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Prctica 1

Produccin de anticuerpos policlonales Inmunizacin experimental de ratones Semestre B-2010

Introduccin Los anticuerpos o inmunoglobulinas son un grupo de glicoprotenas heterogneas presentes en el plasma y en los tejidos que poseen una especificidad de enlace para un antgeno particular. El mtodo usual para producir anticuerpos policlonales experimentalmente consiste en la inoculacin de animales con preparaciones purificadas o parcialmente purificadas de antgeno (inmungeno). La administracin de un inmungeno in vivo estimula diferentes clulas del sistema inmune, dando origen a una poblacin mixta de anticuerpos derivados de un nmero variado de clones de linfocitos B (policlonal). El suero de un animal inmunizado contiene estos anticuerpos y es referido como antisuero policlonal. Los anticuerpos policlonales son particularmente valiosos como reactivos biolgicos para el estudio de protenas, clulas y tejidos cuando se utilizan en tcnicas muy diversas, tales como: ELISA, inmunofluorescencia e inmunotransferencia. Los mtodos de inmunizacin experimental son muy variados y dependen del uso que se le quiera dar al anticuerpo producido. En general, al establecer un protocolo de inmunizacin experimental se debe tomar en consideracin un conjunto de factores que afectan el tipo y la magnitud de la respuesta humoral del animal inmunizado. Estos factores son los siguientes: la especie del animal utilizado, la constitucin gentica del animal, el tipo, la dosis y la ruta de administracin del inmungeno, el nmero de inmunizaciones (refuerzos) y el uso de adyuvantes. La seleccin del animal para la produccin de anticuerpos policlonales depende de la cantidad de antisuero deseada, la experiencia previa con el inmungeno y la distancia evolutiva entre la especie de donde se aisl el inmungeno y la especie del animal inmunizado. En el laboratorio se inmuniza frecuentemente conejos puesto que son fciles de mantener, responden bien frente a un amplio rango de antgenos y es posible obtener hasta 25 ml de suero de cada desangrado sin efectos dainos para el animal. Sin embargo, la inmunizacin experimental puede realizarse tambin en otras especies, tales como: ratones, ratas, cobayos, gallinas, cabras y ovejas. La constitucin gentica del animal influye sobre el tipo y grado de respuesta inmune del animal inmunizado. Los genes que codifican el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), los receptores de antgeno de los linfocitos T y B y otros genes involucrados en los mecanismos inmunoregulatorios juegan un papel fundamental en la respuesta inmune. Por tal razn se suele inmunizar de dos a tres conejos y de 4 a 6 ratones con el mismo antgeno. La produccin de anticuerpos policlonales depende en gran medida de la calidad, cantidad y pureza del inmungeno as como la especificidad y sensibilidad del ensayo donde se desee utilizar el anticuerpo. Las protenas son las molculas ms inmunognicas, mientras que los carbohidratos, los lpidos y cidos nucleicos son poco inmunognicos. En general, mientras ms purificado y menos heterogneo sea un antgeno, mayor ser la probabilidad de obtener el anticuerpo deseado con alta especificidad. El principal problema con las preparaciones de antgenos heterogneas es la falta de especificidad deseada en el antisuero resultante, ya que algunas molculas contaminantes de la preparacin son frecuentemente ms antignicas que el inmungeno de inters y el antisuero resultante podra tener mayor especificidad hacia las molculas contaminantes que hacia la protena de inters.

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La mayora de los antgenos de inters son las sustancias solubles, los cuales tienen una inmunogenicidad variable dependiendo del tamao de la molcula y de la composicin qumica. Las molculas ms inmunognicas tienen una masa molecular cerca de 100.000 Da mientras que las sustancias con pesos inferiores a 5000 Da son poco inmunognicas. Estas sustancias de bajo peso pueden hacerse inmunognicas si se les conjuga qumicamente a una protena (haptenoportador). La mayora de los antgenos requieren la adicin de sustancias adyuvantes a fin de mejorar su inmunogenicidad. Un adyuvante es una sustancia que al inocularse junto con el antgeno mejora de manera no especfica la respuesta inmune frente a ese antgeno. Ellos prolongan la persistencia del antgeno, aumentan las seales coestimulatorias y estimulan la proliferacin de linfocitos de manera inespecfica. Entre los adyuvantes ms utilizados se encuentran las sales de aluminio, carbn, aceites minerales, y componentes de la pared bacteriana. El adyuvante de Freud incompleto es muy utilizado y est constituido por una mezcla de aceite mineral y detergente mientras que la incorporacin de Mycobacterium tuberculosis a la mezcla de aceite produce el adyuvante completo de Freud. La magnitud de la respuesta inmune depende tambin de la dosis del inmungeno administrada. Dosis muy bajas o muy altas de inmungeno no estimulan respuesta inmune o inducen un estado de ausencia de respuesta inmune (anrgia). En lneas generales, los conejos se inmunizan con dosis entre 10 y 1000 g, mientras que los ratones son inmunizados con dosis entre 1 y 100 g. Despus de la primera inoculacin (inmunizacin primaria) del antgeno, hay un perodo de latencia donde no se detectan anticuerpos en el suero del animal, seguido por la produccin de niveles de anticuerpos de tipo IgM detectables en el suero despus de 7 das. Los anticuerpos de tipo IgG se producen de 3 a 4 das ms tarde. Posteriormente se desvanece la respuesta inmune relativamente rpido. Sin embargo, si despus de un perodo de tiempo re-inoculamos el mismo antgeno (inmunizacin de refuerzo) al animal inmunizado, esto conduce a la produccin de una respuesta inmune secundaria, la cual tiene un perodo de latencia ms corto y produce mayores niveles de anticuerpos. La respuesta secundaria posee altos niveles de anticuerpos del tipo IgG e IgA. La respuesta de IgM ser similar a la obtenida en la inmunizacin primaria, mientras que los anticuerpos IgG especficos sern detectables entre el 3 y 4 da despus del refuerzo, alcanzando un pico despus de los 10 a 14 das y sern producidos durante mayor tiempo que en la respuesta inmune primaria. La generacin de una respuesta inmune secundaria eficiente requiere que los refuerzos sean administrados despus que la respuesta inmune primaria haya decado (mnimo 2 semanas), de lo contrario se producir un estado de anrgia. Los refuerzos resultan en un aumento de la afinidad y la avidez de los anticuerpos producidos por el antgeno. Durante la produccin de antisueros, es comn administrar de 2 a 3 inyecciones de refuerzos. El objetivo de la prctica es la obtencin de sueros policlonales mediante inmunizacin experimental las cuales incluyen el manejo de tcnicas de inmovilizacin del animal, inoculacin por varias rutas parenterales y desangrado que garanticen el menor dolor e incomodidad en el animal y a la vez asegure la administracin exitosa de la sustancia inmunognica.

Objetivos del trabajo prctico Obtencin de anticuerpos policlonales especficos anti Trypanosoma cruzi, mediante inmunizacin experimental de ratones NMRI o Balb/c. Familiarizar al estudiante con las tcnicas de inmovilizacin de animal; preparacin del inmungeno con o sin adyuvante; inoculacin de inmungenos a travs de diferentes rutas; preparacin de sueros y extraccin de muestras de sangre de animales de laboratorio.

3 Protocolo de Inmunizacin
Esquema de inmunizacin para la produccin de anticuerpos policlonales Para la obtencin de antisueros de ratn, especficos contra Trypanosoma cruzi, hemos diseado un protocolo o esquema de inmunizacin que consiste en la inoculacin de una preparacin purificada de una protena recombinante (Pgr24) del parsito T. cruzi, por tres vas parenterales diferentes, en cuatro oportunidades, durante el curso de un semestre. Cada grupo experimental conformado por 5 ratones, para un total de 15 individuos. El primer grupo de ensayo (A), constituido por 5 ratones sern inoculados por primera vez con una dosis de 100 g de la protena recombinante Pgr24 de T. cruzi previamente purificada, en presencia de adyuvante completo de Freud, va intraperitoneal. Despus de 15 das de la primera inmunizacin se realiza la primera inmunizacin de refuerzo por va intradrmica utilizando la mitad de la dosis del antgeno (50 g) inoculada en la primera inmunizacin junto con adyuvante incompleto de Freud. Se contina el segundo refuerzo por va subcutnea, despus de un intervalo de 15 das, inoculando la misma dosis de antgeno utilizada en el primer refuerzo, luego de un intervalo de 15 das, un tercer refuerzo del antgeno recombinante en solucin salina. El segundo grupo experimental (B) sern inoculados slo con adyuvante de Freud, siguiendo el mismo protocolo, intervalos y va de inoculacin similar a lo descrito para el grupo A. El tercer grupo experimental (5 ratones restantes), al que llamaremos control (C), ser sometido al mismo esquema de inmunizacin y refuerzo cada 15 das, pero se inocular slo con solucin salina. Antes de la primera inmunizacin, despus de la primera inmunizacin y de los refuerzos se extrae una pequea muestra de sangre a fin de valorar el desarrollo de la respuesta inmune en los sueros. Una vez que aparece una respuesta de anticuerpos ptima (determinada por algn mtodo serolgico, por ejemplo inmunofluorescencia o E.L.I.S.A.) el animal se desangra por puncin cardaca a cielo abierto o bien se puede continuar las inmunizaciones de refuerzos y realizar sangramientos secuenciales a fin de obtener los antisueros.

Procedimiento a seguir en el protocolo de inmunizacin

Da 1 (07-10-2010) Primera inmunizacin

Objetivos: Inocule cada ratn del grupo A, en la cavidad peritoneal, un volumen total de 0,2 ml de emulsin que contiene 100 g de la protena recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentracin inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante completo de Freud (ACF). Inocule cada ratn del grupo B, un volumen de 0,2 ml de emulsin que contiene adyuvante completo de Freud (ACF) en solucin salina. Inocule cada ratn del grupo C, un volumen de 0,2 ml de solucin salina.

Identificacin de los ratones a ser inmunizados 1. Identifique los ratones que sern inmunizados colocando una marca, con una gasa embebida en una solucin de cido pcrico (en la frente, una de las patas, lomo o abdomen del animal utilizando). Otra manera de realizar el marcaje es realizando pequeos cortes, previa asepsia, en la oreja y cola del animal. 2. Pese los ratones. 3. Lleve en su cuaderno el registro de los datos de identificacin del animal: sexo, peso, marca con cido pcrico, edad del animal, fecha de nacimiento, fechas de inmunizaciones, seas

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particulares del ratn (marca de corte), tipo de inmungeno, dosis del inmungeno, vas de inoculacin y desangrado total. Grupo A marcas OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada DOC: dos orejas cortadas CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadas OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada DOC: dos orejas cortadas CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadas OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada DOC: dos orejas cortadas CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadas Edad/Peso (g) Tratamiento

Inmungeno + Adyuvante

Adyuvante

Solucin salina

Muestra de sangre Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la primera inmunizacin. Separe el suero, colquelo en un vial de congelacin, rotule el vial y almacene a -20 C. Prepare la emulsin del antgeno junto con el adyuvante Cada ratn del grupo A recibir, en cavidad abdominal, 200 l de la mezcla de inmungeno y adyuvante completo de Freud (proporcin 1:1 v/v), que contiene un total de 100 g de Pgr24 recombinante purificado de T. cruzi. 1. Prepare 1 ml de emulsin de inmungeno y adyuvante completo de Freud para inocular los 5 ratones de la caja A, de tal manera que 0.2 ml de emulsin contenga 100 g del antgeno. El antgeno recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentracin de 1 g/l. Concentracin inicial de la preparacin de inmungeno Dosis del antgeno a inocular a cada ratn Volumen final de la emulsin a preparar para inocular 5 ratones (Ag +ACF) Concentracin final del inmungeno en la emulsin 1 g/l 100 g / 200 l 1000 l ?

2. Prepare 1 ml de emulsin con adyuvante completo de Freud y solucin salina para inocular los ratones del grupo B El procedimiento para preparar la emulsin es el siguiente: coloque 0.5ml de la solucin de antgeno en una jeringa y en otra jeringa 0.5 ml adyuvante Completo y/o incompleto de Freud (ACF). Remueva las agujas. Elimine las burbujas de aire en ambas jeringas y conecte ambas jeringas mediante una aguja con doble conector. Justo antes de la inmunizacin, emulsifique la preparacin de antgeno con el ACF (1 ml) haciendo pasar repetidas veces de un lado a otro de las jeringas la mezcla, ver Figura 1. Cuando la mezcla se torne homognea y blanca, desconecte la aguja conector, colquele una aguja de 21-G y pruebe si la emulsin es estable. Para ello vierta una gota de la emulsin en 50 ml de

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agua fra en un vaso de precipitacin. Una buena emulsin de agua y aceite debe mantenerse como una gota aislada sobre la superficie del agua sin dispersarse. Si la gota se dispersa, contine emulsificando la mezcla. Durante este proceso se puede generar calor. Enfre las jeringas en una cama de hielo y mantenga la temperatura cercana a 4 C.

Figura 1: Jeringas conectoras

Inoculacin del antgeno por va intraperitoneal 1. Inocule los ratones del grupo A, en el rea abdominal, dentro de cavidad peritoneal con 200 l de emulsin del antgeno y el ACF. El ratn recibir un total de 100 g del antgeno. 2. Inocule cada ratn del grupo B, por va intraperitoneal, con 200 l de emulsin preparada con adyuvante completo de Freud y solucin salina estril 3. Inocule cada ratn del grupo C, por va intraperitoneal, con 200 l de solucin salina estril.

Da 15 (21-10-2010) Segunda inmunizacin (Primer refuerzo)

Objetivos: Inocule cada ratn del grupo A, por va intradrmica, un volumen total de 100 l de emulsin que contiene 50 g de la protena recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentracin inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante incompleto de Freud (AIF), en una proporcin 1:1 v/v. Inocule cada ratn del grupo B, por va intradrmica, un volumen de 200 l de emulsin que contiene adyuvante incompleto de Freud (ACF) en solucin salina. Inocule cada ratn del grupo C, por va intradrmica, un volumen de 200 l de solucin salina. Muestra de sangre Extraiga una muestra de sangre del seno orbital de los ratones antes de la segunda inmunizacin. Separe el suero, colquelo en un vial de congelacin, rotule el vial y almacene el suero a -20C. Prepare el antgeno junto con el adyuvante Prepare 0.5 ml de emulsin de inmungeno y adyuvante incompleto de Freud para inocular los 5 ratones del grupo A, de tal manera que 100 l de emulsin contenga 50 g del antgeno. Este volumen es suficiente para inocular 5 ratones por va intradrmica El antgeno recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentracin de 1 g/l. Dependiendo de la concentracin de antgeno, determine la dilucin de ste, a fin de tener la dosis de antgeno deseada en el volumen que se inocular cada animal.

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Concentracin inicial de la preparacin de inmungeno Dosis del antgeno a inocular a cada ratn Volumen final de la emulsin a preparar para inocular 5 ratones (Ag +AIF) Concentracin final del inmungeno en la emulsin 1 g/l 50 g / 100 l 500 l ?

Prepare 0,5 ml de emulsin de adyuvante incompleto de Freud y solucin salina para inocular los 5 ratones del grupo B Inoculacin del antgeno por va intradrmica 1. Inocule cada ratn del grupo A, en a regin dorsal, por va intradrmica, en aproximadamente 10 sitios (0.01 ml por sitio), con 100 l de emulsin que contiene 50 g del antgeno y AIF. 2. Inocule cada ratn del grupo B, por va intradrmica, con 100 l de emulsin preparada con adyuvante incompleto de Freud y solucin salina estril 3. Inocule cada ratn del grupo C, por va intradrmica, con 100 l de solucin salina estril

Da 22 (04-11-2010): Tercera inmunizacin (Segundo refuerzo)

Objetivos: 1. Inocule cada ratn del grupo A, por va subcutnea, un volumen total de 100 l de disolucin que contiene 50 g de la protena recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentracin inicial 1 mg/ml) 2. Inocule cada ratn del grupo B y C, por va subcutnea, un volumen de 100 l de solucin salina. Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunizacin. Separe el suero, colquelo en un vial de congelacin, rotule el vial y almacene el suero a -20C. Prepare el antgeno Prepare un volumen de 500 l de antgeno purificado en solucin salina estril para inocular 5 ratones por va subcutnea. A cada ratn se le administrar un volumen de 100 l que contiene 50 g la protena recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentracin inicial 1 mg/ml). Concentracin inicial de la preparacin de inmungeno Dosis del antgeno a inocular a cada ratn Volumen final de disolucin del antgeno a preparar para 5 ratones Concentracin final del inmungeno en la disolucin 1 g/l 50 g / 100 l 500 l ?

Inoculacin del antgeno por va subcutnea 1. Inocule los ratones del grupo A, por va subcutnea, en cinco sitios diferentes, .con un volumen de 100 l de solucin salina que contiene 50 g del antgeno. 2. Inocule los ratones del grupo B, y C por va subcutnea, en cinco sitios diferentes, .con un volumen de 100 l de solucin salina estril.

7 Da 37 (18-11-2010) Cuarta inmunizacin (Tercer refuerzo)

Objetivo: 1. Inocule cada ratn del grupo A, por va subcutnea, un volumen total de 100 l de disolucin salina que contiene 50 g de la protena recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentracin inicial 1 mg/ml) 2. Inocule cada ratn de los grupos B y C, por va subcutnea, un volumen de 100 l de solucin salina. Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunizacin. Separe el suero, colquelo en un vial de congelacin, rotule el vial y almacene el suero a -20C. Prepare el antgeno Prepare el antgeno de la misma manera que se prepar en la tercera inmunizacin Inoculacin del antgeno por va subcutnea - Ver anexo Inocule los tres grupos de ratones, por va subcutnea y con la misma dosis que lo hizo en la tercera inmunizacin

Da 52 (02-12-2010) Obtencin de antisuero policlonal

Desangrado de los ratones Sangrado total de los ratones por puncin cardiaca a cielo abierto para obtener sueros inmunes y determinar los niveles de anticuerpos especficos producidos despus de la cuarta inmunizacin.

ANEXOS
Preparacin de antisueros 1. Despus de extraer muestras de sangre deje la sangre a temperatura ambiente 1/2 a 1 hora hasta la formacin del cogulo. Separe cuidadosamente el cogulo de la pared del tubo con un aplicador de madera. Si se requiere mejor retraccin del cogulo, mantenga la sangre refrigerada a 4C durante 2 a 4 horas. 2. Decante el suero en un tubo y centrifugue a 1000g durante 15 minutos a 4C (2500 r.p.m.). 3. Cuidadosamente separe el suero por decantacin o con pipeta Pasteur. El suero obtenido debe estar libre de clulas. 4. Alicuote el suero en viales de 0.2 ml y almacene a -20C. Seguimiento de la inmunizacin y aplicacin de refuerzos 1. Dos semanas despus de la primera inmunizacin tome una muestra de sangre. Separe el suero y almacnelo a 20 C. Determine el ttulo de anticuerpos especficos contra el antgeno inoculado presentes en el antisuero. Esta muestra tiene la finalidad de permitir determinar el desarrollo de la respuesta de anticuerpos en el antisuero de los ratones durante el curso de la inmunizacin. 2. Administre el primer refuerzo a los 15 das despus de la primera inmunizacin. Tome muestra de sangre del ratn, previo a la inmunizacin y separe el suero.

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3. Administre el segundo refuerzo con 15 das de intervalo. Tome muestra de sangre del ratn previo a la inmunizacin y separe el suero. 4. Dos semanas despus de la cuarta inmunizacin, desangre el ratn mediante puncin cardiaca, separe el suero y prepare alcuotas de 0.2 ml en viales de congelacin y almacene a 20 C. Caracterizacin y evaluacin de los antisueros obtenidos Una vez obtenido el antisuero de los ratones inmunizados es necesario detectar la presencia de anticuerpos, cantidad, pureza, tctuo y especificidad utilizando una tcnica de inmunoensayo confiable. El ttulo de un antisuero se puede estimar utilizando alguna de las tcnicas de inmunoensayo taes como ELISAy su especificidad a travs de pruebas de reacciones cruzadas o por cromatografa de afinidad utilizando el antgeno purificado. Para algunas tcnicas de inmunoensayos es suficiente utilizar los antisueros crudos, mientras que en otras tcnicas, es conveniente purificar alguno de los isotipos de anticuerpos con una especificidad particular. En los siguientes trabajos prcticos ustedes caracterizarn los antisueros obtenidos durante el proceso de inmunizacin de este curso, utilizando la tcnica de E.L.I.S.A. y la determinarn de la cantidad de protenas mediante el mtodo de Lowry. Materiales equipos y reactivos para las inmunizaciones de los ratones Ratones de 6 semanas de edad Aguja de jeringa con conectador doble Antgeno purificado (protena de 1 a 2 mg/ml Algodn en PBS) Gasa Adyuvante completo e incompleto de Freud Marcador Solucin salina al 0,9% estril Viales Alcohol al 70% Guantes Jeringas de vidrio de 1 c.c. Lentes Agujas 20, 21 y 25. Acido pcrico Materiales, equipo y reactivos necesarios para el desangrado de los ratones Ratones inmunizados Aplicadores de madera Algodn Tubos de ensayo Tubos de ensayo Tubos de centrifuga Alcohol al 70% Pipetas Pasteur Tubo de centrfuga estril, 44 x 142 mm Centrifuga refrigerada Jeringa estril de 3 ml con aguja de 21. Viales Aguja estril Tubo de hematocrito Algodn y gasa. Bibliografa Current Protocols in Immunology 1992. Editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach y Warren Strober. Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. Volumen 1. Capitulo 1.6. Antibody production. Essential Techniques (1997). PJ Delves. Editorial John Wiley and Sons. Tcnicas de inoculacin y sangras de animales: http://www.scribd.com/doc/3288391/TECNICAS-DEINOCULACION-Y-SANGRIA-DE-ANIMALES Tcnicas de obtencin e inoculacin de muestras. Consejo Superior de investigaciones cientficas. Comit tico de experimentacin animal del Centro Nacional de Biotecnologa. Espaa. http://www.cnb.csic.es/~animalario/CEEA.html

9 Protocolo de inmunizacin Semestre B-2010

Produccin de anticuerpos de ratn policlonales anti-Pgr24 mediante la inoculacin de la protena recombinante Pgr24de T. cruzi (Ag). Concentracin del Ag: 1 mg/ml, por tres vas parenterales diferentes (intraperitoneal, intradrmica y subcutnea). GRUPOS EXPERIMENTALES Grupo A: 5 ratones inoculados con emulsin de la protena recombinante Pgr24 de T. cruzi y adyuvante de Freud (esquema de inmunizacin). Grupo B: 5 ratones inoculados con emulsin de Adyuvante de Freud y solucin salina. Grupo C: 5 ratones inoculados con solucin salina.

PRIMERA INMUNIZACIN 07-10-2010

grupos muestra de sangre (Suero normal)

SEGUNDA INMUNIZACIN 21-10-2010 Va

muestra de sangre (Sueros1 Inm.)

Grupo A Dosis del antgeno 100 g

Prepare 1000 l emulsin para inocular los ratones A: ____ l l Ag (mg/ml) 500 l Adyuvante completo de Freud (ACF).
Inocule cavidad abdominal de cada ratn con 200 l de emulsin que contiene 100g del antgeno

Grupo A Dosis del antgeno 50 g

Prepare 0.5 ml emulsin para inocular los ratones A: ____ l l Ag mg/ml) 250 l Adyuvante Incompleto de Freud (AIF).
Inocule la dermis de cada ratn con 100 l de emulsin que contiene 50 g del antgeno

Va

A B C

A-SN B-SN C-SN

A-S1 i.p. B-S1 C-S1

i.d

grupos

TERCERA y CUARTA INMUNIZACIN 04-11-2010 / 18-11-2010

muestra de sangre (Sueros 2 y 3Inm.)

DESANGRADO TOTAL 02-12-2010

Obtencin de antisueros de ratones inmunizados por puncin cardaca despus de 4 Inmunizacin

Grupo A Dosis del antgeno 50 g

Prepare 0.5 ml de disolucin para inocular los ratones A: ____ l l Ag (mg/ml) 250 l solucin salina estril

Va

Va

A-S2

A B

B-S2 C-S2 A-S3

A-S4 s.c. B-S4 C-S4 p.c.

B-S3

Inocule por va subcutnea, con 100 l de disolucin que contiene 50 g del antgeno.

C-S3 Inoculacin intraperitoneal (i.p.); intradrmica (i.d.); subcutnea (s.c.); puncin cardaca (p.c.) Extraiga una muestra de sangre de los ratones (0.05 -0.2ml.) del seno orbital. Realice el sangrado total (1ml) del ratn por puncin cardiaca.
GA/mc Septiembre 2010