 ml.
4) Menghomogenkan larutan yang ada pada erlenmeyer dengan batang
pengaduk.
5) Mengukur pH larutan dengan pengukur pH (normalnya pada pH 7,4).
6) Memipet 2 ml larutan ke dalam tabung reaksi.
7) Menutup mulut tabung reaksi menggunakan kapas.
8) Membungkus tabung reaksi secara bersamaan dengan menggunakan
kertas lalu mengikatnya dengan karet gelang.
9) Mensterilkan tabung reaksi yang berisi larutan BHIB (Brain Heart
Infusion Broth) di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (jika
menggunakan panci biasa maka dipanaskan selama 1 jam).
10) Mendinginkan media dan memasukkannya ke lemari pendingin dalam
keadaan terbungkus.
Pembuatan Media MCA (Mac Conkey Agar)
 Alat : Plate steril, erlenmeyer, hot plate, autoklaf, neraca analitik, pipet
pasteur dan lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk MCA (Mac Conkey Agar), akuades, kapas, karet gelang,
aluminium foil dan kertas.
50 x 500
= 25 gr
1000
  Cara kerja :
1) Menimbang 25 gr bubuk MCA (Mac Conkey Agar) yang akan
digunakan untuk membuat 20 plate media.
2) Memasukkan bubuk MCA (Mac Conkey Agar) ke dalam
erlenmeyer.
3) Melarutkan bubuk MCA (Mac Conkey Agar) dengan akuades
hingga volume mencapai 500 ml, kemudian menutup mulut
erlenmeyer dengan kapas dan aluminium foil (agar lebih rapat
maka dapat juga diikat dengan karet gelang).
4) Memanaskan larutan pada hot plate hingga bubuk MCA (Mac
Conkey Agar) larut/homogen (tidak ada gumpalan).
5) Kemudian mensterilisasi larutan di autoklaf pada suhu 121°C
selama 15 menit (jika menggunakan panci maka dipanaskan
selama 1 jam).
6) Setelah melakukan sterilisasi pada larutan tersebut,
selanjutnya mendiamkan larutan hingga suhunya menurun
(sekitar 40°C).
7) Memipet 20 ml larutan ke cawan petri steril.
8) Mendiamkan hingga mengeras.
9) Membungkus media menggunakan kertas dan menyimpannya
pada lemari pendingin.
Pembuatan Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
 Alat : Plate steril, erlenmeyer, hot plate, autoklaf, neraca analitik, pipet
pasteur dan lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), akuades, kapas, karet
gelang, aluminium foil dan kertas.
37,5 x 500
= 18,75 gr
1000

 Cara kerja :
1) Menimbang 18,75 gr bubuk EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), yang
akan digunakan untuk membuat 20 plate media.
2) Memasukkan bubuk EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), ke dalam
erlenmeyer.
3) Melarutkan bubuk EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), dengan akuades
hingga volume mencapai 500 ml, kemudian menutup mulut erlenmeyer
dengan kapas dan aluminium foil (agar lebih rapat maka dapat juga diikat
dengan karet gelang).
4) Memanaskan larutan pada hot plate hingga bubuk EMBA (Eosin Methylene
Blue Agar), larut/homogen (tidak ada gumpalan).
 5) Kemudian mensterilisasi larutan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15
menit (jika menggunakan panci maka dipanaskan selama 1 jam).
6) Setelah melakukan sterilisasi pada larutan tersebut, selanjutnya
mendiamkan larutan hingga suhunya menurun (sekitar 40°C).
7) Memipet 20 ml larutan ke cawan petri steril.
8) Mendiamkan hingga mengeras.
9) Membungkus media menggunakan kertas dan menyimpannya pada lemari
pendingin.
Pembuatan Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
 Alat : Neraca analitik, tabung reaksi, erlenmeyer, hot plate, autoklaf, lemari
pendingin dan pipet pasteur.
 Bahan : Bubuk TSIA (Triple Sugar Iron Agar), akuades, kapas, aluminium
foil, pengukur pH, karet gelang dan kertas.
37 x 40 = 1,48 gr
1000
o
 Cara kerja :
1) Menimbang 4,55 gr (4,6 gr) bubuk TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
yang akan digunakan untuk membuat 20 tabung media.
2) Memasukkan bubuk TSIA (Triple Sugar Iron Agar) ke dalam
erlenmeyer dan melarutkannya dengan akuades hingga volume
mencapai 70 ml.
3) Menutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan aluminium
foil untuk mencegah keluarnya uap.
4) Memanaskan larutan menggunakan hot plate hingga TSIA (Triple
Sugar Iron Agar) larut/homogen (tidak menggumpal).
5) Menguji pH larutan menggunakan pengukur pH (pH normal 7,4 ±
0,2). Jika terlalu asam maka dapat menambahkan KOH hingga
mencapai pH yang diinginkan. Sedangkan jika terlalu basa maka
dapat menambahkan HCl hingga mencapai pH yang diinginkan.
6) Memipet 3,5 ml larutan ke dalam tiap tabung reaksi.
7) Menutup mulut tabung dengan kapas dan membungkus tabung
secara bersamaan menggunakan kertas, lalu mengikatnya dengan
karet gelang.
8) Mensterilkan tabung berisi larutan TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
yang telah dibungkus di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit
(jika menggunakan panci maka dipanaskan selama 1 jam).
9) Mendinginkan media pada posisi miring hingga padat (dapat
dilakukan dengan menidurkan tabung, namun bagian atasnya
diganjal dengan buku sehingga lebih tinggi dari bagian dasar
tabung). Setelah mengeras simpan media pada lemarin pendingin.
Pembuatan Media SCA ( Simmons Citrate Agar)
 Alat : Neraca analitik, erlenmeyer, hot plate, lemari pendingin, pipet pasteur,
autoklaf dan tabung.
  Bahan : Bubuk SCA (Simmon Citrate Agar), akuades, kapas, aluminium foil,
karet gelang, pengukur pH dan kertas.
22,5 x 40 = 0,9 gr
1000

 Cara kerja :
1) Menimbang bubuk SCA (Simmon Citrate Agar) sebanyak 0,9 gr yang akan
digunakan untuk membuat 20 tabung media.
2) Memasukkan bubuk SCA (Simmon Citrate Agar) ke erlenmeyer dan
melarutkannya dengan akuades hingga volume mencapai 40 ml.
3) Menutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan aluminium foil, lalu
mengikatnya dengan karet gelang.
4) Memanaskan larutan menggunakan hot plate hingga bubuk SCA (Simmon
Citrate Agar) larut/homogen (tidak ada gumpalan).
5) Mengukur pH larutan menggunakan pengukur pH (pH yang normal 6,6
± 0,2). Jika terlalu asam maka dapat menambahkan KOH hingga mencapai
pH yang diinginkan. Sedangkan jika terlalu basa maka dapat menambahkan
HCl hingga mencapai pH yang diinginkan.
6) Memipet 2 ml larutan SCA (Simmon Citrate Agar) dan memasukkannya ke
dalam tabung.
7) Menutup mulut tabung menggunakan kapas dan membungkus tabung secara
bersamaan menggunakan kertas, lalu mengikatnya dengan karet gelang.
8) Mensterilkan tabung yang berisi larutan SCA (Simmon Citrate Agar) di
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (jika menggunakan panci maka
dipanaskan selama 1 jam).
9) Mendinginkan media pada posisi miring hingga padat.
10) Menyimpan media di dalam lemari pendingin dalam keadaan terbungkus.
Pembuatan Media SIM (Sulfit Indol Motility)
 Alat : Neraca analitik, erlenmeyer, hot plate, autoklaf, tabung reaksi, pipet
pasteur dan lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk SIM (Sulfit Indol Motility), akuades, kapas, aluminium foil,
karet gelang, pengukur pH dan kertas.
30
x 40 = 1,2 gr
1000
 Cara kerja :
1) Menimbang 1,2 gr bubuk SIM (Sulfit Indol Motility) yang akan digunakan
untuk membuat 20 tabung media.
2) Memasukkan bubuk SIM (Sulfit Indol Motility) ke erlenmeyer dan
melarutkannya dengan akuades hingga volume mencapai 40 ml.
3) Menutup mulut erlenmeyer menggunakan kapas dan aluminium foil, lalu
mengikatnya menggunakan karet gelang.
 4) Memanaskan larutan pada hot plate hingga bubuk SIM (Sulfit Indol Motility)
larut/homogen (tidak menggumpal).
5) Mengukur pH larutan menggunakan pengukur pH (pH normal 7,3± 0,2). Jika
terlalu asam maka dapat menambahkan KOH hingga mencapai pH yang
diinginkan. Sedangkan jika terlalu basa maka dapat menambahkan HCl
hingga mencapai pH yang diinginkan.
6) Memipet larutan sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi.
7) Menutup mulut tabung reaksi dengan kapas dan membungkus tabung reaksi
tersebut menggunakan secara bersamaan dan mengikatnya dengan karet
gelang.
8) Mensterilkan tabung reaksi yang telah berisi larutan SIM (Sulfit Indol
Motility) di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (jika menggunakan
panci maka dipanaskan selama 1 jam).
9) Mendinginkan media hingga padat dan menyimpannya dalam lemari
pendingin dalam keadaan terbungkus.
Pembuatan Media MR-VP (Methyl Red- Voges Proskauer)
 Alat : Neraca analitik, erlenmeyer, batang pengaduk, tabung reaksi kecil,
tabung durham, pipet pasteur, autoklaf an lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk MR/VP (Methyl Red/Voges Proskauer), akuades, pengukur
Ph, kapas, kertas dan karet gelang.
 Cara kerja :
1) Menimbang 3 gr bubuk MR/VP (Methyl Red/Voges Proskauer) yang akan
digunakan untuk membuat 80 tabung media.
2) Memasukkan bubuk MR/VP (Methyl Red/Voges Proskauer) ke dalam
erlenmeyer.
3) Melarutkan bubuk MR/VP (Methyl Red/Voges Proskauer) dengan akuades
hingga volumenya mencapai 176 ml.
4) Menghomogenkan larutan menggunakan batang pengaduk pada erlenmeyer.
5) Mengukur pH larutan menggunakan pengukur pH (pH normal 6,9 ± 0,2). Jika
terlalu asam maka dapat menambahkan KOH hingga mencapai pH yang
diinginkan. Sedangkan jika terlalu basa maka dapat menambahkan HCl
hingga mencapai pH yang diinginkan.
6) Memipet 2 ml larutan MR/VP (Methyl Red/Voges Proskauer) ke dalam
tabung reaksi kecil.
7) Menutup mulut tabung menggunakan kapas dan membungkus tabung secara
bersamaan dengan kertas, lalu mengikatnya dengan karet gelang.
8) Mensterilkan tabung yang berisi larutan MR/VP (Methyl Red/Voges
Proskauer) di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (jika menggunakan
panci maka dipanaskan selama 1 jam).
9) Mendinginkan media dan menyimpannya di dalam lemari pendingin dalam
keadaan terbungkus.
Pembuatan Media Gula-gula
  Alat : Beaker gelas, pipet tetes, pipet pasteur, neraca analitik, tabung durham,
batang pengaduk, autoklaf dan lemari pendingin.
 Bahan : Bubuk water pepton, akuades, indikator BTB (Bromtimol Blue),
KOH 10%, pengukur pH, bubuk glukosa, bubuk sukrosa, bubuk laktosa,
bubuk manitol, bubuk maltosa, kapas, kertas dan karet gelang.
7 x 1000 x 40 = 276,67 ml
V=
25,3
 Cara kerja :
1) Membuat larutan water pepton dengan menimbang ubuk water peton sebanyak 7
gr yang akan digunakan untuk membuat 5 macam media gula-gula.
2) Memasukkan bubuk water pepton ke beaker gelas dan melarutkannya dengan
akuades hingga volumenya mencapai 276,67 ml, lalu menghomogenkannya
menggunakan batang pengaduk.
3) Menambahkan indikator BTB (Bromtimol Blue) dan KOH 10% ke dalam larutan
water pepton secara selang-seling hingga pH larutan menjadi basa (pH 8-9).
4) Menyiapkan 5 beaker gelas dan menuang 50 ml water pepton untuk tiap beaker
gelas.
5) Membuat larutan gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa)
dengan konsentrasi 2% pada volume yang akan dibuat (50 ml).
2 x 50 = 1 gr
100
6) Menimbang masing-masing 1 gr bubuk gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa,
manitol dan maltosa) untuk membuat 20 tabung media untuk tiap jenis media
gula-gula.
7) Memasukkan bubuk gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa)
ke masing-masing 1 beaker gelas berbeda yang telah berisi water pepton 50 ml.
8) Menghomogenkan larutan pada beaker gelas menggunakan batang pengaduk.
9) Memipet 2,5 ml larutan gula-gula ke tabung durham.
10) Menutup bagian mulut tabung dengan kapas dan membungkus tabung secara
bersamaan menggunakan kertas untuk tiap jenis media gula-gula, lalu
mengikatnya dengan karet gelang.
11) Mensterilisasi tabung yang telah berisi larutan gula-gula di autoklaf pada suhu
121°C selama 15 menit (jika menggunakan panci maka dipanaskan selama 1
jam).
12) Mendinginkan media dan menyimpannya pada lemari pendingin dalam keadaan
terbungkus.
2. Penanaman sampel pada media
1) Menanam atau memasukkan sampel ke dalam media BHIB (Brain Heart
Infusion Broth), lalu menginkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
2) Kemudian, mengambil 1 sengkelit biakan pada media BHIB (Brain Heart
Infusion Broth) menggunakan ose steril dan menggoreskannya pada media
MCA ( Mac Conkey Agar) dan media EMBA (Eosin Methylen Blue Agar)
yang dibagi menjadi 4 kuadran.
 a) Pada kuadran I, dilakukan dengan menggoreskan ose pada media secara
rapat antara goresan yang satu dengan yang lainnya.
b) Memijarkan ose sebelum lanjut menggores pada kuadran II dan III.
c) Pada kuadran II, biakan diambil dari goresan kuadran I dengan cara
menyentuhkan ose pada goresan di kuadran I dan menyambung goresan
ke kuadran II. Begitu seterusnya hingga kuadran IV.
d) Pada kuadran II kerapatan goresan mulai berkurang, begitupun pada
kuadran III dan IV yang goresannya semakin merenggang.
3) Kemudian membungkus media MCA ( Mac Conkey Agar) dan media EMBA
(Eosin Methylen Blue Agar) pada posisi terbalik dengan menggunakan
kertas.
4) Menginkubasi media selama 24 jam pada suhu 37°C.
5) Mengamati koloni pada media setelah diinkubasi.
3. Isolasi koloni
1) Memilih 1 koloni yang akan diisolasi dan diidentifikasi (koloni yang tidak
berdempetan dengan koloni lain).
2) Menyentuhkan nall steril pada koloni yang telah dipilih, kemudian
menusukkan nall pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) secara
vertikal tanpa menyentuh dasar tabung. Setelah itu, menggoreskan nall
secara zig-zag pada daerah slant (lereng) media tersebut.
3) Menyentuhkan nall steril pada koloni yang dipilih, kemudian menusukkan
nall pada media SIM (Sulfit Indol Motility) secara vertikal tanpa
menyentuh dasar tabung.
4) Untuk media SCA (Simmon Citrate Agar), dilakukan dengan
menyentuhkan nall steril pada koloni yang dipilih dan menggoreskannya
secara zig-zag pada bagian slant (lereng) media SCA (Simmon Citrate
Agar).
5) Sedangkan untuk media cair (media gula-gula, Methyl Red dan Voges
Proskauer) dilakukan dengan menyentuhkan nall steril pada koloni yang
dipilih dan memasukkannya ke dalam media cair.
6) Setelah semua media ditanami koloni, selanjutnya menginkubasi media
tersebut selama 24 jam pada suhu 37°C.
4. Identifikasi media yang telah diinkubasi
1) Mengidentifikasi perubahan yang terjadi pada setiap media yang telah
diinkubasi (Triple Sugar Iron Agar, Simmon Citrate Agar dan gula-gula).
Sedangkan untuk media Sulfit Indol Motility (SIM), Methyl Red (MR)
dan Voges Proskauer (VP) dapat diidentifikasi setelah penambahan
reagen.
2) Menambahkan reagen kovach sebanyak 1-2 tetes pada media SIM (Sulfit
Indol Motility).
3) Menambahkan reagen methyl red pada media MR (Methyl Red).
 4) Menambahkan reagen alpha napthol sebanyak 1-2 tetes dan KOH 10%
sebanyak 1-2 tetes pada media VP (Voges Proskauer).
5) Melakukan pewarnaan gram dari biakan yang tumbuh pada media TSIA
(Triple Sugar Iron Agar).

E. Hasil
Ciri Koloni
Media Mac Conkey : bulat, kecil, jernih, cembung, licin dan mengkilat
Media EMBA : Bulat, berwarna ungu gelap, cembung, dan smooth

Uji Biokimia

No. Media/uji Media Media

Mac Conkey Agar EMBA
1. TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
a. Lereng (slant) Alkali Acid
b. Dasar (butt) Acid Acid
c. H2S (-) (-)
d. Gas (+) (+)
2. SIM (Sulfit Indol Motility)
a. Indol (-) (+)
b. Motility (+) (+)
c. H2S (-) (-)
3. SCA (Simmon Citrate Agar) (-) (+)
4. Gula-gula
a. Glukosa (+), gas (+) (+), gas (+)
b. Laktosa (-), gas (-) (+), gas (+)
c. Sukrosa (+), gas(+) (+), gas (+)
d. Maltosa (+), gas (+) (+), gas (+)
e. Manitol (+), gas (+) (+), gas (+)
5. MR (Methyl Red) (+) (+)
6. VP (Voges Proskauer) (-) (-)
Gambar Hasil Pengamatan
Media Mac Conkey Media EMBA

Uji Biokimia
No Dari Media Mac Conkey Agar Dari Media Eosin Methylen Blue Agar
1. Media TSIA (Triple Sugar Iron Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Agar)
2. SIM (Sulfit Indol Motility) SIM (Sulfit Indol Motility)
3. SCA (Simmon Citrate Agar) SCA (Simmon Citrate Agar)

4. MR (Methyl Red) MR (Methyl Red)

5. VP (Voges Proskauer) VP (Voges Proskauer)

6. Gula-gula Gula-gula
a. Glukosa Glukosa

b. Laktosa Laktosa
 c. Sukrosa Sukrosa

d. Maltosa Maltosa

e. Manitol Manitol

F. Pembahasan
Hari pertama dilakukan penanaman sampel feses pada media BHIB
kemudian pada hari kedua dilakukan penananam pada media Mac Conkey dan
Media EMBA. Media Mac Conkey ini dapat menghambat bakteri Gram positif
(+) karena mengandung empedu, Mac Conkey juga mengandung indicator
neutral red yang dapat memberikan warna merah pada media Mac Conkey
 tersebut. Setelah koloni dari Media BHIB tersebut ditanam pada media Mac
Conkey dan EMBA kemudian di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C
kemudian didapatkan koloni yang diduga bukan merupakan bakteri
Escherichia coli karena mempunyai morfologi koloni dengan ciri-ciri
berbentuk bulat kecil, berwarna jernih, elevasi cembung licin, dan pinggiran
rata..
Setelah didapatkan koloni murni yang terpisah pada hari selanjutnya
koloni terpisah dari media Mac Conkey dan EMBA ditanam pada media TSIA
kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Diperoleh hasil
TSIA media MCA : Alkali/Acid, gas (+), H2S (-)
TSIA media EMBA : Acid/Acid, gas (+), H2S (-)
Tersangka bakteri pada media EMBA adalah Klebsiella sp. dan dari media
MCA adalah Salmonella sp.
Pada hari selanjutnya dilakukan uji biokimia pada gula-gula cair ( manitol,
sukrosa, laktosa, dan glukosa ), SIM, Simon Citrate, MR,dan VP. Setelah
dilakukan penanaman pada uji biokimia dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu
37°C. Diperoleh uji biokimia
Media/uji Media Media
Mac Conkey Agar EMBA
SIM (Sulfit Indol Motility)
d. Indol (-) (+)
e. Motility (+) (+)
f. H2S (-) (-)
SCA (Simmon Citrate Agar) (-) (+)
Gula-gula
f. Glukosa (+), gas (+) (+), gas (+)
g. Laktosa (-), gas (-) (+), gas (+)
h. Sukrosa (+), gas(+) (+), gas (+)
i. Maltosa (+), gas (+) (+), gas (+)
j. Manitol (+), gas (+) (+), gas (+)
MR (Methyl Red) (+) (+)
VP (Voges Proskauer) (-) (-)

Berdasarkan hasil uji bikomia yang dilakukan hasil dari isolasi dan
identifikasi dari bahan sampel media feses yang ditanam pada media Mac Conkey
dan EMBA bukan bakteri Escherichia coli karena hasil IMVIC yang diperoleh
tidak sesuai. Adapun bakteri yang diperoleh pada media Mac Conkey adalah
bakteri Salmonella parathypi A. Dan bakteri yang ditanam pada media EMBA
adalah bakteri Klebsiella oxytoca .
Kesimpulan
Berdasarkan hasil isolasi dan identifikasi Escherichia coli yang dilakukan
dari bahan sampel media feses yang kemudian ditanam pada media Mac Conkey
dan EMBA bukan bakteri Escherichia coli karena hasil IMVIC yang diperoleh
tidak sesuai. Adpaun bakteri yang diperoleh pada media Mac Conkey adalah
bakteri Salmonella parathypi A. Dan bakteri yang ditanam pada media EMBA
adalah bakteri Klebsiella oxytoca
 Daftar Pustaka
Anggraini, R., D. Aliza., dan S. Mellisa. 2016. Identifikasi Bakteri Aeromonas
Hydrophila dengan Uji Mikrobiologi pada Ikan Lele Dumbo (Clarias
gariepinus) yang dibudidayakan di Kecamatan Baitussalam Kabupaten Aceh
Besar. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Kelautan dan Perikanan Unsyiah, 1(2): 270-
286.
Arianda, Dedy. 2016. Buku Saku Bakteriologi. AM Pubhlishing : Bekasi

Gani, A. 2003. Metode Diagnostik Bakteriologi III. Balai Laboratorium Kesehatan

Makassar

Kismiyati., S. Subekti., R. W. N. Yusuf., R. Kusdarwati. 2009. Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Maskoki (Carassius auratus) Akibat
Infestasi Ektoparasit Argulus sp. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 1 (2) :
289-295.
Michael J. Pelczar, 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press.
Jakarta

Sutedjo, Mul Mulyani. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta : Jakarta

Yulvizar, 2013, ‘Isolasi dan identifikasi bakteri probiotik pada Rastrelliger sp.’,
Jurnal Biospesies , 6 (2): 1-7.