para purificar o caracterizar una protena intracelular, un mtodo eficiente de la interrupcin de la clula se debe desarrollar lo que libera la protena

en forma soluble de su compartimiento intracelular en una solucin de composicin bien defned. porque este paso es el punto de subsequen para todos los procedimientos, el mtodo de la interrupcin no debe ser perjudicial para la protena de inters. procedimientos estndar para la lisis de los tipos de tejidos o clulas certaim o estn disponibles, pero en algunos casos, es necesario estudiar mtodos alternativos de lisis con el fin de mejorar el rendimiento de protena o de Maximiza la recuperacin de la protena activa. A veces disruptio clulas Alne no libera solutin proteiinto activa. este es el caso de bodiesaccumulations la inclusin o la protena insoluble que forma ofte en bateria que han inducido a millones de epres una nica protena en niveles muy altos en la clula. En tales casos, se deben tomar medidas para convertir la protena en forma soluble, activa en algn momento antes o durante, la purificacin de la protena Extraccion de Proteinas Los primeros pasos de un tpico procedimiento de aislamiento de protenas por lo general consisten en el lavado del tejido y la aplicacin del mtodo de lisis. Entonces, la centrifugacin separa las protenas solubles de la fraccin de la membrana y los desechos insolubles por ltimo, la muestra de la protena puede ser anayzed, adems puridied o almacenada. El tejido se lava con una solucin buffer salina para eliminar los restos de sangre o de otro material extracelular, mientras que muchas clulas microbianas se centrfuga, resuspendido en el buffer, y resentrifugando no deseado para eliminar los rastros del medio de cultivo. El extracto obtenido despus de la lisis, denominado homogeneizado, por lo general se centrifuga en condiciones que van de 10 minutos a 15.000 xg de una hora a 100,00 x g. el sobrenadante posterior se llama el extracto crudo y el sedimento contiene la fraccin de la membrana. Si el extracto crudo contiene partculas en suspensin, la extraccin puede ser filtrada utilizando una gasa o lana de vidrio. A. Homogenizacin 1.- Consideraciones generales Una de las formas ms comunes de perturbar los tejidos blandos es de homogeneizacin. La homogeneizacin es llevado a cabo por cortar el tejido en una licuadora o en el tejido a travs de una abertura estrecha entre la mano de un mortero de tefln y un recipiente de vidrio. Estos mtodos son rpidos y representan un peligro relativamente poco a las protenas, aparte de la liberacin de baile de otros compartimentos celulares.

2.- pasos especficos Protocolo

1.- cortar el tejido lavado en trozos pequeos (por ejemplo, en cubos de 1 cm) 2.- Aadir tampn de homogeneizacin, normalmente de 3-5 3.- preparacin de el homogeneizado

a. con un poder-Potter Diven-Gass Elvehjem-homogeneizador de tefln en 500-1500 rpm. pasar a travs de la muestra de 3-6 veces, lo que permite 5-10 segundos por movimiento. b. utilizando un homogeneizador de la mano Dounce, pasan a travs de la muestra de 10-20 veces. c. utilizando una licuadora, mi tres veces durante 20 segundos a alta velocidad, haciendo una pausa de varios segundos entre cada pulso Comentarios 1 .- tejidos de mamferos tales como el hgado, corazn, cerebro y msculo liso son comnmente interrumpido WTH Potter-homogeneizador Elvehjem. homogeneizador de la mano Dounce se ha utilizado para cultivos de clulas y el tejido cerebral 2.-El espacio libre entre la mano del mortero y el recipiente de vidrio puede ser variada para proporcionar ms o tejido o menos de corte. autorizaciones pueden variar from035 a .70 mm 3. el envase de vidrio puede ser sumergido en agua helada te para mantener la temperatura baja durante la homogeneizacin. la blanda debe prechilled a 4 C, y la mezcla puede tener lugar en un cuarto fro 4.-en la medida de la rotura de clulas pueden ser controlados por el servicio de las clulas en un microscopio de contraste de fase o mediante la cuantificacin de la cantidad de protena liberada por gramo de tejido hmedo peso 5. Si este mtodo no produce la lisis satisfactoria, una tcnica algo ms duras, como el francs o presionando agitacin que cuentas de vidrio, deben ser juzgados

B. sonificacin 1.-Consideraciones generales Un sonificador altera el tejido mediante la creacin de las vibraciones que causan la rotura mecnica de la pared celular. Con el fin de optimizar el corte. Es necesario lograr la mxima agitacin afinando la mxima sonificacion agitacin debe ser moderada por la necesidad de mantener las vibraciones por debajo del nivel en el que la formacin de espuma de la solucin se produce, ya que airear la solucin causa.y la desnaturalizacin de las protenas La sonda sonficador debe mantenerse por debajo de la superficie de la solucin en todo momento mientras est encendido. Para sintonizar el sonificador antes de su uso, coloque la sonda sonicador en una parte no fungibles de la muestra (o una solucin con una viscosidad similares) en el buque del mismo tamao que se utilizar para el sonificado de la muestra. Ms comnmente, pesados tubos de ensayo de plstico se utilizan para proporcionar la mayor sonda-a-superficie de la solucin. Entonces, el poder est encendido y ajuste a un nivel ligeramente inferior a la que se produce la formacin de espuma. En este punto, el sonicador se considera ajustado y slo pequeos ajustes sern necesarios

durante la sonicacin de la muestra. Pasos 2. Pasos especificos Protocolo 1.-Lavar el tejido y la carne picada en trozos pequeos con cuchillo o una licuadora, luego suspender por lo menos en 2 volmenes de buffer. 2.-Someter a ultrasonidos durante unos 2 minutos. Si la solucin para iniciar la espuma, disminuye el poder hasta el ajuste hasta que cesa la formacin de espuma. La Sonificacion suele llevarse a cabo durante varios ciclos (por ejemplo, 4 x 30 seg) para enfriar la muestra en hielo entre los tratamientos

Comentarios 1 .- cheque por la interrupcin de la clula utilizando un microscopio de contraste de fase despus de diferentes perodos de interrupcin por sonicacin. 2 .- hasta 1 g de clulas o tejidos puede ser lisis en un momento con un sonicador. 3 .- este mtodo hs sido utilizados para la preparacin de muchas fuentes, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, ND tejido cerebral homogeneizada. 4 .- ejemplo para el uso de la sonicacin en las alteraciones de la membrana se puede encontrar en Hochstadt (1978), un Hullihen Pederson (1979), y Enquist y Sternberg

C. Presin de Francia de la clula 1.-consideraciones generales La presin de la clula francesa (France Press) archivos lisis celular al someter la muestra a alta presin seguido de una liberacin repentina de la presin atmosfrica. El cambio rpido de la presin hace que las clulas de estallar. Mayora de los casos, el mtodo se utiliza para la lisis de las bacterias y clulas de levadura. Este procedimiento funciona muy bien para un volumen moderado (10-30 ml), pero se hace tcnicamente con volmenes ms pequeos y consume demasiado tiempo con volmenes ms grandes. La clula de la presin de Francia debe limpiar a fondo antes y despus de su uso para prevenir la contaminacin por microbios, y O-ring control de la tasa si la liberacin de la muestra deben ser reemplazados peridicamente debido al desgaste causado por la presin alta. 2.-Medidas especficas Protocolo 1. Resuspender las clulas lavadas en tampn de lisis. Razones de peso hmedo de clulas para amortiguar el volumen van desde 1:1 para 1:4 g / ml

2. Aada la muestra a la celda de la presin de Francia y llevar a RESIN deseada (comnmente 8000 a 20.000 libras por pulgada cuadrada, o 550-1400 kg / cm) 3. Mientras mantiene la presin, ajustar la velocidad de flujo de salida de 2-3 ml por minuto 4. Vi algunas muestras, una segunda o incluso tercera a travs de la prensa francesa es til para una mayor lisis. Comentarios Este mtodo ha sido utilizado para la preparacin de muchas fuentes, incluyendo scherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, flourescens pseudomas, denitrificans pracoccus. Y vinelandii Azotobacter

D. Pulido con almina o arena Al igual que con la prensa francesa, la molienda de la clula con materiales abrasivos es un medio eficaz de la lisis de los organismos unicelular. El material es de bajo costo - un mortero, mortero y arena o almina - y el procedimiento se presta muy bien a las pesas de celda hmeda hasta 30 g. Lisis de la clula se logra por la accin abrasiva de la molienda de la pasta espesa de la muestra a mano con almina o arena - Medidas especficas Protocolo 1.-Para un mortero fro, aadir 20 g de pasta de lavado de clulas 2 .- Prpare 40 g de almina o arena de cuarzo para aadir cuando la molienda 3 .- Uso de la mano del mortero, moler pasta de celular mientras poco a poco algunas de almina o arena. 4 .- molienda debe continuar durante varios minutos despus de la ltima adicin de arena. Es un buen cantar si griding resultados en la adquisicin ruidos. 5 .- Despus de moler, toma de clulas en 60 ml de solucin tampn y se centrifuga para eliminar los restos celulares y de arena o almina. Comentarios Este mtodo ha sido utilizado para la preparacin de muchas fuentes, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, as como el plan de tejidos E. - de abalorios vortex 1 .- Consideraciones generales Vortex con cuentas de cristal es de alguna manera una extensin del mtodo de molienda de la lisis celular. La accin abrasiva de las cuentas vortex tijeras de las paredes celulares, liberando el contenido citoplasmtico. Este mtodo se utiliza principalmente en organismos unicelulares, en particular, las levaduras el mtodo descrito para muestras pequeas (de

hasta 3G) y puede ser realizado en tubo de ensayo. Para muestras ms grandes, aparatos especializados se han desarrollado y se cifr a continuacin. 2.- pasos especficos Protocolo 1 .- Resuspender 0.1-3 g lavarse las clulas en un volumen igual de tampn de lisis y colocarlos en un tubo resistente (de preferencia no de vidrio, ya que muchos pedazos debido a la accin de las bolas de cristal). Un tubo Eppendorf funciona bien para muestras pequeas. 2 .- Aadir 1-3 g de perlas de vidrio refrigerada por gramo de peso hmedo de clulas. 3 .- Vortex 3.5 veces durante un minuto, cada hora de mantenimiento de las clulas en hielo durante un minuto entre vortexings. Utilice el ajuste ms alto de la mesa de mezclas vrtice Comentarios. 1.-Para evitar fugas durante agitacin, los tubos deben cerrarse con un tapn de rosca con junta de goma o deben sellarse con parafilm. 2.-Este mtodo se utiliza con ms frecuencia con la Yest cerevisiae. 3 .- Los aparatos que permiten abalorios agitacin con grandes cantidades de clulas incluyen el de vidrio Braun MSK abalorios Mill, el cordn de Productos Biospec-Beater, y el Mantonhomogeneizador Gaulin. 4.-Cuentas de vidrio (500 um de dimetro) son preparados por el lavado en HCl concentrado, seguido de un enjuague extensa (comprobar que el pH es neutro) y el secado. Granos secos pueden ser refrigerados antes de su uso. F. Tratamientos enzimaticos

1 .- Consideraciones generales

La alteracin de la clula por medio enzimtica se usa principalmente con microorganismos, ya que un tratamiento relativamente uniforme se obtiene cuando las clulas estn en suspensin. Un protocolo para la alteracin enzimtica de Escherichia coli sigue. Tiempo para la lisis: 15 - 30 min 2.-pasos especificos Protocolo para celulas de E. Coli 1 .- suspender clulas lavadas E Coly en buffer TE 3 ml por gramo de clulas y llevar a 20-37 C TE Buffer: 50 mM Tris-HCl (8.0) 10 mM EDTA 2 .- Aadir que la lisozima mg / 5 ml de suspensin celular (puede ser aadido de un recin hecho 10 mg / ml de solucin madre en el buffer TE o directamente como polvo liofilizado en la celda de suspensin). 3 .- Incubar durante 10-20 min a 20 - 37 C, agitando suavemente

Comentarios

1.-Ms de lisis celular rpida se puede obtener al aumentar la concentracin de lisozima (a tanto como 10 mg / ml). con concentraciones ms altas de la lisozima, la lisis satisfactoria puede ser obtenida es tan poco como 5 minutos, incluso a temperaturas tan bajas como 4 C. 2.-Un protocolo para la lisis enzimtica de CN clulas de levadura se encuentra en Harlow y Lane. G.Otros mtodos de Lisis F. Otros mtodos de Lisis 1.-Detergentes Lisis Consideraciones generales Lisis de la clula con detergentes se hace comnmente con las bacterias, aunque este mtodo se ha limitado principalmente a la lisis de las clulas en los filtros para ser incubadas con anticuerpos de sondas de cidos nucleicos

2.-choque osmtico Lisis Las clulas son susceptibles a la lisis por choque osmtico suspendidas en una solucin hipotnica (es decir, de una menor fuerza inica que el citoplasma de la clula) si no estn protegidos por una pared celular. Este mtodo se utiliza comnmente para los glbulos rojos. 3.-Freeze-Thaw Lisis Es posible romper las clulas, sometindolos a varios ciclos de congelacin y descongelacin. Sin embargo, este mtodo slo debe intentarse cuando se trabaja con una protena en particular, estable, que se resistir a la desnaturalizacin y est protegido de la protelisis III. La solubilizacin de la protena de los cuerpos de inclusin. Las bacterias son una fuente conveniente de protenas para las multas de depuracin. Pueden ser cultivadas en Grandes Cantidades en condiciones bien definidas, y son relativamente fciles y de romper para la extraccin. Ms an importante, las tcnicas de clonacin molecular Permite Altos niveles de expresin en bacterias de casi todas las protenas De Cualquier organismo, bacterianas o de otra manera. Desafortunadamente, las protenas expresadas por bacterias son a menudo difciles de purificar por su tendencia a precipitar en la clula. El precipitado de forma cuerpos de inclusin de protenas: denso, las estructuras granulares, que se distribuyen por todo el citoplasma (Marston, 1986; Krueger et al. 1989; Hockney, 1995). Las protenas bacterianas La formacin de cuerpos de inclusin es especialmente comn en las protenas no bacterianas, pero incluso nativos muestran una tendencia a agregarse cuando se expresan en los niveles celular muy alto. Los cuerpos de inclusin tambin se pueden formar a partir de protenas bacterianas que han sido alterados por la mutacin de un solo residuos de aminocidos (Krueger et al 1990). Aunque ningn mtodo se aplicar a todas las protenas, una serie de estrategias estn disponibles para cualquiera de solubilizar la inclusin de protenas del cuerpo directa o

modificar las condiciones de crecimiento celular y la expresin de la protena para reducir al mnimo la precipitacin. Algunas de estas estrategias se discuten en las secciones siguientes. A. Solubilization of Inclusion Body Protein 1.-Consideraciones generales

La causa exacta de la formacin de cuerpos de inclusin no se sabe. Un nmero de estudios han descartado la posibilidad de que la concentracin de la protena expresada excede el lmite de solubilidad de la protena nativa (Mitraki y Rey. 1989). Sulfidrilo emparejamiento errneo tampoco Appers a ser el factor principal (Kane y Hartley, 1988). A pesar de que muchas protenas con residuos de cisteinil hacer exhibicin incorrecta (no coincidentes) disulfuro de bonos emparejamiento (Pigiet una Schuster, 1986). En cambio, la opinin predominante es que la formacin de cuerpos de inclusin est ligada a la visin prevaleciente es que la formacin de cuerpos de inclusin est relacionada con la va de plegamiento de las protenas (Haasepettingell y King, 1988; Mitraki y King 1989; Krueger et al. 1990). Como la cadena polipeptdica naciente de una protena que se sintetiza en la clula, puede adoptar una serie de intermedios conformaciones plegables hasta que encuentra su correcta, nativo de la estructura tridimensional. Algunos de los intermediarios de plegamiento pueden exponer a los parches de los residuos que no se presenta normalmente en la superficie de la protena nativa: por ejemplo, los residuos hidrofbicos que debera estar en el ncleo de la protena. Cuando esto sucede en altas concentraciones en el citoplasma, intermediarios de protenas puede asociarse entre s ms rpido de lo que puede replegarse en sus conformaciones nativas. Esto conduce a su precipitacin en los cuerpos de inclusin insolubles. Aunque la protena de cuerpos de inclusin puede contener una mezcla de conformaciones no nativas, las cadenas de polipptidos se suelen completar una intacta. De hecho, la purificacin de protenas de los cuerpos de inclusin pueden ofrecer ciertas ventajas, ya que los cuerpos son a menudo fcilmente separados de otros componentes celulares (Marston, 1986) y THS puede ser aislado en un estado relativamente puro. La razn de renaturalizacin de las protenas de los cuerpos de inclusin es reconocer que el proceso de plegamiento de las protenas deben ser completados. Desde la cadena polipeptdica en la protena de cuerpos de inclusin se encuentran atrapados en una serie de plegado parcial o incompleta conformaciones que se estabilize por asociaciones con cadenas de polipptidos, el primer paso consiste en disociar y solubilizar las protenas. Las protenas contenidas en los cuerpos de inclusin en general insolubles en sales y detergentes no inicos, por lo que los detergentes inicos (1% SDS) o desnaturalizantes de protenas, tales como la urea (8 M) y guanidina (6 M) se utilizan para archivar la desnaturalizacin completa. Entonces, la protena es renaturalizaron por eliminar el agente de desnaturalizacin en codiciones que favorecen el plegado completo de la protena sobre la formacin de la protena intermolecular: interacciones de la protena. Algunas de estas condiciones incluyen la temperatura ms baja y la concentracin de protenas que se producen en el citoplasma de las clulas en crecimiento, adems de los reactivos sulfhidrilo de aumentar las reacciones de intercambio disulfuro durante el proceso de plegado, y la adicin de cofactores y ligandos a favor de la estructura nativa correctamente doblada. 2.- Pasos especficos Protocolo

Diagnstico

Normalmente, las protenas overexressed puede ser detectada por la unin del anticuerpo o por la observacin de la presencia de protena en el peso molecular adecuado cuando los extractos de clulas que expresan son comparados con nonexpressing clulas control. Un diagnstico de cuerpos de inclusin de la acumulacin de cuerpos de inclusin se hace generalmente cuando la protena no parece estar presente en las partes solubles de extractos celulares, a pesar de que pueden detectarse en niveles altos en los extractos de clulas total desnaturalizacin mediante electroforesis en gel o inmunotransferencia. La formacin de cuerpos de inclusin dentro de las clulas bacterianas tambin puede ser detectado mediante microscopa electrnica. Cell Lysis 1.- Choose a working buffer for cell lysis. A good generalpurpose buffer is 50 mM phosphate, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.0) 2.- Suspend cells in an appropriate volume of working buffer for the chosen extraction method. Suitable extraction methods for acterial cells include sonication, glass bead milling, and lysozyme treatment. 3.- Lyse cells as described in section II. It is generally advisable to carry this step out in the presence of protease inhibitors. 4.- Centrifuge the cell lysate 5 min at 12000 x g and 4C 5.- Resuspend the pellet in 9 volumes of working buffer containing .5% of the nonionic detergent Trion X-100. This removes cell membranes and other debris. 6.- Incubate at room temperature for 5 min 7.- Recentrifuge 8.- Suspend pellet in working buffer containing 8 M urea, 2 mM reduced glutathione and 0.2 mM oxidized glutathione. Use a volume of 9 ml/g pellet, but in any case do not exceed a protein concentration of 2.5 mg/ml. the formation of mixed glutathione-protein disulfides accelerates the correct pairing of disulfides to allow formation of the native structure. 9.- Allow solution to remain at room temperature for 60 min

Renaturation 10.- Slowly add 9 ml of working buffer containing 2 mM reduced glutathione and .2 mM oxidized glutathione