Hilda Montero L.

de Guevara

CONTENIDO
1. 2. 3. 4. INTRODUCCIN..1 TEORIA DE LA SEDIMENTACIN...2 FUERZA CENTRFUGA RELATIVA..3 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.. 3 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN ESTNDAR... 4 DEPENDENCIA DE S CON RESPECTO A LA CONCENTRACIN...4 SEDIMENTACIN DEPENDIENTE DE LA VELOCIDAD...6 EFECTO DE LA CARGA EN LA SEDIMENTACIN....7 MEDICIN EXACTA DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.....7 CENTRFUGAS..8 CENTRFUGAS DE BAJA VELOCIDAD....8 CENTRFUGAS DE ALTA VELOCIDAD....8 ULTRACENTRFUGAS.8 CENTRFUGA TUBULAR..11 CENTRFUGA DE CAMARA MULTIPLE.11 CENTRFUGAS DECANTADORAS O DE TORNILLOS.12 CENTRFUGAS DE DISCOS...12 TIPOS DE ROTORES...13 ROTORES DE COLUMPIO.13 ROTORES DE NGULO FIJO....14 ROTORES VERTICALES....14 ROTORES ZONAL...15 FACTOR K Y K...16 TIPOS DE CENTRIFUGACIN..17 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL O PELLETING...18 CENTRIFUGACIN ZONAL..18 MATERIALES PARA GENERAR UN GRADIENTE DE DENSIDAD.20 FORMAS DE GRADIENTES...22 CENTRIFUGACIN AL EQUILIBRIO...23 GRADIENTES DE DENSIDAD AUTOGENERADOS..24 MATERIALES PARA FORMAR GRADIENTES AUTOGENERADOS..24 PREPARARACIN DE GRADIENTES..25 GRADIENTES DISCONTINUOS....25 GRADIENTES CONTINUOS..26 GRADIENTES PREFORMADOS....26 GRADIENTES AUTOGENERADOS..27 DETERMINACIN DE LA FORMA DE UN GRADIENTE AUTOGENERADO..29 GRADIENTES ISOSMTICOS...29 ANLISIS DE LA DISTRIBUCIN DE LA MUESTRA EN EL GRADIENTE...29 INSPECCIN VISUAL.....29 ANLISIS RADIOQUIMICOS DE LA MUESTRA ...30 APLICACIONES...31 CROMATOGRAFA DE PRECIPITACIN CENTRFUGA.31 MICROSCOPIO DE POLARIZACIN CENTRFUGA.32 SEPARACIN DE DNA, RNA Y PROTEINAS DE NUCLEOS FIBROBLASTOS DE HAMSTER...33 SEPARACIN DE DNA EN BASE ALA COMPOSICIN GC, CON USO DE BAMD..33 SEPARACIN DE DNA NATIVO Y DESNATURALIZADO CON GRADIENTES DE DENSIDAD DE TRICLOROACETATO DE RUBIDIO...33 FRACCIONAMIENTO DE RNA.34 SEPARACIN DE DNA PLASMDICO, EN ROTORES DE TUBO VERTICAL....34 FRACCIONAMIENTO CELULAR POR CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL..35 BIBLIOGRAFA36 APNDICE ...37

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INTRODUCCIN
La separacin de lquidos y partculas insolubles se ha dado en la naturaleza desde que se form el universo. La aplicacin de una fuerza centrfuga ayuda a la separacin y este proceso se ha venido aplicando recientemente. La separacin de partculas por medio de la centrifugacin tuvo aplicaciones en procesos industriales hasta hace aproximadamente 100 aos. Los primeros usos fueron en la manufactura del azcar y en separar la crema de la leche. Las primeras separaciones de partculas usando centrifugacin fueron probablemente inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik DeLaval para separar crema de leche, estas centrfugas funcionaban a velocidades de hasta 3 000 r.p.m. El desarrollo de la ultracentrfuga se le atribuye a Svedberg quien trabaj entre 1920 y 1930, el fue quien introdujo el termino de ultracentrfuga y debido a que era un qumico coloidal, estudiaba la estructura de las protenas ( en esa poca todas las protenas eran consideradas coloides); su grupo utilizaba la ultracentrfuga para determinar el peso molecular y la subunidad estructural de la hemoglobina, sus estudios cambiaron las ideas concernientes a la estructura de las protenas que se tenan en aquel tiempo. El grupo de Svedberg desarrollo algunas centrfugas y los primeros modelos funcionaban a velocidades de hasta 900 000 g y cuyos rotores eran pequeos; otros modelos funcionaban a velocidades de hasta 260 000 g. SPINCO produjo en 1940 la primera centrfuga comercial, el modelo original es mostrado en la siguiente figura.

Una de las tcnicas ms comnmente utilizadas en la actualidad para caracterizar las macromolculas es la sedimentacin. Utilizando las variantes adecuadas de esta tcnica, se pueden obtener el peso molecular, la densidad y la forma general de la macromolcula; adems, se puede detectar cambios en estos parmetros y cualquiera de ellos se puede aprovechar como base para la separacin de los componentes de una mezcla con propsitos preparativos o analticos. Debido a la facilidad con la que se obtienen los resultados en los modernos instrumentos automticos, hacen de la ultracentrifugacin una tcnica especialmente til. En realidad, con una ultracentrfuga solamente se hace una cosa: mover a las partculas por la fuerza centrfuga y medir, una o varias veces a lo largo del tiempo, la distribucin de la concentracin de las partculas a lo largo del tubo de la centrifugadora. La medicin realizada mientras las molculas se estn moviendo a lo largo del eje de la fuerza centrfuga, se denomina determinacin de la velocidad de sedimentacin y el resultado es un coeficiente de sedimentacin, cifra que proporciona informacin sobre el peso molecular y la forma de la partcula. Cuando se mide la distribucin de concentraciones bajo condiciones en las que la distribucin ya no cambia con el tiempo, se dice que las partculas han alcanzado el equilibrio de sedimentacin; este segundo tipo de medida proporciona datos sobre los pesos moleculares, la densidad y la composicin de las partculas.

Teora de la Sedimentacin
Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden cambiar de posicin con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin (en un gradiente de concentracin, las partculas tienden a ir de la zona de mayor concentracin a la de menor concentracin) o bien a procesos de sedimentacin. En un proceso de sedimentacin la velocidad a la cual sedimentan las partculas en una suspensin, no slo depende de su naturaleza, depende tambin de la naturaleza del medio en el cual estn suspendidas as como, de la fuerza aplicada a las partculas. Intuitivamente, uno especulara que las partculas ms grandes sedimentarn ms rpido que las ms pequeas. Un factor que afecta la sedimentacin de las partculas es la viscosidad del medio. En 1856 Sir Gabriel Stokes propuso que la fuerza friccional, F, que acta en una partcula esfrica de radio rp es relacionada a la viscosidad, h, por la siguiente ecuacin: F= 6 p h rp dr/dt Donde dr/dt es la velocidad de la partcula. La fuerza que experimenta una partcula no est slo determinada por la fuerza gravitacional, g, sino tambin, por los efectos de flotacin que reflejan las diferencias en la densidad del medio dm y de la partcula dp, por lo que tenemos: (dm - dp) V g = 6 p h rp dr/dt V= volumen de la partcula Como se asume que la partcula es esfrica, el volumen puede ser expresado en trminos del radio: (dm - dp) ( 4/3 p rp3) g = 6 p h rp dr/dt en la prctica, la fuerza centrfuga que mueve a la partcula sobre su eje de rotacin es mucho mayor que la fuerza de gravedad, se puede expresar la fuerza centrfuga de la siguiente manera: Fuerza centrfuga = w2r / g Donde r es la distancia radial de la partcula del eje de rotacin y w es la velocidad angular en radianes / segundo, haciendo una sustitucin en esta frmula y simplificando la expresin en trminos de la velocidad de la partcula, tenemos: dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r dt 9h Esta expresin es cierta para partculas esfricas. Las partculas no esfricas tienen altos coeficientes de friccin, por lo que, la expresin se puede modificar en base a los coeficientes de friccin de una molcula dada, f (f= 2phmD), con relacin al coeficiente de friccin de una partcula esfrica, fo. dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r dt 9h (f/fo)

Por la anterior ecuacin, podemos deducir que: 1) Una partcula con mayor masa tiende a moverse ms de prisa que una de menos masa 2) Una partcula ms densa se mueve ms de prisa que otra menos densa 3) Cuanto ms densa sea la disolucin, ms lentamente se mover la partcula 4) A mayor coeficiente de friccin, ms lento ser el movimiento de la partcula

Fuerza Centrifuga Relativa

La fuerza centrfuga (RCF) es dependiente de la velocidad de rotacin (N) en r.p.m. y la distancia de la partcula (r) al centro de rotacin. Cuando la distancia es expresada en cm tenemos que: RCF = 1.18 x r x (r.p.m / 1000)2 RCF = 1.18 x r x (N)2

La fuerza centrifuga es dada en trminos de g y N esta dada en miles de r.p.m.. Si la fuerza centrifuga es conocida, entonces la velocidad (N) requerida en r.p.m. para obtener esa fuerza centrfuga a un punto r (cm) de el centro de rotacin puede ser calculada con solo despejar la ecuacin anterior.

Coeficiente

de Sedimentacin

Como la velocidad de una molcula es proporcional a la magnitud del campo centrfugo (w2r) es comn discutir las propiedades de sedimentacin en trminos de la velocidad por unidad de campo, o sea: s = (dt/dr) / w2 r

Donde s es el coeficiente de sedimentacin; el objetivo inmediato de muchos de los experimentos de velocidad de sedimentacin es la determinacin del valor del coeficiente de sedimentacin. Dado que la velocidad de sedimentacin es mucho mas pequea que la velocidad angular, para la mayora de macromolculas biolgicas la magnitud de s es alrededor de 10-13 seg y es por ello que la unidad de sedimentacin Svedberg (S) ha sido definida como 10-13 S = 10-13 seg As por ejemplo, tenemos que la constante de sedimentacin de los ribosomas de eucarotes es 80S, o sea, s = 80 x 10-13 seg.

Coeficiente

de Sedimentacin Estndar

En una centrifugacin, el valor del coeficiente de sedimentacin no depende slo de la velocidad o tipo de rotor, depende tambin del tamao y densidad de la partcula, as como, de la densidad y viscosidad del medio utilizado para la centrifugacin. La dependencia de la viscosidad del medio se puede descartar siempre que se utilice el mismo medio para la centrifugacin. El medio ms utilizado es el agua, cuya densidad y viscosidad son conocidas a 20 0C. El coeficiente de sedimentacin de una partcula en agua a esta temperatura se denotar s20,w y como las condiciones de viscosidad y densidad del medio se descartan por ser siempre las mismas, ahora, el coeficiente de sedimentacin depender slo de las parmetros de la partcula. Entonces tenemos: s20,w = k [D2 (d - d20,w)] / h20,w Donde k es 1.18 para una partcula esfrica y 1.12 para una partcula cilndrica, D es el dimetro en cm, d es la densidad de la partcula (g/cm3) , d20,w y h20,w son la densidad y viscosidad del agua. Para determinar la constante de sedimentacin no es necesario realizar la centrifugacin con agua como medio, los datos de la centrifugacin pueden obtenerse con otro medio cuya densidad y viscosidad sean conocidas. Para transformar el coeficiente de sedimentacin de una partcula de un experimento dado a la constante de sedimentacin estndar, s20,w es dividida entre s, as, se obtiene la eliminacin de k y D2 : s20,w = s [ (d - d20,w) hm ] / [ (d - dm ) h20,w] Sustituyendo s en la ecuacin, tenemos: s20,w = v w2r . (d - d20,w) hm (d - dm ) h20,w

Donde d es la densidad de la partcula (g/cm3), v es la velocidad de sedimentacin, r es la distancia de la partcula al eje de rotacin (cm) y w es la velocidad angular (rad/seg). El coeficiente de sedimentacin de las macromolculas depende de toda una serie de factores, puesto que las molculas tienen una forma que depende de la composicin del disolvente, muchas de ellas pueden estar elctricamente cargadas, son muy grandes comparadas con las molculas del disolvente y se deforman a medida que se mueven. Estos efectos se manifiestan en la dependencia que s presenta respecto a la concentracin, la velocidad de centrifugacin y la fuerza inica del disolvente.

Dependencia de s con Respecto a la Concentracin

Considrese una disolucin de macromolculas de un tamao tal que chocan frecuentemente unas con otras. sta es una caracterstica de las molculas muy grandes y muy extendidas en disolucin (protenas y cidos nucleicos), porque a medida que giran sobre s mismas, ocupan un volumen efectivo de la disolucin realmente grande. Cuando se aproximan entre s, es ms fcil para las molculas del disolvente el moverse en direccin opuesta, es decir, la viscosidad del disolvente se incrementa efectivamente en la vecindad de las macromolculas. Esto reduce la velocidad hacia adelante de la partcula en un campo centrfugo dado y por

consiguiente se reduce s. Como la probabilidad de colisin aumenta tanto con el volumen como con el grado de extensin de la molcula, la magnitud de la dependencia respecto a la concentracin tambin aumenta a medida que lo hacen dichos parmetros. En la siguiente figura se ejemplifica este punto con varias curvas de s en funcin de la concentracin de DNA o de protena.

Protenas pequeas y globulares

Fago FX 174

s/s0
T7 DNA

T6 DNA

Concentracin mg/ml Dependencia de s con respecto a la concentracin expresada como s/so donde s0 es el valor de s extrapolado a concentracin cero.

En la grfica se puede observar que la dependencia respecto a la concentracin aumenta a medida que aumenta el peso molecular y a medida que la molcula es ms extendida. Las protenas pequeas son ms pequeas que Fago fx 174, este es ms pequeo que el DNA del fago T7. Nota: El valor de so se obtiene experimentalmente midiendo s a varias concentraciones y representando grficamente 1/s frente a la concentracin para determinar 1/s0 por extrapolacin a concentracin de cero. Esto se deduce de la siguiente ecuacin 1/sc= 1/s0 + k/s0. Si las molculas de una disolucin tienen diferentes s y la concentracin es relativamente alta, surge un nuevo problema. En este caso, las molculas no solamente interfieren con la sedimentacin de las de su misma clase, sino tambin con las de otros tipos. Es ms, la molcula con el mayor s y mayor dependencia respecto a la concentracin, tiene que sedimentar a travs de la disolucin de las molculas de movimiento ms lento . A concentraciones elevadas, las molculas ms veloces resultan tan impedidas en su movimiento que sedimentan a la misma o similar velocidad que las lentas, lo cual puede enmascarar el hecho de que, en realidad, se trata de una mezcla y dar la informacin errnea de que el material que se est analizando es homogneo. Este fenmeno se conoce como efecto de Jhonston-Ogston. De hecho, con cidos nucleicos de gran tamao se hace necesario utilizar pequesimas concentraciones antes de que los dos tipos de molculas puedan diferenciarse e, incluso a estas concentraciones, los datos indican a menudo que hay menos cantidad del componente rpido de la que realmente hay. Cabe mencionar que este problema queda muy reducido con el uso de la tcnica de centrifugacin zonal.
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En la siguiente figura hay un ejemplo que ilustra este punto.

DNA DE PORCENTAJE

60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 Concentracin 60 (mcg/ml) 80 100

Sedimentacin Dependiente de la Velocidad

La sedimentacin dependiente de la velocidad se refiere a dos fenmenos independientes: la agregacin de las molculas, dependiente de la velocidad, que se produce a grandes concentraciones, y la reduccin real de s a elevadas velocidades. En ninguno de los dos casos se comprende completamente el fenmeno, pero gracias a los trabajos de Bruno Zimm y sus colaboradores, se tiene una idea de cules pueden ser las causas. La agregacin dependiente de la velocidad se refiere a la prdida aparente de material de la disolucin, que disminuye la concentracin efectiva de la macromolcula (aumentando el s aparente). La explicacin que normalmente se da de este fenmeno es que, a elevadas velocidades, las molculas dejan atrs de s una estela que aumenta la velocidad de la molcula que est justamente detrs de ella. El resultado es la formacin de agregados moleculares que tienen valores de s muy elevados y que forman rpidamente un sedimento en el fondo del tubo de la centrfuga. Este proceso continua hasta que la concentracin es demasiado baja para que se produzcan agregados. El segundo tipo de dependencia con respecto a la velocidad, se produce con las grandes molculas a bajas concentraciones. En el caso del DNA de T4 (peso molecular = 106 x 106 daltones) el aumento de s es del 9% al pasar de 65 000 a 10 000 r.p.m.. Con molculas de DNA de mayor tamao (con pesos moleculares mayores a 500 x 106 daltones), la dependencia respecto a la velocidad se hace significativa y puede conducir a errores de entre tres y ocho veces al estimar el peso molecular. Este fenmeno tiene importancia, puesto que el ADN del cromosoma de bacterias y de los eucariotes poseen pesos moleculares que van de 2 x 109 a 10 x 109 daltones. En la siguiente grfica podemos ver como por encima de una cierta velocidad se pierde la dependencia de s respecto al peso molecular. Zimm ha propuesto que esto se debe a una alteracin de la forma (un agrandamiento) de las molculas de DNA, debido a que el arrastre creciente provocado por la friccin distiende los extremos de la molcula.

Peso molecular

Efecto de la Carga en la Sedimentacin

Cuando la sedimentacin se lleva a cabo en disoluciones de baja fuerza inica (menores 0.01 M) y la molcula esta elctricamente cargada, lo que suele ocurrir con la mayora de las macromolculas biolgicas, se presenta un fenmeno en el disolvente que no implica ningn cambio de conformacin. Debido a los elevados valores de s para las macromolculas, comparndolos con los de los iones neutralizantes, como Na+ y Mg+2, la macromolcula ionizada sedimenta mucho ms rpidamente que los iones estabilizadores. Esta separacin de las cargas crea un gradiente de potencial contrario a la direccin de sedimentacin, con el resultado de disminuir s. Para evitar esta complicacin, se realiza la centrifugacin con un exceso de iones estabilizadores, por ejemplo, utilizando una fuerza inica mayor a 0.05.

Medicin Exacta del Coeficiente de Sedimentacin

En primer lugar, habra que mantener la fuerza inica entre 0.05 y 1.0 para evitar efectos de la carga y el pH debera quedar regulado por una disolucin tampn. Debe efectuarse las medidas a varias velocidades, difiriendo entre ellas en un 50%, para asegurarse que los efectos de la velocidad no estn presentes. A cada velocidad debe usarse como mnimo cuatro concentraciones distintas, incluyendo la solucin ms diluida posible, para asegurarse de que o bien solamente hay un tipo de molculas o que se esta observando la proporcin real entre las distintas molculas. Por ltimo, debe calcularse s20,w con las ecuaciones dadas anteriormente.

CENTRFUGAS
Los experimentos de centrifugacin requieren aparatos que funcionan a velocidades exactamente conocidas con pequeas variaciones y sin fluctuaciones de temperatura. Existen varios criterios para clasificar las centrfugas, uno de ellos es por la mximo velocidad a la que operan, as tenemos:

Centrfugas de Baja Velocidad

Estas centrfugas son capaces de centrifugar hasta 6 litros de muestra a la vez, mantienen la muestra fra por un flujo de aire que pasa a travs del fondo de la centrifuga. Estas mquinas son utilizadas rutinariamente para procesos iniciales de muestras biolgicas; puede ser utilizadas para separar clulas, y con mayores velocidades, separar organelos as como ncleo y cloroplastos que tambin pueden ser separados por gradientes de densidad.

Centrfugas de Alta Velocidad

Estas centrfugas , usualmente con mximas velocidades de 18 000 25 000 r.p.m.,son mquinas que pueden generar cerca de 60 000 g, son muy baratas comparadas con las ultracentrfugas. Estas centrfugas tienen sistema de refrigeracin y algunos tipos tienen tambin sistema de vaco, sin embargo, las maquinas que cuentan con sistema de vaco son mas caras pero tienen la ventaja que controlan con mayor exactitud la temperatura. Al igual que las centrfugas de baja velocidad las centrfugas de alta velocidad son muy utilizadas para el fraccionamiento subcelular. La ventaja de los rotores verticales ha facilitado el uso de centrfugas de alta velocidad para las separaciones por gradiente.

Ultracentrfugas
La fuerza generada por las ultracentrfugas pueden ser significativamente mayor de los 600,000 g, los cuales son suficientes para separar protenas pequeas. Las ultracentrfugas son subdivididas en dos tipos: analticas y preparativas. La ultracentrfuga analtica a menudo es confundida con la ultracentrfuga preparativa. Sin embargo, los experimentos con la analtica son diferentes en varios aspectos. El ms importante es que cuenta con un sistema ptico, por lo que, la muestra es visualizada en tiempo real durante la sedimentacin, permitiendo la determinacin exacta de parmetros hidrodinmicos y termodinmicos. Adems, el propsito del experimento es para caracterizar las propiedades claves de la muestra o para purificar la muestra para un uso posterior.
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En contraste a muchas tcnicas biofsicas, las biomolculas son caracterizadas durante la ultracentrifugacin analtica en su estado nativo bajo condiciones biolgicas importantes. En el siguiente esquema se pueden observar las diferencias entre un rotor de una centrfuga analtica y una centrfuga preparativa.

Analtica

Preparativa

Las ultracentrfugas analticas Beckman se componen esencialmente de un motor, de un rotor de centrifugacin, que esta en una cmara blindada protectora y de un sistema fotogrfico para registrar la distribucin de las concentraciones de la muestra en la celda de centrifugacin, o bien, de una computadora. El rotor esta suspendido en el centro del motor mediante un cable. Uno de los agujeros del rotor contiene la celda de centrifugacin; el otro sirve para equilibrar el peso y contiene un agujero de referencia para determinar la distancia al centro de rotacin. Las paredes de la celda estn diseadas de modo que si se orientan con cuidado al colocar la celda en el rotor, tales paredes sern paralelas a las lneas del campo centrfugo, lo cual impide la acumulacin de materiales en las paredes de la celda. La celda consta de una pieza central que contiene la muestra lquida, dos ventanas, un cilindro soporte en el que se introduce la pieza central y las ventanas; y una compuerta de alimentacin. Las ventanas suelen estar hechas de cuarzo, aunque a veces se utiliza zafiro para centrfugas de velocidades muy altas puesto que se deforma menos cuando se opera a fuerzas elevadas. La pieza central suele estar hecha de metal (aluminio) o de plstico, las primeras tienen la ventaja de que el equilibrio trmico queda establecido rpidamente, reduciendo al mnimo la conveccin producida por los gradientes trmicos. La desventaja del metal es que a veces reacciona con el disolvente o el soluto por lo que, hay que utilizar el plstico. Una ultracentrfuga analtica es una ultracentrfuga preparativa complementada con un sistema de deteccin ptico que es capaz de medir directamente la concentracin de la muestra durante la sedimentacin. La introduccin de la ultracentrfuga analtica Beckman Coulter XL-A fue en 1992 y en contraste a la versin anterior (modelo E), el modelo XL-A es compacto y fcil de utilizar. Los parmetros de centrifugacin (velocidad del rotor, temperatura.) y adquisicin de datos son bajo control computarizado y experimentos largos, de horas o das, se llevan a cabo con la mnima intervencin del operador y si se desea, los datos pueden ser vistos o analizados en tiempo real. El modelo XL-A utiliza un sistema ptico de absorbancia basado en una lmpara de xenn, un rastreador monocromtico que permite la medicin de la concentracin de la muestra en un rango de longitud de onda de 200 a 800 nanmetros. El sistema ptico de interferencia Rayleigh fue adicionado al modelo XLA creando la ultracentrifuga analtica XL-I que puede obtener datos simultneamente con ambos tipos de sistemas pticos. El sistema ptico de interferencia Rayleigh mide la concentracin de la muestra basado en cambios en el ndice de refraccin.
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Cada sistema ptico tiene ciertas ventajas y desventajas. La ptica de absorcin es sensible para la deteccin de macromolculas que contienen fuertes grupos cromforos. Por ejemplo, tomando la ventaja de la intensa absorcin del grupo amida en el lejano ultravioleta (230 nm), las protenas pueden ser caracterizadas con una buena seal a concentraciones de 10 mg/ml. Similarmente, los cidos nucleicos pueden ser estudiados en la misma concentracin por su absorbancia a 260 nm. Para muestras que contienen dos a ms componentes con diferente espectro de absorcin (por ejemplo protenas y cidos nucleicos) los datos pueden ser obtenidos a mltiples longitudes de onda para detectar selectivamente las diferentes especies en solucin. El sistema ptico de interferencia Rayleigh es utilizado para el anlisis de macromolculas que carecen de cromforos intensos (ejemplo polisacridos) y muestras que contienen molculas que absorben fuertemente (ejemplo ATP, GTP, DTTOXIDADO). Este sistema ptico es utilizado para la caracterizacin de muestras muy concentradas.

Existe otro tipo de sistema ptico utilizado en las centrfugas analticas llamado sistema Schlieren, en el cual la luz que atraviesa las regiones de concentracin uniforme prosigue su camino sin desviarse, mientras que la que atraviesa regiones de concentracin cambiante se desva debido al cambio del ndice de refraccin que vara con la concentracin. El sistema ptico de las modernas centrfugas convierte estas desviaciones en una curva que muestra el gradiente de concentracin. Se puede ajustar el sistema de modo que las curvas sean ms o menos agudas; sin embargo, al realizar estos ajustes, el rea rodeada por la curva Schlieren y la lnea de base debe permanecer constante y proporcional a la concentracin. Midiendo estas reas y utilizando ciertas constantes pticas del aparato, se puede determinar la concentracin. A medida que disminuye la
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concentracin del material en la celda, tambin disminuye el rea englobada por el pico hasta que apenas puede diferenciarse de la lnea de base. En la prctica, el limite inferior del sistema Schlieren es una concentracin de algunos miligramos por milmetro. El valor del sistema Schlieren reside en su gran capacidad para examinar el perfil del frente de sedimentacin y para detectar la presencia de heterogeneidades en s. Se ha utilizado muy ampliamente, sobre todo para la determinacin del coeficiente de sedimentacin de las protenas. Otras variantes de centrfugas utilizadas ampliamente, son descritas a continuacin.

Centrfuga Tubular
Las centrifugas tubulares (CT) consisten bsicamente de un tubo vertical esbelto que gira a altas velocidades por la accin de un motor elctrico, o una turbina de aire o vapor. Este tipo de centrfuga es una de los ms eficientes y sencillos, capaz de separar partculas hasta de 0.1 mm. Las CT pueden contar con un sistema de enfriamiento por lo que son empleadas en el manejo de caldos con enzimas o protenas. Durante la operacin de la CT la suspensin es alimentada por la parte inferior y los slidos sedimentan en la pared del tubo. El lquido claro se recolecta por rebosamiento en la parte superior. Conforme se forma la precipitado el rea de flujo se reduce y el tiempo de residencia del liquido disminuye. Esto se traduce en un aumento gradual del contenido de slidos en el sobrenadante que puede ser determinado por mediciones de turbidez. Un modelo tpico de laboratorio consta de un tubo de 4.5 cm de dimetro por 25 cm de longitud, el cual puede girar a una velocidad de hasta 50 000 r.p.m., desarrollando campos de hasta 62 000 g, con una capacidad de hasta 100 l/h. En la siguiente imagen se muestra una centrfuga tubular.

Centrifugas de Cmara Mltiple

Las centrfugas de cmara mltiple fueron creadas para incrementar la capacidad de manejo de slidos de las centrfugas tubulares. Estas centrfugas consisten en una serie de tazones concntricos con deflectores que provocan un flujo en serie de la suspensin. Su operacin permite la clasificacin de las partculas conforme pasan de una cmara a otra. El lquido claro se obtiene por rebosamiento en la ltima cmara. Este arreglo genera un mayor tiempo de residencia del lquido, en relacin al de la centrfuga tubular, as como mayor capacidad de manejo de slidos.

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El dimetro de los equipos de cmara mltiple vara de 335 a 615 mm, con velocidades de rotacin entre 5 000 y 8 400 r.p.m., produciendo campos entre 5 000 y 9 000 g, respectivamente. La capacidad de manejo de slidos vara entre 2.5 y 60 litros dependiendo del material y del nmero de cmaras. La descarga de slidos y el mantenimiento de estos equipos es ms difcil que el de las centrfugas tubulares, ya que la centrfuga tiene que ser desarmada para sacar los slidos.

Centrfugas Decantadoras o de Tornillo

Las centrfugas decantadoras se caracterizan por un tazn horizontal con una seccin cilndrica y una seccin cnica, con una relacin de longitud a dimetro entre 1.5 - 3.5. el tazn contiene un tornillo transportador que gira en la misma direccin, pero a una velocidad ligeramente superior o inferior que el tazn (entre 5 100 r.p.m.) de diferencia. Las velocidades de rotacin son de 1 600 a 6 000 r.p.m. por lo que los campos centrfugos son menores que los de los otros equipos. En las centrfugas decantadoras la suspensin es introducida a travs de perforaciones por un tubo axial concntrico a la flecha del tornillo, al final de la seccin cnica o de compresin de slidos. Los slidos que se depositan en la pared son transportados y descargados continuamente por el extremo cnico de la centrfuga, donde escurren antes de salir. El lquido claro se obtiene por rebosamiento en el extremo opuesto a travs de orificios de descarga que fijan el nivel del lquido en la centrifuga. Existen diversos diseos de centrifugas decantadoras. Los dimetros de los tazones varan de 15 a 140 cm. Para los modelos piloto e industriales. La descarga de los slidos vara de 30 Kg/h hasta 60 Ton/h, con alimentaciones entre 308 y 1890 l/min, respectivamente. En Internet se encuentra un movie del funcionamiento de este tipo de centrfuga, la direccin es: http://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html

Centrfuga de Discos
La centrfuga de discos consta de un eje vertical sobre el cual se montan un conjunto de discos en forma de conos truncados, uno sobre otro. El rotor de la centrifuga provoca el giro tanto de los discos como del tazn de la centrifuga. Los discos constan de bordes internos que permiten mantener pequeas separaciones entre ellos, del orden de 0.5 a 2.0 mm. El ngulo que forman los conos con la vertical vara entre 35 y 500 dependiendo de la aplicacin particular. Entre la pila de discos y el tazn existe un espacio que permite la acumulacin de slidos. Durante la operacin de la centrifuga de discos la suspensin es alimentada continuamente en el fondo del tazn a travs de la parte central de la flecha, y fluye hacia arriba entre las placas hacia la salida en la parte central superior del equipo. Debido a la fuerza centrfuga, los slidos se depositan en la cara interna de los discos, resbalando hacia la cmara colectora debido al ngulo de los discos. La siguiente imagen muestra una centrfuga de discos. En Internet, se encuentra un archivo del funcionamiento de este tipo de centrfugas en la direccin: te://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html

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TIPOS DE ROTORES
Los rotores para centrfugas preparativas pueden ser clasificados en cuatro tipos principalmente: rotores de columpio, rotores de ngulo fijo, rotores verticales y rotores zonales.

Rotores de Columpio
En el caso de estos rotores la muestra estn en una cubeta individual el cual se mueve de forma perpendicular al eje de rotacin del rotor, por lo tanto, en estos rotores, la fuerza centrfuga es ejercida a lo largo del eje del tubo, y a pesar de que la fuerza centrfuga es axial, algunas partculas son sedimentadas sobre la pared del tubo; esto se puede evitar con la sedimentacin zonal. Estos rotores llevan de tres a seis tubos fijados a un soporte de metal que esta libremente suspendido, la suspensin libre sirve solo para fijar la posicin de inicio del tubo con la muestra, cuando el rotor comienza a girar, el bucket se pone de forma horizontal. Todos los buckets de un rotor son de igual masa por lo que slo se necesita balancear los tubos con la muestra. La superficie de los buckets debe de estar seca y limpia Los rotores de columpio Beckman tiene un nmero que designa la mxima velocidad permitida (r.p.m. x 1000) y por Ti si esta hecho de titanio, el digito adicional que sigue a la marca mencionada indica la variante del rotor con la misma velocidad mxima ( 50 Ti, 50.2 Ti, etc.) seguido de las letras SW. Estos rotores pueden ser divididos en tres grupos. 1.- Rotores de alta velocidad con tubos de 4.4 y 5 ml. Tipo SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti y SW 65 Ti. Estos rotores son convenientes para centrifugacin zonal y al equilibrio donde no es necesaria una fina resolucin. 2.- Rotores de velocidad moderada para tubos de 13.2 a 17 ml de capacidad, son convenientes para la separacin de partculas de masa similar por medio de centrifugacin zonal en gradientes de densidad de sacarosa. Este grupo incluye rotores del tipo SW 20.1, SW 40 Ti y SW 41 Ti. 3.- Rotores para tubos largos y de baja velocidad de rotacin. Incluye rotores del tipo SW 25.1 que contiene tres tubos de 34 ml, el tipo SW 25.2 (3x 60 ml) y SW 28 con seis tubos de 38.5 ml. A continuacin, la imagen corresponde a un rotor de columpio.

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Rotores de ngulo Fijo

Como su nombre lo indica los tubos tienen un ngulo fijo y cuando el rotor gira la solucin se reorienta en el tubo. El ngulo del tubo en el rotor puede variar de 140 a 400 . En los modelos comerciales existe una gran variedad de capacidades, rango de velocidades y ngulos de inclinacin. Los rotores con bajo ngulo son ms eficientes para sedimentacin porque el trayecto de las partculas que sedimentan es corto. Los rotores de ngulo fijo estn diseados para soportar altas fuerzas centrfugas, por arriba de 600 000 g . Las siguientes imgenes muestran dos modelos de rotores de ngulo fijo.

Eje de rotacin

rmin rmax

Rotores Verticales
Estos rotores se utilizan en la mayora de centrfugas de alta velocidad y ultracentrfugas. En estos rotores, los tubos estn en posicin vertical y se podra considerar que es una forma extrema de un rotor de ngulo fijo, sin embargo, las caractersticas del rotor vertical son lo suficientemente diferentes para considerarse otra categora. Cuando el rotor gira la solucin se reorienta 900, esta reorientacin se lleva a cabo debajo de las 1000 r.p.m. y si la aceleracin es suficientemente lenta la reorientacin no rompe el gradiente. La caracterstica importante de los rotores verticales es la corta trayectoria de sedimentacin de las partculas (que equivale al dimetro del tubo). El diseo de los rotores verticales permite muy altas fuerzas centrfugas.

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Los rotores verticales no son convenientes para sedimentacin pero pueden ser utilizados para centrifugacin isopcnica. La siguiente imagen muestra un rotor vertical.

Rotores Zonal
Los procesos de sedimentacin que se llevan a cabo en un rotor zonal son similares a los que ocurren en los rotores de bucket, sin embargo, en lugar de tubos hay cuatro sectores en el cuerpo del rotor zonal formados por la insercin de una cilindro de cuatro sectores que esta hecha de Noryl, un qumico inerte y suave. El ensamble del aspa asegura la rotacin del liquido junto con el rotor y consecuentemente la formacin de una fuerza centrfuga. La direccin de la sedimentacin es hacia la periferia del rotor. En el interior del centro de las aspas hay canales que conectan la parte central y la regin perifrica del rotor con un dispositivo transicional que se encuentra arriba del rotor. Esto permite que el rotor pueda ser llenado y descargado mientras esta girando a baja velocidad (2000 a 3000 r.p.m.), esto es necesario para crear un gradiente de densidad al inicio de la corrida y prevenir la ruptura del mismo despus del fraccionamiento. La densidad del gradiente aumenta del centro a la periferia del rotor haciendo que la fuerza centrfuga sea mantenida a lo largo de la corrida. La siguiente imagen ilustra la carga de la muestra: la solucin es bombeada o inyectada con una jeringa por un canal central, mientras el exceso de muestra es desalojado del sistema. Para asegurar la eficiencia de separacin el volumen no debe de exceder el 10 % de la cavidad del rotor. La inyeccin de la muestra debe de ser en forma lenta y uniforme.

El siguiente esquema muestra el paso final de una centrifugacin zonal. El rotor es cerrado con una tapa y gira a altas velocidades, las partculas estn distribuidas a lo largo del gradiente de acuerdo a sus respectivas constantes de sedimentacin.

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Carga y fraccionamiento de un gradiente: Mientras el rotor est girando lentamente el lquido de mayor densidad que ser usado en la formacin de gradiente se carga a travs de una conexin hacia el centro del rotor, seguida por las dems soluciones de densidad decreciente. El siguiente esquema muestra la salida de las soluciones del gradiente, esta es a travs de una lnea central donde la salida de la solucin menos densa precede a la ms densa. La solucin es monitoreada por un densitmetro, fluormetro o medidor de la radioactividad para que las fracciones puedan ser colectadas individualmente.

Se han desarrollado diferentes diseos de este tipo de rotores a los que se las ha agrupado en diferentes series, de tal manera que hay de la serie A, B, C, D, F, K y J. Cada serie agrupa a rotores que comparten caractersticas en cuanto a su velocidad. En la siguiente tabla se muestran las aplicaciones de los rotores en los diferentes tipos de centrifugacin.
Tipos de rotores y sus aplicaciones.

Tipo de separacin Tipo de rotor ngulo fijo. Vertical. De columpio. Zonal. sedimentacin zonal excelente Pobre Ineficiente Pobre isopcnica buena excelente adecuado adecuado

pobre buena buena excelente

Factor k y k
Un concepto para la seleccin o funcionamiento de un rotor es el factor k y el factor k. Estos factores pueden ser utilizados para comparar la eficiencia de varios rotores para el material con el que se esta trabajando. El factor k provee una estimacin del tiempo t en horas, requerido para separar la partcula de inters con un coeficiente de sedimentacin conocido s (en unidades Svedberg), a la mxima velocidad del rotor, por lo que tenemos: t= k / S20,w Si se conoce el coeficiente de sedimentacin de la partcula en el medio utilizado y el factor k del rotor, es posible estimar el tiempo de separacin de la partcula.

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El factor k se calcula de la siguiente manera k= ln (rmax/rmin) x 1013 w2 3600 donde, w es igual a 0.104720x r.p.m., rmax es la mxima distancia radial de el eje centrifugo (en cm) y rmin es la distancia mnima radial de el eje centrfugo (en cm). A menor valor de k, ms eficiente es el rotor, puesto que varia directamente proporcional al tiempo en que tarda la partcula en separarse. El factor k es utilizado para estimar el tiempo requerido para mover una zona de partculas a el fondo del tubo a travs de un gradiente lineal de sacarosa a la mxima velocidad del rotor. K = I Z2 I Z1 x 1013 W2 3600 Donde Z2 es el mximo porcentaje de el gradiente de sacarosa, Z1 es el mnimo porcentaje de el gradiente de sacarosa, I es el valor integral obtenido en unas tablas (ver tabla I del apndice), despus de calcular Z0. Z0 = Z1 rmax Z2 rmin rmax rmin El tiempo t (en hrs) para que una partcula (que se conoce su coeficiente de sedimentacin), alcance el fondo del tubo en un gradiente lineal de sacarosa se puede calcular por la siguiente ecuacin: t = k/s20,w. Frecuentemente el tiempo de corrida que se utiliza es el que se encuentra en la literatura, o bien, es determinado arbitrariamente hasta que se completa la separacin. El utilizar los factores k y k podra ahorrar tiempo en la centrifugacin. Estos factores pueden ser utilizados para convertir un tiempo de corrida de un tipo de rotor a otro. Por ejemplo si el rotor tipo 40 tiene una mxima velocidad de 40 000 r.p.m. se lleva 4 horas en realizar la separacin, el tiempo de corrida que se lleva un rotor tipo 60 Ti a 60 000 r.p.m. puede ser determinado por la siguiente relacin: t1 = k1 x t2 / k2 donde t1 es el tiempo de corrida de el rotor tipo 60 Ti, k1 es el factor k del rotor 60 Ti, t2 es el tiempo observado en el rotor tipo 40 y k2 es el factor k para el rotor tipo 40. Para el ejemplo anterior el tiempo de corrida para el rotor 60 Ti es aproximadamente de dos horas

TIPOS DE CENTRIFUGACIN
El objetivo de la centrifugacin es la separacin de partculas especificas en una solucin. El trmino partcula involucra sustancias disueltas y partculas de tamao microscpico y macroscpico que se encuentran suspendidas en un fluido que usualmente es agua. En biologa las partculas suelen ser clulas, organelos subcelulares o molculas grandes; en qumica, usualmente son solutos macromoleculares disueltos. Existen tres tipos principales de centrifugacin: Centrifugacin diferencial, centrifugacin zonal y centrifugacin al equilibrio.

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Centrifugacin Diferencial o Pelleting

En este mtodo, el tubo de la centrfuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solucin de la muestra, a travs de la centrifugacin se obtiene una separacin de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partcula sedimentada y un sobrenadante con la fraccin no sedimentada de la solucin. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podra estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamao y/o de las condiciones de centrifugacin. El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y esta contaminado con cualquier partcula no sedimentada que estuviera en el fondo de el tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantacin de la solucin sobrenadante del pellet. El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificacin con la formacin de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeo volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

Otro mtodo de separacin es por gradiente de densidad, un mtodo que es ms complicado que la centrifugacin diferencial pero tiene algunas ventajas: el mtodo de gradiente de densidad permite la completa separacin de algunos o todos los componentes de la mezcla y tambin permite que se puedan realizar mediciones analticas. Hay dos mtodos bsicos de centrifugacin por gradiente de densidad: La centrifugacin zonal y la centrifugacin isopcnica o al equilibrio.

Centrifugacin Zonal
Cuando se coloca una pequea cantidad de la disolucin con las molculas que se quieren caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo de centrifugacin, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior de el gradiente y cuando se centrifuga el tubo las molculas de la capa superior sedimentan a travs de el gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentacin sedimentarn en una estrecha franja, sin embargo, si hay molculas con distintos coeficientes de sedimentacin, se separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugacin y finalmente los diferentes componentes se resolvern en una serie de zonas o bandas, de ah el nombre de centrifugacin zonal. Una vez completada la centrifugacin, se fracciona el contenido del tubo generalmente por recoleccin de las gotas cuando se hace un orificio en el fondo del tubo y el goteo es lo suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una lamina del tubo y una fraccin est representada por una o varias gotas.

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Se pueden utilizar una gran variedad de tcnicas para medir la cantidad de los materiales y, a partir de stas, determinar la distribucin de las concentraciones. En la centrifugacin analtica se depende totalmente de tcnicas pticas para detectar las molculas. En cambio, las porciones obtenidas de un tubo fraccionado por goteo, pueden titularse radiactivamente por reacciones qumicas, por actividad enzimtica, por absorcin, fluorescencia o por una combinacin de todas estas tcnicas. La necesidad de un gradiente de concentracin para la centrifugacin zonal se debe a lo siguiente: considrese las consecuencias de colocar una disolucin de baja densidad sobre otra de alta densidad en la que no existe gradiente de concentracin. Inicialmente, el sistema es estable, debido a la diferencia de densidades en la interfase, supngase que hay pequeas fluctuaciones de temperatura en la disolucin, como la densidad de la mayora de las disoluciones disminuye al aumentar la temperatura, estas fluctuaciones crearn inversiones locales de la densidad lo que se traducir en un flujo local de lquido, flujo que recibe nombre de conveccin. Esta conveccin tendr un efecto nulo sobre la interfase inicial, ya que la diferencia de densidades en dicha interfase suele ser lo suficientemente grande como para que no se produzcan mezclas a travs de ellas, a menos que la diferencia de temperatura sea enorme (10 oC a 20 oC). Por el contrario, tras la sedimentacin, las molculas que se pretenden estudiar se habrn movido hacia el interior de las capas inferiores ms densas, donde la conveccin comentada puede distorsionar cualquier tipo de banda que pudiera formarse. La introduccin de un gradiente de densidad pronunciado asegura que los cambios de temperatura tengan que ser muy grandes para poder crear las diferencias de densidad suficientemente grandes para provocar conveccin en el interior del gradiente. Una segunda funcin importante del gradiente es el impedir las mezclas debidas a perturbaciones mecnicas; cualquier perturbacin sera contrarrestada por la tendencia a restablecer el equilibrio en el que la densidad baja esta por encima de la alta. El gradiente tiene una tercera funcin. Considrese un sistema sin gradiente en el que no existieran ni fluctuaciones de temperatura ni perturbaciones mecnicas, en el que las molculas que estn sedimentando han entrado en la capa inferior y formado una banda. En esta zona, la propia presencia de las molculas incrementa la densidad de la disolucin, normalmente un efecto muy pequeo, pero que es muy importante cuando se utilizan concentraciones elevadas. De modo que la densidad de la banda es superior a la de la capa inmediatamente por debajo de ella, lo que se traduce en el flujo convectivo de la zona hacia el fondo del tubo.

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Si, por el contrario, se realiza la sedimentacin a travs de un gradiente de concentracin previamente formado, las molculas en sedimentacin estaran constantemente entrando en una zona de mayor densidad . Su llegada aumentara la densidad de la regin, pero si el gradiente fuera suficientemente fuerte, el soporte de las molculas recin llegadas sera insuficiente para ocasionar una inversin de la densidad y el sistema permanecera estable. El material ms comnmente utilizado para formar gradientes de densidad es la sacarosa, debido a su pureza, su bajo costo y su no interferencia con la mayora de las mediciones qumicas, pticas o enzimticas. Si la macromolcula en estudio es una enzima o una protena inestable se usa frecuentemente el glicerol, puesto que muchas protenas son ms estables y se desnaturalizan ms difcilmente en presencia de glicerol. La separacin zonal es ideal para separar partculas de tamao definido (ejemplo: protenas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partculas del mismo tipo son heterogneas; en este caso, la separacin por centrifugacin zonal no es eficiente y es mas apropiado separar las partculas en base a otro parmetro como la densidad; por lo tanto se recurre a la separacin isopcnica.

Materiales para Generar un Gradiente de Densidad

Sacarosa: La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formacin de gradiente y es el ms utilizado en la centrifugacin zonal. Este material tiene aplicacin en el fraccionamiento de organelos celulares y virus. La razn de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia del material biolgico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentracin y viscosidad, densidad e ndice de refraccin en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugacin para la separacin de un gran tipo de muestras biolgicas. La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoqumicas. Las soluciones de sacarosa tienen alta fuerza osmtica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertnicas y solo tienen una densidad de 1.03 g/cm3 lo que reduce su uso en la separacin de partculas osmticamente sensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones isopcnicas son muy viscosas, por lo que, las partculas pequeas son incapaces de alcanzar su posicin isopcnica en el gradiente. La sacarosa es muy susceptible a hidrlisis de los enlaces glicoslicos a pH menores a 3. Cuando se calientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse por arriba de los 100 0C. Esta caramelizacin provoca cambios en las propiedades de la solucin de sacarosa. Como regla general, es mejor esterilizar por filtracin o bien, esterilizar la solucin de sacarosa con 0.1% de dietilpirocarbonato; el exceso de dietilpirocarbonato puede ser removido calentando la solucin a 60 0C por varias horas. La ventaja de tratar la solucin de sacarosa con dietilpirocarbonato es que inactiva a la mayora de las enzimas y por ello es utilizado para remover actividad ribonucleasa en las soluciones de sacarosa. Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromolculas y complejos macromoleculares, por ejemplo, protenas, cidos nucleicos, ribosomas y polisomas, tambin se utiliza gradientes de sacarosa para la separacin isopcnica de virus, organelos celulares y de clulas si la viabilidad no es esencial.

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Glicerol: El glicerol est disponible como reactivo puro y sus gradientes han sido utilizados en lugar de soluciones de sacarosa en centrifugacin zonal. Las soluciones de glicerol son menos densas y menos viscosas que las correspondientes soluciones de sacarosa, sin embargo, las soluciones de glicerol de la misma densidad de una solucin de sacarosa es mucho ms viscosa que la solucin equivalente de sacarosa. La ventaja de utilizar glicerol es que ayuda a conservar la actividad de un gran nmero de enzimas adems de ser muy barato. Polisacridos: Para evitar el problema que se puede originar en el fraccionamiento de partculas osmticamente sensibles (clulas y organelos) en altas fuerzas osmticas en las soluciones de sacarosa, se han utilizado un gran nmero de polisacridos como medio para la formacin de gradientes. Se han utilizado polisacridos como glucgeno, dextrn y otros materiales, sin embrago, el ms utilizado es el Ficoll. El Ficoll es producido por la copolimerizacin de molculas de sacarosa con epiclorohidrina para dar un polisacrido con un peso molecular promedio de 400 KDa. La soluciones de Ficoll por debajo del 20% (P/V) equivalente a una densidad de 1.07 g/cm3 son inertes osmticamente pero la desventaja que presentan es que a altas concentraciones, la osmolaridad aumenta abruptamente. El otro problema al trabajar con estas soluciones de Ficoll es su alta viscosidad. Su aplicacin ha sido en separaciones zonal e isopcnica. La muestra se puede separar de la solucin de ficoll por pelleting de la fraccin diluida. Gradientes de iodinato: la mayora de los compuestos iodinatos usados como medio para generar gradientes tienen una estructura basada en el cido tri-iodobenzoico, en el que los grupos hidroflicos estn unidos para aumentar la solubilidad de estos compuestos en agua. La metrizamida y Nycodenz son solubles en medio acuoso y son estables en un rango de pH 2 a 12.5. Las soluciones de metrizoato de sodio y Nycodenz no son termolbiles por lo que pueden ser esterilizadas en autoclave, sin embargo, el grupo glucosamida de la metrizamida la hace inestable a temperaturas por arriba de los 55 0C , por lo que, deben ser esterilizadas por filtracin. En comparacin con otros medios para generar gradientes, los compuestos iodinatos tienen grandes ventajas. Por ejemplo, a todas las densidades, los gradientes de iodinato presentan menor viscosidad y osmolaridad que los de sacarosa. Los gradientes de iodinatos pueden ser preformados y la muestra se carga en la parte superior del gradiente. Este mtodo es preferible para la preparacin de gradientes isopcnicos y para la separacin de partculas grandes (clulas, organelos et.) los cuales necesitan ser centrifugados por corto tiempo (2 horas o menos). Alternativamente, para partculas pequeas es posible realizar gradientes autogenerados durante la centrifugacin, en este caso, la muestra es mezclada con la solucin del gradiente haciendo posible el uso de un mayor volumen de la muestra. Suspensiones coloidales de slica: las suspensiones coloidales de slica contienen partculas en el rango de 3-15 milimtros de dimetro y son extensamente usadas para varias aplicaciones industriales y para separaciones centrfugas. El Percoll tiene algunas ventajas sobre las preparaciones de slica de las que deriva. Las partculas coloidales estn cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) la cual minimiza sus interacciones con material biolgico. Las suspensiones de slica coloidal son desestabilizadas por condiciones que tienden a neutralizar las cargas de las partculas, por lo tanto, el Percoll precipita a bajo pH y las altas fuerzas inicas tambin desestabilizan la suspensin coloidal. El Percoll interfiere con la mayora de los tipos de los anlisis de protenas y para algunos tipos de anlisis de cidos nucleicos y polisacridos. El uso de gradientes de Percoll es restringido para separaciones isopcnicas y estos gradientes pueden ser usados para clulas, organelos y algunos virus. La slica coloidal puede ser removida de las fracciones por centrifugacin diferencial para retirar el material fraccionado de la mayora de las partculas de slice.
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Formas de Gradientes
La forma del gradiente se refiere al perfil de concentracin, es decir, a la variacin de la concentracin en el gradiente a lo largo del tubo. Hay dos tipos bsicos de gradientes que son representados con funciones matemticas simples y son fciles de preparar con equipo de laboratorio, estos son: 1) Continuos que pueden tener forma lineal, convexo, cncavo y 2) discontinuo. La siguiente imagen muestra ambos gradientes.

Los gradientes continuos pueden ser producidos por adicin continua de una solucin de alta densidad CD desde un reservorio a un compartimento que contiene una solucin de baja densidad CL, mientras al mismo tiempo se desplaza la mezcla al tubo que contiene el gradiente. El gradiente producido es lineal si los dos compartimentos tienen el mismo dimetro. Cuando los compartimentos tienen diferentes dimetros se pueden producir gradientes convexos o cncavos como se puede observar en las siguientes figuras.

a) Gradiente lineal, b) Gradiente convexo y c) Gradiente cncavo

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La forma del gradiente es importante para lograr la separacin deseada, y para determinar propiedades tales como densidad de flotacin y coeficiente de sedimentacin. Los gradientes lineales en densidad son los mas utilizados y a menudo dan la mejor resolucin de componentes de protenas, enzimas, hormonas, subunidades ribosomales y algunos virus de plantas. En un gradiente lineal la densidad incrementa linealmente conforme aumenta la distancia del centro de rotacin. Cuando se disea un gradiente lineal en un rotor vertical o de columpio, la densidad en la superficie del gradiente debe soportar la muestra, mientras que la densidad en el fondo del tubo no debe exceder la densidad de las partculas a ser separadas y en general, a mayor pendiente del gradiente (ms pronunciado), mayor resolucin. Para algunas aplicaciones es necesario generar gradientes cncavos o convexos. Cuando el gradiente necesita un cambio pronunciado en la superficie para soportar la muestra y no tener un cambio abrupto conforme se acerque al fondo, es necesario utilizar un gradiente de forma convexa. Si es necesario que en la terminacin del gradiente haya un cambio abrupto, se puede realizar un gradiente de forma cncavo. Este tipo de gradiente es preferido cuando se necesita un cambio brusco en la viscosidad cerca del fondo del tubo, el cual puede ser utilizado para disminuir la sedimentacin de partculas de un tamao determinado mientras las zonas de menor viscosidad siguen separando a las otras partculas. Los gradientes cncavos son utilizados para separacin de lipoprotenas. En los gradientes discontinuos, el cambio de concentracin de las soluciones en el gradiente no es gradual. Los gradientes discontinuos se utilizan para separar clulas u organelos subcelulares de plantas u homogenados de tejidos animales y para la purificacin de algunos virus.

Centrifugacin al Equilibrio
En la separacin isopcnica las partculas son separadas en base a su densidad, el tamao solo afecta la velocidad con la que las partculas alcanzan su posicin isopcnica. Estas separaciones se llevan a cabo en un gradiente de densidad en el que las partculas se mueven hasta el punto en el que su densidad es la misma que el medio. La tcnica de centrifugacin al equilibrio fue desarrollada por Matthew Meselson, Franklin Stahl y Jerome Vinograd. En esta tcnica la densidad del disolvente es casi la misma que la de la molcula que se est estudiando. Esta tcnica requiere un tercer componente (normalmente una sal de cesio), de bajo peso molecular y elevada densidad. Cuando se centrifuga la disolucin, las sal se redistribuye y alcanza un equilibrio, formando, un gradiente de concentracin que es menos denso en la parte superior y ms denso en el fondo del tubo obtenindose como resultado un gradiente de densidad. Las macromolculas tambin sedimentan, pero el material en la parte superior del tubo se mueve centrfugamente a travs del gradiente, mientras que el mismo material en la parte baja del tubo se mueve centrpetamente. Este movimiento continua hasta que las macromolculas forman una banda en una posicin determinada del gradiente de concentracin, posicin en la que la densidad de la macromolcula iguala a la de la disolucin. La anchura de la banda est determinada por el equilibrio entre la fuerza centrfuga (que tiende a estrechar la banda), la difusin (que tiende a ensancharla) y el gradiente de densidad (un gradiente ms pronunciado dar una banda ms estrecha). Como se mencion anteriormente, la muestra se mezcla con la solucin del gradiente y conforme se lleva a cabo la centrifugacin se genera el gradiente (gradiente autogenerado) a la vez que se separan las partculas de la muestra. Sin embargo, la muestra puede ser colocada en la superficie de un gradiente preformado de igual forma que en la centrifugacin zonal.

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Gradientes de Densidad Autogenerados

Tal como se indic anteriormente, si se extiende una capa de la muestra sobre una disolucin ms densa sin gradiente de densidad, la conveccin acabar destruyendo o dilatando el lmite de sedimentacin. Vinograd se dio cuenta de que si la muestra estaba en una disolucin de muy baja densidad, debido a la difusin del soluto utilizado para incrementar la densidad de la disolucin ms densa, al cabo de un cierto tiempo la discontinuidad de la densidad generada en la interfase se propagara lentamente hacia el fondo del tubo de centrifugacin, formando un gradiente suave. Por debajo del frente generado por el gradiente que se va propagando, no existe gradiente y puede producirse la conveccin. Por el contrario, en el gradiente en propagacin y por encima de l, hay una estabilizacin frente a la conveccin. Obviamente el material en estudio no sedimenta con mayor velocidad que la de propagacin del gradiente, el material se hallar en un gradiente de densidad y la sedimentacin ser completamente normal, es ms, si el soluto de la disolucin ms densa tiene una densidad muy elevada, como ocurre con el cloruro de cesio, la sal tambin sedimentar ligeramente formando un gradiente estabilizador adicional. Se ha denominado a esta tcnica sedimentacin en gradientes de densidad autogenerados.

Materiales para formar Gradientes Autogenerados

Sales de cesio Los gradientes de sales de cesio fueron primero utilizados para la separacin isopcnica de cidos nuclecos y se han establecido como los ms extensamente utilizados para la formacin de gradientes isopcnicos. Todas estas soluciones son altamente inicas, son no viscosas pero, tienen alta osmolaridad. Los gradientes de soluciones de sales de cesio se pueden generar in situ por centrifugacin. Lo abrupto del gradiente formado depende del campo centrfugo aplicado y del soluto utilizado; por ejemplo, para una fuerza centrifuga dada el sulfato de cesio forma gradientes mas abruptos que los que se forman con cloruro de cesio.

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Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de acuerdo a su composicin de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina bandean denso. El grado de separacin de diferentes especies puede ser utilizado por la adicin de drogas como la distamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en adenina y timina y disminuye la densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de etidio, es posible separar DNA de diferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal) incluso teniendo la misma composicin de bases. Los gradientes de sulfato de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA, sin embargo, la composicin de bases tiene un efecto pequeo en la densidad de flotacin de DNA y los gradientes deben de ser abruptos. Una ventaja de los gradientes de sulfato de cesio comparado con el gradiente de cloruro de cesio es que ellos pueden ser utilizados para bandear RNA. Algunas especies de alto peso molecular de RNA tienden a agregarse y precipitar en gradientes de sulfato de cesio, sin embargo, estos se pueden minimizar adicionando urea 4 M al gradiente. Cuando se utiliza un gradiente abrupto es posible bandear protenas, DNA y RNA en un solo gradiente de sulfato de cesio. Un problema con los gradientes de sulfato de cesio es que los iones de sulfato reaccionan y se precipitan con la mayora de los fluidos de centelleo. El cloruro de cesio y el sulfato de cesio son las sales de cesio mas utilizadas para la separacin de cidos nucleicos, sin embargo, hay otras sales de cesio que pueden ser utilizadas para obtener mejores separaciones. Por ejemplo, las sales de tricloroacetato y trifluoroacetato se han utilizado para buenas separaciones de cidos nuclecos. En el caso del trifluoroacetao de cesio es posible obtener una buena separacin de plsmidos superhelicoidal y DNA lineal sin la adicin de bromuro de etidio. Sales de sodio y potasio. El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayora de las macromolculas, el bromuro de sodio, el yoduro de sodio, el bromuro de potasio y el yoduro de potasio forman soluciones densas no viscosas y han sido utilizadas para el bandeo de lipoprotenas, protenas y cidos nucleicos. Una ventaja de los gradientes de yoduro de potasio y de yoduro de sodio es que el RNA no se agrega y precipita como en los gradientes de sulfato de cesio. Sin embargo, las sales de yodo tienen la desventaja de que son propensas a la oxidacin y se pueden adicionar algunos agentes reductores para prevenir la formacin de yodo libre. Sales de rubidio. Estas sales han sido utilizadas para fraccionamientos isopcnicos, en particular se han utilizado gradientes de cloruro de rubidio en lugar de gradientes de cloruro de cesio para separaciones isopcnicas de protenas, sin embargo el uso de esta sal para la formacin de gradientes no presenta mas ventajas que las que se obtienen al utilizar gradientes con cloruro de cesio.

PREPARACIN DE GRADIENTES Preparacin de Gradientes Discontinuos

Los gradientes discontinuos pueden ser hechos simplemente colocando una solucin de baja densidad sobre otra mas densa, sin embargo una mejor interfase puede ser obtenida si la solucin mas densa es colocada bajo la solucin menos densa utilizando una jeringa con una aguja larga o una pipeta. El principal problema es que algunos solutos (ejemplo: cloruro de cesio) difunde rpidamente as que la

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interfase desaparece rpidamente. La siguiente imagen muestra las dos formas de hacer un gradiente discontinuo.

A)

Cargando por arriba, B) Cargando por abajo

Preparacin de Gradientes Continuos

Este tipo de gradientes incluye a los gradientes autoformados y los gradientes preformados. Los gradientes tambin pueden ser divididos en normales e isoosmticos. Los ltimos son importantes para la separacin de clulas. Con la excepcin de gradientes de Percoll, los gradientes autoformados no pueden ser isoosmticos.

Generacin de Gradientes Preformados

Los gradientes continuos pueden ser preparados simplemente adicionando las soluciones de diferentes concentraciones para que puedan difundir. Por ejemplo, para un gradiente de sacarosa de 5-20%, se agregan cantidades iguales de cada solucin 5, 10, 15 y 20 %, una tras otra (en orden descendiente de concentracin) y se dejan difundir de 12-18 h si el tubo es vertical y de 1-2 h si el tubo es colocado horizontalmente. Este mtodo es aplicable para la mayora de los solutos para realizar gradientes, sin embargo, existen dispositivos para preparar gradientes con diferentes perfiles. En la siguiente imagen se describe la formacin de un gradiente continuo a partir de un discontinuo.

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El dispositivo utilizado para la formacin de gradientes se esquematiza en la siguiente imagen .

El lquido denso en la cmara A se mezcla continuamente con el lquido menos denso en la cmara B. El flujo es producido por una bomba peristltica (P) la cual coloca el lquido cada vez ms denso en el fondo del tubo de centrifuga. La llave (T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cmara B se da con un agitador magntico (SB).

Gradientes Autogenerados
En un gradiente autogenerado, las soluciones son centrifugadas y las molculas del medio tienden a sedimentar formando un gradiente de densidad. En algunos casos, los gradientes como los de Percoll, forman muy rpidamente un gradiente (20,000 g x 30 min.) sin embargo, hay otras soluciones como el cloruro de cesio que toma muchas horas para alcanzar el equilibrio. Existen una serie de ecuaciones que permiten conocer algunos parmetros tiles en una corrida de centrifugacin. En el caso de metales alcalinos (ej. CsCl) es posible predecir el rango del gradiente y el tiempo en que alcanza el equilibrio. Estos clculos son basados en el valor de b0 (ver valores en el apndice) que es la constante de proporcionalidad del gradiente de densidad cuyo valor ha derivado de trabajos experimentales. Utilizando este valor, el rango del gradiente de densidad en el equilibrio puede ser calculado como sigue. Primero es necesario encontrar el punto de isoconcentracin de el gradiente. Este es el punto (rc) donde la concentracin del gradiente es constante independientemente de su forma: rc= [1/3 (rmin2 + r min x rmax + rmax2)] 1/2 Donde rmin y respectivamente. rmax son la distancia radial (cm) de la parte superior y del fondo del gradiente

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La densidad (dr) en cualquier punto r de el centro de rotacin relativo a la densidad en el punto de isoconcentracin puede ser calculada con la siguiente ecuacin: dr = 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 r2) 2 b0 donde N es la velocidad del rotor en miles de r.p.m.. Por lo tanto, conociendo la densidad inicial de la solucin (di), es posible calcular la densidad mxima (en el fondo del tubo) y la densidad mnima (parte superior del tubo) del gradiente en el equilibrio utilizando las siguientes ecuaciones: dmax = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 rmax2) 2 b0 dmin = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 rmin2) 2 b0 Una vez teniendo los valores de dmax y d min , por diferencia podemos conocer el valor del rango de densidad (Dd) que est presente a lo largo del tubo del gradiente, o bien, rearreglando las anteriores ecuaciones, tenemos que:

Dd = 0.545 x 104 x N2 (rmax2 rmin2) = dmax- dmin b0 Alternativamente podemos utilizar esta ecuacin para conocer la velocidad del rotor siempre que se conozca el valor de Dd. Es muy importante conocer el valor de la d max de el soluto con el que estamos formando el gradiente, este parmetro nos informa si el soluto cristaliza en el fondo del tubo. Por ejemplo, cuando la densidad del cloruro de cesio en el fondo del tubo es mayor a 1.8 g/cm3 (1.75 g/cm3 a bajas temperaturas), se encuentra formando cristales y puede ocasionar dao en el rotor. Por otra parte, el tiempo para llegar al equilibrio es muy grande, tpicamente 100 hrs. para un gradiente de 12 ml, sin embrago, la velocidad a la que se forma el gradiente es exponencial, y una buena separacin se puede obtener en una tercera parte del tiempo calculado. El tiempo requerido para que las partculas alcancen la posicin isopcnica puede ser calculado para gradientes no viscosos (CsCl) usando la siguiente ecuacin: t (h) = 9.83 x 1013 x b0 (dp 1) Q4 x rp2 x sp Donde dp y sp son la densidad y coeficiente de sedimentacin de la partcula, y rp es la distancia radial de la banda de partculas en el equilibrio.

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Determinacin de la Forma de un Gradiente Autogenerado

Para saber la forma de un gradiente autogenerado, es necesario seguir la siguiente formula para saber el valor de la pendiente (dd/dr): dd = w2 r = 1.1 x 10-2 N2 r dr b0 b0

Donde w es la velocidad angular (rad/seg), r es la distancia (cm) de el eje de rotacin, N es la velocidad del rotor (r.p.m.). Esta ecuacin puede predecir la pendiente del gradiente para la regin central que abarca.

Gradientes Isoosmticos
La separacin de clulas animales y otras partculas sensibles osmticamente requieren que el gradiente para la centrifugacin sea conveniente osmticamente, es decir, mantengan constante la osmolaridad a travs del gradiente. Las soluciones utilizadas son: suspensiones de slica coloidal como el Percoll, iodonidatos como el Nycodenz y metrizamida.

Anlisis de la Distribucin de la Muestra en el Gradiente

Inspeccin visual, anlisis flouromtricos y espectrofotomtricos: En algunos casos, la inspeccin visual simple podra revelar la posicin de la banda de inters, por ejemplo, las bandas mitocondriales tienen un color caf que las distingue y el DNA en gradientes de cloruro de cesio y con bromuro de etidio presenta un color rosa. Estas bandas pueden ser removidas utilizando una jeringa o una pipeta para su anlisis posterior. En otros casos, las partculas absorben o dispersan la luz, as que, su posicin puede ser determinada por medicin de la densidad ptica en un espectrofotmetro. Los cidos nuclecos y las protenas absorben en la regin ultravioleta del espectro sin embargo, hay algunos medios (NaI, Nycodenz) que absorben fuertemente en la regin ultravioleta y otros medios que dispersan la luz (Percoll) haciendo que sea muy difcil la medida de la absorcin de la luz. A menudo los problemas asociados con la medida directa pueden eliminarse utilizando anlisis colorimtrico o fluorimtrico para diferentes tipos de macromolculas, sin embargo, en estos ensayos no es fcil remover la fraccin del gradiente lo que involucra perdida de materiales, en el peor de los casos puede ser no selectivo y dar un fraccionamiento falso. Es posible utilizar marcadores para fraccionamiento subcelular (ver tabla 5 Apndice) para poder distinguir su banda despus de una centrifugacin. A continuacin se muestra un tubo de centrifuga despus de un fraccionamiento por centrifugacin zonal, en donde podemos ver claramente las diferentes fracciones.

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Fotografa de un fraccionamiento de hepatocito de rata utilizando centrifugacin zonal con rotor vertical.

Anlisis Radioqumicos de Muestras

Los anlisis radioisotpicos son convenientes para analizar un gran nmero de partculas biolgicas, si los istopos son 125I o 32P, las muestras pueden ser contadas en un contador de centelleo. Este mtodo tiene la ventaja de que las fracciones de inters pueden ser identificadas y recuperadas despus de contarse para procedimientos analticos posteriores, sin embargo, el uso de estos istopos exponen al usuario a la radiacin. Los istopos mas utilizados son 3H, 14C y 35S y en todos los casos las muestras pueden ser mezcladas con fluidos de centelleo antes de medir su actividad en un contador. Los ensayos radioisotpicos pueden ser afectados por extincin en el gradiente y puede variar de una muestra a otra. La mayora de las sustancias con las que se hace un gradiente actan como agentes extinguidores y el sulfato de cesio precipita casi todos los tipos de fluidos de centelleo. La extincin de istopos de baja energa tiende a ser mucho mayor que la de istopos de mayor energa, por ejemplo las muestras que estn marcadas con 3H se extinguen mas fcilmente que las muestras que tienen 14C.

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APLICACIONES Cromatografa de Precipitacin Centrfuga

Un nuevo sistema de cromatografa introduce un gradiente de concentracin generado internamente con sulfato de amonio a travs de un conducto de separacin bajo un campo de fuerza centrfuga. Las muestras de protenas son expuestas a un incremento gradual de concentracin de sulfato de amonio y precipitado a lo largo del conducto, entonces se inicia la elusin cromatogrfica disminuyendo gradualmente la concentracin de sulfato de amonio en el gradiente que causa que las protenas se disuelvan y precipiten a travs del canal; consecuentemente, las protenas salen de acuerdo a su solubilidad en la solucin de sulfato de amonio. La columna de separacin consiste en un par de discos equipados que tienen dentro una membrana de dilisis de tal manera que se forman dos canales divididos por esta membrana. El disco es ensamblado en una centrfuga de flujo continuo. Cuando una solucin concentrada de sulfato de amonio es eluda a travs de un canal y el agua a travs de otro canal en direccin opuesta, se forma un gradiente exponencial de sulfato de amonio. Este nuevo mtodo elimina varias complicaciones tales como prdida de la muestra por absorcin y desactivacin causada por el soporte slido y el arrastre de los precipitados finos a travs de la columna cromatogrfica. En suma el mtodo ofrece varias ventajas incluyendo: la capacidad de concentrar la muestra dentro del canal, la manipulacin mas flexible del gradiente a travs del canal y la completa eliminacin de impurezas de bajo peso molecular. En la siguiente figura se muestra la separacin de suero humano bajo las siguientes condiciones experimentales: 0.05 ml en un ml de solucin de buffer, gradiente de sulfato de amonio de 95 a 0 % x 1600 min, se utiliza una centrfuga de flujo continuo a 2 000 r.p.m., la velocidad de flujo de elusin del gradiente de sulfato de amonio de 1 ml x min y la deteccin fue a 275 nm.

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Microscopio de Polarizacin Centrfuga

La razn del desarrollo de este tipo de microscopio centrfugo es que permite utilizar luz polarizada y observar estructuras finas dinmicas en clulas vivas que estn expuestas a aproximadamente 11 500 veces la fuerza de gravedad de la tierra. El espcimen se coloca en un rotor conectado a un motor, la imagen es apreciada en un microscopio externo y aunque el objeto est girando, la imagen es capturada por una cmara CCD que esta sincronizada al rotor de la centrfuga, la imagen tiene una resolucin menor a una micra y es detectada con una sensibilidad de retardo menor que un nanmetro. En la siguiente figura podemos ver la imagen de un microscopio polarizado centrfugo.

La siguiente figura muestra un huevo de erizo de mar (Arbacia punctulata) observado en un microscopio de polarizacin centrfugo en donde se utiliz un gradiente isopcnico y despus de haber centrifugado 15 min a 5 200 r.p.m.

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Separacin de DNA, RNA y Protenas de Ncleos de Fibroblastos de Hamster.

Los ncleos purificados fueron suspendidos en 6 M de cloruro de guanidino y 10 mM EDTA (pH = 7), despus de este tratamiento las uniones entre cidos nucleicos y protenas son disociadas. La mezcla fue sonicada para reducir la viscosidad. Los carbohidratos fueron extrados con acetato de etilo y 2.2 ml de lisado fue centrifugado en un rotor SW 50.1 con 2.8 ml de 2.2 M de sulfato de cesio que contiene 10 mM de EDTA y 9 % de DMSO. La centrifugacin se llevo a cabo a 35 000 r.p.m. a 20 0C por 40 hrs. Tres bandas muy bien separadas fueron colectadas. Los cidos nucleicos fueron monitoreados por absorcin ultravioleta y las protenas fueron detectadas por tincin con fluorescena.

Separacin de DNA en Base a la Composicin GC con uso de BAMD

La aplicacin de un compuesto rgano mercurial conocido con el nombre de BAMD (3,6 bis (acetoximercuriometil) dioxano), es ms eficiente que los iones de mercurio. El BAMD interacta principalmente con regiones ricas de GC del DNA, la formacin del complejo BAMD-DNA ocurre bajo vigorosa agitacin de las soluciones en 0.1 M de sulfato de sodio que contiene 5 mM de buffer de borato de sodio pH 9.2. La densidad de inicio de la solucin de sulfato de cesio debe de ser 1.47 g / cm3. La regin rica del DNA satlite del timo de ternero fue purificado con BAMD, la centrifugacion se llev acabo en un rotor Spinco 65 a 35 000 r.p.m. x 60 h y en rotor Spinco 30 a 25 000 r.p.m. x 110 h. El DNA fue parcialmente separado y slo la regin rica en GC form una banda separada cerca al menisco del tubo. Un tercer paso para la separacin fue por centrifugacin isopcnica en gradientes de cloruro de cesio.

Separacin de DNA Nativo y Desnaturalizado con Gradientes de Densidad de Tricloroacetato de Rubidio

La densidad de flotacin del DNA desnaturalizado en solucin de tricloroacetato de rubidio es 1.675 g / cm3 y del DNA nativo es 1.48 g / cm3 entonces, la diferencia entre las densidades del DNA nativo y desnaturalizado es 0.177 g / cm3 , esto es 10 veces la diferencia de densidad que se presenta en cloruro de cesio (0.016 g / cm3). La centrifugacin fue llevada en un rotor SW Ti x 36 hrs a 45 000 r.p.m. y 250 C. El gradiente fue preformado con cinco soluciones de diferentes densidades: 1.695 g / cm3, 1.635 g / cm3, 1.575 g / cm3, 1.515 g / cm3 y 1.455 g / cm3. La separacin de DNA nativo y desnaturalizado fue tan eficiente que uno puede esperar separar molculas con regiones nicas entrelazadas (hbridos de DNA imperfectos) de perfectas molculas de doble cadena; tambin es posible separar molculas circulares intactas de molculas con rupturas en una de las cadenas o en base a sus diferentes propiedades de desnaturalizacin.

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Fraccionamiento de RNA
Si es necesario separar un rango completo de molculas de RNA desde s20,w = 4S a s20,w = 28S (1:7) en una corrida de centrifugacin se puede utilizar un gradiente abrupto con una diferencia de concentracin de 25 %, por ejemplo 10 35 % de sacarosa a la mxima velocidad del rotor SW 40 Ti. Se utiliz una centrifugacin a 30 000 r.p.m. x 14 hrs a 0 0C. Utilizando nomogramas ( d = 1.5) dan una posicin de x / L = 0.45 para RNA 28 S y x / L = 0.06 para RNA 4 S. Nota: los nomogramas son grficas que representan unas constantes (a , S ) en el eje de las ordenadas y x/L (longitud del gradiente) en el eje de las absisas. Estas grficas ayudan a obtener los parmetros para realizar una centrifugacin.

Separacin de DNA Plasmdico en Rotores de Tubo Vertical

Se utilizaron cultivos de E. coli en donde los cidos nuclecos fueron separados utilizando un procedimiento alcalino. Se llev a cabo una centrifugacin a 5 000 r.p.m. a 4 0C en una centrifuga J-6 usando un rotor JS-5.2 con varios adaptadores. El Pellet de cidos nuclecos (plsmido y fragmentos cromosomales, RNA y algunas protenas ), fue resuspendido en buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4). El cloruro de cesio fue adicionado a una densidad final de 1.55 g / ml, y bromuro de etidio a una concentracin final de 0.06 mg / ml. Se centrifug 4.2 hrs a 55 000 r.p.m. en un rotor VTi. Despus de la centrifugacin, la banda del plsmido fue colectada, el bromuro de etidio fue removido con n butanol saturado con agua y cloruro de cesio y finalmente, los cidos nuclecos fueron precipitados 2 veces con etanol.

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Fraccionamiento Celular por Centrifugacin Diferencial

Condiciones: primera centrifugacin: 600 g por 5 min segunda centrifugacin: 3000 g por 20 min tercera centrifugacin: 15 000 g por 1 h

La centrifugacin es una tcnica que no slo se utiliza en el laboratorio, sino que tambin se usa a nivel industrial. Por ejemplo es utilizada para purificar y recuperar aceites, fluidos hidrulicos y enfriadores ahorrando miles de dlares a la industria. Otra aplicacin es en la industria de alimentos en donde las centrfugas son utilizadas en muchas operaciones. Por ejemplo en la extraccin de protenas comestibles de productos vegetales y animales; en la industria farmacutica cada vez tienen ms auge en procesos de control automatizados. Las impurezas del caf, t y jugos de fruta son eliminadas con la ayuda de centrfugas. Cabe mencionar que cada vez son ms las aplicaciones de la centrifugacin en micro y macro escala, sto es debido a los nuevos diseos automatizados que proporcionan mayor eficiencia y nuevas aplicaciones en los procesos de separacin de molculas.

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BIBLIOGRAFA
Ito, Y., (2000) Centrifugal Precipitation Chromatography :Principale, Apparatus, and Optimization of Key Parameters for Protein Fractionation by Ammonium Sulfate Precipitation. Analytical Biochemistry. 277. 143-153.

Inou, S., Knudson, R.A., Goda, M., Suzuki, K., Nagano, C., Okada, N., Takahashi, H., Ichie, K., Iida, M., Yamanaka, K., (2000) Centrifuge polarizing microscope. I. Rationale, design and instrument performance. Journal of Microscopy. 201. 341-356. Inou, S., Knudson, R.A., Goda, M., (2000) Centrifuge polarizing microscope. II. Sample biological applications. Journal of Microscopy. 201. 357-367. Little, S.E., (1989) Plasmid DNA Separations in High Performance Vertical Tube Rotors. Effect of Speed on Run Times. Beckman Instruments, Inc. DS-726. Griffith, O. M., Techniques of Preparative, Zonal, and Continuous Flow Ultracentrifugation. Beckman Instruments, Inc. 50 pp. Wen Hsu, H.,(1981) Separations by Centrifugal Phenomena, Techniques of Chemistry Volume XVI. John Wiley & Sons, Inc. 466 pp. Tejeda, A., Montesinos, R.M., Guzmn, R., (1995) Bioseparaciones. Unison. Capitulo 4 Centrifugacin. Rickwood, D., Ford, T.C., Steensgaard, J., (1994) Centrifugation Essential Data. John Wiley & Sons, Inc. 114 pp. Ford, T.C., Graham, J.G., (1991) An Introduction to Centrifugation, BIOS Scientific Publishers, Oxford. 118 pp. Rickwood, D., (1984) Centrifugation: a Practical Approach. 2nd edition IRL Press, Oxford. Cole, J.L., Hansen, J.C., (1999) Analytical Ultracentrifugation as a Contemporary Biomolecular Research Tool. Journal of Biomolecular Techniques. 10. 163-176.

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APNDICE
En el siguiente apndice se encuentran algunas tablas con informacin relevante en el tema de la centrifugacin, cada una tiene un encabezado que permite identificar su uso.

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