Determinacin de los Resultados para Recuento en Placa

OBJETIVO GENERAL

Aprender a cuantificar microorganismos usando mtodos de recuento viables sobre placa.

MARCO TEORICO
Continuando con la prctica anterior, el recuento en placa ha sido uno de los mtodos mas utilizados en la microbiologa clsica. Se basa en la hiptesis de que todas las clulas formaran una colonia y que todas las colonias surgen de una sola clula. El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas. Puede realizarse sembrando en superficie o en fondo. Esta ltima opcin permite realizar el recuento de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de los medios de cultivo. Siempre deben sembrarse como mnimo tres diluciones consecutivas y se recomienda que cada dilucin tenga su duplicado. La capacidad de una clula para formar una colonia depende de una serie de factores entre los que se incluyen el estado fisiolgico de la clula, el medio de cultivo utilizado para el recuento, la temperatura de incubacin, etc. Estos factores son los que plantean un limitante en este tipo mtodo ya que, por citar el caso, existe la posibilidad que los microorganismos puedan estar daados sin llegar a morir por lo cual no necesariamente crecern en el medio de cultivo pero s podran recuperarse en el alimento y causar problemas. Tambin se tiene que tener presente que no todos los microorganismos presentes en un alimento puedan ser cultivables por este mtodo, por lo cual al no crecer no quiere decir que se tenga certeza que no estn presentes. NOTA Para reforzarles lo que sucedi en las diluciones pasadas. Recuerde que cuando se hace esta dilucin, la siguiente va ser 10 veces ms diluida (el tubo con la dilucin 10-2 es diez veces ms diluida que el tubo de la dilucin 10-1y a su vez, el tubo con la dilucin 10-3 es diez veces ms diluida que el tubo de la dilucin 10-2). Imaginmonos que se tienen ya listas las diluciones seriadas y a manera de ejemplo diramos que en el tubo con la dilucin 10-1hay 900 clulas o bacterias por cada ml (900 cel/ml), en el tubo con la dilucin 10-2habria una decima parte por ml (90 cel/ml) que en el tubo con la dilucin 10 -1 y en el tubo con la dilucin 10-3habria una decima parte por ml (9 cel/ml) que en el tubo con la dilucin 10 -2. Por lo tanto si se toma 0.1 ml del tubo con la dilucin 10-1 seria tomar 90 cel/ml (la decima parte de las 900 cel/ml que se tiene por ml en la dilucin 10-1), este valor es el mismo que est presente por ml en el tubo de dilucin con la dilucin 10-2, por esta razn es que se dice que si se toma 0.1 ml se est sembrado en la siguiente dilucin. En otro caso, si toma 1 ml del tubo con la dilucin 10-1 seria tomar 90 cel/ml, este valor es el mismo que est presente por ml en el tubo de esa dilucin, por esta razn es que se dice que si se toma 1 ml se est sembrado en la misma dilucin.

PROCEDIMIENTO
* Los procedimientos desarrollados en esta prctica se explicaran en el laboratorio. Tienen que traer leda la gua y por lo menos por grupo debe haber una gua impresa. Antes de comenzar el laboratorio lvese las manos y tenga puesto los elementos de proteccin. Desinfecte con hipoclorito de sodio el rea de trabajo; prenda el mechero y trabaje siempre junto a su llama. Finalizado el laboratorio la zona de trabajo debe ser desinfectada de nuevo. Clculo e interpretacin de los resultados que podra presentar Para los diferentes recuentos (anlisis de aerobios mesfilos / anlisis de mohos y levaduras): - Organice las cajas dependiendo del tipo de anlisis realizado y ordene las cajas de la menor dilucin sembrada (la menos diluida) a la mayor dilucin sembrada (la ms diluida). - Evidencie si el crecimiento en las diluciones es coherente, es decir, que a medida que aumenta la dilucin vaya disminuyendo la cantidad de colonias. Si no es coherente, el trabajo realizado en la anterior practica no es confiable. - As mismo se esperara que el crecimiento sea homogneo por toda la caja y que en caso de existir duplicado, las cajas con la misma dilucin debern tener ms o menos el mismo nmero de colonias.

Secuencia de crecimiento esperada para un recuento en placa de unas diluciones sembradas de 10 0, 10-1 y 10-2.

Cuando se hace recuento en placa, es necesario que los resultados cumplan las siguientes recomendaciones: a. Expresar el resultado del conteo de las colonias en dos cifras significativas. b. Mostrar el factor de dilucin (el inverso de la dilucin sembrada). Solo se reporta un conteo por anlisis de la muestra y no por cada dilucin que se hizo en el anlisis. c. Se reporta como UFC / ml (muestra liquida) UFC /g, (muestra solida). d. Especificar el anlisis que est reportando.

Ejemplo: Recuento de Aerobios Mesfilos 45 x 103 UFC / ml Resultado conteo 45 Factor de dilucin 103 Unidad UFC / ml (muestra liquida)

En caso que el resultado del conteo no fuera de dos cifras significativas, deber adecuarlo sencillamente dividindolo por 10 y aumentado el factor dilucin (divida y aumente hasta que logre las dos cifras). El informe tambin se podra expresar multiplicando de una vez el factor de dilucin (ejemplo 2) pero no es algo muy usado por lo que necesita arreglarse a dos cifras significativas. Ejemplo 1. 248 x 103 UFC/g = 24.8 x 104 UFC/g (como hay decimales se aproxima) = 25 x 104 UFC/g Ejemplo 2. 189000 UFC/ml = 18900 x 101 UFC/ml = 1890 x 10 2 UFC/ml = 189 x 10 3 UFC/ml = 18.9 x 10 4 UFC/ml = 19 x 104 UFC/ml A continuacin encontrara una forma de hacer el recuento de sus anlisis pero tenga presente que otros clculos pueden ser usados.

Haga un conteo de las colonias de bacterias, sin importar el tamao de las colonias, presentes en las respectivas cajas. Seleccione una caja con una dilucin que presente entre 30 y 300 colonias de bacterias. Informe el resultado del recuento (ejemplo 3). Ejemplo 3: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-1): conteo 180 colonias. 180 x 101 UFC/g ml = 18 x 102 UFC/g ml.

En caso que dos diluciones consecutivas estn dentro del rango 30 300 colonias, se hace recuento para cada una de las diluciones y se reporta el promedio de los dos valores obtenidos (ejemplo 4), a menos que el recuento mayor contenga dos veces al menor, en ese caso se reporta el recuento menor (ejemplo 5).

Ejemplo 4: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-1 ): conteo 290 colonias = 290 x 10 1 = 2900 Caja 2 (sembrada a una dilucin 10-2 ): conteo 40 colonias. = 40 x 10 2 = 4000 4000 = 1.3 (menos de 2) 2900 Resultados: 2900 + 4000 = 3450 UFC/g ml = 34.5 x 102 UFC/g ml. = 35 x 102 UFC/g ml. 2 Ejemplo 5: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-1 ): conteo 160 colonias = 160 x 10 1 = 1600 Caja 2 (sembrada a una dilucin 10-2 ): conteo 35 colonias. = 35 x 10 2 = 3500 3500 = 2.18 (mayor de 2) 1600 Resultados: 160 x 101 UFC/g ml (recuento menor entre las dos cajas) = 16 x 102 UFC/g ml. En caso que exista un duplicado de la caja, siempre que se mantengan las dos cajas en el rango de 30 a 300 colonias. Haga conteo de cada caja, saque el promedio y multiplquelo por el factor de dilucin (ejemplo 6). Ejemplo 6: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-3): conteo 240 colonias. Caja 1 duplicado (sembrada a una dilucin 10-3): conteo 258 colonias. 240 + 258 x 10 3 = 249000 UFC/g ml = 24.9 x 104 UFC/g ml. = 25 x 104 UFC/g ml. 2 Teniendo las cajas con sus respectivos duplicados. Si no presenta ninguna caja con el rango de colonias que se le pide pero presenta cajas de diluciones consecutivas con recuentos menores de 30 y mayores de 300 colonias. Cuente las cuatro cajas (dos diluciones cada una con su duplicado), calcule el recuento para cada una de las cajas y saque el promedio entre las dos diluciones (ejemplo 7). Ejemplo 7: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-1): conteo 330 colonias. Caja 1 duplicado (sembrada a una dilucin 10-1): conteo 350 colonias. 330 + 350 x 10 1 = 3400 2 Caja 2 (sembrada a una dilucin 10-2): conteo 26 colonias. Caja 2 duplicado (sembrada a una dilucin 10-2): conteo 28 colonias.

26 + 28 x 10 2= 2700 2 3400 + 2700 = 3050 UFC/g ml = 31 x 10 2 UFC/g ml. 2 Si la caja con la menor dilucin (la ms concentrada) no presenta ningn tipo de crecimiento, debe reportar el resultado como menor de 1 multiplicado por el factor de la menor dilucin sembrada (ejemplo 8 y 9). Ejemplo 8: Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-1): ausencia de colonias. Resultado: menor de 1 x 10 1 UFC/g ml = menor de 10 UFC/g ml. Ejemplo 9 (si se ha sembrado 0.1 ml de la dilucin 10-1): Caja 1 (sembrada a una dilucin 10-2): ausencia de colonias. Resultado: menor de 1 x 10 2 UFC/g ml = menor de 100 UFC/g ml. Nota: para el caso del recuento de mohos y levaduras el rango de las colonias es 20 y 100 colonias. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Siguiendo normas como la NTC no se requiere seguir los ejemplos anteriormente mencionados sino limitarse a la formula:

C = suma de todas las COLONIAS presentes en las cajas de las dos diluciones CONSECUTIVAS que se escojan para contar. En cada caja el numero de colonias no debe superar las 300 y preferiblemente tener como mnimo 15 colonias por caja. V = volumen de muestra en mililitros servido en cada caja. En nuestro caso para siembra en superficie (0,1 mL) y para siembra en fondo (1 mL 0,1 mL). n1 = numero de CAJAS contadas en la dilucin ms baja escogida. n2 = numero de CAJAS contadas en la dilucin ms alta escogida.

d = el FACTOR DE DILUCIN de la dilucin ms baja escogida. No olvide que el factor de dilucin es el INVERSO de la dilucin. (Ejemplo: si la menor dilucin es 10 - 2 el factor de dilucin es 10 2 o si tenemos como menor dilucin la muestra liquida sin diluir 10 0 el factor de dilucin es 1).

BIBLIOGRAFIA
Caon, F. & Gracia, T (1998). Manual de Tcnicas de Anlisis para Control de calidad Microbiolgico de Alimentos para Consumo Humano. INVIMA Bogota, Colombia. Pag. 15 21.

Doyle, M; Beuchat, L & Montville, T. (2001). Microbiologa de los Alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. Pag. 23 28.