Citogenetica

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agricolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del
l curso Citogentica Aplicada al Mejoramiento
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS AGRARIAS PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
203023 - CITOGENTICA APLICADA AL MEJORAMIENTO LESLIE YANETH LEAL MEJA (Tutora ECAPMA)
LUZ MERY BERNAL Acreditador
Bogot septiembre de 2009
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agricolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del curso Citogentica Aplicada al Mejoramiento
INDICE DE CONTENIDO INTRODUCCION. UNIDAD 1: MATERIAL GENTICO CAPITULO 1: MATERIAL GENTICO Leccin 1: Estructura qumica del ADN Leccin 2: Sntesis de transcritos funcionales Leccin 3: Transcripcin del ADN Leccin 4: Organizacin del ADN Leccin 5: Empaquetamiento del ADN CAPITULO 2: CICLO CELULAR Y CROMOSOMAS Leccin 6: Ciclo celular Leccin 7: Regulacin del ciclo celular Leccin 8: Estructura del cromosoma Leccin 9: Tipos y nomenclatura de cromosomas Leccin 10: Alteraciones cromosmicas y Genotoxicidad 8 12 12 12 16 22 25 30 34 34 40 44 50 58
CAPITULO 3: MTODOS DE OBTENCIN DE CROMOSOMAS Leccin 11: Obtencin de cromosomas en Vegetales Leccin 12: Requerimientos de las clulas en cultivo: Medios de cultivo y Factores de Crecimiento. Leccin 13: Requerimientos de las clulas en cultivo: Antibiticos, Enzimas, Requerimientos minerales Leccin 14: Medios de cultivo Leccin 15: Tcnicas para obtencin de cromosomas Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 1
77 77 82 90 93 99 111
Fuentes Documentales de la UNIDAD 1
112
UNIDAD 2: BANDAS CROMOSMICAS Y DIAGNSTICO CROMOSMICO CAPITULO 4: MATERIAL GENTICO Leccin 16: Tipos de cromatina Leccin 17: Bandeo Cromosmico Leccin 18: Tcnicas de Bandeo Cromosmico Leccin 19: Tcnicas de Bandeo en Cromosomas Vegetales Leccin 20: Determinacin nmero cromosmico y nmero fundamental
118 118 118 123 130 139 141
CAPITULO 5: LECTURA Y ANLISIS DE LMINAS Leccin 21: Clasificacin de cromosomas y elaboracin de Cariotipo Giemsa e ideograma Leccin 22: Lectura lminas con tratamientos bandas cromosomicas Leccin 23: Elaboracin de cariotipo con bandas Leccin 24: Tcnicas de Fluorescencia in situ Leccin 25: Tipos de Sondas
144
144 145 146 146 148
CAPITULO 6: APLICACIONES DE LA CITOGENTICA Leccin 26: Tipos de heterocromatina en animales Leccin 27: Cambios cromosmicos en animales Leccin 28: Caracterizacin citogentica de algunas especies animales Leccin 29. Cariotipo en plantas Leccin 30. Variaciones cariotpicas y otros estudios cariotpicos en plantas
152 152 156 159 166 170
Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 2
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Fuentes Documentales de la UNIDAD 2
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LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Secuencias de ADN telomrico mejor caracterizadas Tabla 2. Algunas secuencia de telmeros conocidas Tabla 3. Algunos ejemplos de niveles de poliploidias Tabla 4. Factores de crecimiento utilizados para cultivos animales Tabla 5. Composicin de algunos medios de cultivo ampliamente utilizados en Cultivo de Tejidos de plantas. Tabla 6. Principales fitohormonas utilizadas en cultivo de tejidos de plantas y sus pesos moleculares. Tabla 7. Fitohormonas utilizadas para el cultivo de clulas vegetales Tabla 8. Resumen de las principales fitohormonas empleadas en cultivo de tejidos y sus mayores efectos Tabla 9. Productos requeridos para cultivos de diferentes especies animales Tabla 10. Variacin de heteroromatina en diferentes especies
48 48 64 85
96 97
97
98 120 123
LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS Figura 1. Estructura qumica de los componentes del ADN Figura 2. Estructura-y-organizacion-de-los-acidos-nucleicos. Figura 3. Estructura qumica de un nucletido Figura 4. Organizacin complementaria de las hebras del ADN Figura 5 Modelos de replicacin del ADN Figura 6. Replicacin de ADN Figura 7. Sntesis de ARNm Figura 8. Representacin de la capucha del ARNm. Figura 9. Doble hlice del ADN Figura 11. Diferentes estructuras despus de la digestin del ADN con nucleasa Figura 12. Estructura del nucleosoma Figura 13. Estructura del nucleosoma Figura 14. Modelo del enrrollamiento del ADN alrededor del octmero de histonas. Figura 15. Solenoide, segundo grado de compactacin del ADN Figura 16. Asa, tercer grado de compactacin del ADN Figura 17. Roseta: cuarto grado de compactacin del ADN Figura 18. cromosoma. Mxima condensacin del ADN Figura 19. Modelo de los grados de compactacin del ADN Figura 20. Fases del ciclo celular Figura 21. Profase mittica Figura 22. Metafase mittica Figura 23. Anafase mittica Figura 24. Telofase mittica Figura 25. Cromosoma metafasico. Figura 27. Estructura Telomerica 30 31 31 32 32 33 35 37 38 38 39 45 47 28 29 29 13
14
14 15 18 20 22 24 26
Figura 10. Estructura del ADN en forma de cuentas de collar de perlas 27
Figura 28. Metafase de Clolosthetus puntatus Figura 29. Cromosoma politnico. Figura 30. Cromosoma politnico Figura 31. Cromosomas politnicos en anfibios Figura 32. Cariotipos de Pseudoplatystoma sp Figura 33. Cariotipos de Crocodylus acutus Figura 34. Ideograma del complemento cromosmico haploide Crocodylus acutus Figura 35. Translocacin 11 -14 en humanos Figura 36. Translocacin Robertsoniana t (1;29) en condiciones homocigoto Protoplastos
50 51 52 53 56 57 57 59 60 63 64 66 69 69
70
Figura 37. Metafase humana mostrando monosomia del cromosoma X 62 Figura 38. Metafase humana mostrando trisomia del cromosoma 21 Figura 39. Cariotipo con banda C de hbrido Pseudoplatystoma fasciatum X Pseudoplatystoma tigrinum Figura 40. Evolucin del Trigo harinero Figura 41. Metafases que muestran mosicismo leucocitario 64XX/63,XO en yeguas Figura 42. Anastomosis vascular placentaria de fetos bovinos Figura 43. Fotografa de clulas en metafase mostrando el complemento cromosmico sexual de una freemartin. Figura 44. Metafase mostrando eucromatina y heterocromatina Figura 45. Metafase mostrando heterocromatina constitutiva, regiones cercana a los centrmeros Figura 46. Heterocromatina facultativa Figura 47. Tcnica de hibridacin in situ 122 123 147 120
ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO
El contenido didctico del curso academico: Citogentica Aplicada al Mejoramiento fue diseado inicialmente en el ao 2007 por Janet Camacho Garzn, El contenido didctico ha sido actualizado por la biloga Leslie Yaneth Leal Meja en el ao 2009 tutora ECAPMA en el CEAD de Jos Celestino Mutis Bogot desde el ao 2009. La version del contenido didctico que actualmente se presenta tiene como caractersticas: incorporar nuevos contenidos relacionados con las Unidades y una mejor articulacin de loa contenidos de las lecciones que las componenen.
INTRODUCCIN Desde el punto de vista de satisfacer la demanda de produccin de alimentos en cuanto a cantidad y calidad son varias las alternativas, el de uso de algunas disciplinas con el propsito de cumplir con los requerimientos esperados. por parte de una poblacin mundial han venido tomando fuerza. Hoy en da y desde hace muchas dcadas, nos encontramos enfrentados a una cultura en donde la aplicacin de fertilizantes, y estimulantes hormonales son normalmente utilizados para obtener la mxima expresin de productividad tanto de animales como vegetales, pero con el gran inconveniente de que el uso de estos acarrea el detrimento del medio ambiente y sin contar con los altos grados de toxicidad que adquiere tanto el alimento como la persona expuesta al uso de este tipo de prcticas. Por otro lado existe tambin el desconocimiento de los recursos con los que se cuentan, pues muchas especies han sido estudiadas en aspectos relacionados con su morfologa, fisiologa, ecologa, distribucin, etologa y hasta filogenia y sistemtica, pero desde la gentica no todas las especies promisorias estn analizadas. As que es de gran importancia recurrir a disciplinas que aporten en alguna medida conocimiento sobre las caractersticas inherentes del material a trabajar; o en otras ocasiones mejorar las propiedades de algunas especies con los beneficios de otras para asegurar una mayor productividad. Tanto las tcnicas en Biologa Molecular como la Citogentica son dos herramientas genticas que son tiles en la determinacin de las caractersticas genticas de una especie. Slo que cada una de ellas lo hacen en diferente plano pero que pueden ser complementarias en el momento de analizar una especie, dado que al saber con que recurso gentico se cuenta, se hacen ms exitosos los programa de mejoramiento gentico. La citogentica se encarga del estudio de los cromosomas tanto en nmero como en estructura determinando con exactitud el complemento cromosmico normal haploide o diploide de las especies estudiadas, estableciendo de esta forma caractersticas nicas; las tcnicas de diferenciacin de los cromosomas conocidas como bandas cromosmicas son de gran utilidad en el momento de identificar inequvocamente los cromosomas de cada complemento dentro de un mismo individuo o entre ejemplares hbridos producidos artificialmente. La importancia de la citogentica, radica en la deteccin de variaciones en la estructura cromosmica entre y dentro de poblaciones, identificacin de anormalidades cromosmicas individuales en cuanto a tamao, forma y nmero cromosmico en un individuo.
En el presente modulo se expondrn diferentes aspectos de la Citogentica desde la estructura del ADN, principios bsicos de citogentica, tcnicas en la obtencin de cromosomas, tcnicas de coloracin diferencial, diagnostico citogentico y uso de la citogentica molecular, todo con el propsito de brindar al estudiante una visin de la potencialidad que tienen esta disciplina y el uso alternativo en el mejoramiento gentico animal y/o vegetal. UNIDAD 1 Nombre de la Unidad Introduccin MATERIAL GENTICO El (ADN) es la abreviatura del Acido Desoxiribo Nucleico, constituye el material gentico de la mayora de los organismos junto con el ARN, contiene la informacin para la sntesis de protenas especificas que permiten la vida. El ADN es el componente qumico primario de los cromosomas y el material en el que los genes estn codificados. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplasma mientras que en organismos ms complejos, tales como plantas, animales y otros organismos multicelulares, la mayora del ADN reside en el ncleo celular. El ADN se conoce desde hace ms de cien aos fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, bilogo suizo, en los ncleos de las clulas del pus obtenidas de los vendajes quirrgicos desechados y en el esperma del salmn. l llam a la sustancia nuclena, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery. (http://es.wikipedia.org/wiki/ADN) Es importante estudiar el material la cantidad, composicin, y organizacin del material gentico, porque a partir de l se forman los cromosomas que son la base de la citogentica. Estudiar la estructura y formacin de los cromosomas en difernetes especies vegetales y animales. Determinar la importancia de la distribucin del material gentico en diferentes especies.
Justificacin
Intencionalidades Formativas
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Denominacin de captulo 1 Denominacin de Leccin 1 Denominacin de Leccin 2 Denominacin de Leccin 3 Denominacin de Leccin 4 Denominacin de Leccin 5 Denominacin de captulo 2 Denominacin de Leccin 6 Denominacin de Leccin 7 Denominacin de Leccin 8 Denominacin de Leccin 9 Denominacin de Leccin 10 Denominacin de captulo 3 Denominacin de Leccin 11 Denominacin de Leccin 12 Denominacin de Leccin 13
Denominacin de Leccin 14 Denominacin de Leccin 15
Material gentico Estructura qumica del ADN Sntesis de Transcritos Funcionales Transripcin del ADN Organizacin del ADN Empaquetamiento del ADN CICLO CELULAR Y CROMOSOMAS Ciclo celular Regulacin del ciclo celular Estructura del cromosoma Tipos y nomenclatura de cromosomas Alteraciones cromosmicas y Genotoxicidad MTODOS DE OBTENCIN DE CROMOSOMAS Obtencin de cromosomas en Vegetales Requerimientos de las clulas en cultivo: Medios de cultivo y Factores de Crecimiento Requerimientos de las clulas en cultivo: Antibiticos, Enzimas, Requerimientos minerales Medios de cultivo Tcnicas para obtencin de cromosomas UNIDAD 2
Nombre de la Unidad Introduccin
BANDAS CROMOSMICAS Y DIAGNSTICO CROMOSMICO Dentro de los organelos celulares ms prominentes esta el ncleo pues ocupa cerca del 10% del volumen celular, dentro de l en estado interfasico se alberga el material gentico en forma de cromatina, recordemos que cuando se hablo de enrrollamiento del ADN se comento el primer grado de compactacin que corresponda a la estructura del nucleosoma, hebra de ADN ms protenas histonicas, pues la secuencia de estos nucleosomas unidos por la protena no histonica H1 conforman la hebra flexible de cromatina. As que la cromatina es el estado no condensado del ADN y que constituir los cromosomas en el momento
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Justificacin
Intencionalidades Formativas
Denominacin de captulo 4 Denominacin de Leccin 16 Denominacin de Leccin 17 Denominacin de Leccin 18 Denominacin de Leccin 19
Denominacin de Leccin 20
Denominacin de captulo 5 Denominacin de Leccin 21
Denominacin de Leccin 23 Denominacin de Leccin 24 Denominacin de Leccin 25 Denominacin de captulo 6 Denominacin de Leccin 26 Denominacin de Leccin 27 Denominacin de Leccin 28 Denominacin de Leccin 29
que la clula entre en divisin celular. Como caracterstica se tiene adems que la cromatina tie fcilmente con colorantes bsicos por afinidad con el cido desoxirribonucleico. El bandeo cromosmico permite realizar una caracterizacin correcta de las especies y un diagnstico adecuado de problemas patolgicos o ventajas adquiridas por cambios en el nmero y caractersticas cromosmicas. Conocer los diferntes tipos de bandeo que premiten estudios citogenticos en diferentes individuos. Determinar las diferentes aplicaciones que tiene la citogentica en estudios de mejoramiento. MATERIAL GENTICO Tipos de cromatina Bandeo Cromosmico Tcnicas de Bandeo Cromosmico (Prctica de laboratorio) Tcnicas de Bandeo en Cromosomas Vegetales (Prctica de laboratorio) Determinacin nmero cromosmico y nmero fundamental (Prctica de Laboratorio) LECTURA Y ANLISIS DE LMINAS Clasificacin de cromosomas y elaboracin de Cariotipo Giemsa e ideograma (Prctica de Laboratorio) Lectura lminas con tratamientos bandas cromosomicas (Prctica de Laboratorio) Elaboracin de cariotipo con bandas (Prctica de Laboratorio) Tcnicas de Fluorescencia in situ Tipos de Sondas APLICACIONES DE LA CITOGENTICA Tipos de heterocromatina en animales Cambios cromosmicos en animales Caracterizacin citogentica de algunas esepcies animales Cariotipo en plantas
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Variaciones cariotpicas y otros estudios cariotpicos en plantas
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UNIDAD 1 MATERIAL GENTICO
CAPITULO 1: MATERIAL GENTICO
Introduccin El (ADN) es la abreviatura del Acido Desoxiribo Nucleico, constituye el material gentico de la mayora de los organismos junto con el ARN, contiene la informacin para la sntesis de protenas especificas que permiten la vida. El ADN es el componente qumico primario de los cromosomas y el material en el que los genes estn codificados. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplasma mientras que en organismos ms complejos, tales como plantas, animales y otros organismos multicelulares, la mayora del ADN reside en el ncleo celular. El ADN se conoce desde hace ms de cien aos fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, bilogo suizo, en los ncleos de las clulas del pus obtenidas de los vendajes quirrgicos desechados y en el esperma del salmn. l llam a la sustancia nuclena, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery. (http://es.wikipedia.org/wiki/ADN)
Leccin 1: Estructura qumica del ADN El ADN es una molcula polimrica formada por repeticiones de azcar desoxirribosa (fig. 1a) , fosfato (fig.1b) y una base nitrogenada que puede ser purina (Adenina, Guanina) (fig 1c) o pirimidina (Citosina, Timina, Uracilo) (fig 1d); la unin de bases nitrogenadas con el azcar lo hacen mediante un enlace Nglicosdico, dependiendo de si la base es pirimidinica se une el N1 con el carbono 1 del azcar, o si es purinica quien se une es el N9 con el carbono 1, la unin de la base con el azcar se conoce como nucleosido. El P siempre est en el carbono 5 del azcar, el enlace que los une es fosfodister (figura 2). y la unin del nucleosido ms el fosfato es conocida como nucletido (fig 3); todos los nucletidos de la misma cadena estn orientados de la misma forma y se une el 3' de un nucletido con el 5' del siguiente. Al principio siempre habr un P libre (5') y
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al final un OH (3'). (http://pdf.rincondelvago.com/estructura-y-organizacion-de-losacidos-nucleicos.html) La estructura de la doble hlice esta representada por el Modelo propuesto por Watson y Crick. Quienes se basaron en las experiencias de Chargaff en cuanto a la composicin de bases, quien descubri que la cantidad de adenina era igual a la de timina y que la de citosina igual a la de guanina, basndose en difraccin de rayos X. Watson y Crick propusieron un modelo de cadenas antiparalelas ordenadas en una estructura helicoidal dextrgira, el modelo de la doble hlice.
Figura 1. Estructura qumica de: a) pentosas b)cido fosfrico c) bases pricas d) bases pirimidnicas (Modificada de http://pdf.rincondelvago.com/ htm)
De esta forma frente a un nucletido de adenina se encuentra siempre uno de timina y frente a uno de citosina otro de guanina, que establecen entre ellos dos y tres puentes de hidrgeno respectivamente. En la doble cadena del ADN, las dos hebras tienen orientacin opuesta, o antiparalela, una de las hebras est orientada 5 3. La otra hebra, aunque es tambin 5 3, corre en direccin contraria, o dicho
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de otra forma, es 3 5. De esta forma los dos filamentos de la hlice del ADN, son complementarios debido a su afinidad qumica. (fig. 4).
Extremo 3 OH
Enlace Nglucosdico
Azca r
Extremo 5 P
Base nitrogenada Enlace fosfodiester
Figura 2. Estructura-y-organizacion-de-los-acidos-nucleicos. l (Modificada de http://pdf.rincondelvago.com/ htm)
Figura 3. Estructura qumica de un nucletido (tomado de http://www.ucn.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.html#composicion)
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Al organizarse en una hlice el esqueleto, que es hidroflico, medio acuoso se queda hacia fuera con las bases (hidrofbicas) hacia dentro. La disposicin de las bases es perpendicular al eje de la hlice. Adems de los puentes de hidrgeno otras interacciones dbiles aportan estabilidad: Interacciones hidrofbicas de las bases. Fuerzas de Van der Waals entre las bases. La carga negativa de los fosfatos.
El fosfato tiene pKa " 1 por lo que a pH fisiolgico estar disociado, por lo que habrn cargas negativas que no estarn desestabilizando porque estn asociadas a cargas positivas casi siempre>[Author:REB]. Como la estructura ha de abrirse para llevar a cabo sus funciones, la molcula de DNA podr desnaturalizarse (separacin de las dos cadenas). Esto se consigue cuando la temperatura sube ( temperatura de fusin). A esta temperatura encontraremos 50% de doble hlice y 50% de cadena sencilla. Cuanto mayor sea la cantidad de citosina y timina mayor ser la temperatura de fusin porque habr que romper ms puentes de hidrgeno. (http://pdf.rincondelvago.com/estructura-y-organizacion-de-los-acidosnucleicos.html)
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Figura 4. Organizacin complementaria de las hebras del ADN adenina-timina doble enlace y guanina citosina triple enlace
En cuanto al Acido Ribo Nucleico (ARN), se encuentra principalmente fuera del ncleo celular aunque su sntesis tiene lugar a partir del ADN. Existen tres tipos de ARN: El mensajero, el ribosmico y el de transferencia. El RNA est formado por subunidades ribonucleotdicas unidas por enlaces 5 - 3 como los del DNA. Tres de las bases nitrogenadas, adenina, guanina y citosina, son las mismas que en el DNA. Sin embargo, en lugar de timina el RNA tiene uracilo el cual se aparea con la adenina. Los cuatro nucletidos contienen el azcar de cinco carbonos ribosa, que tiene un grupo hidroxilo en el tomo de carbono 2.
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Leccin 2: Sntesis de transcritos funcionales (tomado de http://www.geocities.com/CapeCanaveral/Lab/9232/) Despus de que la ciencia de la gentica se estableciera y de que se clarificaran los patrones de la herencia a travs de los genes, las preguntas ms importantes permanecieron sin respuesta durante ms de cincuenta aos: cmo se copian los cromosomas y sus genes de una clula a otra, y cmo determinan stos la estructura y conducta de los seres vivos? A principios de la dcada de 1940, dos genetistas estadounidenses, George Wells Beadle y Edward Lawrie Tatum, proporcionaron las primeras pistas importantes. Trabajaron con el hongo Neurospora y Penicillium, y descubrieron que los genes dirigen la formacin de enzimas a travs de las unidades que los constituyen. Cada unidad (un polipptido) est producida por un gen especfico. Este trabajo orient los estudios hacia la naturaleza qumica de los genes y ayud a establecer el campo de la gentica molecular.Desde hace tiempo se sabe que los cromosomas estn compuestos casi en su totalidad por dos tipos de sustancias qumicas, protenas y cidos nucleicos. Debido en parte a la estrecha relacin establecida entre los genes y las enzimas, que son protenas, al principio estas ltimas parecan la sustancia fundamental que determinaba la herencia. Sin embargo, en 1944, el bacterilogo canadiense Oswald Theodore Avery demostr que el cido desoxirribonucleico (ADN) era el que desempeaba esta funcin. Extrajo el ADN de una cepa de bacterias y lo introdujo en otra cepa. La segunda no slo adquiri las caractersticas de la primera sino que tambin las transmiti a generaciones posteriores. Por aquel entonces, se saba que el ADN estaba formado por unas sustancias denominadas nucletidos. Cada nucletido estaba compuesto a su vez por un grupo fosfato, un azcar conocido como desoxirribosa, y una de las cuatro bases que contienen nitrgeno. Las cuatro bases nitrogenadas son adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C).En 1953, el genetista estadounidense James Dewey Watson y el britnico Francis Harry Compton Crick aunaron sus conocimientos qumicos y trabajaron juntos en la estructura del ADN. Esta informacin proporcion de inmediato los medios necesarios para comprender cmo se copia la informacin hereditaria. Cada base est unida a una molcula de azcar y ligada por un enlace de hidrgeno a una base complementaria localizada en la cadena opuesta. La adenina siempre se vincula con la timina, y la guanina con la citosina. Para hacer una copia nueva e idntica de la molcula de ADN, slo se necesita que las dos cadenas se extiendan y se separen por sus bases (que estn unidas de forma dbil); gracias a la presencia en la clula de ms nucletidos, se pueden unir a cada cadena separada bases complementarias nuevas, formando dos dobles hlices. Si la secuencia de bases que exista en una cadena era AGATC, la nueva contendra la secuencia complementaria, o "imagen especular", TCTAG. Ya que la "base" de cada cromosoma es una molcula larga
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de ADN formada por dos cadenas, la produccin de dos dobles hlices idnticas dar lugar a dos cromosomas idnticos.
Replicacin del ADN La vida de los seres vivos es muy variable, por tanto para que esta no se extinga ha de haber un momento en que se reproduzcan, lo cual lleva implcito la formacin de copias del ADN del progenitor o progenitores. Se dieron muchas hiptesis sobre como se duplicaba el ADN, entre ellas esta la conservativa en donde se estableca que cada una de las hebras del ADN progenitor se duplica o replica, produciendo dos molculas de ADN hijas una de las cules es la molcula de ADN progenitora intacta y la otra una molcula de ADN cuyas dos hebras son nuevas; la dispersiva, propona que el ADN iba siendo duplicado por segmentos, encontrndose al final cada una de las hebras con fragmentos cortos de hebra original y hebra recin sintetizada; para la hiptesis semiconservativa (posteriormente demostrada por Meselson Y Stahl en 1957), se propuso que las dos hebras de la molcula de ADN se podran separar y servir como moldes para la sntesis de nuevas hebras complementarias, cuya secuencia sera dictada por la especificidad en el apareamiento de bases , porque una hebra de ADN progenitor se conserva en cada una de las dos molculas hijas de ADN (fig 5). Meselson Y Stahl demostraron la duplicacin semiconservativa gracias a una serie de experimentos llevados a cabo en los cuales el ADN fue marcado con istopos que alteraron su densidad. Se hizo crecer E. coli en medios de cultivo que contenan el istopo pesado del nitrgeno (N15) en lugar del istopo normal, ms ligero (N14). Consecuentemente el ADN de estas bacterias contena N15 y era mas pesadas que las bacterias crecidas en N14. Este ADN pesado se poda separar del ADN que contena N14 por centrifugacin de equilibrio en un gradiente de densidad de CsCl. Esta posibilidad de separar ADN pesado del ADN ligero permiti estudiar la sntesis de ADN. Se transfirieron clulas de E. coli que haban crecido en el medio con N15 a un medio que contena N14, y se les permiti replicarse una vez ms. Se extrajo su ADN y se analizo por centrifugacin en un gradiente de densidad de CsCl. Los resultados de este anlisis indicaron que todo el ADN pesado haba sido remplazado por ADN de nueva sntesis con una densidad intermedia entre el de las molculas de ADN pesada N 15 y ligera N14. El significado es que durante la replicacin de las dos hebras de ADN parental pesado se separan y sirven de moldes para la sntesis de hebras hijas de ADN ligero, produciendo molculas de doble hebra de densidad intermedia. Este
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experimento proporcion evidencia directa de la replicacin semiconservativa del ADN, subrayando la importancia del apareamiento complementario de las bases entre las hebras de la doble hlice (Cooper, 2002)
Figura 5 Modelos de replicacin del ADN (tomado de http://html.rincondelvago.com/duplicacion-de-adn.html)
La capacidad del ADN para servir de molde para su propia replicacin fue establecida ms adelante con la demostracin de que una enzima purificada de E. coli (la ADN polimerasa) poda catalizar la replicacin del ADN in vitro. Con la presencia del ADN como molde, la ADN polimerasa era capaz de dirigir la incorporacin de nucletidos en una molcula del ADN complementaria (fig 5)
Mecanismos de replicacin Con la replicacin se realiza una transmisin fiel de la informacin gentica de padres a hijos, por lo tanto este proceso es esencial para la vida de todas las clulas y organismos. Cada vez que una clula se divide, su genoma completo debe duplicarse, necesitndose una compleja maquinaria para copiar las grandes molculas de ADN. Como se dijo anteriormente el proceso de replicacin del ADN es semiconservativo en la que cada hebra parental sirve como molde para la sntesis
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de una nueva hebra hija complementaria. La enzima principal implicada es la ADN polimerasa, que cataliza la unin de los desoxirribonuclesidos 5'-trifosfatos para formar la cadena de ADN en crecimiento. Sin embargo, la replicacin del ADN es mucho ms compleja que una reaccin enzimtica. Estn involucradas otras protenas, y son necesarios mecanismos de lectura para asegurar que la exactitud de la replicacin es compatible con la baja frecuencia de errores que se permiten en la reproduccin celular. Tambin son necesarias protenas adicionales y secuencias de ADN para iniciar la replicacin y para copiar los extremos de los cromosomas eucariotas (Cooper, 2002) En la figura 6 se observa la replicacin del ADN, este es un proceso es lineal, bidireccional y en clulas eucariotas hay varios orgenes. El avance es ms lento que en procariotas ya que hay ms protenas asociadas al ADN que hay que soltar. La replicacin del ADN, que ocurre una sola vez en cada generacin celular necesita de muchos "ladrillos", enzimas y una gran cantidad de energa en forma de ATP (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular , las clulas pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energa para la siguiente fase de la divisin celular). La replicacin del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 50 nucletidos por segundo. Los nucletidos tienen que ser armados y estar disponibles en el ncleo conjuntamente con la energa para unirlos. Una vez que se abre la molcula, se forma una rea conocida como "burbuja de replicacin" en ella se encuentran las "horquillas de replicacin". Por accin de la ADN polimerasa los nuevos nucletidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucletido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicacin, mientras que los eucariotas mltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas". Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicacin procede solo en la direccin 5' a 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos han mostrado que, una cadena formar una copia continua, mientras que en la otra se formarn una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki, los cuales sern unidos por ADN ligasa. La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena gua, delantera conductora y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada tarda, la cual tiene una replicacin semidescontinua.
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Para que la ADN polimerasa trabaje, se necesaria la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeas unidades de RNA conocidas como cebadores, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de RNA, colocan nucletidos de ADN en su lugar y una ADN ligasa que los une a la cadena en crecimiento. Las protenas de enganche descargan la ADN polimerasa en el ADN en la unin entre el cebador y el molde. El anillo formado por las protenas de enganche mantienen la asociacin de la polimerasa con su molde durante la replicacin, permitiendo la sntesis ininterrumpida de miles de nucletidos de ADN.
Figura 6. Replicacin de ADN (Tomado de http://html.rincondelvago.com/duplicacion-de-adn.html)
Otras protenas desenrollan la hebra molde de ADN y estabiliza regiones de una sola hebra. Las helicasas son enzimas que catalizan el desenrollamiento del ADN parental y lo mantienen de forma lisa. La enzimas implicadas en la replicacin del ADN de forma coordinada para sintetizar las hebras conductora y tarda de ADN simultneamente en la horquilla
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de replicacin. Esta caracterstica esta acompaada por la formacin de dimeros de las polimerasas ADN replicativas, cada una de ellas con sus protenas accesorias adecuadas.
Replicacin semidescontinua (tomado de http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/duplicacion%20dna3.html) Para dar respuesta al interrogante, de cmo se replica la cadena tarda del ADN, en 1968, Reiji Okazaki realiz el siguiente experimento: Coloc clulas de Escherichia coli durante 30 segundos en un medio que contena [3H] Timina; posteriormente, centrifug las clulas en un medio bsico y obtuvo fragmentos de cidos nucleicos de 7 y 11S (Svedvergs, unidades de densidad), lo que significaba que contenan entre 1X103 y 2X103 nucletidos. Despus verifico el efecto del tiempo en la incubacin y encontr que el tamao de los fragmentos era proporcional al tiempo, a estos fragmentos se les denomina fragmentos de Okazaki.
Okazaki interpret la presencia de estos fragmentos en trminos de la replicacin semidiscontinua, que finalmente se unen por la ADN ligasa. El estudio cuidadoso de los fragmentos de Okazaki, revela que su extremo 5 consiste de segmentos de ARN que constan de 1 a 60 nucletidos (lo cual depende de la especie) que son complementarios con la hebra de ADN. En Escherichia coli dos enzimas catalizan este proceso, la ARN polimerasa (es la enzima encargada de la transcripcin) y la primasa (monmero de 60 kD) que fabrica los fragmentos de Okazaki. La ARN polimerasa es inhibida por rifampicina (inhibe la sntesis de la hebra lder). In vivo las enzimas son sinergsticas. El proceso de la replicacin se puede resumir en los siguientes eventos (con sus respectivas enzimas, que en conjunto, se denominan replicosoma): 1.- ADN girasa 2.- separar el ADN en la horquilla 3.- no permitir la realineacin antes de la replicacin 4.- cebadores de ARN (ARN polimerasa) 5.- ADN polimerasa
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6.- quitar cebadores de ARN 7.- unir covalentemente los fragmentos de Okazaki (ADN ligasa) Las protenas Rep, la helicasa y las protenas de unin a hebra sencilla (SSB) desdoblan al ADN antes de que avance la horquilla, este proceso necesita de la hidrlisis de ATP. El monmero Rep (del gen rep) acta sobre la hebra lder (3 5), gasta 2 molculas de ATP por cada par de base separado. La helicasa, retarda la sntesis de la que crece en direccin 5- 3, esta enzima tambin es un monmero. Las protenas SSB, no permiten que se unan las hebras ya separadas, son un tetrmero.
Leccin 3: Transcripcin del ADN Es el primer proceso de la expresin gentica en la cual un trozo de ADN es copiado a una hebra de ARN mensajero mediante una serie de procesos celulares regidos por diferentes enzimas (fig 7), la transcripcin es el inicio de la sntesis de protenas, tambin es conocida como sntesis del ARN mensajero.
Figura 7. Sntesis de ARNm
En la mayora de los procariotas, una sola polimerasa de RNA transcribe todos los tipos de RNA. Sin embargo, los eucariotes tienen tres polimerasas diferentes: 1. La polimerasa de RNA I (Pol I) transcribe los genes que determinan el RNAr
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2. La polimerasa de RNA II (Pol II) transcribe los genes que determinan protenas. 3. La polimerasa de RNA III (PolIII) transcribe otros RNA funcionales (por ejemplo, los RNAt) Existen tres fases dentro de la transcripcin, en las cuales estn involucrados los elementos anteriormente mencionados. Iniciacin Proceso por el cual la informacin almacenada en el ADN se transfiere al RNA y se hace disponible para la sntesis de protenas. El primer paso en la transcripcin es localizar el inicio del gen, justamente junto al gen hay una secuencia de bases de ADN que es el sitio que reconoce la RNA polimerasa, esta secuencia es conocida como promotora; la polimerasa explora el ADN en busca de ella, donde se une, abre la doble hlice y comienza la sntesis de una molcula del RNA a partir del sitio de inicio de la transcripcin. Elongacin El ADN se desenrolla y el RNA polimerasa empieza a viajar a lo largo de las cadenas de ADN catalizando la formacin de una cadena continua de RNA a partir de nucleotidos libres, la polimerasa compara ribonucletidos trifosfatados libres con la siguiente base expuesta del ADN molde y, si detecta complementariedad, aade el ribonucletido a la cadena. Terminacin Cuando la polimerasa de RNA reconoce secuencias especficas en el ADN que actan como seales de terminacin de la transcripcin abandona el ADN, y este vuelve a enrollarse, as la molcula de RNA es liberada. Aun cuando el proceso de la transcripcin esta ya terminado, el producto no es transportado todava al citosol, este sufre algunas modificaciones; el trascrito primario se conoce como pre-RNAm y las alteraciones en su estructura como postranscripcionales Durante la transcripcin se aade una caperuza constituida por un residuo 7metilguanosina al extremo 5 del transcrito, mediante el establecimiento de un enlace trifosfato (fig 8). A continuacin, la enzima que reconoce la secuencia AAUAAA cerca del extremo 3 corta el RNA 20 bases abajo. En ese momento se produce la adicin al extremo 3 cortado de una cola de 150-200 residuos adenina denominada poli A. Posteriormente, un paso de maduracin elimina cualquier
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intrn del transcrito, convirtiendo el pre-mRNA en RNA maduro (Griffiths et al. 2000).
Figura 8. Representacin de la capucha del ARNm. Tomado de http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/capuchado%20rna%20mensajero. html
Las colas de poliA, se unen a la protena de unin al poli(A) (PABP), lo que genera una ribonucleoprotena. PABP protege al mARN; la presencia de esta protena reduce la velocidad de degradacin del mARN. La mutacin de la cola poliA de un transcrito presenta una vida media (t 1/2) menor a 30 min en el citoplasma, por el contrario, el mismo transcrito con su cola de poliA tiene una t1/2 que vara de horas a das. Esta cola de poliA, es agregada al transcrito primario en dos reacciones. 1.- el transcrito es cortado en una posicin entre 15 a 25 nucletidos pasando una secuencia conservada AAUAAA, que al mutarse, inhibe el corte y la poliadenilacin.
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2.- la cola de poliA se genera a partir de ATP, gracias a la catlisis de la poli(A) polimerasa (http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/cola%20poli%20a%20rna%20men sajero.html)
Los intrones son interrupciones de un gen, formadas por secuencias sin codificar a lo largo de una secuencia de nucletidos que codifican un polipptido; en particular, puede haber uno o ms intrones, en algunos genes pueden encontrarse 50 o ms de estas secuencias. Durante la transcripcin, los intrones son copiados en el RNA junto con las secuencias codificadas, originando una molcula de RNA extra larga. En el ncleo, las secuencias que corresponden a los intrones son eliminadas del RNA por unas enzimas especiales para formar el RNAm, que se exporta al citoplasma. Las funciones de los intrones (si existen) son desconocidas, aunque se ha sugerido que el procesamiento del RNA mediante la eliminacin de las secuencias interrumpidas tal vez est implicado en la regulacin de la cantidad de polipptidos producidos por los genes. Tambin se han encontrado intrones en genes que codifican RNAs especiales, como los que forman parte de los ribosomas. El descubrimiento de los intrones ha sido posible gracias a nuevos mtodos que determinan la secuencia exacta de nucletidos en las molculas de ADN y RNA, mtodos desarrollados por el bilogo molecular britnico Frederick Sanger, quien recibi en 1980 por este trabajo el segundo Premio Nobel de Qumica ( Tomado de http://www.geocities.com/CapeCanaveral/Lab/9232
Leccin 4: Organizacin del ADN Introduccin El material gentico se encuentra dispuesto en varias estructuras de organizacin, que van teniendo mayor complejidad en forma ascendente a medida que ocurre cada una de ellas, la principal razn de dicha organizacin es el ahorro de energa celular en la transmisin y reparticin de la dotacin gentica de una clula madre a sus clulas hijas, pues seria muy difcil pensar otra forma de heredar las hebras de ADN sueltas que pueden medir inclusive hasta 2 metros o ms. Recordemos que la mxima condensacin del ADN se conoce como cromosomas y son precisamente estos los protagonistas de el presente modulo. Otra razn para esperar esta complejidad, es la diversidad estructural y bioqumica de los muchos tipos de clulas eucariticas presentes en un organismo pluricelular. Clulas diferentes asumen funciones especficas basadas en actividades bioqumicas altamente especficas. Aunque todas las clulas contienen un complemento gentico completo, las diferentes clulas activan
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diferentes grupos de genes. Si hay clulas diferentes realizando funciones distintas, debe haber un sistema regulador ordenado que gobierne la lectura de esta informacin. Dicho sistema debe estar impuesto por la estructura molecular del material gentico, o relacionado con ella (klug y Cummings, 1999) Las primeras investigaciones realizadas en citogentica se llevaron acabo en cromosomas gigantes que corresponden a los cromosomas politnicos y plumosos observados en algunos insectos, sin embargo con los avances hechos en microscopa se han podido establecer las estructuras de cromosomas mitticos y meiticos. A continuacin se describirn los diferentes grados de organizacin del ADN, para poder entender ms aun el empaquetamiento del mismo en la estructura de los cromosomas. Recordemos inicialmente su estructura molecular, que corresponde a la hebra de ADN, sin ninguna modificacin, la unin de bases nitrogenadas con el azcar lo hacen mediante un enlace Nglicosdico, el P siempre est en el carbono 5 del azcar, el enlace que los une es fosfodister Todos los nucletidos de la misma cadena estn orientados de la misma forma y se une el 3' de un nucletido con el 5' del siguiente. Al principio siempre habr un P libre (5') y al final un OH (3'). La estructura primaria esta representada por el Modelo de la doble hlice propuesto por Watson y Crick quienes propusieron un modelo de cadenas antiparalelas, el modelo de la doble hlice. La timina siempre se aparea con una adenina, y una citosina con una guanina. Adems TA tiene 2 puentes de hidrgeno y CG tiene 3, por lo que las bases estarn formando puentes de hidrgeno que dan estabilidad a la molcula (fig. 9)
Figura 9. Doble hlice del ADN Tomado de (http://www.biotech.bioetica.org/clase1-14.htm#_Toc95371667)
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Nucleosoma: Primer grado de organizacin del ADN La estructura del ADN es en realidad mucho ms larga que la del cromosoma, por eso el ADN se halla muy condensado o empaquetado en diminutas estructuras llamadas nucleosomas que slo son visibles con el microscopio electrnico ms potente. As, el nucleosoma es el primer grado de compactacin del ADN.
El nucleosoma fue descubierto en 1974 por Roger Kornberg. El descubri mediante cristalografa de rayos X que en la cromatina existe una estructura regular que se repite cada 100 sobre la fibra, a manera de cuentas de un rosario (fig 10).
Nuclosomas e
Figura 10. Estructura del ADN en forma de cuentas de collar de perlas http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/estructura%20cromosoma2.html Para dicha observacin Kornberg determino lo siguiente: 1.- la cromatina contiene aproximadamente el mismo nmero de molculas de histonas h2a, h2b, h3 y h4 y no ms de la mitad de H1. 2.- La cristalografa de rayos X indica que e la cromatina existe una estructura regular que se repite cada 100 sobre la fibra. Este mismo patrn se observa cuando ADN purificado se mezcla con cantidades equimolares de histonas, excepto H1. 3.- Micrografas electrnicas de la cromatina revelan que consiste de partculas de aproximadamente 100 de dimetro conectadas a partir de ADN desnudo (como un collar de cuentas) y son aparentemente las responsables del patrn de rayos X.
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4.- Controlando el tiempo de digestin de la cromatina con la nucleasa micrococal, (que rompe la doble hebra del ADN), se obtienen diferentes estructuras: Monomeros, dimeros, trimeros y tetrmeros (Fig 11)
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/estructura%20cromosoma2.html
El modelo general de la estructura de la cromatina se base en la suposicin que las fibras de cromatina, compuestas por ADN y protena, experimentan un enrrollamiento y plegamiento al condensarse dentro del ncleo celular. De las protenas asociadas al ADN, las histonas desempean claramente la funcin estructural ms esencial . Las histonas contienen grandes cantidades de los aminocidos lisina y arginina, que estn cargados positivamente, lo que les posibilita unirse electrostticamente a los grupos fosfato de los nucletidos, cargados negativamente. Hay 5 tipos de histonas H1, H2A, H2B, H3 y H4. (Klug y Cummings, 1999)
Figura 11. Diferentes estructuras despus de la digestin del ADN con nucleasa http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/estructura%20cromosoma2.html
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La primera subestructura en la formacin del nucleosoma es la formacin de dos tetrmeros que corresponde a las protenas H2A, H2B, H3 y H4, cada tetrmero tendra entonces una protena de cada uno y luego se unirn en una estructura a manera de dos botones uno frente al otro conocido como octmero (fig 12 a, b) y alrededor de este octmero se enrollarn 2 vueltas de la hebra de ADN, correspondientes a 146 200 pares de bases, estructura conocida como nucleosoma (Fig 13). El espaciamiento entre las cuentas est formado por ADN que se llama ADN puente. El nucleosoma mide 6 nm. Los nucleosomas se vuelven a organizar con la ayuda de la histona H1 habiendo una por cada nucleosoma (Fig 14).
Figura 12. Estructura del a) tetrmero y b) octmero que constituyen el nucleosoma
Kornberg en sus experimentos dedujo que el ADN, se enreda alrededor de un octmero de histonas para formar el nucleosoma y observando que: Cromatina + nucleasa cromatosoma + nucleasa ncleo del nucleosoma micrococal + H1 es decir que el cromatosoma lo conforma el nucleosoma + la protena H1 El ADN removido por la digestin se denomina ADN de unin. Y varia de especie a especie y de tejido a tejido entre 8 y 114 pares de bases, pero generalmente es de aproximadamente 55 pares de bases. Cuando el ADN se replica in vivo, las hebras hijas, inmediatamente son incorporadas en nucleosomas. Cuando el ADN se replica en presencia de cicloheximida (inhibidor de la sntesis de ADN), slo una hebra hija tiene nucleosomas.
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Figura 13. Estructura del nucleosoma http://www.ciencia.net/enciclo/a/images/adn00.gif
Figura 14. Modelo del enrrollamiento del ADN alrededor del octmero de histonas. Tomado de htpp://www.unorte.edu.uy/agro/ACIDOSNUCLEICOS.doc
Leccin 5: Empaquetamiento del ADN Solenoide: segundo grado de compactacin del ADN. La fibra de cromatina de 100 se dobla, en una fibra ms gruesa, denominada selenoide que tiene 300 (30nm) y corresponde entonces al enrrollamiento de los nucleosomas, su forma se asemeja a un espagueti y se mantienen gracias a la protena histonica H1. . Por cada vuelta de la espiral que forma esta fibra hay seis nucleosomas. (fig. 15 y 19)
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Asas: tercer grado de compactacin del ADN, se conoce tambin como cromatina extendida, es una estructura de 200 - 300 nm y corresponde al enrrollamiento de los selonoides (Fig 16 y 19)
Si se elimina las histonas del cromosoma en metafase mittica se puede ver que los cromosomas tienen un esqueleto central densamente teido. Desde este esqueleto se proyectan lazos de ADN que comienzan y acaban en el esqueleto. Este esqueleto central est compuesto por la enzima toposiomerasa II (enlazan o desenlazan nudos o lazos en una cadena) en el que parece haber regiones especiales llamadas regiones de unin al esqueleto o SAR (http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-material-genetico.htm)
Figura 15. Solenoide, segundo grado de compactacin del ADN http://www.ciencia.net/enciclo_imprimir.jsp?id=5125

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Figura 16. Asa, tercer grado de compactacin del ADN Modificado de http://aportes.educ.ar/biologia/compactacion.jpg
Roseta: cuarto grado de compactacin ADN, se produce por el arrollamiento de la fibra de 200 - 300 nm sobre s misma y corresponde a 6 Asas. Esta estructura tiene un dimetro de 700 (Fig 17 y 19)
Figura 17. Roseta: cuarto grado de compactacin del ADN Modificado de http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/LaCelula/Nucleo_archivos/image017.j pg
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Cromatina condensada: corresponde al superenrollamiento de 30 rocetas, es el ltimo grado de compactacin del ADN corresponde al cromosoma metafasico con sus dos cromatides es una estructura de 1400 nm (Fig 18 y 19) El cromosoma metafsico es en si el objetivo final de la citogentica, pues precisamente sobre el se trabaja para determinar caractersticas propias de una especie en cuanto a nmero y morfologa de los cromosomas adems de ser la materia prima para determinar patrones de la composicin del ADN, gracias a procedimiento qumicos, que mas adelante trataremos en bandas cromosmicas. En la figura 19 se muestra la secuencia de la compactacin del ADN para que se globalice el concepto de cromosoma como la mxima condensacin del ADN y portador de la toda la informacin gentica .
Figura 18: cromosoma. Mxima condensacin del ADN http://www.educa.aragob.es/iespseza/ciencias/jesus_delgado/Cromosoma.jpg
Figura 19. Modelo de los grados de compactacin del ADN tomado de htpp://www.unorte.edu.uy/agro/ACIDOSNUCLEICOS.doc
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CAPITULO 2: CICLO CELULAR Y CROMOSOMAS
Introduccin Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y el estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye cintica del crecimiento, tiempo de generaciones y limitantes en el crecimiento. (http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934315)
Leccin 6: Ciclo celular El ciclo celular de una clula es anlogo al de un ser vivo, nace, mediante la divisin de una clula progenitora, crece y se reproduce. El ciclo celular es la secuencia regular de los fenmenos para el crecimiento y la divisin de las clulas. Las clulas pasan por dos periodos o etapas en el curso de la vida; una es la interfase, que es la de no divisin celular y otra de divisin, en la cual se producen las clulas hijas. Estas fases que atraviesa una clula es entre una divisin y la siguiente. La divisin celular es un proceso complejo que requiere no solo de la replicacin del patrimonio gentico de la clula madre y su posterior distribucin a las clulas hijas, sino tambin la duplicacin de todos los componentes intracelulares que sern necesarios para la constitucin de una nueva clula.
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Entonces antes de que la clula se pueda dividir efectivamente, debe sintetizar protenas, duplicar ADN, duplicar organelos y ensamblar las estructuras necesarias para que se lleve acabo la mitosis y/o meiosis y, estos procesos preparatorios ocurren durante la interfase del ciclo celular.
Etapas del ciclo celular Las clulas eucariotas que tienen la propiedad de dividirse son las que cumplen con el ciclo celular. La secuencia cclica de procesos que lleva a la clula a dividirse esta determinada por la interfase, mitosis y citocinesis que son las etapas del ciclo celular. Hay que tener en cuenta ante todo que las clulas que no se dividen no se consideran que estn en el ciclo celular, ya que la divisin es la culminacin del ciclo o de otra forma toda clula que se inicia en el ciclo celular y sobrepasa la etapa de G1 y entra a S terminar dividindose. La interfase es el intervalo existente entre una divisin y otra y es la que mayor duracin tiene dentro del ciclo celular, se ha determinado por varios estudios que la interfase tiene 3 periodos reconocidos como son G1, S y G2 (fig 20); G1 y G2 estn antes y despus de S respectivamente. La mayora de las clulas tienen 4 procesos coordinados crecimiento celular, replicacin del ADN, distribucin de los cromosomas y divisin celular, los cuales estn dentro de las etapas anteriormente mencionadas interfase y mitosis.
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Figura 20. Fases del ciclo celular (tomado de http:// efn.uncor.edu/dep/biologia/introbiol/ciclo.htm)
La mayor parte del conocimiento del ciclo celular se basa en estudios in vitro (en tubos de ensayo). Cuando las clulas crecen en cultivo, muchos tipos celulares de diferentes organismos completan el ciclo en unas 16 horas. La mitosis ocupa slo una pequea parte del ciclo, normalmente alrededor de una hora. La duracin de S y G2 de la interfase son casi similares en diferentes tipos de clulas. La mayor variacin se da en la duracin del periodo G1 (Klug y Cummings, 1999) Con estas investigaciones se dejo de lado la idea de que la interfase era una etapa de descanso celular, por el contrario se ha establecido que en estos periodos hay una gran actividad celular.
Periodo G1 El periodo G1 quiere decir "GAP 1 (Intervalo 1). Es el perodo que trascurre entre el fin de una mitosis y otra, as que se considera el primer periodo del ciclo celular, en l la clula aumenta en masa y duplica la cantidad de organelos, enzimas y otras molculas obteniendo de hecho tambin un aumento en tamao. Aqu hay una gran expresin de los genes responsables de la maquinaria metablica para tal fin. G1 tiene una duracin de entre 6 y 12 horas. La fase G1 tiene gran inters en el estudio de la proliferacin celular y de su control. En un momento tardo de G1, todas las clulas siguen uno de estos dos caminos: o bien abandonan el ciclo y entran en una fase de reposo, la llamada fase G0, o bien son obligadas a iniciar la sntesis de ADN y completar el ciclo. El momento en que se toma esa decisin se denomina punto de control G1, este tema ser tratado ms adelante en regulacin del ciclo celular. Las clulas que entran en la fase G0 permanecen viables y activas metablicamente, pero no se dividen. Aparentemente, las clulas cancerososa evitan entrar en G0 o pasan muy rpidamentenpor ella. Otras clulas entran en G0 y nunca reinician el ciclo celular. Y aun hay otras que permanecen quiescentes en G0, pero pueden ser estimuladas para volver a G1, continuando el ciclo celular (Klug y Cummings, 1999)
Periodo S
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Es el segundo periodo del ciclo, es en el que se produce la duplicacin o replicacin del ADN (ver leccin 2), como resultado de esta sntesis se observan los cromosomas homlogos duplicados formados cada uno por dos cromtidas idnticas. Con la duplicacin del ADN, el ncleo contiene el doble de protenas nucleares y de ADN que al principio. Tiene una duracin de unas 6-8 horas. Periodo G2 El periodo G2 quiere decir GAP 2 (intervalo 2). Es el tercer periodo de la interfase aqu el ciclo celular contina con la sntesis de protenas y ARN y se prepara con todas las estructuras necesarias para la divisin celular y citocinesis. Al final de este perodo se observa al microscopio cambios en la estructura celular, G2 termina cuando los cromosomas empiezan a condensarse al inicio de la mitosis. La duracin de este periodo esta entre 3 y 4 horas.
Divisin Celular La otra etapa del ciclo celular es la M que puede significar "mitosis" o meiosis la cual tiene una duracin de 1 hora aproximadamente, aqu ocurre la distribucin del material gentico (separacin de cromosomas) seguido de la separacin del citoplasma (citocinesis). La mitosis es un proceso muy dinmico y cumple con varias fases para distribuir el material gentico, a saber son profase, metafase, anafase y telofase. Profase: Durante esta primera fase, el ncleolo se decolora y la cromatina (ADN y protenas asociadas) empieza a condensarse en los cromosomas. Cada cromosoma esta compuesto por dos cromatides ambas con la misma informacin gentica. Los microtubulos del citoesqueleto quienes dan la forma a la clula se desmonta y comienza estos son utilizados para empezar a crear el huso mittico desde los centriolos. Los kinetocoros se unen al huso mittico (fig 21)
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Figura 21. Profase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases) Metafase: el huso mittico se tensiona de tal forma que todos los cromosomas se alinean en el centro de la clula, y quedan ubicados en el plano ecuatorial para posteriormente separarse en cromatides hermanas (fig 22) Los cromosomas al ser la mxima condensacin del ADN son el objeto de estudio de la citogentica, por eso es de suma importancia para el anlisis cromosmico conocer el momento preciso de la metafase dentro del ciclo celular.
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Figura 22. Metafase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases) Anafase: Las fibras del huso mittico se acortan y la unin entre cromatides hermanas se rompe, as los cromosomas quedan libres para moverse hacia los polos. En clulas animales el movimiento de los cromosomas es debido a la despolarizacin de los microtubulos y el kinetocoro, en muchos organismos, la densidad del astro de microtubulos decrece durante la anafase, permitiendo decrecer la fuerzas hacia los polos facilitando el movimiento de los cromosomas hacia los polos (fig 23)
Figura 23. Anafase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases)
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Telofase: Los cromosomas hijos llegan a los polos y se observan dos ncleos opuestos e idnticos que empiezan a ir adoptando la situacin primigenia de la interfase, la cromatina empieza a descondensarse y el huso mittico desaparece, el nucleolo y la membrana nuclear vuelven a recontruirse, con esta fase se da por terminado la cariocinesis (fig 24)
Figura 24. Telofase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases)
Para entender un poco mejor este proceso puede hacer clic aqu y observar la simulacin de la mitosis. http://www.geocities.com/trogers56/ http://www.cellsalive.com/mitosis.htm http://www.eduvinet.de/mallig/bio/Repetito/Bzellteils.html Citocinesis Una vez termina la distribucin del material gentico (cariocinesis), la clula se dispone a una separacin fsica de su citoplasma y lo hace bajo el proceso de citocinesis o citodiresis, este proceso es diferente en clulas animales y vegetales, a continuacin se explicara muy brevemente este fenmeno. Clulas animales: la citocinesis comienza con la formacin de un anillo que contiene actina y miosina justamente debajo del corte de la clula. La contraccin de este anillo acta como una cuerda que va estrangulando la clula en dos porciones y deja ver la formacin de dos monedas una sobre otra las cuales son las clulas hijas. El sitio en el cual se forma el anillo contrctil es claramente especfico, se presenta en la posicin en donde el huso intercepta el plano que pasa a travs de la placa de la metafase. Una vez inicie la anafase el huso puede ser fsicamente removido sin afectar el clivaje de la clula.
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Clulas vegetales: la citocinesis en estas clulas es diferente porque no se presenta por estrangulacin sino por la formacin de un tabique en la zona media de la clula. Tomado de http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema9/9-2mitosis.htm En las plantas superiores, durante la telofase tarda, aparece en el ecuador de la clula, una estructura llamada fragmoplasto. Est constituida por dos sets de microtubulos con polaridad opuesta que superponen sus extremos en el plano de divisin. Se forma a medida que el huso acromtico desaparece.
Entre los microtbulos aparecen numerosos dictiosomas, que se unen formando una gran cisterna. En su interior se encuentran los polisacridos necesarios para la formacin de la laminilla media y de la fase amorfa de la pared primaria La membrana de los dictiosomas unidos entre s se transforma en membrana plasmtica. Tbulos del retculo endoplasmtico se disponen en la placa celular en formacin, perpendicularmente con respecto a ella. A medida que se forma la pared primaria, quedan mangas citoplasmticas alrededor de los tbulos del retculo endoplasmtico, rodeadas por la membrana plasmtica: constituyen los plasmodesmos primarios. Los microtbulos juegan un papel importante, al determinar la orientacin y disposicin de las microfibrillas de celulosa que constituyen la fase fibrilar de la pared primaria. Las microfibrillas son sintetizadas por las rocetas de celulosasintasas ubicadas en la membrana plasmtica. La formacin del tabique progresa en forma centrifuga hasta alcanzar la periferia, exactamente en el lugar donde se form la banda preprofsica
El comienzo de la tabicacin parece que requiere dos seales: Los cromosomas han terminado su replicacin y las copias hijas deben estar separadas en extremos opuestos. - Por otro lado, la clula debe haber alcanzado con una longitud umbral (http://club.telepolis.com/ohcop/lect49.html).
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Leccin 7: Regulacin del ciclo celular Como el ciclo celular esta ntimamente relacionado con la proliferacin celular es importante tener en cuenta que existen controles celulares para su desarrollo y son comunes a todas las clulas. Universalmente, el proceso de divisin celular consta de numerosos pasos que deben ocurrir de forma secuencial para que se produzcan clulas descendientes viables. Adems, el ciclo de divisin celular ha evolucionado de tal manera que existen varios puntos de control para evitar que el ciclo avance, a menos que hayan ocurrido con xito los pasos precedentes. Por ejemplo, seria letal que la mitosis ocurriera antes de que la replicacin se haya completado y por ello, se ha desarrollado mecanismos que impiden esos desastres celulares (Griffiths, 2000) Para entender el proceso de control celular se har uso de trminos como CDK (quinasa de protena dependiente de una ciclina), cdc2 (nombre de un gen), CdK 2 (nombre de la protena asociada), Y dos CICLASAS , estos son los responsables de regular a la perfeccin el ciclo de crecimiento y duplicacin celular. ciclinas y Quinasas de Protenas Dependientes de Ciclinas (tomado de Griffiths, 2000) Los motores que impulsan la progresin del ciclo celular son una serie de complejos proteicos compuestos que dos subunidades: una ciclina y una quinasa de protenas dependientes de una ciclina (abreviada como CDK, del ingls cyclindependent protein kinase). Todos los eucariotas presentan una familia de ciclinas estructural y funcionalmente relacionadas, que reciben este nombre porque cada una de ellas slo est presente en un momento determinado del ciclo celular. La aparicin de una ciclina determinada en un momento determinado del ciclo celular est regulada transcripcionalmente, de manera que un complejo ciclina-CDK funcional conduce a la activacin de un factor de transcripcin, que a su vez activa la transcripcin de la nueva ciclina. La desaparicin de una ciclina est regulada por tres sucesos; la rpida inactivacin del activador de la transcripcin de dicha ciclina (cesa la produccin de ARNm), la extremada inestabilidad del ARNm de la ciclina (desaparece el remanente de ARNm), y la extrema inestabilidad de la propia ciclina (desaparece el remanente de ciclina). Las quinasas de protenas dependientes de las ciclinas tambin constituyen una familia de protenas relacionadas estructural y funcionalmente. Las quinasas son enzimas que aaden grupos fosfato a los sustratos diana; en el caso de las quinasas de protenas, entre las que se incluyen las CDK, los sustratos son protenas. La designacin CDK para estas protenas se debe a que su actividad
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est regulada por las ciclinas y a que catalizan la fosforilacin de determinados residuos de serina y treonina de las protenas diana. El factor que dictamina qu protenas diana son fosforiladas por una determinada CDK es la ciclina asociada. En otras palabras, la ciclina es la que sujeta a la protena diana para que CDK pueda fosforilarla y se modifique as la actividad de la protena diana. Puesto que las ciclinas varan a lo largo del ciclo celular, cada fase del ciclo se caracteriza por la fosforilacin de un conjunto especfico de protenas diana. La fosforilacin es una modificacin transitoria y reversible. Cuando el complejo ciclina.CDK desaparece, las protenas fosforiladas son rpidamente desfosforiladas por la accin de las fosfatasas.
Protenas Diana de las CDK Cmo se produce la regulacin del ciclo celular pro fosforilacin de algunas protenas diana? La fosforilacin inicia una cadena de sucesos que culmina con la activacin de factores de transcripcin especficos. Estos factores de transcripcin promueven la expresin de una serie de genes cuyos productos se requieren en la siguiente fase del ciclo celular. Gran parte de nuestro conocimiento sobre el ciclo celular proviene de estudios genticos con la levadura y de estudios bioqumicos con clulas de mamfero en cultivo. Una cascada de regulacin bien caracterizada en las clulas de mamferos es la ruta designada como Rb-E2F. Rb es la protena diana de un complejo ciclina-CDK denominado Cdk2-ciclina A, y E2F es el factor de transcripcin regulado por Rb. Desde la fase M tarda hasta la mitad de la fase G1, las protenas Rb y E2F, se encuentran formando un complejo proteico inactivo que es incapaz de promover la transcripcin. En la fase G1 tarda, se constituye el complejo Cdk2-ciclina A que fosforila a la protena Rb. Esta fosforilacin produce un cambio conformacional de la protena Rb que provoca su disociacin del factor E2F. La protena E2F libre activa la transcripcin de un grupo de genes que determinan la sntesis de protenas esenciales para la replicacin del DNA. Las clulas se encuentran ahora en disposicin de proceder a la siguiente fase: la fase S del ciclo celular.
Rb y E2F, de hecho, representan dos familias de protenas relacionadas. En los mamferos, se cree que los diferentes complejos ciclina-CDK fosforilan selectivamente diferentes protenas de la familia Rb, cada una de las cuales a su vez libera de protena especfica de la familia E2F a la que est unida. Los
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diferentes factores E2F activan entonces la transcripcin de diferentes genes encargados de ejecutar diferentes aspectos del ciclo celular. La existencia del control del ciclo celular se ha realizado por medio del anlisis de la divisin celular de la levadura Saccharamyces, y otros aportes observemos el aporte hecho por los Bilogos moleculares Masui y Smith y los Bilogos Geneticistas Hartwell y Nurse. (tomado de http://club.telepolis.com/ohcop/lect49.html) Aporte de Bilogos Moleculares: Masui y Smith Durante la dcada del 80, dos evidencias distintas convergieron hacia un descubrimiento asombroso. La protena CDC2 , producida por el gen cdc2, es la reguladora del ciclo de crecimiento y duplicacin en todos los eucariontes y junto con dos ciclinas (protenas que aparecen y desaparecen cada ciclo), regulan el momento inicial de cada uno de los dos mecanismos, el de tener gordura suficiente y el de tener todos los cromosomas indispensables. La regulacin de este aspecto es debida a una protena mixta denominada FPM (factor de promocin de la maduracin o meyosis). El agregado intencional de FPM por un investigador a un huevo de rana inmaduro provoca la duplicacin tpica del huevo maduro. FPM acta no solamente en ranas sino en levaduras, invertebrados marinos y mamferos, y tambin en mitosis. Este primer tipo de experiencia lleva al convencimiento que el FPM gatilla tanto a la mitosis como a la meyosis, de una manera qumicamente autoorganizada.
Aporte de Biologos Geneticistas: Hartwell y Nurse Hartwell estudi al Saccharomyces cerevisiae, la levadura, que primero engorda, empieza una mitosis asexual en el momento que asoma la primera seal de un brote y termina con el desprendimiento de ese brote dejando una cicatriz en la madre e independencia para el nuevo microorganismo. La experiencia comenz con la fabricacin de mutantes de la levadura que se quedaban trabados a una cierta altura del proceso de engorde y mitosis, diferente para cada mutante. Razon que esto era debido a la mutacin de algn gen especfico, cuyo producto normal tendra que ayudar a seguir el ciclo (cada de fichas de domin) y cuya conducta mutada no inclua el aporte de ese producto, que sabemos que ser una protena. El nombre genrico de esa serie de protenas es el de protenas obtenidas de los genes para el CDC (ciclo de divisin celular). Estudi las levaduras mutantes, ponindolas en fila segn el momento cuando se trababan. Dedujo de all la secuencia normal de accin de los genes que gobiernan el ciclo. Imitndolo a Hartwell, Nurse repiti sus observaciones con Saccharomyces pombe
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(levadura de fisin), que se divide en dos mitades iguales y no como la levadura de cerveza (levadura de brote), en hijas de menor tamao que la madre. Con las nuevas mutantes atascadas a diferentes alturas del ciclo describi tambin aqu la secuencia normal de los genes del CDC. El ms curioso result ser cdc2, porque su correcta actividad era la nica puerta hacia una correcta mitosis. Los otros genes para el cdc generaban protenas que aceleraban una etapa del ciclo de mitosis. Se empez a mutar el gen cdc2. Unas mutaciones volvan imposible toda mitosis. Otras mutaciones hacan lo mismo que el resto, aceleraban el arranque de la mitosis.
Sntesis de las Dos Experiencias No seran las dos protenas una nica: CDC2 igual que FPM? Del FPM lo poco que se saba era que apareca en todos los eucariontes, sin haber sido aislado. La protena CDC2, en cambio, estaba aislada pero no se saba si actuaba en otros seres vivos. La primera tentativa fue la de rastrillar entre las protenas de los genes de la levadura de brote, alguna que reactivara a una levadura de fisin mutada y atascada sin avanzar en su duplicacin. En seguida se encontr pues serva bien una de las protenas de la familia CDC halladas ya por Hartwell. Nurse, en la misma bsqueda, insert segmentos de DNA humano al mensaje gentico de levadura de fisin con genes cdc2 inactivos. Fue suficiente, ya que la mitosis antes interrumpida sigui adelante. Qu significa? Pues que el ser humano tambin fabrica la protena CDC2. Las secuencias de amino cidos fueron similares. Mil millones de aos de seleccin natural no alteraron esta protena crucial, ms que en algn detalle estructural menor que no afectaba su funcin (neutralismo darwiniano). La funcin de la protena CDC2 es la de ser una quinasa, enzima que transfiere ATP, la moneda de la energa, a otras protenas. Finalmente se aisl el FMP y se lo vio formado, como protena mixta, por dos protenas simples. Una de ellas result ser CDC2. Los estudios con ranas y con levaduras coincidan en sus explicaciones. La otra protena simple se denomina ciclina, que se construye durante el ciclo a un ritmo estable, pero que se destruye rpidamente al acabar el ciclo de la mitosis. El balance entre su construccin lenta y constante y su destruccin completa y abrupta lleva a oscilaciones que actan como un reloj biolgico.
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Leccin 8: Estructura del cromosoma Como se dijo anteriormente, los cromosomas son los portadores de la informacin gentica y son la mxima manifestacin de condensacin del cido desoxirribonucleico (ADN); Se pueden observar al microscopio en la etapa de metafase de la divisin celular en mitosis (Darnell et al, 1988). Los cromosomas estn constituidos por cromatina, y sta a su vez por protenas histnicas, no histnicas y DNA (Darnell et al, 1988), las protenas histnicas son conocidas como H1, H2A, H2B, H3 y H4, el DNA esta compuesto por secuencias de pares de bases Adenina - Timina (A-T) y Citocina Guanina (C-G). Existen dos clases de cromatina, la heterocromatina que tiene la propiedad de mantenerse condensada durante todo el ciclo celular y la eucromatina que es funcionalmente activa y corresponde a porciones menos condensadas, la cantidad y localizacin de la cromatina es particular para cada especie (Cortes, 1984). Las principales partes distinguibles de un cromosoma son el centrmero o constriccin primaria; telmero o parte final del cromosoma; las cromtides, que corresponden a cada una de los partes separadas longitudinalmente (excepto en el centrmero) en un cromosoma duplicado; los brazos largos (q) y cortos (p) son cada una de las partes de mayor o menor longitud en un mismo cromosoma al dividirlo horizontalmente sobre el centrmero. Centrmero Es la constriccin primaria de los cromosomas es visible nicamente en cromosomas metafasicos, es el responsable de dividir las dos cromtidas en un cromosoma duplicado (fig 25) El centrmero se caracteriza por presentar secuencias cortas de ADN correspondientes a pocos pares de bases a algunos cientos, repetidas un nmero elevado de veces, (de 100.000 a varios millones) (http://www.iibce.edu.uy/uas/biomolec/secrepet.htm).
Cromtidas hermanas
Centrmero
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Figura 25. Cromosoma metafasico. Las cromticas se encuentran unidas por el centrmero. El primer centrmero que se estudio en gran detalle fue el del cromosoma Y en humanos. Este proporcion informacin de un inters particular, pues permiti conocer el nmero de repeticiones necesarias para generar un centrmero estable con el cual se puede llevar acabo el complejo de la divisin celular (Clarck, 1996). El centrmero no siempre es una figura permanente de los cromosomas pero si es una estructura dinmica. El polimorfismo natural de los centrmeros cobra gran importancia en el momento de mantener la integridad del cromosoma. No pareciera ser que esta unidad funcional tan pequea, no pudiera funcionar sin centrmero. Los cromosomas supernumerarios en Maz, aunque genticamente inertes tienen todos las partes requeridas de un cromosoma normal para ser estable en lo concerniente con la divisin celular, los cromosoma de B comparten mucho de la secuencia de repeticin comn en los cromosomas A. Una importante parte de algunos cromosomas es que los centrmeros estn en asociacin de protenas las cuales forman un complejo conocido como Kinetocoro el cual sirve para la unin de los microtubulos del huso mittico al cromosoma en el momento de la divisin celular. Se puede definir al kinetocoro o las protenas asociadas a el como el centrmero activo.
Kinetocoro Como se comento anteriormente el centrmero es considerado el sitio de constriccin primaria del cromosoma, adems de ser el ltimo punto de unin de las cromtidas hermanas al inicio de la anafase. Sin embargo, una de las consideraciones ms importantes tambin es la presencia del kinetocoro, pues es el lugar espacial de unin del centrmero con las fibras del huso mittico. En la Universidad de Wisconsin-Madison se realizaron estudios con microscopia electrnica de alto voltaje para determinar la composicin del kinetocoro, encontraron que el disco externo estaba compuesto por cromatina y a la vez asegurado de afuera hacia dentro del disco ms interno. La zona de los microtubulos del huso mittico est adjunta directamente a la fibras de cromatina, esto queda especialmente claro pues la fuerza inica baja cuando la organizacin del disco desaparece. Nuevamente la regin de los microtubulos y el kinetocoro aparecen cuando las fibras de cromatina hacen contacto tardo con el disco ms externo (Ris H., y Witt. P. l. 1981)
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El kinetocoro es un complejo de protenas que colabora en el direccionamiento correcto de los cromosomas en el momento de la migracin. Su morfologa es en forma de disco (trilaminar) a manera de monedas. Cada cromosoma tiene dos kinetocoros, uno en cada polo los cuales se mueven en direcciones diferentes. Algunos de los complejos protenicos conocidos son CENP-A 17 Kda, CENP-B 80 Kda, CENP-C 140 Kda, CENP-D 50 Kda. Casi el 99 % de CENP-B se encuentra fuera del kinetocoro y generalmente esta organizado en el centrmero. El CENP-B tiene dos regiones que son cidas porque ellos contienen niveles altos de glutamina y aspartamina, esto puede alterar la conformacin de cromatina porque reacciona con otras protenas presentes en el centrmero (Wall, 1996) La importancia que tiene conocer el complejo del kinetocoro esta en que est se afecta con la presencia de algunos medicamentos como lo es la Colchicina, y es por eso que se pueden obtener cromosomas libres para el anlisis citogentico, en experimentos realizados en la profase, se ha observado que el dimetro de las fibras es menos denso en la zona de los microtubulos adems de observar que el disco mas externo no es el mas visible (Ris H., y Witt. P. l. 1981). Telmeros Los telmeros fueron descubiertos por Hermann Joseph Muller durante la dcada de los aos 30, que junto a Barbara Mc Clintock recibieron el Premio Nobel. El termino fue propuesto mucho tiempo antes de conocer el significado de ADN. En cromosomas de clulas procariotas el ADN es circular por lo tanto no tiene un extremo expuesto, a diferencia de los cromosomas de clulas eucariotas que al presentar una forma lineal (es decir tienen dos extremos) requieren de una proteccin de sus extremos (Fig 27), (http://es.wikipedia.org/wiki/Tel%C3%B3mero) El telmero es la parte terminal del cromosoma en forma de capucha, su funcin principal es proteger el cromosoma frente a la degradacin, as como la unin de los extremos de ADN por enzimas reparadoras. Los telmeros son estructuras cromatnicas especializadas, tanto el ADN como las protenas que los constituyen presentan caractersticas singulares que los diferencian del resto de los cromosomas. En casi todos los eucariontes estudiados, el ADN telomrico (ADNt) consiste en repeticiones en tanden de pequeas secuencias nucleotdicas con una distribucin asimtrica de los pares G:C, pues las G se acumulan en una de las hebras (hebra G) y se encuentran agrupadas. La hebra G est orientada de 5' a 3' hacia el extremo del telmero y forma el extremo 3'del ADN cromosmico. En la zona ms extrema no est apareada formando un segmento final monofibrilar con una longitud que vara segn la especie (http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol18_2_99/ibi09299.htm) Se han realizado varios estudios tendientes a establecer un estndar en las secuencias de los telmeros, pero en no ha sido posible pues entre ms se analizan mas se aleja la posibilidad de encontrar un patrn entre los pares de
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bases. A continuacin se mencionan las secuencias de los telmeros estudiados en una serie de organismos, para poder apreciar su heterogeneidad.
Telmero Telmeros
Figura 27. Estructura Telomerica a) Tomado de http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Telomere.png/200pxTelomere.png y b) http://www.ifir.edu.ar/~divulgon/setiembre03/imagenes/telomer.jpg
Tabla 1. Secuencias de ADN telomrico mejor caracterizadas Organismo Tetrahymena Oxytricha Giardia Physarum Kluyveromyces Neurospora Caenorphabditis Vertebrados Secuencia TTGGGG TTTTGGGG TAGGG TTAGGG TCGGATTTGATTAGGTATGTGGTGT TTAGGG TTAGGG TTAGGG
Tomado de http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol18_2_99/ibi09299.htm
Tabla 2. Algunas secuencia de telmeros conocidas

Grupo Organismo Secuencia telomero (Direccin 5a 3 hasta el fin) TTAGGG TTAGGG AG(1-8) TTAGGG TTGGGG TTGGG(T/G)
Hongos filamentosos Neurospora crassa Moho del fango Physarum,Didynium Dictyosteliu Protozoos Tripanosomas, Crithidia cinetoplstidos Protozoos ciliados Tetrahymena, Glaucoma Paramecium
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Protozoo apicomplexa Plantas superiores Algas verdes Insectos Sacridos Levaduras aisladas
Oxytricha, Euplotes Plasmodium
Stylonychia, TTTTGGGG TTAGGG(T/C) TTTAGGG TTTTAGGG TTAGG TTAGGC TCA(A)(C)G(1-8) TGTGGGTGTGGTG (de copias de ARN) O G(2-3)(TG)(1-6)T consenso GGGGTCTGGGTGCTG GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT GGTGTA(C/A)GGATGTCACGATCATT GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT GGTGTAC GGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT
Arabidopsis thaliana Chlamydomonas Bmbix mori Ascaris lumbricoides Schizosaccharomyces pombe Leaduras agregadas Saccharomyces cerevisiae
Candida glabrata Candida albicans Candida tropicalis Candida maltosa Candida gullermondii Candida pseudotropicalis Kluyveromyces lactis
Tomado de http://es.wikipedia.org/wiki/Tel%C3%B3mero Los telmeros humanos y murinos contienen hasta 2000 veces repetida la secuencia 5' TTAGGG 3'. 5'...TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..3' 3'...AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC..5' La longitud del telmero es variable. En Oxytricha y Euplotes es apenas de 38 pb mientras en ratones alcanza 150 kb. Cada organismo posee una longitud media caracterstica. La cantidad de ADNt por cromosoma tambin flucta. En algunos organismos la longitud promedio de los telmeros responde a cambios genticos o nutricionales. En cuanto al desempeo de los telmeros parecen estar implicados en numerosas funciones celulares, se considera como el reloj biolgico que controla la vida de todas las clulas vivas de diferentes estirpes celulares. Estas estructuras se replican durante el ciclo celular gracias a la accin de enzimas denominadas telomerasas que estn formadas por protenas y ARN y presentan un mecanismo peculiar. http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol18_2_99/ibi09299.htm Previamente a la divisin celular, la clula duplica su ADN, incluida la secuencia de bases que constituyen el telmero. Sin embargo, en una clula normal, la maquinaria de replicacin no es capaz de copiar la totalidad de la secuencia del telmero en una de las hebras del ADN en el cromosoma y como resultado, el telmero se hace cada vez ms corto en cada replicacin. El desgaste del
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telmero con la sucesin de ciclos celulares, impide su funcin protectora, con lo que el cromosoma se hace inestable, originando errores en la segregacin, aparicin de anomalas y diversos tipos de mutaciones. Las clulas que presentan estos defectos, no solo son incapaces de duplicarse, sino que dejan de ser viables activndose los procesos de apoptosis o muerte celular programada. El desgaste del telmero limita la duracin del ciclo vital celular de la mayora de los tipos de clulas. Sin embargo, en el caso de las clulas germinales y embrionarias, de las que el organismo no puede prescindir; existe un elemento capaz de restaurar la secuencia del telmero para as prolongar la vida de la clula, manteniendo su capacidad de multiplicacin. Este elemento es una enzima extraordinaria, la telomerasa, que es un complejo de protenas y ARN. Durante cada ciclo de divisin celular se produce un acortamiento de los telmeros, con lo que se pierden unos 50-200 nucletidos. Ello se debe a la incapacidad de la polimerasa de ADN de replicar los extremos de las molculas de ADN. La telomerasa es muy activa en clulas fetales, manteniendo un alto nivel de proliferacin en ellas, pero muy poca proliferacin en las clulas de los tejidos de adultos (http://www.colegiomicrobiologoscr.org/Revista/2001-0%20Tel%F3meros.doc).
Brazos cromosmicos Los brazos cromosmicos son cada una de las estructuras largas y delgadas que se observan hacia arriba y abajo del centrmero. Se designan como brazo largo (q) a aquel de mayor longitud con respecto al corto (p) que es de menor longitud en un mismo cromosoma (fig 28). En citogentica se utiliza la relacin entre las diferentes longitudes de los brazos cromosmicos para distinguirlos unos de otros, pues dependiendo de esta relacin surgen diferentes tipos de morfologa, esta clasificacin ser tratada ms adelante. Cromtidas hermanas En un cromosoma duplicado son las dos estructuras que longitudinalmente se encuentran a lado y lado del centrmero y que permanecen unidas a travs de esta misma estructura (fig 28). Las cromtidas hermanas de un cromosoma pasan a ser cromosomas cuando ocurre la divisin en la anafase.
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Figura 28. Metafase de Clolosthetus puntatus Cortesa Cortes y Rodrguez 2004
Leccin 9: Tipos y nomenclatura de cromosomas Durante el estudio citolgico de algunos animales y/o plantas se han observado estructuras que corresponden a diferentes tipos de cromosomas, son considerados como cromosomas politenicos, plumosos, cromosmas B. Cromosomas Politnicos Son cromosomas interfasicos poco comunes que se encuentra en las clulas de intestino, rganos excretores o en las glndulas sebceas de algunos insectos (Clark y Wall 1996),, se define como un cromosoma excesivamente grande constituido por haces de filamentos cromonemicos no separados, es decir que se forman durante la replicacin del ADN sin mitosis ni citocinesis (fig 29). Los cromosomas politnicos o gigantes miden ms o menos 2 mm, se descubrieron en Drosophila y se han observado en otros dpteros del genero Chironomus. Estos cromosomas tienen bandas correspondientes a varias endoreduplicaciones 210 copias o aproximadamente 1024 hebras de ADN. El sistema de bandas es muy especializado, estos cromosomas se replican varias veces sin que se produzca una separacin real de las cromtidas con lo que el cromosoma se alarga y se hace ms grueso, as el cromosoma queda unido por el cromocentro (figura 29), que es la zona de fusin de las regiones heterocromatnicas situadas alrededor de los centrmeros de los pares cromosmicos.
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Figura 29. Cromosoma politnico. (Tomado de www.ucm.es/.../grupod/mitosis/MDtrans.jpg)
A lo largo del cromosoma politnico se encuentran estras llamadas bandas que varan en anchura y morfologa. Hay regiones engrosadas llamadas PUFFS (fig 30) y a veces muy distendidas llamadas ANILLOS DE BALBIANI que corresponden a regiones de sntesis de ARN. No hay una relacin uno a uno de bandas y genes, aunque se piensa que los genes activos estn en las bandas ms claras (http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-materialgenetico.htm). Se sabe que los genes de ARNr que estn en mltiples copias durante la replicacin del ADN en cromosomas politnicos no lo estn, estos genes estn normalmente en el 0.5% del genoma pero en cromosomas politnicos solo corresponde a un 0.1%. Cuando la replicacin es completada la separacin de las hebras de ADN son alineadas exactamente paralelas.
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Figura 30. Cromosoma politnico, observndose diferentes bandas oscuras y claras. Modificado de http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/genet2.htm y www.ucm.es/.../grupod/Cromoeuc/politen1.jpg La induccin de cromosomas politnicos en plantas ha sido demostrado en vivo y tambin in vitro. En el caso de la induccin es un artefacto de largo tiempo en cultivos celulares y choques de calores en clulas en suspensin. Esto es presumiblemente una reflexin de los eventos de endoreduplicacin causados por la disrupcin nuclear. Los cromosomas politcnicos en plantas son estructuralmente poco definidos cuando se comparan con los cromosomas politnicos de dpteros, es por eso que los estudios se han direccionado en este ltimo grupo. Cromosomas plumosos o escobillones Su descubrimiento fue hecho por Flemming en 1882, los cromosomas plumosos en una mirada panormica parecen ser como las cerdas de un cepillo, pues los lazos de ADN estn sobre un mismo eje; aunque el DNA slo se ha replicado una vez, el gran tamao de estos cromosomas se debe a su elevado grado de desespiralizacin con multitud de lazos, su longitud vara entre 0.4 y 0.8 mm (http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-material-genetico.htm). (fig 31) Los cromosomas plumosos son evidentes en los anfibios pero tambin se encuentran en los ovocitos de la mayora de las especies de vertebrados, incluyendo los humanos (mujeres antes de nacer). Tienen como caracterstica
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adems que ms del 90% del ADN esta en forma de crommeros. Cada cromosomas plumoso representa un bivalente o ttrada.
Figura 31. Cromosomas politnicos en anfibios Tomado de http://biologia.fciencias.unam.mx/bioanim3/04ovogen/sld023.htm
Cada uno de los lazos o asas que presentan corresponde a una zona de transcripcin de algn tipo de RNA. La transcripcin parece empezar justamente cerca de la parte central del eje del cromosoma y procede alrededor del lazo del otro lado. El cromosoma plumoso nmero 1 de Triturus cartnifex, tiene entre 350 a 500 lazos laterales. La actividad transcripcional de ADN parece estar asociada aproximadamente con 20-30 de estos lazos, los cuales pueden por lo tanto ser utilizados como marcadores (Clark y Wall, 1996). Los cromosomas plumosos se asocian con actividad celular, antes de producirse la fertilizacin, los huevos se dividen tempranamente, el embrin no puede comenzar la produccin de ARN ribosomal hasta que la gastrulacin haya empezado, as que no es adecuado encontrar cantidades de este antes de empezar la encubacin. En consecuencia, algunos ARN ribosomales que son requeridos por el organismo pueden ser provistos en estadios tempranos. La produccin de ribosomas es asumido ligeramente por diferentes caminos en
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donde el gen circular de los ribosomas es replicado , la produccin de ARN 18S y 28S puede ser producida rpida y eficientemente (Clark y Wall, 1996). Cromosomas B Frecuentemente son llamados cromosomas supernumerarios y son adicionales al complemento cromosmico normal bsico, ocurren en unas 1000 y 260 especies de plantas y animales respectivamente, estn relacionados usualmente con la distribucin de una poblacin especfica. Los individuos que poseen cromosomas B son fenotipicamente iguales a aquellos que no los poseen, as que los cromosomas B son prescindibles y no son esenciales para el normal crecimiento, desarrollo y reproduccin. Como caracterstica de los cromosomas B se tiene que Son morfolgicamente diferentes a los cromosomas A es decir a los del complemento normal. - Son ms pequeos que los cromosomas A - Contienen largas proporciones de heterocromatina - No tienen un par cromosmico durante la divisin celular - No presentan herencia Mendeliana - No portan mayor cantidad de genes - La influencia primaria esta determinada por la acumulacin en nmero (Clark y Wall, 1996) Muchos trabajos han demostrado que en experimentos de manipulacin temprana en plantas la forma y funcin de los cromosomas B han venido cumpliendo con los propsitos de ventajas en resistencia y/o produccin Ciertas razas de maz poseen uno o ms cromosomas adicionales por encima del juego bsico de diez cromosomas. Estos cromosomas adicionales son de menor tamao, compuestos sobre todo de heterocromatina; no son considerados esenciales para el crecimiento y desarrollo normal de la planta y no parecen contener ningn gen esencial. Stark et al. (1996) informaron acerca de los resultados de los anlisis moleculares de los cromosomas B del maz y llegaron a la conclusin de que su composicin es similar a la de los cromosomas normales o cromosomas A. Estos estudios sugieren un origen interno de los cromosomas B, dentro del genomio del maz. Los "genes B" tienen efectos citolgicos importantes sobre los cromosomas A durante la meiosis y los cruzamientos entre los mismos (Carlson, 1978, 1986, 1988). Las aberraciones cromosmicas causadas por tratamientos de rayos-X pueden dar lugar a traslocaciones o intercambios de segmentos de cromosomas B con segmentos de cromosomas normales A. Estas son llamadas traslocaciones B-A y tienen caractersticas peculiares, especialmente por su capacidad de no-disyuncin en la segunda mitosis polnica. Las traslocaciones B-A se encuentran en un gran nmero de combinaciones
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cromosmicas. Beckett (1978) describi 71 traslocaciones B-A. Su importancia para ubicar los genes en los brazos de los cromosomas normales y la preparacin de mapas de ligamiento y otras aplicaciones en el cruzamiento del maz tambin han sido discutidas por Beckett (1978, 1991, 1994). Birchler y Hart (1987) discutieron la importancia de la translocacin B-A para producir diferentes cantidades de segmentos especficos de cromosomas y el consecuente efecto de la cantidad de los genes sobre el endosperma del maz. Carlson (1994) describi el sistema de la nomenclatura de las trasloca-ciones B-A, su mantenimiento y uso (http://www.fao.org/docrep/003/X7650S/x7650s06.htm) En animales tambin han sido reportados cromosomas supernumerarios un ejemplo de estos son algunos grupos de insectos y peces, de hecho Wilson 1907 fue el primero en utilizar este termino al observar cromosomas adicionales al complemento estndar en el genero Metapodius (heminoptera) (Pauls y Bertollo, 1983) En peces han sido reportado cerca de 14 especies de diferentes familias neotropicales dentro de las cuales se encuentran diferencias intra e Inter especificas; en Astyanax scabripinnis paranae se reporta un 2n=50 pero en un estudio de 27 ejemplares 8 de estos presentan 2n=51 correspondiendo este nmero a un largo cromosoma metacntrico extra, esta diferencia puede ser posible a que la poblacin se encuentra aislada (Maistro et al., 1992). Por su parte en un estudio de Prochilodus scrofa y Rhambia hilarii se encontr variacin de la presencia de cromosomas B; para la primera especie iban desde 0 a 5 los cuales aparecan en el mayor de los casos de forma univalente, adems con un anlisis de bandas C los cromosomas B correspondieron en su totalidad a heterocromatina pues tieron positivamente para las regiones pericentromerica con esta tcnica (Pauls y Bertollo, 1983); para la segunda especie el nmero cromosmico vario entre 2n=58 y 2n=63 mostrando diferencias con los cromosomas A del complemento estndar, se sugiere que la presencia de estos cromosomas B tienen que ver con ventajas adaptativas (Fenocchio y Bertollo, 1990), pues han sido reportados como un mecanismos de acumulacin en donde su distribucin y frecuencia son determinantes en las fuerzas de oposicin de eliminacin y acumulacin durante el crecimiento y reproduccin de los organismos (Jones y Rees, 1982 citado por Fenocchio y Bertollo, 1990) Cromosomas A Se conocen como los cromosomas normales dentro del cariotipo de cualquier individuo de una especie cualquiera. El cromosoma metacntrico corresponde a la mxima condensacin del ADN y es visible nicamente en la fase de la metafase de las divisiones celulares tanto mittica como meiotica.
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Como se menciona en la leccin 8 las principales partes distinguibles de un cromosoma son el centrmero o constriccin primaria; telmero o parte final del cromosoma; las cromtides, que corresponden a cada una de los partes separadas longitudinalmente (excepto en el centrmero) en un cromosoma duplicado; los brazos largos (q) y cortos (p) son cada una de las partes de mayor o menor longitud en un mismo cromosoma al dividirlo horizontalmente sobre el centrmero.
La importancia de identificar cada una de las partes de los cromosomas esta en que ha sido utilizada para establecer el cariotipo que se define como el complemento cromosmico normal haploide o diploide con respecto a la talla, forma y nmero, caracterstico de un individuo, especie, gnero u otro grupo, en la mayora de organismos todas las clulas que los forman tienen el mismo cariotipo. Este manifiesta un nmero cromosmico constante conocido como nmero modal, adems del nmero fundamental que se refiere al nmero total de brazos cromosmicos dentro del complemento. (fig 32 y 33)
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Figura 32. Cariotipos de Pseudoplatystoma sp organizados segn forma y tamao de los cromosomas (Cortesa Janet Camacho Garzn, 1999)
Cuando el cariotipo es presentado grficamente, con los cromosomas ordenados por talla, numerados, con el brazo corto hacia arriba y los centrmeros alineados en cada una de las categoras segn relacin de brazos e ndices centromricos, se denomina idiograma (fig 34) (Camacho, 1999)
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Figura 33. Cariotipos de Crocodylus acutus organizados segn forma y tamao de los cromosomas (Cortesa Janet Camacho Garzn, 2003)
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Figura 34. Ideograma del complemento cromosmico haploide Crocodylus acutus (Fuente Camacho 2003) Leccin 10: Alteraciones cromosmicas y Genotoxicidad Ante todo es de aclarar que existe un sistema de nomenclatura estndar para designar los cromosomas de un cariotipo normal, as que cualquier alteracin de este patrn estndar se considera como alteracin y se denomina anomala cromosmica. En trminos muy generales una anomala puede ser constitucional o adquirida, entendiendo por la primera como aquella que involucra todos los tejidos del individuo, es decir que el error ocurri en uno de los gametos antes de la fecundacin, o en el cigoto; y el segundo caso es aquella que involucra un solo rgano, aqu se consideran el desarrollo del cancer. Las alteraciones del material gentico pueden afectar a un gen (alteracin congnita de origen gentico puntual) o a varios genes (alteracin congnita polignica) o a los cromosomas (alteracin de origen cromosmico)
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En este capitulo se trataran las anomalas constitucionales pues son ellas las responsables de la manifestacin de muchas enfermedades, infertilidad y/o muerte de los individuos quienes la portan. Adems algunas de ellas son el propsito principal cuando se trata de realizar un estudio y diagnostico citogentico de una especie dada. Alteraciones congnitas de origen gnico. Recordemos cuando se hablo en captulos anteriores sobre transcritos funcionales, se comentaba que la funcin tanto de la transcripcin del ARN y traduccin de protenas es obtener protenas especificas de acuerdo a lo establecido por el ADN, pues ste es ledo por tripletas de cidos nucleicos que traducen a una amino cido especfico y la secuencia de estos son los que definen una protena y no otra; la funcin de las protenas depende completamente de la cantidad, calidad y ordenamiento de los aminocido, as que la modificacin de tan slo una tripleta en la lectura del ARN-m puede acarrear alteraciones en el producto final. Teniendo en cuenta que el cdigo gentico es el traductor universal y realiza el cambio de lenguaje de cidos nucleicos a aminoacidos, en ocasiones la perdida, aumento o sustitucin de un cido nucleico puede alterar la secuencia ms no la protena sintetizada pero en el peor de los casos si habr una sustitucin total tanto en la lectura del triplete como en la protena final, obtenindose de esta forma una protena alterada en sus propiedades; as que estas alteraciones son de tipo estructural. Dentro de estas modificaciones se pueden encontrar alteraciones puntuales, delecin, aumento o inversin de un segmento de ADN; las primeras que se tratan del cambio de una base por otra no pueden ser detectadas por tcnicas citogenticas pues slo lo son cuando hay secuenciacin del gen involucrado en la anomala congnita. Generalmente la delecin y duplicacin involucran segmentos de ADN que podran ser identificadas por las tcnicas citogenticas, su identificacin se realiza por que se pierde un segmento en el caso de la delecion y un aumento en la porcin de material gentico en caso de la duplicacin. Por su parte, las translocaciones e inversiones son modificaciones sin perdida de material; la translocacin es el intercambio de material gentico entre un cromosoma y otro, y la inversin la ruptura y reorganizacin de un segmento gentico dentro del mismo cromosoma. Para dar una mejor idea de lo que significa esta anomalia a continuacin se da un ejemplo en cariotipo humano (fig 35).
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Figura 35. Translocacin 11 -14 en humanos www.conganat.org/.../5curso/cap4/images/fig2.jpg Un ejemplo muy particular en animales para este tipo de alteracin son las translocaciones que producen trastornos en la fertilidad de los individuos que la portan, en un estudio citogentico en bovinos criollos se detecto la anomala de translocacin 1/29 en un 7.9% de los ejemplares estudiados; uno de los ejemplares corresponda a una hembra homocigota para esta traslocacin lo que permiti ver la falta de seleccin en el pie parental en progrmas de reproduccin debido a que esta hembra hace parte del ncleo de conservacin de la Secretara de Agricultura y Desarrollo Econmico del Casanare (Snchez et al., 2006). (fig 36)
Alteraciones congnitas de origen cromosmico
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El cromosoma al ser la mxima condensacin del ADN y portan numerosos genes, la falta o duplicacin de uno de ellos traern graves consecuencias que pueden representar anomalas severas o hasta la muerte del individuo que las porta inclusive en sus primeros estadios de vida.
Figura 36. Translocacin Robertsoniana t (1;29) en condiciones homocigoto, es mostrada en el cariotipo de una hembra de la raza criolla Casanareo, (Bandas RBG) (Sanchez, 2006) Las alteraciones de origen cromosmico se conocen como alteraciones numricas pues alteran el nmero normal del complemento cromosmico al aumentarse o
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perderse cromosomas individuales, ests alteraciones estn representadas fundamentalmente por aneuploidias, as puede haber nulosomias 2n-2, monosomia: 2n-1, estas se conocen tambin como hipodiploides representadas como 2n-x, las alteraciones que presentan aumento de un cromosoma son trisomia 2n+1 tetrasomia 2n+2 conocidas como hiperdiploides representado por 2n+x (fig 37) Los mecanismos que producen anomalas cromosmicas pueden ejercerse en cualquiera de las dos divisiones que conforman la meiosis. Puede ocurrir una falla en la separacin de los cromosomas homlogos, resultando anormal la distribucin de los mismos entre las clulas hijas. La aneuploidias pueden involucrar los cromosomas sexuales por ejemplo en bovinos se presentar 61 XXY, 61 XYY o 61 XXX, la razn principal de esto es la no disyuncin de los cromosomas o de cromtides hermanas en las clulas germinales durante la meiosis generando un vulo o un espermatozoide con un cromosoma sexual extra que unido al gameto normal forman las aneuploidias (Eldridge, 1985) A continuacin se presentaran algunos ejemplos en los cuales se incluye algunos en humanos, el motivo de esto es que se encuentran mucha ms documentacin e imgenes disponibles, pero para ejemplarizar las anormalidades cromosmicas esta bien pues el principio bsico es el mismo. Sin embargo tambin se mencionan algunos ejemplos en animales. Entre las aneuploidas, las nulisomas (2n-2) estn muy escasamente representadas debido a que, en general, son letales en los organismos diploides normales. Las monosomas (2n-1) tambin son generalmente letales. En la especie humana, la nica viable es la monosoma para el cromosoma X y da lugar a un sndrome gentico llamado sndrome de Turner. (www.oni.escuelas.edu.ar/.../adn/ftxtalte.htm)
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Figura 37. Metafase humana mostrando monosomia del cromosoma X conocida como sndrome de Turner (www.oni.escuelas.edu.ar/.../adn/ftxtalte.htm) Las trisomas (2n+1) son, en general, ms viables que las monosomas. En la especie humana hay varios ejemplos. En primer lugar, estn las trisomas autosmicas y, entre ellas, la ms frecuente es la trisoma para el cromosoma 21 que da lugar al sndrome de Down (fig 38). (www.oni.escuelas.edu.ar/.../adn/ftxtalte.htm) Existen otras dos trisomas autosmicas que se presentan al nacimiento en la especie humana. La trisnoma del cromosoma 18, que da lugar al sndrome de Edwards y la trisoma del cromosoma 13, que origina el sndrome de Patau. La hibridacin es otra posibilidad para que se encuentren alteraciones numricas ya sean monosomias o trisomias, tetrasomias, etc., un caso particular es el presentado en un ejemplar hbrido de pseudoplatystoma fasciatum con pseudoplatystoma tigrinum, en una misma metafase se encontr monosomia del cromosoma 2, 26, 27 y tetrasomia del par cromosmico 1 (fig 39)
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Figura 38. Metafase humana mostrando trisomia del cromosoma 21 conocida como sndrome de Down (www.oni.escuelas.edu.ar/.../adn/ftxtalte.htm)
Poliploidia (tomado de www.unavarra.es/.../autotriploide.gif) Las modificaciones numricas que involucran todo el set de cromosomas son conocidas como euploidias, cuando los organismos tienen dos cromosomas de cada uno de los cuales componen el complemento normal se le conoce como diploide.
Figura 39. Cariotipo con banda C de hbrido Pseudoplatystoma fasciatum X Pseudoplatystoma tigrinum se observa tretasomia del cromosoma 1 y monosomia de 2, 26 y 27 (Camacho, 1999)
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Un individuo se dice diploide cuando en sus clulas somticas estn presentes 2 juegos idnticos de x cromosomas cada uno, de forma que cada uno de dichos x cromosomas son todos diferentes entre s. Al conjunto de los x cromosomas, se les denomina genomio y nmero bsico al de cromosomas que lo forman o sea x. Por tanto, una clula, tejido u rgano es diploide cuando sus ncleos poseen los 2x cromosomas (autosomas) tpicos del individuo a que pertenecen. Un individuo que contiene en sus clulas somticas la mitad de los cromosomas pertenecientes a su especie se llama monoploide o haploide. Cuando la dotacin cromosmica normal de un individuo est compuesta por varios genomios o juegos completos de cromosomas se dice que es un poliploide. Si los genomios son iguales, el poliploide es un autopoliploide y se lo denomina autotriploide, autotetraploide, autopentaploide, n-ploide segn que sus clulas somticas tengan 3, 4, 5 n juegos idnticos de cromosomas. Sus nmeros cromosmicos sern, por tanto 3x, 4x, 5x, nx, siendo x el nmero bsico antes definido. Si los genomios que componen la dotacin cromosmica del poliploide no son iguales, entonces se llama aloploide. El aloploide rene en su complemento cromosmico los de dos o ms especies diploides. Si una especie aloploide est formada por dos genomios distintos, se llama alotetraploide(G 1 G1 G2 G2 ), si son tres lo genomios, se trata de un alohexaploide (G1 G1 G2 G2 G3 G3 ), etc. La poliploida es muy comn en plantas, especialmente en angiospermas, esta condicin les confiere beneficios en cuanto a resistencias fisiolgicas a condiciones especficas. Actualmente, se piensa que entre el 30 y el 70% de las Angiospermas son poliploides. Se sabe que las herbceas perennes muestran mayor porcentaje de formas poliploides que las anuales y stas menos que las leosas aunque las herbceas perennes y las leosas se comportan de diferente manera en las regiones tropicales.
Tabla 3. Algunos ejemplos de niveles de poliploidias Planta Avena Cacahuete caa de azcar Banana N cromosmico bsico 7 10 10 11 Nmero cromosmico 42 40 80 22,33 Nivel de ploida. 6x 4x 8x 2x,3x
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Patata Tabaco Algodn Manzana
12 12 13 17
48 48 52 34,51
4x 4x 4x 2x,3x
Las plantas poliploides tiene importancia comercial y por eso se utilizan mucho en agricultura, las clulas poliploides son frecuentemente mayores, y en consecuencia tambin lo son las plantas, frutos, etc,. Un ejemplo es la obtencin del trigo harinero a partir de cebada y trigo durum con el objetivo de obtener granos de mejor calidad (Fig 40). Normalmente dos genomas en cada clula son suficientes para producir la cantidad necesaria de ARN para dirigir la sntesis proteica. Sin embargo, en las clulas vegetales muy activas metablicamente, dos copias pareceran insuficientes, y entonces el ncleo replica su ADN volvindose poliploide. Parecera que en las plantas superiores, muchos tipos de clulas son poliploides. Los vasos del xilema, las clulas del tapete, las clulas secretoras, muchos pelos, etc. son generalmente poliploides. En un mismo individuo pueden aparecer clulas con distintos niveles de ploida: en Tropaeolum majus se han encontrado clulas en el pecolo con nivel de ploida 32x; clulas en tallo 128x y ciertas clulas del tegumento seminal son 1024x. A veces se forman clulas polinucleadas, como por ejemplo en los tubos laticferos, en el endosperma y en las clulas del tapete. (http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema9/9-2mitosis.htm).
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Figura 40. Evolucin del Trigo harinero (Tomado de www.ciencia-activa.org/.../TriticumPloidy.jpg) Otro ejemplo es el encontrado en sandia, pues aquellas que se encuentran en el mercado y poseen pepas tienen como dotacin cromosomica 2n=11 pero las hay triploides que garantizan un alimento ms fcil para consumir pues por su tamao permite ser comida en una sola racin, sin contar adems que su pulpa es mucho ms dulce dado que no invierten en la produccin de las pepas. Las sandias sin pepas se obtienen de semillas especiales, las cuales se producen a partir de sandias normales (diploides) por sandias tetraploides, estas ltimas se obtiene al tratar la sandia normal con colquicina, una sustancia que se obtiene del clquito una planta de la familia de las lilceas muy toxica. Las plantas que crecen a partir de las semillas del cruce cuando son polinezadas por plenes de plantas normales producen ejemplares estriles que contienen semillas que no se han desarrollado normalmente muy rudimentarias y blandas (http://www.botanicalonline.com/sandias.htm) Pocos gneros de gimnospermas contienen especies poliploides. Ejemplos son Ephedra, Gnetum y Welwitschia. El Juniperus chinensis es especie tetraploide y la Sequoia sempervirens es una especie exaploide de origen natural. Aunque la poliploidia no desempea un papel importante entre las formas de variacin de las Pinaceae se encuentran ocasionalmente plantas poliploides en los viveros y en la naturaleza. Se ha encontrado condicin aneuploide y mixoploide en brinzales enanos de Picea abies (Kiellander, 1950; Illies, 1959) y tetraploide en un brinzal gemelo de Aojes firma (Kanezawa, 1949). Hay informes aislados sobre poliploidia natural en Larix. Christiansen (1950) localiz un tetraploide adulto de Larix decidua, y Chiba y Watanabe (1952) encontraron entre repicados de dos aos de Larix leptolepis ocho plantas poliploides - dos tenan races diploides, mientras que
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las seis restantes eran todas tetraploides. Un ejemplar originado por cruzamiento entre Larix decidua y L. occidentalis era triploide (Larsen y Westergaard 1938). Se ha comunicado la existencia de ejemplares poliploides o mixoploides espontneos en cuatro especies de pino. Zinnai (1953) localiz cinco plantitas tetraploides de Pinus densiflora; en el Pinus elliottii Mergen (1958) describi plantitas mixoploides con 2n, 3n y 4n complementos cromosmicos; la presencia de poliploidia en Pinus sylvestris en Suecia fue comunicada por Johnsson (1959); y Nishimura (1960) describi una planta tetraploide de Pinus thunbergii nacido de una semilla con dos embriones. Por tratamiento con colchicina (Margen, 1959) se han formado poliploides en especies gimnospermas. En todas las especies en que se intent, se consigui inducir la poliploidia y los cambios en los brinzales o rboles fueron similares. En general, las acculas fueron ms cortas y gruesas, el nmero de clulas se redujo, la ramificacin fue ms basta, la floracin se inhibi y fue frecuente en los rboles el enanismo. Los tetraploides son poco deseables en la mayora de las especies, pero tienen aplicacin como paso intermedio en la produccin de triploides. Se ha intentado saltar la fase de esporofita tetraploide tratando estrbilos de microesporangios de Larix leptolepis (Illies, 1956) y Pinus nigra y Pinus mugo (Margen, 1959) durante la microesporognesis. Se produjeron granos de polen diploides pero no se dispone de resultados relativos a la descendencia de este tipo de polen. El mtodo es prometedor, sin embargo, y no cabe duda que recibir ms atencin. Gustafsson (1960a), Mehra (1960) y Mergen (1963) dan ms informacin sobre poliploidia en gimnospermas La poliploidia natural se origina a menudo despus de la hibridacin entre especies diferentes o poblaciones equivalentes a especies y subsiguiente doblado del nmero de cromosomas, debido a la formacin de gametos no reducidos (condicin conocida como anfiploidia o alopoliploidia). Tal tipo de poliploidia es comn entre las angiospermas cultivadas (Nicotiana, Gossypium, Triticum, Brassica) aunque tambin en especies silvestres (Galeopsis, Rubus, Poa), pudiendo formarse artificialmente nuevas combinaciones como por ejemplo Triticale, que es un nuevo gnero combinacin de Triticum y Secale. En otros muchos casos la poliploidia es de origen intraespecfico (el trmino empleado es autopoliploidia). Los lmites entre la alo- y la autopoliploidia no son rgidos (Mntzing, 1936). El gnero Dactylis es interesante a este respecto pues los tetraploides naturales son considerados a menudo como poliploides interespecficos, aunque los correspondientes diploides estn sin duda muy emparentados (Mntzing, 1956).
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Un caso interesante fue reseado por Wright (1959a) en fresno blanco, Fraxinus americana, que se divide en tres ecotipos, uno septentrional (2n = 46), uno intermedio (conteniendo poliploides) y uno meridional (con 2n = 46, 92, 138). El fresno Pumpkin, Fraxinus tomentosa, es una especie exaploide rara (&= 138), derivada probablemente de un cruce entre un fresno verde diploide y un fresno blanco tetraploide (Wright, 1959b). De acuerdo con estos hechos, en el Fraxinus se dan ambas formas, la autopoliploidia y la anfiploidia. La caracterstica ms sobresaliente de las razas poliploides intraespecficas consiste en los cambios del ritmo de desarrollo y de exigencias ecolgicas, como fue explicado primeramente por Mntzing (1936) y luego, con ms extensin, por Stebbins (1950, 1956) y por Mntzing (1956, 1959). La apariencia generalmente gigas, el aumento del crecimiento vegetativo, la alteracin de reacciones de incompatibilidad y los cambios en exigencias ecolgicas permiten a los autopoliploides extender las reas de cultivo de las variedades diploides. Tales poliploides tienen aplicacin tambin en la mejora gentica forestal, idea defendida por Nilsson-Ehle cuando hace ya tiempo estudi las reacciones y potencialidades del autotriploide gigante del Populus tremula, En las gimnospermas, as como en muchas frondosas, los alopoliploides pueden llegar a ser ms adecuados para el uso directo en la prctica que los autopoliploides (http://www.fao.org/docrep/03650s/03650s02.htm)
Alteraciones cromosmicas en mosaicos y quimeras. Mosaicos: existen individuos cuyas clulas no tienen todas la misma constitucin cromosmica, a estos casos se los denomina mosaicos cromosmicos. Un ejemplo de individuos mosaicos se genera cuando durante la primera segmentacin embrionaria se produce una falta de disyuncin. Los dos blastmeros resultantes presentan distinto nmero de cromosomas, dndose lugar a dos linajes o lneas celulares diferentes. Las anomalas cromosmicas que ocurren despus de la fecundacin tienen una elevada probabilidad de originar individuos con un mosaico cromosmico. La falta de separacin de cromosomas puede ocurrir en cualquiera de las divisiones mitticas, por ejemplo durante la segmentacin. Es improbable que la anomala ocurra en todas las clulas embrionarias o blastmeros. Si afecta a algunas de ellas, pueden originarse tres lneas celulares distintas: las normales, las trismicas y las monosmicas. En muchos casos estas no son capaces de sobrevivir, por lo que el embrin resulta ser un mosaico conformado por clulas normales y trismicas.
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La presencia de anomalias cromosmicas como el mosaico 63,XO/64,XX (fig. 41) presencia de dos o ms tipos de lneas celulares presentes en un organismo, de origen pre-cigtico o pos-cigotico (Jimnez, 1996), disminuye el desempeo reproductivo de yeguas fenotipicamente normales porque afecta el desarrollo del tracto reproductivo: ovarios muy pequeos y/o qusticos, cuerpos lteos prseistnetes, atrofia endometrial y/o flacidez cervical; lo que se hace evidente por la presentacin de ciclos irregulares, anovulatorios o anestros prolongados (MacFeely, 1990) (citado por Moncaleano, 2007).
Fi gura 41. Metafases que muestran mosicismo leucocitario 64XX/63,XO en yeguas Quimeras: Las quimeras son embriones resultantes de la fusin de dos embriones de constitucin cromosmica distinta. Experimentalmente se ha logrado la fusin de blastocistos de mamferos. Estos embriones logran desarrollarse normalmente, aunque si uno de los componentes es XX y el otro XY se presentan cuadros de intersexualidad. El mejor caso conocido de quimeras es el Freemartinimso en bovinos, estos casos se han observado en hembras mellizas de un macho cuando se han fusionado sus circulaciones placentarias(fig 42) en los terneros normales la identificacin cromosmica de las hembras es 60XX y de los machos 60 XY, pero en algunas hembras freemartin se encuentra una mezcla de 60XX en algunas clulas y 60XY en otras (fig. 43). La frecuencia de sndrome freemartin ha sido estimada en 92% de los partos gemelares heterosexuales (macho y hembra) del bovino; sin embargo, pueden producirse en partos mltiples de ms de dos productos si por lo menos un individuo macho est presente (www.cuencarural.com/img/varias/img2288.jp). Tambin se supone que, en caso de gestacin nica, ocurri fusin de embriones tempranos. Este tipo de quimeras se han observa do tambin en cerdos, cabras y ovejas.
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Figura 42. Anastomosis vascular placentaria de fetos bovinos (Tomado de Robert A. Foster, Department of Pathobiology, Ontario Veterinary College, University of Guelph). (Tomado de www.cuencarural.com/img/varias/img2288.jpg)
Figura 43. Fotografa de clulas en metafase mostrando el complemento cromosmico sexual de una freemartin. Ntese la presencia de cromosmas XX (Figura A) y cromosomas XY (Figura B). (Tomado de Ayala-Valdovinos y col. Vet. Mx., 31 (4) 2000. (citado por www.cuencarural.com/img/varias/img2288.jpg)
Genotoxicidad La Genotoxicidad hace referencia a todos los agentes externos que deterioran la estructura del ADN y por ende la funcin del mismo. Existen elementos medioambientales y/o qumicos que afectan en mayor o menor grado la estructura del ADN, representando alteraciones gnicas de alta o baja expresividad relacionndolas con alteraciones fisiolgicas o fenotpicas en el individuo afectado. Se define como genotoxico el agente toxico (daino) para el ADN. Las sustancias genotxicas pueden unirse directamente al ADN o actuar indirectamente mediante
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la afectacin de las enzimas involucradas en la replicacin del ADN y causando, en consecuencia, mutuaciones que pueden o no desembocar en un cncer. Las sustancias genotxicas no son necesariamente cancergenas, pero la mayor parte de les cancergenos son genotxicos. (http://www.greenfacts.org/es/glosario/ghi/genotoxico-genotoxicidad.htm) Todos los das el cuerpo est rodeado de substancias qumicas potencialmente peligrosas y algunas de ellas estn relacionadas con el desarrollo de cncer. Un individuo puede quedar expuesto a cancergenos ambientales en su sitio de trabajo, debido a sus hbitos personales y por los alimentos que ingiere. Algunos riesgos son ubicuos (incremento en el desarrollo de cncer de piel por exposicin a la luz solar) y otros son especficos para un estilo de vida (incremento de distintos cnceres asociados al uso del tabaco). (http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-4-1-3.html) Existen dos factores que contribuyen a la genotoxicidad que son los agentes fsicos y los compuestos qumicos.
Genotoxicidad por Agentes Fsicos: ionizantes y no ionizantes.
Dentro de estos estn las radiaciones
Las ondas electromagnticas son transportadas por partculas llamadas cuantos de luz. Los cuantos de luz de ondas con frecuencias ms altas (longitudes de onda ms cortas) transportan ms energa que los de las ondas de menor frecuencia (longitudes de onda ms largas). Algunas ondas electromagnticas transportan tanta energa por cuanto de luz que son capaces de romper los enlaces entre las molculas. De las radiaciones que componen el espectro electromagntico, los rayos gamma que emiten los materiales radioactivos, los rayos csmicos y los rayos X tienen esta capacidad y se conocen como radiacin ionizante. Las radiaciones compuestas por cuantos de luz sin energa suficiente para romper los enlaces moleculares se conocen como radiacin no ionizante. (http://www.who.int/peh-emf/about/WhatisEMF/es/index.html) Las radiaciones ionizantes se clasifican en dos categoras.

1. las ondas electromagnticas (radiaciones gamma y rayos X) 2. las corpusculares (radiaciones alfa, los neutrones y las radiaciones beta).
Se las denomina ionizantes porque, al actuar sobre la materia, producen impactos en los tomos que la constituyen, expulsando de los mismos protones o electrones, alterando as el balance de cargas que normalmente mantiene a los tomos en un estado de neutralidad elctrica. Cuando una radiacin altera alguno de los tomos que constituyen una molcula proteica, determina su ionizacin y la molcula se vuelve extraa para la clula. Los efectos nocivos dependen de la cantidad de radiacin recibida. Si es baja, probablemente afectar a pocas
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protenas y la clula pondr en accin mecanismos reparadores, siendo el dao reversible. Existe as un "umbral" que deber ser sobrepasado para que el dao sea irreversible. Otro tipo de molcula para cuya alteracin no existe un umbral es el cido desoxirribonucleico (ADN). Si el impacto de la radiacin provoca la ruptura en un cierto lugar de la molcula, esta puede, en ciertos casos, repararse completamente. Pero esa reparacin puede producirse de manera errnea. Por ejemplo, que las dos hlices se unan entre s de manera cruzada, alterndose el cdigo gentico, lo que implicar una alteracin en la protena codificada por ese segmento. Toda alteracin en el cdigo lleva a la aparicin de genes anormales. La trada clsica de las anomalas por radiacin en los animales domsticos incluye: 1- retardo del crecimiento intra o extrauterino, 2- muerte embrionaria, fetal o neonatal y 3- malformaciones congnitas. El sistema nervioso central es la estructura ms afectada en los mamferos (http://es.wikipedia.org/wiki/Teratolog%C3%ADa). Por su parte las no inonizantes estn representadas por la luz ultravioleta. Campos electromagnticos. Ultrasonidos. La radiacin ultravioleta, cuyas longitudes que van aproximadamente desde los 400 nm, hasta los 15 nm, es emitida por el sol en las formas UV-A, UV-B y UV-C pero a causa de la absorcin por parte de la atmsfera terrestre, el 99% de los rayos ultravioletas que llegan a la superficie de la tierra son del tipo UV-A. Estos rangos estn relacionados con el dao que producen en el ser humano. La radiacin UV-C no llega a la tierra porque es absorbida por el oxgeno y el ozono de la atmsfera, por lo tanto no produce dao. La radiacin UV-B es parcialmente absorbida por el ozono y llega a la superficie de la tierra, produciendo dao en la piel, debido a que penetran muy dentro de la epidermis y dermis donde mata a las clulas. los rayos ultravioleta provoca envejecimiento de la piel enrojecimiento, irritacin, arrugas, manchas , perdida de elasticidad entre otras cosas. los uv provocan que las clulas mueran, que los vasos sanguneos se dilaten y que la piel pierda varias propiedades como las vitaminas (http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_ultravioleta) En otro sentido los rayos UV tiene ventajas, puesto que se utilizan para generar espacios estriles, pues cuando un microorganismo se expone a UV-C, los ncleos de las clulas modifican su divisin debido a los procesos fotolticos por lo tanto la reproduccin es prevenida (http://www.lenntech.com/espanol/uvinformacion.htm) Experimentalmente, se han irradiado clulas in vitro durante la etapa G1 del ciclo y las mismas han desarrollado anomalas al llegar a la fase M, es decir, cuando se dividen. Se supone que estas anomalas reflejan alteraciones fsico-qumicas en los cromosomas, que impediran su separacin normal durante la mitosis.
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Por su parte las fuentes de campos electromagnticos generadas por el hombre que constituyen una parte fundamental de las sociedades industriales (la electricidad, las microondas y los campos de radiofrecuencia) estn en el extremo del espectro electromagntico correspondiente a longitudes de onda relativamente largas y frecuencias bajas y sus cuantos no son capaces de romper enlaces qumicos. Hoy en da, todas las poblaciones del mundo estn expuestas a Campos Electromagntico (CEM) en mayor o menor grado, y conforme avance la tecnologa el grado de exposicin continuar creciendo.
Fuentes naturales de campos electromagnticos En el medio en que vivimos, hay campos electromagnticos por todas partes, pero son invisibles para el ojo humano. Se producen campos elctricos por la acumulacin de cargas elctricas en determinadas zonas de la atmsfera por efecto de las tormentas. El campo magntico terrestre provoca la orientacin de las agujas de los compases en direccin Norte-Sur y los pjaros y los peces lo utilizan para orientarse.
Fuentes de campos electromagnticos generadas por el hombre Adems de las fuentes naturales, en el espectro electromagntico hay tambin fuentes generadas por el hombre: Para diagnosticar la rotura de un hueso por un accidente deportivo, se utilizan los rayos X. La electricidad que surge de cualquier toma de corriente lleva asociados campos electromagnticos de frecuencia baja. Adems, diversos tipos de ondas de radio de frecuencia ms alta se utilizan para transmitir informacin, ya sea por medio de antenas de televisin, estaciones de radio o estaciones base de telefona mvil. (http://www.who.int/pehemf/about/WhatisEMF/es/index.html) Como parte de su mandato de proteger la salud pblica, y en respuesta a la preocupacin pblica por los efectos sobre la salud de la exposicin a campos Electromagntico, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) cre en 1996 el Proyecto Internacional CEM para evaluar las pruebas cientficas de los posibles efectos sobre la salud de los CEM en el intervalo de frecuencia de 0 a 300 GHz (http://www.who.int/peh-emf/es/index.html) Los ultrasonidos son aquellas ondas sonoras cuya frecuencia es superior al margen de audicin humano, es decir, 20 KHz aproximadamente. Las frecuencias utilizadas en la prctica pueden llegar, incluso, a los gigahertzios. En cuanto a las longitudes de onda, stas son del orden de centmetros para frecuencias bajas y del orden de micras para altas frecuencias.
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La tcnica ms conocida, sin ninguna duda, es la ecografa. La idea, una vez ms, es inyectar ultrasonidos a travs de la piel en el organismo del paciente (baja intensidad, en torno a unos pocos miliwatios). Estos se reflejan a medida que vayan pasando de unos medios a otros y los ecos son procesados para mostrarlos finalmente por pantalla. Se ha visto cmo los mdicos aplican un gel sobre la piel antes de producir los ultrasonidos, pues bien, este gel no es ms que un material que sirve a modo de acoplo de impedancias para evitar la reflexin excesiva del ultrasonido en la propia superficie de la piel. Tambin se han venido desarrollando numerosas tcnicas para el tratamiento de los alimentos. Frente a los mtodos tradicionales, como la refrigeracin, el ahumado, la pasteurizacin,... se estn imponiendo otros nuevos como las altas presiones o los ultrasonidos. Lo primero que diremos es que estas tcnicas estn en investigacin. La aplicacin de ultrasonidos se llama de procesado mnimo puesto que la idea es destruir los microorganismos que daan los alimentos pero sin cambiar la apariencia externa de los mismos. Lo que hacen las ondas ultrasnicas es destruir la membrana celular de estos organismos, provocndoles la muerte como es lgico. De todas formas, esta tcnica no es vlida para cualquier producto puesto que algunos conducen muy bien los ultrasonidos y otros no. (http://www.lpi.tel.uva.es/~nacho/docencia/ing_ond_1/trabajos_03_04/infra_y_ultra /ultrasonidos.htm)
Genotoxicidad por Compuestos Qumicos: Mecanismos de los Agentes Alquilantes (Tomado de http://www.cancerquest.org/index.cfm?page=486&lang=spanish) Los agentes alquilantes funcionan por medio de tres mecanismos diferentes, los cuales todos alcanzan el mismo resultado - la interrupcin de la funcin del ADN y la muerte celular. En el primer mecanismo un agente alquilante (representado en la figura debajo como una estrella rosada) adhiere grupos alquilos (compuestos pequeos de carbono-ilustrados como tringulos rosados) a las bases del ADN. Esta alteracin resulta en que el ADN sea fragmentado por las enzimas de reparo cuando stas tratan de reemplazar las bases alquiladas (esquema 3 del diagrama debajo). Las bases alquiladas previenen el sntesis del ADN y la transcripcin del ARN del ADN afectado.
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Un segundo mecanismo por el cual los agentes alquilantes causan dao al ADN es en la formacin de puentes cruzados, uniones entre tomos en el ADN (las cadenas rosadas debajo). En este proceso, dos bases son unidas por medio de un agente alquilante que tiene dos sitios de unin con el ADN. Los puentes pueden ser formados dentro de una sola molcula de ADN (como es ilustrado debajo) o como puentes cruzados que conectan dos molculas distintas de ADN. Este enlace previene el ADN de ser separado para la sntesis o la transcripcin.
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Un tercer mecanismo de accin de los agentes alquilantes es la induccin de nucletidos disparejos llevando a mutaciones. En una doble hlice normal de ADN, A siempre se empareja con la T y G siempre se empareja con C. Como la figura muestra, las bases alquiladas G pueden ser emparejadas errneamente con T. Si esta alteracin sucede y no es corregida, esto puede resultar en una mutacin permanente.
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Agentes antioxidantes. En trabajos recientes llevados a cabo en nuestro grupo de investigacin se ha puesto de manifiesto que el fenol y algunos derivados metilados reaccionan con el nitrito sdico para formar Cnitrosofenoles1. Por otra parte, se ha demostrado la genotoxicidad de los C-nitrosofenoles formados a partir de sus precursores2. Esta genotoxicidad era de esperar pues otros nitrosocompuestos, como las nitrosaminas, han demostrado su poder mutgeno, carcingeno y teratgeno. En este trabajo se ha estudiado el mecanismo de formacin de Cnitrosocompuestos a partir de la combinacin de antioxidantes hidroquinnicos, butilhidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT), con nitrito sdico, todos ellos utilizados asiduamente como conservantes en la industria alimenticia. El mecanismo de formacin de estos C-nitrosocompuestos transcurre mediante un ataque electroflico del grupo NO+ sobre el antioxidante hidroquinnico. Se ha probado el carcter genotxico de los nitrosocompuestos obtenidos, nitrosobutilhidroxianisol (NBHA) y nitrosobutilhidroxitolueno (NBHT), mediante un test de mutagenicidad, test de Ames. Finalmente, se ha investigado la influencia de varios compuestos que podran actuar como posibles inhibidores de la reaccin de nitrosacin, a-ciclodextrina, b- ciclodextrina, cido paraaminobenzoico, cido ascrbico y acetonitrilo. Los resultados concluyen que los compuestos formados tienen una respuesta positiva en el test de mutagenicidad y que los compuestos utilizados para inhibir la formacin de los mismos son efectivos, a excepcin de la a-ciclodextrina (Ruano et al. 2003).
Mecanismo genotxico de los compuestos no mutagnicos. (Tomado de http://es.wikipedia.org/wiki/Teratolog%C3%Ada) Existen agentes conocidos como teratognicos, estos pueden inducir o aumentar la incidencia de las malformaciones congnitas cuando se administran o actan en un animal preado durante su organogensis. Las muertes intrauterinas y las reabsorciones no siempre son incluidas como efectos teratolgicos. Entre los agentes teratognicos ambientales, los infecciosos conocidos como virus son los ms importantes. Los virus pueden afectar a las clulas de dos maneras distintas. Por una parte, pueden proliferar dentro de las clulas produciendo su ulterior ruptura y, por otra, incorporar su informacin gentica, determinando la sntesis intracelular de protenas que conducen a una alteracin del metabolismo. Un requisito para que los embriones resulten afectados por los virus es que en la madre se produzca una "viremia", es decir una generalizacin de la infeccin por virus. Existen casos donde los virus no provocan alteraciones en la madre y, sin embargo, afectan gravemente al embrin. La determinacin del origen viral de una
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alteracin en los embriones puede hacerse nicamente mediante aislamiento del virus de los tejidos embrionarios o por medio de estudios serolgicos. Otro tipo de infecciones son las parasitarias. El caso ms conocido es el de la toxoplasmosis. Este parsito ocasiona, al afectar a mujeres embarazadas, casos de retardo mental. Entre los factores teratognicos ambientales, los nutricionales y endocrinos son importantes. La nutricin materna tiene un sealado efecto sobre el desarrollo prenatal. La carencia de vitamina A (avitaminosis A), genera labio leporino, defectos oculares, cardiovasculares, urinarios y genitales en cerdo, ratas y conejos. La hipervotaminosis A, produce malformaciones en hamster, conejo, cobayo, rata, ratn y cerdo. La deficiencia de vitamina D ocasiona alteraciones esquelticas y anormalidades dentarias. La carencia de yodo en la dieta causa "cretinismo". La glndula tiroides comienza a acumular yodo hacia mediados de la gestacin. Ese mineral llega al embrin a travs de la placenta y, si su concentracin es baja en la sangre materna por carencia nutricional, tambin ser deficiente en el embrin. Esto ocasiona carencia de produccin de hormonas tiroideas que determinan retardo mental y enanismos. Muchas alteraciones en el desarrollo se encuadran dentro de las denominadas "malformaciones de causa multifactorial". Esta denominacin indica que no es un nico gen o un cromosoma alterados los responsables de su aparicin, sino la accin conjunta de varios genes diferentes sobre los que actan factores ambientales desencadenantes. Entre otros factores ambientales, la temperatura ambiental es tambin notable. La hipertemia en los animales domsticos preados es causa de anomalas del sistema nervioso central y del ojo. Entre las causas ambientales que conllevan hipertermia est el encerrar a una hembra preada en un auto expuesto al sol. Las enfermedades febriles durante la preez tambin constituyen un riesgo de embriotoxicidad. La hipotermia experimental en ratas, ratones y hamsters gestantes ocasiona defectos en el sistema nervioso central y el desarrollo esqueltico.
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CAPITULO 3: MTODOS DE OBTENCIN DE CROMOSOMAS
Introduccin Los avances logrados por la gentica durante los ltimos aos en la determinacin de los complementos cromosmicos, los mecanismos de la herencia, los procesos de evolucin, la identificacin de especies, conseguidos a travs del aislamiento y la observacin directa de los cromosomas, han sido el resultado del desarrollo, mejoramiento y estandarizacin de tcnicas citogenticas (Camacho, 1999). En la siguiente leccin se hablara de los diferentes mtodos de obtencin de cromosomas, en este modulo se habla tanto de citogentica animal como vegetal, as que para una mejor comprensin se trataran los dos temas por separado iniciando con obtencin de cromosomas en vegetales y continuando con la obtencin de cromosomas en animales.
Leccin 11: Obtencin de cromosomas en Vegetales Los cromosomas en vegetales pueden ser obtenidos directamente de tejidos que estn en constante divisin celular como por ejemplo clulas meristemticas en el pice de la raz, aqu se encontraran clulas en divisin y la probabilidad de obtener ndices mitticos adecuados depender del estado de crecimiento de la raz. Otro rgano que son utilizados para la obtencin de cromosomas son semillas germinadas, brotes de hojas, embriones o para metafases meioticas las anteras. Sin embargo se pueden realizar tambin anlisis en protoplastos obtenidos en cultivos in vitro, pues esta tcnica es comnmente utilizada en propagacin vegetal y al encontrar gran cantidad de clulas en divisin pueden ser utilizados con otros fines como la obtencin de cromosomas, sin embargo esta opcin es de altos costos por los medios utilizados y por la infraestructura para el mantenimiento de los cultivos pero es una alternativa cuando se trabajan especies vegetales que tardan demasiado tiempo en germinar o necesitan de condiciones
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climticas muy especiales e inclusive para con las que se cuentan con pocos ejemplares por estar en peligro de extincin.
Una alternativa para la obtencin de cromosomas de plantas leosas es la maceracin enzimtica, el alto contenido de lignina y pectina en tejidos de plantas leosas hace ms difcil la maceracin que en plantas herbceas, adems el tiempo de divisin celular en plantas leosas tiende a ser mas largo y el crecimiento de las rices es menor, de esta manera se requiere hacer pretratamientos en un tiempo apropiado despus de la germinacin. las races pueden proveer buen material para placas de cromosomas.(Fukui y Nakayama, 1996). Esta tcnica ser explicada mas adelante cuando se mencionen algunos tcnicas en la obtencin de cromosomas. A continuacin se referencia algunos aspectos para cultivo de tejidos vegetales (tomado de Mendoza, 1994) con el propsito de dar una visin general de lo que es esta tcnica.
Cultivo de Tejidos El cultivo de tejidos, mejor conocido como cultivo in vitro representa un valiossimo instrumento para resolver a corto y mediano plazo los mltiples problemas referentes al mejoramiento gentico de las plantas en todo el mundo. A diferencia de las clulas animales, las vegetales en cultivo son inmortales. Adems, las clulas vegetales presentan otra y an ms significativa caracterstica distintiva: tienen la capacidad de regenerar la planta entera de la cual se han aislado. Del callo derivado de una sola clula, se puede obtener una planta similar a la inicial probando varias combinaciones de hormonas agregadas al medio de cultivo. En cambio no es posible regenerar un organismo entero por medio de las clulas somticas animales. Toda clula tiene de un mismo organismo contienen el mismo patrimonio gentico, pero slo una pequea fraccin de la informacin gentica total se expresa en cada clula , y adems esta fraccin es en parte diferente. Mientras una clula vegetal ya diferenciada puede regresa a un estado, por as decir, primordial, en la cual tienen la capacidad de estresar diferentes fracciones de la propia informacin gentica es imposible para una clula animal.
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Las plantas obtenidas por clonacin (del griego Klon que significa brote) son genticamente idnticas (con excepcin de aquellas que tienen variaciones somoclonales) a las plantas de la cual derivan, ya que en la formacin del individuo no intervienen la mezcla del patrimonio gentico que se tiene en la reproduccin sexual. Por cultivo in vitro se entiende el conjunto de tcnicas y de metodologas que permiten el cultivo de partes de una planta tales como rganos, tejidos, clulas o simples protoplastos (clula sin pared celular) en un recipiente que contiene sustancias nutritivas en condiciones de esterilidad y en ambientes controlados. Esta tcnica considerada no convencional, se basa principalmente en el aprovechamiento de la totipotencia de las clulas vegetales, o sea, en la capacidad de reproducir rganos. Como retoos y/o races, organognesis, o una planta entera de embriones adventicios o somticos, embriognesis somtica, en un medio de cultivo favorable dentro de un recipiente, por lo general de vidrio. El cultivo in Vitro, es una actividad sencilla. Consiste en la toma de una muestra del tejido deseado de la planta, el cual se esteriliza superficialmente para eliminar probables microorganismos que de otra manera creceran en el cultivo a expensas de las lentas clulas vegetales debido a su mayor velocidad de reproduccin. Despus, mediante el uso de enzimas especficas se elimina la pared de celulosa que recubre las clulas vegetales, formando as los llamados protoplastos (clulas desprovistas de pared celular). Despus de un cierto tiempo, dentro del medio de cultivo, las clulas comienzan a reconstruir la pared celular para luego continuar con la multiplicacin por divisin. La capacidad de la pared para regenerarse, dividirse y dar lugar a nuevas clulas, depende de numerosos factores como, las condiciones fisiolgicas de la planta madre, cantidad y calidad de las enzimas usadas para la eliminacin de la pared celular, estabilidad del plasmalema y de las condiciones de cultivo y ambiente, luz, temperatura y humedad. De cada protoplasto se obtiene un aglomerado de clulas llamado callo que puede ser mantenido en cultivo por un tiempo indefinido. Para poder crecer y multiplicarse indefinidamente in Vitro. Las clulas vegetales necesitan sustancias nutritivas, esencialmente sales, azcar y vitaminas, y pequesimas cantidades de sustancias llamadas hormonas vegetales. Dentro de un ambiente controlado (celdas climticas) se crean artificialmente las condiciones favorables al desarrollo de una planta, tales como la temperatura, humedad y ciclos de luz-oscuridad, entre otras. De esta manera se pueden igualar las condiciones climticas y ambientales de cualquier punto de la tierra en cualquier poca del ao. Cuando las plntulas alcanzan cierto tamao pueden ser trasplantadas ya sea a invernadero o a pleno campo. En este momento sern comparables cierto por ciento con las plantas obtenidas por fecundacin (tomado de Mendoza, 1994).
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Obtencin de cromosomas en Animales: mtodos directos e indirectos Para los aos 70 ya se haban hecho estudios citogenticos en varios grupos animales, en la mayora de las especies los primeros mtodos de anlisis cromosmico recurrieron a la llamada tcnica directa lo que implicaba en ocasiones a la infeccin del animal y posterior sacrificio, debido a que los principales rganos utilizados eran agalla, bazo, rin, hgado, testculos, medula sea, intestinos, escamas entre otros. Como desventaja en la mayora de las preparaciones se obtenan extendidos de mala calidad en cuanto a cromosomas superpuestos y bajos ndices mitticos adems de la perdida definitiva de los ejemplares analizados sin permitir su utilizacin para posteriores estudios en caso dado de que representaran a un ejemplar nico portador de un marcador citogentico especfico o para que fueran utilizados como individuos padrotes en procesos de reproduccin, hibridizacin o repoblacin. En las tcnicas directas los individuos se tratan in vivo con cantidades diluidas de colchicina o sulfato de vinblastina y luego se sacrifican, se extrae el tejido y se trata con solucin hipotnica, finalmente se fija y tie, de manera que se obtienen metafases. Este mtodo se ha utilizado en mamferos, con tcnicas de squash, utilizando tejidos como mdula sea y bazo (Reig, 1985). Suzuki y Kurihara en 1990 obtuvieron cromosomas del ratn silvestre Mus musculus a partir de mdula sea. En peces, Kligerman y Bloom en 1977 propusieron un mtodo de preparacin cromosmica directa de tejidos de branquia, escamas, riones y tracto intestinal donde se obtuvo alta calidad de metafases. Murofushi, Nishikama y Yosida en 1984 obtuvieron cromosomas en peces dragn de tejido de rin y branquia, igualmente en Colombia durante 1994 Bueno, Forero y Gonzlez caracterizaron cromosmicamente especies icticas de la sabana de Bogot utilizando tcnica directa (Air Driyn) para los mismos tejidos. Peccinini en 1981 report estudios citogenticos de reptiles donde utiliz mtodos directos en los cuales los tejidos ms eficaces fueron medula sea, epitelio intestinal y bazo. Para serpientes se utiliz mdula sea y bazo y en tortugas, bazo, rin, crnea y tejido del msculo cardiaco (citado por Cortes y Rodrguez, 2004) Dentro de la modalidad de mtodos directos esta el uso de la inyeccin y el de inmersin, dependiendo de la especie a tratar se puede utilizar una de las dos o su combinacin, por ejemplo en mamferos y reptiles se utiliza la inyeccin pero en animales como los peces y anfibios se pueden utilizar cualquiera de las dos o como se mencion una combinacin de inmersin + inyeccin.
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El mtodo de la inmersin se refiere a mantener el individuo sumergido en una solucin de colchicina por un tiempo determinado previendo la asimilacin del compuesto por parte del animal e incluirlo en sus clulas somticas principalmente; el mtodo de inyeccin se refiere a la aplicacin de la solucin por puncin directa intraperitonealmente aun cuando en ocasiones se aplica intramuscularmente en este caso tardar mucho ms su accin, esta ltima puncin es utilizada en ocasiones cuando el individuo a ser analizado es muy pequeo 1.5 2.0 cm. Por su parte los mtodos indirectos son aquellos que permiten obtener un mayor nmero de clulas en divisin y lo ms importante no recurren al sacrificio del animal pues se realizan cultivos in vitro de clulas sanguneas (linfocitos) y/o fibroblastos, obteniendo como resultado gran cantidad y calidad de metafases asegurando de esta manera poder aplicar directamente la informacin en diagnsticos cromosmicos o posteriores mejoras genticas. En las tcnicas indirectas se toma la muestra de tejido, si se trata de sangre se aplica anticoagulante en el momento de la toma y posteriormente es llevada al laboratorio en donde es sembrada es decir se coloca en las condiciones necesarias para la divisin celular; se aplica un medios de cultivos especfico que proveen a la clula de los nutrientes necesarios para el crecimiento, factores de crecimiento (Suero Fetal Bovino) que estimulan la multiplicacin celular y un mitgeno que induce la proliferacin celular. Es importante controlar temperatura y el pH de los cultivos, pero otros como CO2, y ventilacin no son tan crticos en el momento de mantener cultivos celulares viables, a no ser de que se trate de cultivos de fibroblastos. Los cultivos de clulas primarias son un excelente recurso de divisin celular, para tal fin se requiere estimular la divisin normal con medios de cultivos, y factores de crecimiento (Thorgaard y Disney 1990) adems los cultivos celulares ofrecen las mejores preparaciones para desarrollar tcnicas de bandeamiento (Hartley y Horne, 1983). El proceso de cultivo de linfocitos no tiene altos costos ni grandes inconvenientes pues no son utilizados mtodos ni medios sofisticados; en especies en donde el tamao del ejemplar es pequeo, el tamao de los individuos no tiene obstculo alguno pues tener 5-7 cm se sangran de igual manera obteniendo volmenes de 0.04 a 0.1 ml de sangre total y sin separacin alguna se siembran directamente en el medio de cultivo, de esta forma se pueden muestrear individuos adultos de 6070 cm ms o juveniles de 10-15 cm menos.
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La tcnica permite trabajar individuos de especies comerciales en cultivo o especies nativas en su medio, si se requiere pueden ser transportados desde sus lugares de origen al lugar de trabajo, Centros de Investigacin o Estaciones, la muestra de sangre se colecta aspticamente y puede ser transportada debidamente marcada y refrigerada hasta el laboratorio en donde por proceso de centrifugacin se obtiene la capa de clulas de inters, los linfocitos. Los prximos captulos se referirn a los diferentes componentes necesarios para el desarrollo de los cultivos celulares.
Leccin 12: Requerimientos de las clulas en cultivo: Medios de cultivo y Factores de Crecimiento. El cultivo celular es el ambiente artificial que se le proporciona a una clula o grupos de clulas animales o vegetales para que permanezcan activas metabolicamente y entren en divisin. Antes de entrar ha hablar de los requerimientos en si de los cultivos celulares es importante mencionar que se debe de contar con una infraestructura para asegurar todo lo necesario para el xito de los mismos. As que en cuanto a la infraestructura se hace necesario poseer un espacio aislado de contaminantes ambientales como hongos bacterias e inclusive ambientes en donde se trabajen con metabolitos residuales de digestiones bioqumicas o moleculares; pues se necesita de un rea estril que adems tambin tiene que estar separado del proceso de lavado y preparacin del material. Se debe contar con una nevera para las muestras y los reactivos, el uso de las incubadoras, centrfugas, cabinas de flujo laminar, microscopios, pHmetro balanzas y baos mara tambin son necesarios al igual que material de vidrio y plstico para los procesos de siembra y cosecha. Ahora si para entrar en materia con los cultivos celulares se han logrado establecer muchas caractersticas estructurales y bioqumicas de microorganismos y/o clulas, lo que ha permitido en avanzar en diferentes campos de la salud y biotecnologa, pero tambin se ha obtenido mucha informacin a su vez de los requerimientos de las clulas en cultivo pues hay una gran variedad de elementos como protenas, factores de crecimiento, hormonas, vitaminas, antibiticos especficos para cada lnea celular o microorganismo, no todos tienen el mismo metabolismo ni tampoco todos responden de igual manera a los diferentes medios de cultivo en los cuales son colocados, as que generar las condiciones ptimas
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para el desarrollo conlleva una alta complejidad pues el propsito es acercarse lo ms posible a las condiciones que tienen in vivo las clulas. Para hablar de los requerimientos de las clulas en cultivo nos referiremos a las condiciones mnimas de cultivos celulares, que estaran representados por las biomoleculas de la vida que son carbohidratos, lpidos, protenas (amino cidos), vitaminas, hormonas entre otros; es importante tener claro que no todas las clulas requieren todos los componentes al mismo tiempo ni en las mismas concentraciones, todo depende del tipo de clula a trabajar. Los componentes que se consideran como nutrientes dentro del medio de cultivo se refieren a aquellas sustancias que entran a las clulas y son utilizadas como substratos para la biosntesis o metabolismo o tambin como catalizadores en aquellos proceso. Dentro de stos se consideran los amino cidos; carbohidratos (glucosa, galactosa, fructuosa, manosa); lpidos (colestero, cido linoleco, oleico, ciertos fosfolpidos); Vitaminas (complejo B); elementos trazas (hierro, zinc, selenio, cobre, manganeso, molibdeno); inones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio, cloruros, fosfatos) entre otros (Ramrez, 2001). De esta manera son varios los aspectos intrnsecos que se deben de considerarse para asegurar el xito de un cultivo celular, entre ellos tenemos medios de cultivo, factores de crecimiento, mitgeno, componentes inorgnicos (inoes) y volumen de siembra. Por otra parte, es muy importante considerar otros aspectos que aun cuando no hacen parte de la mezcla inicial son trascendentales para culminar con xito la obtencin de las clulas en divisin, se trata de la colchicina que es la sustancia encargada de represar la mayor cantidad de clulas en la metafase, en muchas ocasiones por la ausencia de una concentracin adecuada de este componente se echan a perder muchos cultivos celulares. Medios de cultivo: Los hay de diferentes lquidos, semislidos y slidos para estos ltimos se hace necesario la utilizacin de un soporte que solidifique y generalmente se trata de agar, este medio es muy utilizado en cultivo de tejidos vegetales. El agar presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una aereacin insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos. Por otra parte, la composicin del agar es variable y, a veces, mal definida y podra aportar oligoelementos que actan favorablemente sobre el crecimiento. La concentracin ptima de agar es variable con el origen comercial del agar utilizado y el objetivo del cultivo. Las concentraciones ms utilizadas varan entre. En algunos medios de cultivo se aade al soporte (agar) una cantidad de carbn activado en dosis variables entre 0.5 5.0 g/L. Normalmente, el aporte del carbn al medio favorece el crecimiento de los tejidos sobre todo, en el cultivo de pices y anteras. Sin embargo, se ha descrito que en el melocotonero y el almendro, la
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adicin de carbn activado inhibe la formacin de races 6 10 g/L. (Gonzles., S. http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205.doc). En el caso de medios de cultivo lquidos se hace necesario en ocasiones agitar los recipientes que contienen las clulas para proveerles de oxigeno, tambin se les puede suministrar aire estril. El medio lquido es uno de los ms utilizados en cultivo de clulas animales especficamente en linfocitos y clulas de corion; por otra parte un parmetro determinante en algunos cultivos celulares de fibroblastos es importante el anclaje al sustrato y expansin de contacto; el anclaje al sustrato por el contacto con las protenas de la matriz extracelular del sustrato pues son necesarias para que se puedan ordenar las fibras del citoesqueleto paso decisivo para sobrepasar la etapa G1; y la expansin por contacto se refiere a que las clulas dejaran de crecer cuando ocupen toda la capa superficial, pero podrn entrar nuevamente en divisin si se les aplica una vez ms factor de crecimiento. La composicin de algunos medios de cultivo sern tratados en la siguiente leccin. Factores de Crecimiento cultivos celulares animales. Los factores de crecimiento son polipptidos de una decena o centena de aminocidos que regulan la proliferacin celular. Estos factores son segregados por diferentes tipos celulares (Tabla No.1) y algunos se encuentran en la circulacin sangunea, pero otros actan como mediadores qumicos locales. Adems de los factores de crecimiento ya clsicos, existen otros polipptidos que, aunque no se denominen factores de crecimiento actan como tales. Los factores de crecimiento activan toda una compleja serie de seales intracelulares que, entre otros efectos, promueven el ensamblaje de los complejos ciclinas-cdk. Adems, regulan la transcripcin de varios genes que intervienen en la proliferacin celular, entre los que se encuentran los proto-oncogenes y los genes supresores de tumores (Paniagua et al., 2003). Los factores de crecimiento son los responsables de que una clula entre en divisin celular asegurando su permanencia bajo la proliferacin celular. La funcin principal es la del control externo del ciclo celular, mediante el abandono de la quiescencia celular (G0) y la entrada de la clula en fase G1 (http://es.wikipedia.org/wiki/Factor_de_crecimiento) La manera que incursionan los factores de crecimiento es sobre los mecanismos intracelulares y las protenas seal que intervienen y regulan la divisin celular y /o transcripcin del ARN. Las protenas seales son protenas que se encuentran en el citosol de la clula y se encargan de llevar la informacin desde la superficie de la clula hasta el ncleo. Este mecanismo es gatillado cuando algn ligando (ej. insulina) se une a su receptor presente en la membrana plasmtica de la clula (ej. el receptor de
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insulina) producindose la activacin del receptor que es transmitida a modo de cascada a travs de las protenas seal, una protena seal activa a otra y as sucesivamente hasta llegar a activar protenas reguladoras de genes en el ncleo (llamadas factores de transcripcin) y as provocar la transcripcin del ADN a ARNm, con la consiguiente sntesis de protenas. La activacin de estas protenas seal es mediante fosforilacin en distintos aminocidos, generalmente tirosina, serina o treonina (http://www.portalfitness.com/articulos/fisiologia/fisiogym/efectos_intracelulares.ht m) Mediante estudios con cultivos celulares se descubri que los factores de crecimiento son transportados por el suero. Son producidos por gran nmero de clulas y los requerimientos son muy variables entre diferentes clulas. Para que las clulas proliferen en un cultivo es necesario la existencia de suero que aporte los factores de crecimiento y las molculas adhesivas como la fibronectina, vitronectina y nutritivas como lipoprotenas, transferrina, as como nutrientes: aminocidos, iones, molculas energticas (http://es.wikipedia.org/wiki/Factor_de_crecimiento). Tabla 4. Factores de crecimiento utilizados para cultivos animales
Factor Factores de accin mltiple Factor de crecimiento epidrmico o epitelial Factor de crecimiento fibroblastico (cido y bsico) Siglas Accin
EGF
FGF
Factor de crecimiento derivado de las plaquetas Factores de crecimiento de tipo insulina I (somatomedina C) y II Factor de crecimiento transformante a Factor de crecimiento transformante B Factores especficos Factor de crecimiento de
PDGF
IGF-I IGF-II
TGF-a TGF-B
Estimula la proliferacin de derivados y endodrmicos, as como de fibroblastos, condorcitos y osteoblastos y, posiblemente, otros muchos tipos celulares Estimula la proliferacin de fibroblastos, clulas endoteliales, clulas musculares lisas, glndula suprarrenal y prstata. En el desarrollo embrionario inducen la formacin del mesodermo y estimula la proliferacin de los mioblastos para formar msculo. Estimula la proliferacin de fibroblastos, clulas musculares lisas, condorcitos, osteoblastos y clulas gliales. Colaboran con el PDGF y el EGF. Estimulan la proliferacin de clulas de origen mesodrmico en general, incluyendo tejido conjuntivo y adiposo, cartlago, hueso y msculo. Accin similar al EGF Inhibe el desarrollo de clulas epiteliales y neuroectodrmicas y favorece el de las clulas de origen mesodrmico Promueve el crecimiento de los axones, y el
NGF
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clulas nerviosas Factor de crecimiento derivado del cartlado Factor de crecimiento derivado del hueso Factor de crecimiento del esqueleto humano Protena morfognica sea Osteogenina Otros factores (citoquinas) Factores estimuladores de colonias Interleuquinas CDGF BDGF hSGF BMP
mantenimiento de las neuronas simpticas y algunas neuronas sensitivas del sistema nervioso central Es estimular al factor IGF-1. Estimula la proliferacin de cartlago. Es una microglobulina B2 que estimula la formacin de hueso Estimula la formacin de hueso Estimula la formacin de clulas y matriz del tejido conjuntivo, cartlago y hueso. Estimula la formacin de hueso
CSF IL
Factores de necrosis tumoral Interferones
TNF IFN
Estimulan la proliferacin de varios tipos de clulas sanguneas (desde todos ellos a un solo tipo) Estimulan la proliferacin celular y diversas acciones especficas de las clulas linfoides y otros clulas relacionadas con la respuesta inmunitaria. Sin embargo, hay indicios de que su accin tambin se ejerce sobre clulas hematopoyticas y de otros muchos tejidos, principalmente el conjuntivo. Acciones colaboradoras o inhibidoras con otros factores, como interleuquinas. Estimula la reabsorcin sea. Acciones colaboradoras o inhibidoras con otros factores, como interleuquinas. Inhibe la reabsorcin sea.
(Paniagua et al., 2003) En cultivos celulares animales se adicionan factores de crecimientos que comercialmente se encuentran disponibles pues son aislados de los mismos tejidos y como se dijo anteriormente son especficos dependiendo el tipo de clula a cultivar. Aun cuando en algunas ocasiones por ejemplo en linfocitos con solo aplicar Suero Fetal Bovino (SFB) es suficiente para estimular el crecimiento celular, en este caso no se conoce a ciencia cierta cual es el factor que interviene para la proliferacin celular, pero es ampliamente conocido su efecto, sin embargo no ocurre lo mismo en fibroblastos pues adems de aplicar el SFB tambin hay que adicionar factor de crecimiento para fibroblastos.
Factores de Crecimiento cultivos tejidos Vegetales Es importante aclarar que aun cuando se mencionen algunos detalles de los factores de crecimiento para tejidos vegetales, no se profundizara en todos los aspectos para la obtencin de los mismos pues este tema hace parte de otra temtica acadmica, aqu es importante recordar que el cultivo de tejidos es una
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alternativa para obtencin de clulas en divisin slo en condiciones estrictamente necesarias pues lo que se utiliza generalmente son los brotes y tejidos meristematicos que crecen naturalmente. Se mencionan a continuacin los factores de crecimiento para cultivo de tejidos vegetales. (Tomado de Gonzles., S. http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205..doc incluye auxinas, Giberelinas, citokininas y otros reguladores) Los reguladores del crecimiento y el desarrollo de las plantas actualmente se agrupan en cinco categoras: auxinas, giberelinas, citokininas,cido abscsico y etileno. Adems de estas sustancias naturales (reguladores endgenos) existen numerosos productos de sntesis que pueden utilizarse como reguladores del crecimiento en el cultivo in vitro. En los mtodos de propagacin in vitro se emplean ampliamente las auxinas; en la organognesis y las aplicaciones a la multiplicacin vegetativa est ampliamente ligada a la utilizacin conjunta de auxinas y citokininas. La importancia de las giberelinas en cultivo in vitro est mucho ms restringida. El ABA ( cido abscsico) y los compuestos que desprenden etileno se utilizan con menor frecuencia en casos ms especficos. Auxinas: Son compuestos que tienen un ncleo indlico, ste se sintetiza a partir del aminocido Triptfano que se sintetiza por la va Shikmica, la principal auxina es el cido 3-indolactico (AIA), pero tambin se pueden emplear el cido 3 indol propinico (AIP) y el cido 3- indol butrico (AIB), aunque son auxinas relativamente dbiles. Otros compuestos sintticos pueden comportarse como auxinas muy dbiles ( cido fenilactico) o fuertes: cido naftalenactico (ANA), el cido 3 naftoxiactico (NOA), etc. El 2,4 D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) es una auxina muy fuerte. El cido picolnico (picloram), aunque con una estructura qumica diferente, produce en ocasiones efectos morfogenticos comparables a los del 2,4-D; se emplea a concentraciones muy bajas. Las propiedades de las distintas auxinas son diferentes. El AIA es la auxina natural ms difundida en las plantas, es ampliamente utilizada en los medios de cultivo pero es sensible a la degradacin enzimtica (AIA-oxidasa) y a la fotoxidacin. El ANA es una auxina fuerte que se utiliza para inducir la rizognesis, a veces en asociacin con el AIB.
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El 2,4-D es una auxina muy fuerte, txica a concentraciones elevadas, que es un fuerte activador de la actividad meristemtica; su empleo es amplio, muchas veces ligado a citokininas, en trabajos de cultivos celulares, cultivos de tejidos, embriognesis somtica, etc. (Tablas 23, 24 y 25) El efecto de las auxinas est estrechamente ligado al alargamiento celular, que se explica por sus efectos sobre la celulosa sintetasa, el aumento de la plasticidad parietal y el aumento de la absorcin de agua. Por esta razn una prctica usual es evaluar el efecto auxnico mediante la evaluacin del incremento del peso fresco de los tejidos. Las auxinas tambin tienen un efecto marcado sobre la divisin celular (citocinesis). Otros efectos auxnicos son: inducen la rizognesis, pero a su vez indirectamente inhiben el crecimiento de las races; intervienen en la dominancia apical de las yemas, en el desarrollo del fruto (transformacin de las paredes del ovario para formar las paredes del fruto). Tambin inducen la floracin de la pia y son responsables de los tropismos de las plantas. Por otra parte, se ha descrito que las auxinas tienen un efecto marcado sobre la actividad enzimtica, por ejemplo: incrementan los niveles de la enzima que condensa el citrato, inhibe la decarboxilacin del piruvato y del -cetoglutarato; tienen un efecto indirecto sobre la RNA polimerasa; inhibe la enzima indol etanol-oxidasa que ejerce un control feedback de la sntesis de AIA; incrementa las invertasas en la caa de azcar, etc. Giberelinas: Las giberelinas son dipertenos (con C20 C19), derivados de la va isoprenoide, con una estructura bsica denominada esqueleto gibnico o giberelano; la giberelina ms difundida es el AG3 o cido giberlico. Se denominan con la letas AGn y un subndice que indica el orden de su descubrimiento, dado por las molculas con sus radicales sustituidos ( H+, CH3+, OH-, etc); en la actualidad se conocen ms de 90 giberelinas diferentes, aunque en una misma planta pueden encontrarse solo algunas de ellas. Estas fitohormonas endgenas se emplean poco en cultivo in vitro ya que hay numerosas experiencias que indican un efecto inhibitorio sobre la organognesis y, particularmente, la rizognesis. Sus efectos varan segn su concentracin y el material vegetal. Se han reportado efectos sinrgicos entre las giberelinas, con las auxinas y citokininas en trabajos in vitro. Las giberelinas provocan el alargamiento celular; eliminan el enanismo de las plantas; estimulan la germinacin de la semilla de cereales mediante la induccin
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de la produccin de la amilasa; inducen la floracin de plantas de das largos; eliminan la dormancia de las yemas y semillas; intervienen en la tuberizacin; etc. Citokininas: Las citokininas son derivados purnicos, en especial derivados de la adenina, que se han reportado en pequeas cantidades en el agua de coco, jugo de tomate, extactos de flores, tubrculos y ndulos radicales, en frutos y semillas inmaduras de maz (zeatina) hidrolizadas de tRNA de plantas o microorganismos, etc. Entre las citokininas naturales tenemos la zeatina, la isopentenil-adenina (IPA), la dimetil amino-purina, la dihidroxizeatina, la metilzeatina, , etc. Son citokininas sintticas la kinetina (KIN: 6-furfunil aminopurina) el BAP o BA (N-6- bencil aminopurina o N6-benciladenina). Recientemente se ha descrito que la N-6- bencil aminopurina (BAP) o N6-benciladenina (BA) ha sido aislada de plantas y constituye tambin una citokinina natural. Adems de esas citokininas derivadas de las purinas, han sido descritas otras citokininas no purnicas como el thidiazuron (TDZ) y el CPPU ( N-(2-cloro-4-piridil)N-fenil urea. Estos compuestos tienen una actividad histoqumica muy alta y son muy eficientes en las plantas maderables. En cultivos de tejidos, el BAP y las citokininas sintticas Kinetina y TDZ (thidiazuron) son las ms frecuentemente usadas. Las citokininas estimulan la divisin celular (cariocinesis) en cultivo de tejidos vegetales y tienen un efecto sinrgico en este sentido con las auxinas. Por esta razn, una forma de evaluar un efecto citokinina es mediante el estudio del incremento en peso seco. Se han reportado otros efectos de las citokininas, por ejemplo: estimulan el alargamiento celular de discos de hojas etioladas; inducen la formacin de rganos en una gran variedad de cultivos de tejidos in vitro (morfognesis); controlan la formacin de proplastidios en cloroplastos; mantienen la maquinaria de sntesis de protenas mediante la regulacin de la sntesis del RNA; retrasan la senescencia; etc. Las citokininas que se usan con mayor frecuencia en los medios de cultivo son: la kinetina (KIN), la 6-bencilaminopurina (BAP), la 2-isopenteniladenina (IP) y la zeatina. El BAP se emplea con frecuencia debido a su gran actividad y su bajo costo. Generalmente las citokininas de evitan o se emplean en dosis muy dbiles en los medios de enraizamiento porque presentan un efecto inhibidor sobre la rizognesis.
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Otros reguladores: En los ltimos aos se han utilizado otros grupos de reguladores, que al incluirse en los medios de cultivo producen efectos positivos sobre el desarrollo delos callos, la morfognesis, la organognesis, etc. Tal es el caso de los brasinoesteroides (BRs) y las oligosacarinas. Los brasinoesteroides son derivados esteroidales que tienen un ncleo bsico (brasinlido) que se presentan en las plantas y actan a concentraciones muy bajas; fueron aislados del polen de Brassica napus de ah su nombre (Grove et al, 1979). El brasinlido, el 24- epibrasinlido y el homobrasinlido son los brasinoesteroides naturales ms empleados. Sin embargo, por el hecho de que se encuentran en muy bajas concentraciones en las plantas, se trabaja en la sntesis de anlogos de brasinoesteroides, que aun no teniendo la estructura del brasinlido con sus cuatro zonas o sitios activos (Mandava, 1988), puedan tener un efecto positivo sobre la fisiologa de la planta. Resultados en estudios de la morfognesis in vitro en caa de azcar y ctricos se han obtenido con anlogos de brasinoesteroides sintticos producidos en Cuba, por la Facultad de Qumica dela UH. Tal es el caso del Biobras-6 y del Biobras 16. estos compuestos tambin han presentado resultados favorables a nivel de campo en cultivos de caa de azcar, arroz, uva, vegetales de hoja, etc. Las oligosacarinas constituyen un nuevo grupo de reguladores del crecimiento vinculado con la respuesta de la planta al ataque de patgenos e insectos. Por el ataque, se producen fragmentos de las paredes celulares de la clula daada o del hongo. Estos fragmentos que se producen de la ruptura de las molculas de la celulosa, hemicelulosa, sustancias pcticas o quitina, constituyen elicitores que activan el mecanismo de respuesta de la clula para producir las fitoalexinas, txicas a los patgenos e insectos. Hay experiencias con oligogalacturnidos que son fragmentos de la degradacin de las sustancias pcticas, producidas a partir de la corteza de frutos ctricos por el laboratorio de Fisiologa Vegetal del INCA (Cabrera, 2000), que se han evaluado in vitro con resultados satisfactorios en estudios morfogenticos en caa de azcar, ctricos y otros cultivos. Tambin se emplean en el cultivo de tejidos otros reguladores conocidos como el cido abscsico (ABA); las poliaminas: putrescina, espermidina y espermina; as como el cido jasmnico (JA) y su forma metilada, el metil-jasmonato (MeJa).
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Leccin 13: Requerimientos de las clulas en cultivo: Antibiticos, Enzimas, Requerimientos minerales. Dentro de la gran variedad de cultivos celulares se necesita de otros componentes que les permiten a las clulas sobrevivir, a continuacin se mencionaran indistintamente estos otros requerimientos tanto para cultivos de clulas animales y/o vegetales.
Cultivos Celulares animales (Tomado de Ramrez, 2001) Antibiticos: dentro de los cultivos celulares animales los ms utilizados son la Penicilina G y la Dihidroestreptomicina los cuales eliminan bacterias. La Gentamicina o Tylosina previene el crecimiento de Micoplasmas. Adems se emplean frecuentemente un antimictico, por lo general Anfoterician B, la cual es muy til en el control de hongos y levaduras . Enzimas Proteolticas: Se emplean como agentes clulo-dispersantes. Las mas comnmente empleadas son: TRIPSINA: es la ms empleada. Cataliza la hidrlisis de uniones peptdicas entre los grupos carboxilo de arginina o lisina y el grupo de otros aminocidos. COLAGENASA: Recomendada para la dispersin de clulas de rganos ricos en tejido conectivo. PROTEASA: ejerce accin dispersante ms rpida y completa que la tripsina en ciertas clulas diploides fetales humanas. OTRAS: elastasa, pancreatina, papaina. Mitgeno: Es una sustancia que estimula las clulas a entrar en divisin celular, los receptores de membrana son ocupados por las molculas del mitogeno y desencadenan una serie de seales las cuales son transmitidas hasta el ncleo, sin embargo esta relacin no es suficiente para desencadenar la cascada de respuestas necesarias, pues es muy importante tambin considerar el medio ambiente en que se encuentran las clulas. Hay mitgenos especficos de linfocitos T como Concanavalina Fitohemaglutinina PHA-P y otros de linfocitos B como LPS. A y
Es importante aclarar que cuando se trabaja en cultivos celulares se deben de considerar las interacciones que los mitogenos pueden establecer con otros componentes del cultivo, por ejemplo se conoce que la Fitohematoglutinina precipita con las protenas del suero, principalmente con alfa-globulina, esta
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interaccin induce una transformacin en los linfocitos produciendo un efecto inhibitorio (Yachnin, 1972) y un exceso de PHA-P vence este efecto. Ham y Mckeehan (1979) proponen que las macromolculas del suero pueden reducir los nutrientes en el medio, por uniones entre los dos, produciendo un mayor metabolismo celular. Bajo condiciones usuales de cultivo la iniciacin y continuacin de la proliferacin de linfocitos depende principalmente de la concentracin celular (nmero/ml) y/o densidad celular (nmero/cm2) (winger et al. 1977) (Citado por Camacho-Garzn, 1999) Concentracin de volumen a sembrar: Dentro de los parmetros contemplados en cultivos celulares es de gran importancia evaluar el volumen de linfocitos a sembrar pues entran a interactuar con el mitogno. Las lectinas tienen la capacidad para aglutinar clulas y por el hecho de que stas tengan mas de un sitio especfico de combinacin, siendo claro que el primer paso en la mitognesis es la unin de la lectina a un grupo especfico de carbohidrato en la superficie celular, de tal manera que si la lectina no se une la mitognesis no ocurre (Brown y Hunt, 1984) En cultivos celulares de peces la aglutinacin total de las clulas es una manifestacin del exceso de PHA-P, mientras que la presencia de rosetas se explica por la formacin de puentes entre carbohidratos de algunas clulas adyacentes (Camacho-Garzn, 1999)
Cultivo celular Vegetal Componentes minerales: Los componentes minerales esenciales para la vida de las plantas se dividen en: Macroelementos: se utilizan en grandes cantidades: carbono, oxgeno, hidrgeno, nitrgeno, fsforo, azufre, potasio, calcio y magnesio. Oligoelementos o microelementos: aunque son necesarios en menor cantidad, juegan un papel esencial en los mecanismos enzimticos como activadores o constituyentes de las coenzimas. Los principales microelementos son: hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno, cobalto y boro.
Las exigencias minerales varan con la especie, la naturaleza del tejido y su estado fisiolgico, pero, dems, tambin varan con el mtodo de cultivo y el tipo de organognesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los tejidos con actividad metablica elevada, pueden presentar importantes necesidades en potasio.
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En los medios de cultivo se aportan cantidades elevadas de elementos minerales, superiores a las necesidades efectivas de los tejidos. Los problemas que se plantean deben enfocarse en trminos de potenciales osmticos. Vitamina: Las vitaminas favorecen el crecimiento de los tejidos en cultivos in vitro y no se excluye que la falta de alguna de ellas pueda ser un factor limitante de los fenmenos de organognesis. La tiamina (0.1 1.0 mg/L) tiene un efecto claro en los medios de cultivo. Tambin se han sealados efectos favorables para el cido nicotnico, la peridoxina y la riboflavina sobre el crecimiento de los cultivos. El compuesto que mas frecuentemente se aade a los medios de cultivo es el meso-inositol (myo-inositol), se emplea en concentraciones entre 50 500 mg/L y su efecto se evidencia sobre la proliferacin de tejidos y sobre la activacin de la organognesis. El cido ascrbico (1 10 mg/L) y el cido ctrico ( 50 100 mg/L) se utilizan en ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes para evitar el oscurecimiento de determinados tejidos. Aminocidos: El aporte de aminocidos favorece la proliferacin de callos, aunque cuando ms se acude a los mismos es en las experiencias sobre la organognesis y en la multiplicacin vegetativa in vitro. Las mezclas de aminocidos parecen tambin presentar efectos sinrgicos estimulando fuertemente la proliferacin de callos y la organognesis. Los efectos obtenidos mediante el aporte de aminocidos parecen muy variables segn la especie y el tipo de morfognesis estudiada. Hasta el momento no es posible establecer una regla general. Azcares: Los tejidos y clulas cultivadas in vitro son ampliamente hetertrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de asimilacin cloroflica. Luego, resulta indispensable aadir azcares a los medios de cultivo, siendo los dos ms utilizados la sacarosa y la glucosa. La concentracin ptima del azcar en los medios de cultivo vara entre 20 80 g/L, en dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los azcares presentan una accin metablica y energtica. Otros autores vinculan la necesidad de azcares con problemas osmticos o de un efecto indirecto sobre el metabolismo de los reguladores endgenos. Se ha demostrado que la galactosa, la lactosa y la rafinosa inhiben la sntesis de auxina en los coleptilos de avena
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(Avena sativa L.) por mecanismos no dilucidados (Ankler, 1974). Los inhibidores de la sntesis de auxina estimulan la embriognesis a partir de masas de tejidos embriognicos de Citrus sinensis, c.v. Shamouti (Kochba y col., 1978). Igualmente, la galactosa estimula la embriognesis en forma similar, a partir de masas de tejidos que no haban producido jams embriones, previamente; plantean la hiptesis de una inhibicin por la galactosa para la conversin del indolacetaldehido en AIA.
Leccin 14: Medios de cultivo A continuacin se relacionaran las principales caractersticas de algunos de los medios utilizados para cultivos celulares. TC 199, F10, MEM, RPMI, Medios de cultivo utilizados en cultivos de clulas animales. (Tomado de (http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cap3.htm) Propiedades fsicas Las caractersticas del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensin superficial. pH y capacidad tamponadora. El pH ptimo de crecimiento para la mayora de tipos celulares es de 7.4, aunque existen pequeas variaciones: algunas lineas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7.4 y 7.7, y clulas transformadas lo hacen en el margen de pH de 7.0 a 7.4 (Eagle, 1973), clulas epidrmicas pueden ser mantenidas a pH 5.5 (Eisinger y col., 1979). El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, azul-rojo a pH 7.6 y prpura a pH 7.8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solucin tamponadora ms empleada sigue siendo el tampn bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosfrico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a : su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solucin tamponadora de eleccin por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO2 externo, debe estar a concentracin doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado Osmolaridad
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Muchas clulas en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotnicos para compensar la evaporacin durante el periodo de incubacin, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinacin del punto de congleacin o la elevacin de la presin de vapor. Hay que tener en cuenta que la adicin de HEPES, de drogas disueltas en cidos fuertes y la neutralizacin posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. Temperatura La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las clulas, de ah la importancia de un buen control de sta en la incubacin. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH del medio 0.2 unidades por debajo del ptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar o/n en la estufa y despues ajustar el pH, antes de aadirlo al cultivo. Viscosidad La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. S es importante para evitar el dao celular en la agitacin del cultivo (menor dao a ms viscosidad) y en la tripsinizacin. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, aadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch and Pitch, 1971). Tensin superficial La tensin superficial se ha de mantener baja, y en general slo se ve alterada por la aparicin de espumas en los cultivos en suspensin donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en stos casos se produce un aumento de la desnaturalizacin de protenas y se incrementa el riesgo de contaminacin si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. Condiciones fisiolgicas Hacen referencia a la composicin del medio. Ya se indic que la principal dificultad para el establecimiento de las lneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de protena o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el ms
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complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20 %. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios ms complejos como NCTC 109 (Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965), serie de los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980). La aproximacin recomendada para establecer un medio definido es empezar con um medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentracin de suero (20 %) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. Despus de aos de investigacin en la composicin de los medios la eleccin de stos sigue siendo emprica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: 1. Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa. 2. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms corriente, contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicin de suero (10 %). 3. R.P.M.I. 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspencin. Tiene um amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. 4. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentracin de aminocidos y vitaminas que el B.M.E. Se usa para la seleccin de hibridomas suplementado con HAT o HT. 5. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. 6. McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata como humanas. 7. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivio de virus. 8. Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser suplementado xcon protenas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para el cultivo de clulas amniticas.
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9. Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares son suplementos protenicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. 10. Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de cromosomopatas. Medios de cultivos utilizados en cultivo de tejidos vegetales (Tomado de Gonzles., S. http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205..doc) Tabla 5. Composicin de algunos medios de cultivo ampliamente utilizados en Cultivo de Tejidos de plantas. (Concentraciones en mg/L)
COMPONENTES WHITE HELLER 600 75 250 750 125 0.1 1.0 1.0 0.01 0.03 0.03 0.03 1.0 MEDIOS MS NITSCH 1650 1900 440 370 170 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 2.0 0.5 0.5 0.1 720 950 166 185 68 25.0 10.0 10.0 0.25 0.25 0.025 37.3 27.8 2.0 0.5 0.5 0.5 B5 134 2500 150 250 150 10.0 2.0 3.0 0.75 0.25 0.025 0.025 0.025 1.0 1.0 10.0 1.0 1.0 1.0 KM 600 1900 600 300 170 300 10.0 2.0 3.0 0.75 0.25 0.025 0.025 -
MACRONUTRIENTES Ca(NO3)2 4 H2O 300 NaNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 KNO3 80 CaCL2 2 H2O CaCL2 MgSO4 7 H2O 720 KH2PO4 KCl 65 Na2SO4 200 NaH2PO4 H2O 19 MICRONUTRIENTES MnSO4 4 H2O 7.0 MnSO4 H2O ZnSO4 7 H2O 3.0 H3BO3 1.5 KI 0.75 Na2MoO4 2 H2O CuSO4 CuSO4 5 H2O CoCl2 6 H2O AlCL3 NiCL2 6 H2O FE EDTA Na2EDTA 2H2O FeSO4 7 H2O Fe2(SO4)3 2.5 Fe3Cl3 6 H2O COMPUESTOS ORGANICOS Glicina 3.0 Ac. nicotnico 0.5 Piridoxina HCl 0.1 Tiamina - ClH 0.1
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Acido Flico Mioinositol Biotina Sacarosa (g/L) pH
5.5
100.0 -
100.0 30 5.7-5.8
0.5 100.0 0.5 5.5
100.0 20 5.5
100.0 0.01 5.6
White(1943); Heller (1953); MS: Murashige y Skoog(1962); Nitsch y Nitsch(1969); B5: Gambourg et al(1968); Kao y Michayluk(1975).
Tabla 6. Principales fitohormonas utilizadas en cultivo de tejidos de plantas y sus pesos moleculares.
CLASE
AUXINAS
CITOKININAS
Abreviatura AIA ANA AIB CPA 2,4 D Picloram NOA KIN BAP (BA) 2iP Zea PBA
GIBERELINAS INHIBIDORES
AG3 ABA
Nombre qumico Acido 3 - indolactico Acido naftalenoactico Acido indolbutrico Acido (4-clorofenoxi)actico Acido 2,4 diclorofenoxiactico Acido 4 amino 3,5,6, tricloropicolnico Acido naftoxiactico 6 furfuril aminopurina kinetina 5 bencil aminopurina 6 bencil adenina Isopenteniladenina Zeatina (N6-(4 hidroxi 3 metilbut 2 enil) aminopurina (( 6 bencilamino) 9,2,tetrahidropiranil-9,Hpurina Acido giberlico Acido Abscsico
PM 175.2 186.2 203.2 208 221.0 241.5 202.2 215.2 225.2 203.2 219.2 300.0 364.4 264.3
Tabla 7. Fitohormonas utilizadas para el cultivo de clulas vegetales.
CLASE Auxinas Citokininas
REGULADOR AIA ANA 2,4 D Zea Zea-ribsido
CARACTERISTICA N S S N N
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Giberelinas
KIN BAP AG3 N: Natural
S N N S: Sinttica
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Tabla 8. Resumen de las principales fitohormonas empleadas en Cultivo de Tejidos y sus mayores efectos.
Fitohormonas AUXINAS AIA: Ac. 3 indolactico ANA: Ac naftalenactico AIB: Ac indol 3-butrico APA: Ac fenilactico 2,4 D: Ac 2,4 diclorofenoxiactico 2,4,5T: Ac 2,4,5 triclorofenoxiactico Picloram Dicamba ACP: Ac. Clorofenoxiactico CITOKININAS Z: Zeatina ZR: Ribosido de la Zeatina IP: isopenteniladenina IPA: isopenteniladenosina BAP: 6 bencilaminopurina KIN: 6 furfurilaminopurina TDZ: Thidiazuron CPPU: N(2-cloro-4piridil)N-fenil urea ACIDO ABSCISICO Mayores efectos en C.T. Formacin de races adventicias(a altas conc.) Formacin de brotes adventicios (a bajas conc.) Induccin de embriones somticos (embrioides) (en parte 2,4D) Divisin celular Formacin y crecimiento de callos Inhibicin del desarrollo de yemas axilares. Inhibicin del crecimiento de la raz. Formacin de races adventicias (a altas conc.) Inhibicin de la formacin de races. Divisin celular Formacin y crecimiento del callo. Estimulacin del desarrollo de yemas auxiliares. Inhibicin del alargamiento de los tallos Inhibicin de la senescencia de la hoja. Maduracin de embriones somticos Facilita la aclimatacin Formacin de bulbos y tubrculos Promueve el desarrollo de la dormancia Alargamiento del tallo Ruptura de la dormancia de la semilla, embriones somticos, yemas apicales y bulbos. Inhibicin de la formacin de races adventicias Regula la formacin de tubrculos, cormos y bulbos. Estimula la senescencia de las hojas Estimula la maduracin de los frutos Promueve o inhibe la regeneracin adventicia( en dependencia del tiempo de aplicacin o del genotipo) Promueven la formacin de races adventicias Promueven la formacin de brotes Promueven la embriognesis somtica Promueven la formacin de bulbos y tubrculos Estimula la formacin de meristemos. Estimulan el desarrollo de callos de caa de azcar Favorecen recuperacin de callos sometidos a estrs
GIBERELINAS GA3: Ac. giberlico GA1, GA4, GA7: (giberelinas)
ETILENO
POLIAMINAS Putrescina Espermidina Espermina ACIDO JASMONICO (JA) MeJa: METILJASMONATO BRASINOESTEROIDES Anlogos Biobras 6 Biobras 16
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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agricolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del curso Citogentica Aplicada al Mejoramiento OLIGOSACARINAS Pectimorf: oligogalacturnido DPS (1214) Estimulan el desarrollo de callos de caa de azcar Estimulan el desarrollo de brotes de ctricos.
Leccin 15: Tcnicas para obtencin de cromosomas En esta leccin se mencionaran a manera de ejemplos algunas tcnicas tanto directas como indirectas utilizadas en animales y vegetales en la obtencin de cromosomas.
TCNICAS EN VEGETALES Tcnica Bsica para obtencin de cromosomas (Jahier, 1996) Pretratamiento: se utiliza como antimitotico la colchicina, alfabromonaphleno, Beta-hydroxyquinoline y agua fra (0-2% C) . De todos los anteriores el alfabromonaphleno es el mas utilizado. Fijacin: en esta fase es en donde se destruye la clula preservando la estructura integral de los cromosomas. Son varios los fijadores utilizados como pueden ser 1) cido etanol (1:3) y 2) etanol-chloroformo-cido actico (6:3:1). El material puede ser presentado por varios meses en etanol, an cuando tambin el carnoy 1 puede ser utilizado. Hidrlisis: este estado es generalmente utilizado para obtener una buena extensin de los cromosomas. El agente ms utilizado es cido hidroclorico; su accin esta relacionado con enzimas, la hidrlisis disuelve las pectinas de la lnea media permitiendo que el citoplasma se vea ms claro. El cido hidroclorico libera los grupos aldehdos en las molculas de ADN para destruir los enlaces qumicos entre las bases purinicas y el azcar desoxirribosa. Coloracin: La coloracin de fuchsina es la ms usada. Esta se fija a los mismos grupos aldehdo liberados en el momento de la hidrlisis para que los cromosomas tomen un color rojo magenta. Generalmente esta tcnica se llama Feulgen porque fue descrita por primera vez por Feulgen 1926. Montaje: La mayora de las tcnicas se desarrollan en mitosis de meristiemo de races. En este caso, la zona meristemtica que sufre hidrlisis y coloracin es aislada en una lmina con una gota de cido actico o acetocarmin, y luego se aplica aplastamiento entre la lmina portaobjeto y cubreobjetos para asegurar una
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disociacin de las clulas. Esta disociacin es mucho ms difcil en tejidos que han estado previamente guardados en alcohol por un largo tiempo, algo que hay que evitar es un aplastamiento muy duro debido a que se corre el riesgo de encontrar metafases incompletas.
Observacin: los cromosomas de las plantas tienen una longitud alrededor 6 m. Estos son observados bajo una alta magnificacin, ms a menudo combinaciones entre ocular X objetivo dan magnificaciones entre 1000 X u 1500X. Las observaciones pueden ser observadas en fresco o conservadas por ms tiempo al cubrirlas con una solucin que evite el desecamiento. Pero la preservacin de las preparaciones por muchos aos tambin pueden ser deseable por muchos motivos, entre ellos para demostraciones, subsecuentes estudios con otros objetivos, para esto hay que tomar otras tcnicas de conservacin. Tcnicas en meristemo radicular (Jahier, 1996) Vicia faba Tiene que realizarse despus de medio da, cuando haya tomado varias horas de luz extra, tiene que haber turgencia en la punta de la raz. Pretratamiento: Colchicina 1% solucin acuosa, por 2 horas a temperatura ambiente. Fijacin: acetico- etanol (1:3) por 12 h a 5 C Almacenamiento: 70% etanol por periodo de 1 ao a 5 C Lavado: 3 lavados de 5 minutos cada uno. Hidrlisis: 1 N HCl por 8 minutos a 60 C Coloracin: Schiffs por 60 minutos a temperatura ambiente Preparacin: aislamiento de la zona meristemtica en una gota de Bellings 1% acetocarmine. En ocasiones aun cuando se trabaje con el mismo tipo de tejido, hay variaciones dependiendo de la especies a trabajar, como por ejemplo en amaryllidaceae la fijacin presenta una alta variacin en el tiempo de exposicin pasa de 12 horas a 72 horas adems de utilizar el carnoy 2
Tcnicas en meristemo radicular (Jahier, 1996) Amaryllidaceae El mtodo puede ser utilizado en otras especies monocotiledones y dicotiledones.
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Se utiliza meristemo en crecimiento de raz Pretratamiento: alfa-bromonaphthalene por 5 horas a temperatura ambiente o 14 horas a 4 C Fijacin: carnoy 2 (6:3:1) por 72 horas Almacenamiento: despus de pasarlo por 100% en etanol, seguido de 95% etanol este es guardado en 70% etanol en refrigerador por varios meses. Lavado: Con agua destilada por 1 hora a temperatura ambiente. Coloracin: El meristemo es aplastado en una gota acetic-iron-haematosylin. La coloracin es preparada justamente antes de mezclar en partes iguales la solucin A y B inmediantamente se ve una coloracin intensa de color caf. Preparacin: pasado cierto tiempo la muestra puede ser flameada sin llegar al punto de ebullicin. El tejido meristematico se disocia entre la lmina portaobjeto y cubreobjetos sin exceso de liquido.
Tcnicas en meristemo foliar (Jahier, 1996) Especies del Gnero Beta El mtodo es utilizado en hojas muy jvenes mayores de 5 mm. A partir de plantas en crecimiento. Pretratamiento: alfa-bromonaphthalene por 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4 C Fijacin: 90% cido actico por 1 hora a temperatura ambiente Almacenamiento: 70% etanol a 4 C. Maceracin: en solucin acuosa de 2% rapidase CxR por dos horas a 32 C en medio cido (no puede ser cido actico) Lavado: Con agua destilada por 1 hora a temperatura ambiente. Coloracin: El meristemo es aplastado en una gota acetic-iron-haematosylin. La coloracin es preparada justamente antes de mezclar en partes iguales la solucin A y B inmediantamente se ve una coloracin intensa de color caf. Preparacin: En una gota de DAPI (solucipn al 3 g/ml en Mcllvaine-Lillie buffer in 0.2 M de cido ctrico y 0.1 M fosfato disodico, pH 4.1
Tcnica en embriones (Jahier, 1996) Hordeum vulgare X bulbosum El mtodo es utilizado en embriones jvenes, caripsides de 3-5 das despus de la polinizacin.
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Pretratamiento: agua fra entre 0-2 C por 24 horas Fijacin: carnoy (6:3:1) por 15 minutos bajo vaco y 48 horas a presin atmosfrica. Almacenamiento: 70% etanol a 4 C. Lavado: Dos enjuagadas sucesivas en 70%. Coloracin: El embrin y el endospermo son extrados del caripside bajo estereoscopio (40X) y separado de la vaina en una gota de acetocarmin. El material es colocado entre la lamina y laminilla. La coloracin es reforzada por calentamiento varias veces por flameo aplicando una gota de acetocarmin cada vez.
Tcnica en protoplastos (Jahier, 1996) Tobacco La tcnica se realiza en races jvenes de 0.5- 1.0 cm de semillas germinadas de colonias cultivadas in Vitro bajo tratamientos por sincronizacin de mitosis (colonias normales y colonias tumorales) Las colonias de los tejidos en la fase de crecimiento exponencial son recolectados despus de haberlas mantenido durante 5-6 das en agitacin en liquido de medio. Pretratamiento: En solucin acuosa de alfa-chloronaphthalene Tobacco: por 2 hora a temperatura ambiente Prunus: por 4-6 horas a temperatura ambiente. Lavado: en agua por tres minutos Obtencin: maceracin enzimtica por un periodo mximo de 1 hora y 30 minutos Protoplastos: a 26C con agitacin a 60-80 r.p.m. La separacin mecnica del medio enzimtico es hecho al lavarlo en medio con ayuda de un piston de tefln dentro de un tubo de vidrio. Los protoplastos son recolectados al centrifugarlos a 750 r.p.m. Hipotnico: Se lava en medio con un incremento en 0.5 su volumen. Schock: Agua por 10 minutos a temperatura ambiente Fijacin: etanol actico (1:3) por 20 minutos a temperatura ambiente. Almacenamiento: etanol actico (1:3) por varios meses a - 18 C. Montaje: El material es suspendido en fijador. Este es extendido gota a gota sobre una lmina refrigeradas en 10% de etanol. Este es secado al aire o flameado. Lavado: En agua por 2 minutos. Coloracin: Con Giemsa al 3% en buffer fosfoto pH 6.9 a temperatura ambiente para tobacco por 5 minutos y Prunus y chestnut por 10 minutos.
TCNICAS EN ANIMALES TCNICAS DE CULTIVOS PARA ANLISIS CITOGENTICA

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Cultivo de linfocitos de mamferos Recoleccin de muestras de sangre perifrica Se deben recolectar de 2 a 10 ml de sangre venosa mediante puncin de un vaso perifrico, con tubo Vacutainer estril al vaco, al cual en el momento de la toma se le ha adicionado previamente 0,1 0,3 ml de heparina (Liquemine- Roche 5000 USP /ml) o con una jeringa desechable adicionada con el mismo anticoagulante. El sitio elegido para la puncin debe ser limpiado y desinfectado. En los animales domsticos se realiza a nivel de la vena yugular, en los chigiros en la vena safena y en las dantas en la vena femoral. La tcnica que se describe a continuacin, se basa en la reportada por Morread et al., (1960) con las modificaciones propias realizadas en el Laboratorio de Citogentica de la Facultad de medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot.
Protocolo de siembra En un frasco de cultivo estril se coloca la siguiente mezcla: 5 8 ml de medio de cultivo (RPMI-1640) con antibitico al 2% de una mezcla que contenga 5000 unidades de penicilina y 5000 ug de estreptomicina (pH: 7.2 7.3). 2 ml de suero fetal bovino (concentracin final de 20%) La cantidad recomendada de Fitohemaglutinina P (DISCO(), segn la especie animal preparada a partir de una solucin inicial de 5 ml de la cual se toma 1 ml y se diluye en 9 ml de agua desionizada estril. (Tabla). 1 2 ml de sangre estril con 0.01 ml de anticoagulante, (Liquemine Roche, 5000 ul/ml.). Los frascos se incuban por el tiempo pertinente y a la temperatura adecuada segn la especie animal. (Tabla). La Colchicina (concentracin de 0.016%) se aplica dentro de la incubadora durante el tiempo previo a la recoleccin del cultivo. (Tabla).
Recoleccin del cultivo El contenido del frasco de cultivo se transfiere a un tubo de centrfuga de punta cnico estril y se centrifuga a 1000 r.p.m. durante 10 minutos. Posteriormente el sobrenadante se elimina con una pipeta Pasteur. El botn celular se resuspende mediante golpes suaves en 8 ml de solucin hipotnica de cloruro de potasio (0.075 M) precalentada a
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37.5oC por el tiempo pertinente segn la especie animal. En cocodrilos se utiliza citrato de sodio al 1% (Tabla) Al cumplirse el tiempo en solucin hipotnica, se realiza pre-fijacin adicionando 8 gotas de fijador Carnoy 3:1 fresco (tres partes de Alcohol metlico por una parte de cido Actico). La solucin fijadora de Carnoy puede mantenerse a temperatura ambiente o en la nevera. Nuevamente se centrifuga a 1000 r.p.m. por 10 minutos y se descarta el sobrenadante. Para iniciar la fijacin las clulas se resuspenden, adicionando lentamente la solucin fijadora de Carnoy 3:1 recin preparada, con una pipeta Pasteur, hasta completar 8 ml. Se deja actuar por 30 minutos. Se realiza la centrifugacin del botn celular, a 1000 r.p.m. por 10 minutos y se descarta el sobrenadante. Se repite la fijacin con el fijador Carnoy fresco y se deja actuando durante 15 minutos. Se centrifuga a 1000 r.p.m. por 10 minutos y se descarta el sobrenadante. La fijacin se repite 3 4 veces dejndola actuar por 10 minutos cada vez, hasta que el botn celular y el fijador queden completamente limpios. Antes de gotear se realiza el ltimo lavado con fijador Carnoy (3:1) fresco por 10 minutos. Se centrifuga a 1000 r.p.m. por 10 minutos, se descarta el sobrenadante y se fija el botn en aproximadamente 0.5 ml de fijador. El botn celular es goteado sobre lminas limpias, enfriadas en el congelador. En cada lmina se colocan 3 4 gotas sobre el rea central se la lmina para obtener un extendido homogneo. Si se desea se pueden flamear suavemente o sino se dejan secar al aire.
Nota: En los cultivos de linfocitos de cocodrilos se recomienda utilizar como solucin hipotnica, citrato de sodio al 1% por 12 minutos. (Naranjo, 1997).
Coloracin La tincin clsica de Giemsa, se realiza una vez las lminas estn secas. Colorante para una lmina: 4.6 ml de agua destilada 0.2 ml de Buffer Giemsa. 0.2 ml de colorante Giemsa recin filtrado. Las lminas se colorean por 10 15 minutos, al cabo de los cuales se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire. Posteriormente se realizan tres pasajes por Xilol y se montan con Entellan.
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Tabla 9. Productos requeridos para cultivos de diferentes especies animales.

Especie Animal Bovino Equino Danta Chigiro Cocodrilo Cerdo y Zaino Medio de cultivo ml 9 5 5 5 10* 8 Fito P T ( C )de Incubac. 38.5 37.0 37-37.5 37.5 32 37.5
o
Tiempo de Colchicina Colchicina Hipotnica Incub. Horas 16% (cant) Tiempo Tiempo 66 70 71 72 64 67 021 01 0.15 015 0.04 ug/ml 0.2 1h 2h 1h 2h 6h 1h 30 10 30 30 12 30
0.3 0,05 03 03 0.20.3
Medio Hams F10
Cultivo de linfocitos en Peces Las muestras de sangre (1-2 ml) se obtienen por puncin en la vena ventral. La sangre se hepariniza y centrifuga posteriormente a 500-650 r.p.m. durante 3 a 5 minutos. El volumen de siembra es de 0.4 ml el cual se siembra en medio de cultivo TC 199 sin antibitico y suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, Fitophematoglutinina (PHA-P) a una concentracin de 6.25 X10-5 % Se deja en incubacin por 72 horas y en las ltima s 10-11 horas se adiciona 0.1 colchicina a 100 g/ml. Una vez concluida la incubacin se centrfuga a 1200 rpm durante 10 minutos, descartando el sobrenadante, se adiciona 10 ml de solucin hipotnica de KCL a 0.56% durarte 30 minutos. Tras la segunda centrifugacin y descartada la solucin hipotnica se adiciona la solucin carnoy (6:1) (v/v) durante 30 minutos, para volver a centrifugar a 1200 r.p.m durante 10 minutos. Esta ltima operacin se repiti dos veces ms durante 30 y 15 minutos respectivamente con carnoy (3:1) (v/v) Del volumen final obtenido se extiende con pipeta Pasteur dos gotas por lmina para posteriormente colorearlas con Giemsa al 2% en buffer fosfato de pH 6.8 (Camacho-Garzn & Burbano, 1999) Cultivo de linfocitos de aves Toma de muestra Para la toma de la muestra de sangre en aves se recomienda tener en cuenta los siguientes parmetros (peso entre 50 y 100 gr) Vena yugular Vena Cava superior Corazn Cantidad de sangre entre 1.5 2 ml.
En aves de tamao mediano a grande (peso > de 100 gr) Vena Baslica (1 3 ml)
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Vena Yugular (para grandes volmenes) Se deben utilizar jeringas heparinizadas de 5 ml con aguja 23 24.
La muestra debe ser conservada a una temperatura de 4oC hasta que pueda ser puesta en cultivo (de 2 horas hasta 24 horas despus de recolectada). Protocolo de siembra Para la siembra se recomienda separar los linfocitos a partir de la sangre completa mediante el empleo de Histopaque 1077 (Giannoni, 1986) empleando el siguiente procedimiento:
Colocar en un tubo de centrifuga 2 ml de Histopaque. Adicionar 1.5 2 ml de sangre completa, gota a gota, dejndola rodar por las paredes del tubo. Centrifugar por 20 minutos a 900 r.p.m. Transferir la lnea blanca a un tubo de centrifuga con 3 ml de medio de cultivo. Centrifugar por 10 minutos a 900 r.p.m. Eliminar el sobrenadante Restituir el botn.
La siembra se realiza segn lo descrito por DeBoer (1976) con algunas modificaciones, transfiriendo el botn de linfocitos resultantes de la separacin, a un frasco de cultivo estril que contenga: 5 ml de medio de cultivo Iscoves adicionado con antibiticos 1 ml de Suero fetal bovino 0.5 ml de Fitohemaglutinina P Incubar por 72 horas a 37oC Adicionar Colchicina (0.04-0,06 ug/ml) por un tiempo de 2.5 2 horas previas a la cosecha.
Recoleccin del cultivo Centrifugar el botn celular 10 minutos a 1000 r.p.m. y descartar el sobrenadante El tratamiento hipotnico se hace adicionando 8 ml de una solucin de KCl 0,075M por 30 minutos a 37oC. Centrifugar por 10 minutos a 1000 r.p.m. y se descarta el sobrenadante.
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Resuspender las clulas y proceder con la fijacin adicionando gota a gota y con agitacin constante 6-8 ml de Carnoy fro por 30 minutos. Realizar al menos 3 lavados del material por fijador Carnoy. Realizar el resto del procedimiento en forma similar a mamferos.
Cultivo de larga duracin de pulpa de plumas El propsito de esta tcnica es obtener tejido que pueda ser cultivado para produccin de fibroblastos de manera que resulten clulas mitticas en profase tarda e inicio de la metafase para ser usadas en cariotipificacin y diferenciacin citoqumica de cromosomas (banda G, C, R y NOR). Protocolo de siembra Se desinfecta con alcohol la piel del ave en la base de las plumas en crecimiento y se remueven 6-8 plumas con la mano. Se retiran 1-2 mm de pulpa del extremo de las plumas, transfiriendo el material a una caja de Petri, que contenga 0,5 1 ml de medio de cultivo sin suero. Por agitacin suave y aspiracin con pipeta Pasteur estril Se separan los grnulos de pigmento Se agregan 0,5 1 ml de solucin de colagenasa (1 mcg/ml) y se corta las pulpas de pluma en pequeos trozos con un bistur estril. Se transfieren las pulpas a un tubo de centrifuga y se agregan 2 ml de colagenasa agitando suavemente, despus de 10 minutos a temperatura ambiente. Se adicionan 2 ml de medio de cultivo con 15% de suero fetal ovino (SFB) y se centrifuga a 800 r.p.m. durante 10 minutos Se resuspende el material en medio de cultivo con SFB, se centrifuga a 800 r.p.m. por 10 minutos. Se transfiere el material a frascos de cultivo y se incuba a 37 oC en una atmsfera de CO2 al 5%. La clulas proliferan durante 8 16 horas adhirindose a las paredes del frasco, entonces se cambia el medio de cultivo por medio nuevo y esta operacin se repite cada 24 36 horas adicionando apenas 2 ml de medio de cultivo por cada frasco.
Subcultivo Se remueve el medio de cultivo y se lavan las clulas con PBS o BSS. Se agrega 2 ml de solucin de tripsina precalentada Se retira inmediatamente la solucin del frasco dejando 0,5 ml. Se incuba a 37oC por 10 minutos.
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Se adicionan 5 ml de medio de cultivo y se resuspenden las clulas suavemente con pipeta Pasteur. Se transfieren 0,5 ml a dos nuevos frascos de cultivo, se completa con 2 ml de medio y se incuba a 37oC. Despus de 8 horas se verifica el crecimiento celular y se cambia el medio de cultivo cada 36 48 horas. Los frascos que sean usados para la cariotipificacin deben tener el medio de cultivo cambiado el da anterior a la cosecha. Se adicionan 1 2 gotas de solucin de Colchicina (0,05%) 20 30 minutos antes de la cosecha del material.
Recoleccin del cultivo Se transfiere el material (clulas ms medio de cultivo) a tubos de centrifuga y se centrifuga a 800 r.p.m. por 5 minutos, se remueve el medio de cultivo se adicionan 5 ml de BSS o solucin de Hanks. Se centrifuga de nuevo y se descarta el sobrenadante, se agregan 3-5 ml de solucin hipotnica de KCI 0,05 M durante 15 -25 minutos a 37oC. Se centrifuga por 5 minutos a 800 r-p.m. y se descarta el sobrenadante. Se adiciona gota a gota, escurriendo por las paredes del tubo, fijador Carnoy (metanol-cido actico, 3:1). Tiempo de fijacin 30 minutos. Se realizan al menos 3 pasajes del material por fijador Carnoy. Se gotea a una distancia de 50 60 cm. sobre laminas portaobjetos, limpias mojadas previamente en un bao de hielo hecho con agua destilada. Usualmente se gotean 3-4 gotas por lmina para lograr un extendido homogneo; teniendo en cuenta de gotear un nmero de lminas adecuado (4-10) para poder realizar las diferentes tcnicas de tincin, convencional y de bandeo cromosmico. Los extendidos se dejan secar al aire.
Coloracin de lminas Se emplea la tincin clsica de Giemsa ya descrita y se observan al microscopio de luz.
Obtencin directa de cromosomas a partir de pulpa de plumas Esta tcnica consiste en una preparacin celular no cultivada, por lo cual es rpida y sencilla. El siguiente protocolo ha sido modificado de la tcnica de Gmez y Henao (1887), con modificaciones para el transporte desde el sitio de obtencin (zoocriadero, parque zoolgico) hasta el laboratorio.
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Toma y transporte de la muestra Se remueve un promedio de 5 plumones en crecimiento Con la ayuda de un bistur, se remueve el contenido (pulpa) del clamo o la raz de la pluma y se coloca en una caja de Petri que contenga 5 ml de medio de cultivo. La pulpa se macera hasta lograr una solucin homognea. Se adiciona 0.5 ml de Colchicina (0.04 0.06 ug/ml, se homogeneiza y se introduce todo el material en un frasco pequeo estril. La muestra se debe transportar a una temperatura aproximada de 4 oC y debe ser procesada en el menor tiempo posible.
Procedimiento en el laboratorio La muestra se introduce en un tubo de punta cnica y se lleva a incubacin a 37oC por una hora Centrifugar la solucin a 1000 r.p.m. por 15 minutos. Extraer el sobrenadante y adicionar 8 ml de solucin Hipotnica (KCI 0.075 M) dejndola actuar por 30 minutos en incubacin a 37 oC. Agregar 8 gotas de fijador Carnoy y centrifugar a 1000 r.p.m. por 15 minutos. Desechar el sobrenadante y agregar el fijador al botn dejndolo actuar por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 15 minutos, eliminar el sobrenadante y repetir la operacin una vez ms. Gotear, colorear y proceder a analizar las lminas.
Protocolo citogentica para lneas celulares Se transfieren clulas tripsinizadas a los frascos de cultivo los cuales contienen 8 ml de medio (RPMI 1640) con L-glutamina y 10% de SFB. Los cultivos celulares deben ser incubados en una atmsfera de CO 2 al 5% a una temperatura de 37oC por 3 das. Cuatro horas antes de la cosecha de las clulas, debe aadirse Colchicina a una concentracin final de 0.05 ug/ml. Se transfieren los cultivos a tubos de centrifuga de punta cnica y centrifugar a 1000 r.p.m. por 10 minutos, adicionar solucin hipotnica (KCI 0.075M) a 37oC, golpeando vigorosamente la base del tubo despus de adicionar las primeras gotas, completar hasta 8 ml de solucin hipotnica mezclando por inversin (no pipetear debido a que las clulas son frgiles). Dejar en incubacin a 37.5 oC por 10 a 15 minutos. Centrifugar de nuevo (1000 r-p.m. x 10 minutos), descartar el sobrenadante, y golpear la base del tubo para aflojar el pellet. Adicionar unas gotas de fijador fro recin preparado (3 partes de Metanol: 1 de
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cido actico) mientras golpea el tubo, completar hasta 10 ml de fijador mezclando suavemente por inversin (no pipetear), reposar por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar de nuevo (1000 r.p.m. x 10 minutos), descartar el sobrenadante, y golpear la base del tubo para aflojar el pellet, repetir el paso anterior por al menos tres veces (hasta que la solucin est completamente decolorada). Usando una pipeta Pasteur, gotear 2 3 gotas de las clulas resuspendidas sobre las lminas fras desde una altura de 30 a 60 cm, flamear y soplar suavemente la superficie de la lmina, dejar secar por 5 10 minutos y teir con atencin clsica de Giemsa por 3 7 minutos.
Cultivos de clulas de mdula sea in Vitro Cultivo de corta duracin Se sacrifica el animal Se le extrae la mdula, cortando los muslos a la altura de la articulacin coxo femoral se retiran msculos y tendones para dejar libres los huesos fmur y tibia. Se cortan las epfisis sea y se extrae la mdula con medio activo sin SFB mantenido a 37oC. Se transfiere la mdula a tubos estriles, se centrifuga 3 veces a 1.000 r.p.m. durante 5 minutos, procurando eliminar la mayor cantidad de grasa y residuos. Se incuba por 4 horas a 41oC en medio completo con: o 5 ml de RPM 1640 o 1 cc. de SFB o 0.2 cc. de PHA
Se siembran 2 frascos con 15 gotas de mdula sea cada uno. A las 4 horas se agregan 2 gotas de Colchicina 0.016%, se homogeniza el material y se incuba por 2 horas ms. Posteriormente se centrifuga para desechar el sobrante y se agregan 5 cc de solucin hipotnica (KCL 0.075N), resuspendiendo las clulas con pipeta Pasteur varias veces y se incuba por 20 minutos a 37.5 oC. Se centrifuga por 5 minutos a 800 r.p.m. Se descarta el sobrante y se adicionan 5 cc de fijador Carnoy y 3:1. Se resuspenden las clulas y se llevan a la nevera por 30 minutos. Se centrifuga nuevamente y se cambia el Carney 3:1. Se lleva a la nevera por 15 minutos. Se centrifuga y se adiciona Carnoy (1.1) y se lleva a la nevera por 15 minutos. Se centrifuga y se adiciona Carnoy (6.1) y se lleva a la nevera por 10 minutos. Se centrifuga, se gotea en lminas y se realiza la tincin de lminas con Giemsa. 121
Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en la leccin No. ____, as como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en las lecciones siguientes. Los tems a tener en cuenta son: 1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo induvidual y colaborativo en el desarrollo de esta leccin. 2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin
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3) Evaluacin del material usado en la actividad de la leccin: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado. 4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.
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UNIDAD 2 BANDAS CROMOSMICAS Y DIAGNSTICO CROMOSMICO
CAPITULO 4: MATERIAL GENTICO
Introduccin Dentro de los organelos celulares ms prominentes esta el ncleo pues ocupa cerca del 10% del volumen celular, dentro de l en estado interfasico se alberga el material gentico en forma de cromatina, recordemos que cuando se hablo de enrrollamiento del ADN se comento el primer grado de compactacin que corresponda a la estructura del nucleosoma, hebra de ADN ms protenas histonicas, pues la secuencia de estos nucleosomas unidos por la protena no histonica H1 conforman la hebra flexible de cromatina. As que la cromatina es el estado no condensado del ADN y que constituir los cromosomas en el momento que la clula entre en divisin celular. Como caracterstica se tiene adems que la cromatina tie fcilmente con colorantes bsicos por afinidad con el cido desoxirribonucleico.
Leccin 16: Tipos de cromatina La cromatina se encuentra en dos formas eucromatina y heterocromatina, su diferencia depende principalmente de la presencia en mayor o menor proporcin de las diferentes bases que conforman los cidos nucleicos y en el grado de condensacin durante el ciclo celular.
Heterocromatina
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Su principal caracterstica es que esta conformada por secuencias altamente repetitivas y al observarla en el microscopio se presenta en forma muy condensada; las secuencias varan en longitud pero generalmente tienden a ser cortas. Una de las caractersticas propias de la heterocromatina es que no posee actividad transcripcional, es decir, que los genes localizados en estas zonas son inactivos y por lo tanto no transcriben a nada funcional, al microscopio se observa de forma ms coloreada (heteropicnosis positiva) (fig. 44) La heterocromatina es una porcin del material cromosmico que es inactiva en cuanto a la expresin gentica pero que puede funcionar en el control de actividades metablicas, la transcripcin y la divisin celular. Se tie con mxima intensidad durante la interfase y suele mantenerse (http://modsjoweb01.ccss.sa.cr:81/diccionario/palabra.asp?pal=HETEROCROMAT INA&com=2&idLan=1) La inactividad de la heterocromatina ha sido de inters para muchos genetistas, y la pregunta es cual es la posible funcin de esta?, En humanos, se han hecho algunas relaciones de la heterocromatina con el tipo de fenotipo pero generalmente sin xito, se sabe que en humanos el contenido es especifico y se utiliza como un rasgo clnico.
Figura 44. Metafase mostrando eucromatina (menos teida) heterocromatina (ms teida). Tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/cromoeuc.htm Sin embargo, en un anlisis realizado en humanos en donde se estudio el patrn de asimetra de la heterocromatina se revelo ms de un patrn en algunas de las regiones estudiadas (Rocchi, 1982)
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Se ha detectado en varias especies animales y vegetales que la heterocromatina usualmente puede corresponder al 10-30% del total del ADN y puede tener propiedades con la forma de diferenciacin de su antecesor (Walker, 1971) pero en casos como el Salmon corresponde al 60%, en onion (70%) y Amphiuma del 80%. (Maclean y Vaughan, 1978) En organismos como los animales la variacin de la heterocromatina es importante en los procesos de especiacin, algunos ejemplos de variacin de esta se mencionan a continuacin.
Tabla 10. Variacin de heteroromatina en diferentes especies Especie Peromyscus crinitus Muntiacus muntjak Homo sapiens Microtus agrestis Mus musculus Mesocricetus auratus Drosophila novamexicana Peromyscus eremicus Drosophyla americana americana Drosophyla americana texana Drosophyla virilis Dipodomys ordii monoensis Heterocromatina % 6 15 17 26 27 34 34.4 (F), 28.4 (M) 36 38.5 (F), 38.2(M) 40.5(F), 36.1(M) 48.3(F), 49.2(M) 58
(Mahan and Beck, 1986; John and Miklos, 1987 tomado de (Clark y Wall, 1996) La heterocromatina es estructural y qumicamente diferente a la eucromatina inactiva pues se podra pensar que no, ya que las dos son inactivas funcionalmente, sin embargo este tipo de eucromatina es referenciada en ocasiones como heterocromatina facultativa y un ejemplo es la heterocromatina
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encontrada en cromosomas sexuales. Con esta base, la heterocromatizacin facultativa, que es la condensacin e inactivacin de material cromosmico, podra crear una funcin similar a la de la heterocromatina constitutiva. (Clark y Wall, 1996) La heterocromatina, se localizada sobre todo en la periferia del ncleo y puede ser de dos tipos diferentes:
Constitutiva: idntica para todas las clulas del organismo y que carece de informacin gentica, la mayora de las regiones de heterocromatina constitutiva contienen secuencias de DNA satlite se replica al final de la fase S del ciclo celular. Es un rasgo permanente de una posicin concreta del cromosoma y es de carcter hereditario (fig 45)
Figura 45. Metafase mostrando heterocromatina constitutiva, regiones cercana a los centrmeros (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/cromoeuc.htm)
Facultativa: se presenta condensada durante la interfase aunque no en todos los estadios de desarrollo, es diferente en los distintos tipos celulares y contiene informacin sobre todos aquellos genes que no se expresan, pueden estar presentes o ausentes en una posicin determinada del cromosoma
La eucromatina depende del estado fisiolgico o del momento de desarrollo. El cromosoma X, en algunas especies animales, como el saltamontes Schistocerca gregaria, aparece ms intensamente teido que el resto de los cromosomas durante la Diplotena de la Profase I de meiosis (fig. 46). La heterocromatina no es caracterstica de ningn tejido en particular, esta se encuentra principalmente en centrmero y telmeros (fig 45); un estudio en regin centromrica permiti encontrar secuencias de ADN repetidas en tamdem,
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usualmente una repeticin y parece ser estar a travs de toda la heterocromatina pero la naturaleza del motivo de repeticin si varia. Algunas secuencias repetitivas tienen diferencias significativas en la composicin del ADN ms que en el resto del genoma, por ejemplo pueden ser ms ricas en GC o AT; por lo tanto pueden ser aislados y separados del total de ADN genomico por centrifugacin de densidad de gradientes. Este tipo de ADN se le conoce como ADN satlite; el primero aislado fue el de ratn, pero ha sido ampliamente encontrado en el reino animales como vegetal. Las secuencias satlites pueden variar ampliamente pero tienden a ser cortas tales como GAGA/G en trigo o TAACCCC en felinos (Clark y Wall, 1996).
Figura 46. Heterocromatina facultativa http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/cromoeuc.htm Eucromatina Diseminada por el resto del ncleo y no visible con el microscopio de luz. La eucromatina es el material cromosmico activo en la expresin gentica durante la divisin celular. Aun cuando no tie densamente (heteropicnosis negativa) (Fig 44.) se tie ms profundamente durante la mitosis en la cual adquiere un estado condensado en forma de helice; en el curso de cada divisin celular sufre un ciclo continuo de condensacin y dispersin. La cromatina es en la que se transcribiendo el material gentico es decir pasa de ADN ARNm. Resumen: Diferencias genticas entre heterocromatina y eucromatina: tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/cromoeuc.htm
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Los experimentos de construccin de mapas demuestran que la mayor parte de los genes activos se localizan en la eucromatina. En los nucleos interfsicos, la eucromatina se tie menos densamente debido al menor grado de empaquetamiento, en general se acepta que este es el estado ms compatible con la actividad gnica y la transcripcin. La heterocromatina se encuentra en muchos organismos flanqueando las regiones cntromericas, algunas veces tambien se encuentra en regiones telomricas, e incluso se ha observado en algunos casos la existencia de cromosomas completos heterocromticos, por ejemplo, el cromosoma Y de Drosophila melanogater. La funcin de la heterocromatina no es an conocida, se han detectado muy pocos genes activos en la heterocromatina, en Drodophila existen mutaciones letales en genes que se localizan en regiones heterocromticas, por tanto, estos genes deben poseer alguna actividad. En cualquier caso, el porcentaje de genes activos localizados en regiones heterocromaticas es muy bajo comparado con el de genes activos situados en la eucromatina. La principal diferencia entre la eucromatina y la heterocromatina radica por tanto en la actividad de estos dos tipos de cromatina.
Diferencias citolgicas: A nivel estructural, en los nucleos interfsicos, existe una mayor grado de enrollamiento o empaquetamiento en la heterocromatina que en la eucromatina. La forma en la que se mantiene esta diferencia aun no es conocida.
Alociclia: la heterocromatina sigue un ciclo de condensacin y descondensacin distinto a la eucromatina. La heterocromatina puede aparecer ms intensamente teida que la eucromatina o menos intensamente teida dependiendo del estado celular (alociclia). La alociclia a su vez esta relacionada con la replicacin del ADN. La heterocromatina se replica ms tarde que la eucromatina.
Leccin 17: Bandeo Cromosmico Continuando con el tema de la heterogeneidad de la cromatina, las caractersticas qumicas de la misma hacen que al aplicar tratamientos diferenciales se resalte uno u otro de los tipos de cromatina existente, lo que en citogentica se conoce como Bandeo cromosmico. El advenimiento de las tcnicas de bandeo cromosmico, dotan hoy a la citogentica de una nueva herramienta otorgndole una mayor precisin en la individualizacin de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificacin morfolgica: la determinacin de aberraciones cromosmicas de importante
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incidencia en animales con problemas de reduccin de la fertilidad: la localizacin de genes que confluyen al mapeo gentico. Los bandeos cromosmicos hacen posible que se tenga un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosmica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como: fusiones y fisiones cntricas, translocaciones recprocas y en tandem; inverciones peri y paracntricas; delecciones; duplicaciones; contricciones secundarias.; gapss, fracturas cromosmicas, etc. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre si (http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/bandeos.htm) En Citogentica se conocen los trminos de coloracin selectiva y diferencial cada una de ellas es especfica de un tipo de bandas. Las coloraciones selectivas colorean sitios especficos del mismo, se conocen las bandas C y NORs; las tcnicas de coloraciones diferenciales producen bandas a lo largo de cada uno de los cromosomas de un complemento, en este tipo se encuentran las bandas G y R (Verma y Babu 1989 citado por Henao y Gomez, 1999) Los bandeos cromosmicos pueden clasificarse en morfolgicos y dinmicos: (tomado de http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/bandeos.htm) Los bandeos morfolgicos: se obtienen basndose en tcnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina. Existe en ellos una relacin con protenas (histnicas y no histnicas) e interacciones ADN. Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: tcnicas de tincin diferencial, mtodos de tincin selectiva, coloraciones con fluorocromos especficos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes, y tinciones con anticuerpos fluorescentes. Los bandeos dinmicos: se obtienen basndose en: tcnicas que implican la incorporacin de una base anloga, bromo-desoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina tambin bandeo de replicacin debido a la relacin existente entre el tiempo de incorporacin del BrdU y el patrn de replicacin. Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicacin temprana se obtiene un patrn de bandeo R destacndose las regiones ricas en G-C. Luego de realizada esta tcnica, los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos mtodos de tincin que emplean colorante tales como el Giemsa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos especficos.
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Por otro lado si se incorpora la base anloga durante la fase tarda de replicacin se obtiene un patrn de bandas G, destacndose las zonas de predominio de secuencias A-T. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes mtodos de tincin. En relacin con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos cromosmicos, se emplea un cdigo de tres letras: la primera, indica el tipo de bandeo utilizado, la segunda, la tcnica de deteccin empleada y la tercera, el tipo de tincin. Nomeclatura de bandeos morfolgicos. QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina. GTG: Bandas G por tratamiento enzimtico con tripsina utilizando Giemsa. RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina. RHG: Bandas R mediante desnaturalizacin trmica utilizando Giemsa. THG: Bandas T por desnaturalizacin trmica empleando Giemsa. CBG: Bandas C por hidrxido de bario utilizando Giemsa.
Nomeclatura de bandeos dinmicos. GBG: Bandas G por incorporacin de BrdU utilizando Giemsa. RBA: Bandas R por incorporacin de BrdU empleando naranja de acridina. RBG: Bandas R por incorporacin de BrdU utilizando Giemsa. GB-AAu: Bandas G por incorporacin de BrdU empleando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal. RB-AAu: Bandas R por incorporacin de BrdU usando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal. En todas las disciplinas siempre existen procedimientos de mayor uso que otros, as que en este modulo slo hablaremos de las ms bandas cromosomicas mas utilizadas en el cotidiano del ejercicio de la Citogentica. Banda C
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La tcnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originado en un experimento en donde ADN satlite marcado en ratn fue hibridizado in situ con cromosomas de raton. En este experimento, el ADN del cromosoma fue desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. Los sitios hibridizados fueron detectados por autoradiografa usando coloracin de Giemsa para cromosomas. La prueba de hibridizacin preferencialmente fue en las regiones centromericas de los cromosomas. Sin embargo tambin se noto que el Giemsa coloreo otras regiones en otros cromosomas (Fukui y Nakayama, 1996) Esta banda se caracteriza por teir aquellas regiones ricas en heterocromatina constitutiva que corresponden a secuencias de ADN altamente repetitivas; se encuentran principalmente en centrmero, telmeros y ADN satlite y en ocasiones constricciones secundarias como son los NORs. Despus del descubrimiento de las tcnicas de banda C se desarrolladas tcnicas para cromosomas de mamferos. Mientras en animales se utiliza NaOH para el paso de la desnaturalizacin, el Ba(OH)2 es usado para producir banda C en cromosomas de plantas siguiendo el mtodo de Summer. l fue el primero en sugerir que la coloracin oscura del Giemsa coloreaba heterocromatina constitutiva causada por la preferencia de el ADN altamente repetitivo durante la renaturalizacin (Fukui y Nakayama, 1996). Los sitios de los cromosomas que presentan heterocromatina constitutiva y que tien Banda C positiva son 1) en la regin del centrmero 2) alrededor de la regin organizadora nucleolar 3) cerca del sitio del RNA para 5S y 4) en la parte final de los cromosomas es decir la heterocromatina telomerica, en general estas localizaciones se conocen como centromerica e intercalar y la ltima categora incluye todas las otras posiciones (Yunis y Yasmineh, 1972 citado por Maclean y Vaughan, 1978). En el campo de la investigacin para aclarar que tipo de elementos son los que se remueven dentro del tratamiento de esta banda, en un estudio en donde se analiz HCl 0.2 N el cual es una de las soluciones utilizadas para realizar tratamiento para banda C se encontr por medio de electroforesis la presencia de las 5 protenas histnicas, la que presentaba una banda de mayor intensidad fue la H3 y H4, estando presentes tambin las otras pero en menor cantidad (Burkhoder & Duezek, 1980) Para cromosomas de plantas, la estandarizacin de las tcnicas en Banda C han mejorado en su resolucin y el mtodo ha sido utilizado para la identificacin de cromosomas. En plantas esta tcnica identifica las secuencias que contienen gran cantidad de ADN repetitivo. Por ejemplo en cultivos de centeno Secale cereale en hibridizacin in situ es utilizada para detectar zonas de ADN altamente repetitivo
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de las cuales solamente unas pocas colorean Banda C positiva Nakayama, 1996).
(Fukui y
Por su parte, en muchas especies de animales domsticos se han encontrado complementos cromosmicos que por las tcnicas convencionales de coloracin no pueden ser ordenados completamente, debido a la presencia de cromosomas con rasgos morfolgicos muy similares. Esto sucede, por ejemplo: con los cromosomas 8, 9 y X del cerdo; con el 11 y el 12 de la misma especie; con los cromosomas 14, 15, 16, 17, 18 y 19 del equino; con los cromosomas 23, 24, 25, 26 y 27 tambin del equino; y con gran parte de los cromosomas del bovino, del ovino y del caprino. Lo anterior gener la necesidad de desarrollar tcnicas de coloracin denominadas de bandeo, o sea, aquellas que producen patrones constantes de bandas claras y oscuras, caractersticos de cada cromosoma que permiten identificar los cromosomas sin ambigedades (Henao y Gmez, 1997). Las tcnicas de bandeo han permitido tanto en animales como en vegetales, tambin, la deteccin de un gran nmero de aberraciones cromosmicas, con la correspondiente definicin de los componentes del complemento comprometidos en el problema.
Bandas Ag-NOR Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones Organizadoras Nucleares ( de ah la nomenclatura NOR) en ocasiones son tambin llamadas Banda N, su coloracin es debido a la afinidad con el Nitrato de Plata. La Regin Organizadora Nucleolar es el sitio en donde estn localizados los genes de ADNr; el nucleolo esta compuesto por cinco componentes estructurales, el centro fibrilar, el componente fibrilar, el componente granular, el intersticio nucleolar, y la cromatina condensada asociada. (Goessens, 1984) En eucariotas el organizador nucleolar consiste de mltiples repeticiones arregladas en tandem, de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con secuencias espaciadoras. Los espacios pueden ser transcritos, pero su transcripcin nunca incluye un ribosoma maduro. Usualmente se refiere a ADN ribosomal (ADN-r) como una repeticin de genes con secciones en tamdem arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas (Champman y may, 1993) Este tipo de banda se debe especficamente a la presencia de las protenas afines a la actividad transcripcional en los cistrones ribosomales (Henao y Gmez, 1997).Durante la metafase estos estn localizados generalmente dentro de la
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constriccin secundaria (Howell 1982) Citado por (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986). El comportamiento del nucleolo en proliferacin celular es llamado ciclo nucleolar, se considera que el ciclo comienza en el momento en que en interfase este o no la decisin de entrar en proliferacin o diferenciacin, se considera que el ciclo comienza cuando el nucleolo se organiza nuevamente seguido de las fases de la mitosis, es decir el nucleolo no es una entidad nuclear individual (De la Torre y Jimnez-Martn, 1982) Ante todo y de gran importancia es de anotar que esta banda es funcional, es decir, es positiva siempre y cuando las Regiones Organizadoras Nucleolares hayan estado en actividad la interfase inmediatamente anterior al momento de realizar la banda, es decir la banda se expresa en las metafases obtenidas cuando los genes de ADNr hayan sido transcritos. Un anlisis morfo-funcional de las Regiones Organizadoras Nucleolares teniendo en cuenta los ciclos circadianos demostr la relacin directa de los centro fibrilares ( uno de los componentes del NOR) con la actividad nucleolar. (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986 En un estudio sobre protenas asociadas con los NORs se estableci que estas son no histonicas y son argyrophilic Las proteinas NOR estn estrictamente localizadas dentro del centro fibrilar y el componente fibrilar denso del nucleolo interfasico (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986). En general, el nucleolo crece durante la interfase, algunas veces el volumen es proporcional al incremento tanto de el componente fibrilar y el granular, pero en mayor proporcin de la acumulacin del componente granular. La talla final del nucleolo maduro en el ciclo celular aparentemente no es una funcin estrictamente lineal del numero de genes ribosomales que el NOR posee (De la Torre y Jimnez-Martn, 1982). Son varias las aplicaciones de las bandas NOR entre otras se tiene que: (tomado de Camacho, 1999) con la banda NOR se puede establecer el grado de variabilidad de los patrones inter e intra especficos entre especies y/o poblaciones, pues tanto los cromosomas portadores de NOR como la posicin en el cromosoma son usualmente diversos entre especies (Disney y Wright, 1987; Takai y Ojima, 1986 citado por Oberdorff et al, 1990). La diferencia en talla entre NORs homlogos ha sido descrita en varias especies de vertebrados (Miller et al., 1977; Ruiz el al., 1981; Galetti et al., 1984 citados por Sanchez et al., 1990). Esta variacin interespecfica ha sido utilizada para probar hiptesis filogenticas e inferir otras, antes basadas principalmente en datos morfolgicos (Amemiya y
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Gold, 1990); parece ser que las alteraciones en los NOR ocurren normalmente con relacin a la diferenciacin y evolucin de las especies (Oberdorff et al, 1990). La variacin intraespecfica puede ser usada para averiguar el origen maternal y paternal de los cromosomas en un individuo (Mellink et al, 1994) constituyndose la actividad del NOR como una propiedad heredable cuyo tipo de transmisin puede ser mendeliana (Jotterand y Van Melle, 1981); adems los NOR activos muestran variacin de generacin en generacin mientras los inactivos no (Zakharov et al, 1982 citado por Mellink et al, 1994). En plantas se encontr tambin que el mtodo servia no solo para localizar Regiones Organizadoras Nucleolares sino para identificar cromosomas en cereales, adems de encontrar una relacin entre bandas C y Namda N lo cual fue clarificado por Schlegel y Gill. Tambin se realizo tcnicas de una banda N secuencial con hibridacin in situ para identificar cromosomas con las la posicin especifica de ADN, la metafase primero es identificada en sus patrones de bandas y despus se destina para hibridizacin in situ as se puede recurrir a la misma clula en metafase, de esta manera se permite una asignacin directa de los sitios de hibridizacin con cromosomas individuales (Fukui y Nakayama, 1996)
Bandas GTG Las bandas G deben su nombre al hecho de que en todas sus modalidades se emplea Giemsa para colorear los cromosomas. Esta tcnica que, en trminos generales, es la ms usada en mamferos, por permitir excelentes preparaciones permanentes sin requerir el uso de microscopio de fluorescencia, se basa en un tratamiento que altera la estructura de las protenas cromosmicas seguido de una coloracin. El mtodo de denaturacin trmica descrito por Sumner et al. (1971), es conocido como ASG (Acid-Saline-Giemsa) y se constituye en la primera tcnica de bandas G conocida. En esta modalidad se logra la denaturacin proteica mediante un tratamiento con 2XSSC (Solucin Salina Citratada) caliente. Sin embargo, el mtodo ms usado en la actualidad es el conocido con el nombre de bandas GTC (bandas G por Tripsina usando Giemsa como colorante); fue introducido por Seabright en 1971, y como su nombre lo indica, se basa en una digestin enzimtica con Tripsina. Se asume que el mecanismo por el cual se produce el patrn de bandeo G es porque el colorante interactua con las protenas de cromosoma, al parecer ricas en grupos disulfuro en las bandas positivas (oscuras), y en grupos sulfhidrilo en las negativas (claras) (Verma y Babu, 1989). Se acepta, adems, que la extraccin diferencial de protenas ocurrida durante la fijacin y los tratamientos de
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denaturacin, juega un papel muy importante en la obtencin de estas bandas. Rooney y Czepulkowski (1987), consideran que las bandas G oscuras corresponden con las crommeras del paquiteno, que se presentan en segmentos de DNA de replicacin tarda, con alto contenido de Adenina y Timina, y con relativamente pocos genes activos (Henao y Gmez, 1999) La banda G ha sido reportada en muchos grupos animales pero por ejemplo en varias especies de peces esta banda no resulta positiva pues al parecer muchos de ellos no poseen compartamentalizadin del ADN en isocoros quienes serian los responsables del bandeamiento. Por su parte en plantas los reportes son pocos, e inclusive su existencia se ha puesto en duda. Sin embargo en un anlisis de centeno, S. cereale al construir el cariograma despus de tratamiento de banda G, se identificaron los cromosomas homlogos por los patrones de tipo de bandas oscuras y claras, se estableci diferencias con los patrones obtenidos en banda C, mientras banda C positiva produce grandes bandas telomericas y algunas intersticiales Banda G produce ms intersticiales que banda C negativa. Aunque los resultados obtenidos son prometedores en este caso se hace necesario mejorar antes las tcnicas antes de utilizarlas en la identificacin de cromosomas en plantas (Fukui y Nakayama, 1996)
Bandas RHG Este patrn de bandas es, en trminos generales, el inverso (reverse) de las bandas G, o sea, las bandas G-positivas son R-negativas, y las G-negativas son R-positivas; se les denomina bandas RHG para significar que son bandas reversas obtenidas por calor usando Giemsa como colorante. La tcnica original se basa en una denaturacin trmica selectiva en buffers de diversa naturaleza, seguida por una coloracin de cromosomas con Giemsa (Dutrillaux y Lejeune, 1971). Respecto al mecanismo de produccin de este patrn de bandeo, se asume que depende de la denaturacim selectiva que produce el calor en ciertas zonas del cromosoma, al parecer asociadas con segmentos de DNA ricos en Adenina-Timina; en este caso las bandas oscuras son las zonas ricas en GuaninaCitocina, o sea, las que resisten el calor. Verma y Babu (1989) describen el siguiente protocolo para estas bandas: (Henao y Gmez,1999). Entre las mltiples tcnicas de coloracin diferencial conocidas hoy, es preciso resaltar la importancia de las bandas G y de las bandas R en la definicin de los cariotipos de la mayora de los animales de importancia zootcnica. Entre las tcnicas selectivas, las de mayor importancia son las bandas C y las bandas NOR,
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por su aporte tanto a la identificacin cromosmica como a los estudios de heteromorfismos.
Leccin 18: Tcnicas de Bandeo Cromosmico (Prctica de laboratorio) A este nivel del modulo ya estn suficientemente entendidas las diferencias que hay en el comportamiento de los cromosomas tanto de animales como vegetales, as que a continuacin se describirn por separado las diferentes tcnicas de obtencin de bandas cromosmicas, en algunos casos se referirn dos tcnicas para el mismo tipo de banda, pues corresponden a modificaciones de los autores, lo cual es muy comun en citogentica, pues las tcnicas deben de ser ajustadas en ocasiones a las condiciones medio ambientales y especies conlas que se trabajan. Estas tcnicas al igual que las de obtencin de cromosomas sern motivo de prcticas en el laboratorio, es decir, implicaran tutoras presenciales.
Tcnicas de Bandeo en Cromosomas Animales (Tomado de Henao y Gmez, 1999) Tcnicas de coloracin selectiva Bandeo CBG Las bandas CBG (bandas C por Hidrxido de Bario usando Giemsa como colorante) son logradas mediante una tcnica de coloracin selectiva que permite identificar aquellas zonas del cromosoma formadas por heterocromatina constitutiva, localizada regularmente en los centrmeros. Este procedimiento fue originalmente descrito por Arrig y Hsu (1971) y consiste en un tratamiento de denaturacin del DNA cromosmico mediante Acido Clorhdrico e Hidrxido de Sodio, seguido por una incubacin en solucin salina Citratada. Posteriormente Sumner (1972) modific la tcnica reemplazando el Hidrxido de Sodio por Hidrxido de Bario que por ser ms suave permite mejor control sobre el proceso de denaturacin del DNA. La produccin de estas bandas se debe a que en las zonas negativas se pierde el DNA por depurinacin y denaturacin ocasionadas por el cido y el lcali, seguidas de fragmentacin y remocin por una solucin salina Citratada. Con leves modificaciones se describe enseguida la tcnica de Sumner (1972).
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Lminas envejecidas se cubren, en posicin horizontal, durante 60 minutos, con cido Clorhdrico 0.2 N, a temperatura ambiental, preparado mezclando lo siguiente: - 8.62 ml de cido clorhdrico de 1.19 Kg/L, de gravedad especfica, y 37% de concentracin - 991.38 ml de agua destilada Se lava con abundante agua desionizada y se deja secar al aire libre. Las lminas se cubren, en posicin horizontal, con Hidrxido de Bario al 5% en agua destilada, recin preparado, por espacio de 30 40 minutos Se lava con abundante agua desionizada Se incuban las lminas en 2XSSC precalentado a 60 65oC por 2 horas. Lavar con abundante agua desionizada y dejar secar al aire libre Cada lmina se cubre con la siguiente mezcla: 4.5 ml de agua destilada 0.25 ml de buffers fosfato (0.06 M) pH 6.8 0.25 ml de colorante Giemsa recin filtrado
El tratamiento se prolonga durante 25 30 minutos y luego se lava con abundante agua desionizada. Las lminas se dejan secar al aire libre y se les pega laminilla.
Bandeo G y R La tcnica bsica corresponde a Seabright (1971, 1972), y con leves modificaciones, se presenta a continuacin. Se colocan lminas envejecidas en Solucin Salina Nitratada 2X (2XSSC) precalentada a 57oC por 30 minutos, con el fin de eliminar restos citoplasmticos de la preparacin. La 2XSSC se prepara mezclando los siguientes componentes:
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17.5 g de Cloruro de Sodio 8.8 g de Citrato de Sodio Dihidratado 1 L de agua destilada Se recomienda usar slo solucin recin preparada. Despus del tratamiento anterior se lavan las lminas con abundante agua desionizada y se dejan secar al aire libre. Las lminas secas se introducen en una solucin de Tripsina al 0.1%, preparada en solucin de Cloruro de Sodio al 0.9% en agua destilada, a temperatura ambiental durante 10 segundos. La accin de la Tripsina se detiene lavando con abundante agua desionizada. La lmina se deja secar al aire libre. Cada lmina se cubre con una mezcla compuesta por: 4.7 ml de agua destilada 0.2 ml de Buffer Fosfato (0.06 M) pH 6.8 0.1 ml de colorante Giemsa recin filtrado Este tratamiento se prolonga por 7 8 minutos al cabo de los cuales se lava con abundante agua desionizada. La lmina se deja secar al aire libre y se le pega laminilla como se describi en la tcnica anterior. En este momento las bandas GTG est listas para ser evaluadas al microscopio. Henao y Gmez, 1999
Bandeo R Lminas envejecidas de 1 a 3 semanas se incuban a 85 oC por 8 minutos (Las lminas ms viejas requieren menos tiempo de incubacin) en buffers Sorensen (0.06 M, pH 6.5) precalentado en bao Mara a 85 oC. El buffers Sorensen se prepara de acuerdo con la siguiente frmula: 5.6 g de fosfato monobsico de Potasio
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2.64 g de fosfato dibsico de Sodio 1 L de agua destilada
Lavar las lminas con abundante buffers Sorensen a temperatura ambiente. Colorear con Giemsa al 5% por 6 a 10 minutos, lavar con abundante agua desionizada y montar laminilla.
Bandeo NORs Con pipeta Pasteur se colocan sobre una lmina envejecida dos gotas de Solucin de Gelatina, preparada as: 2 g de Gelatina 100 ml de agua destilada 1 ml de cido Frmico
La solucin de gelatina se distribuye, sin raspar la lmina, con una laminilla cubreobjetos para cubrir completamente el material goteado en la lmina. Sobre la solucin de Gelatina se dejan caer, con pipeta Pasteur, 4 gotas de Nitrato de Plata al 50% en agua destilada; se mezcla bien con la misma laminilla usada en el paso anterior y finalmente se cubre la mezcla con esta misma laminilla. La lmina se lleva a un horno precalentado a 70 oC y se coloca all, sobre la superficie de una bandeja esmaltada, de color blanco precalentada a la misma temperatura; este tratamiento debe durar alrededor de 75 segundos, tiempo suficiente para que la preparacin tome una coloracin amarillo-marrn. Se lava la lmina con abundante agua desionizada para eliminar la laminilla y los restos de reactivos. Se deja secar al aire libre y se le pega laminilla. Coloraciones en secuencia Coloracin secuencial de bandas GTG y bandas Ag-NOR
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Finalmente es importante anotar que la evaluacin de algunos casos se hace con mayor facilidad mediante combinaciones de bandeos, como es el caso de la combinacin de bandas GTG y Ag.NOR. El procedimiento se desarrolla de acuerdo con el protocolo de Howell Y Black (1978) con leves modificaciones. Lminas envejecidas se colorean de acuerdo con la tcnica de bandas Ag-NOR descrita anteriormente. Enseguida se cubren, en posicin horizontal, con la mezcla siguiente: 0.3 ml de Tripsina al 2.5% en solucin salina 50 ml de Hanks BSS, 1X libre de Calcio Magnesio y Rojo Fenol Este tratamiento se debe realizar a 20oC durante 3 5 minutos. El Hanks BSS, IX se prepara mezclando: 1 L de agua destilada 0.4 g de Cloruro de Potasio 0.06 g de Fosfato Monobsico de Potasio 8 g de Cloruro de Sodio 0.04788 g de Fosfato Dibsico de Sodio 1 g de Glucosa 0.35 g de Bicarbonato de Sodio El pH de esta solucin debe ser ajustado a 7.3 Cada lmina se lava, durante 5 segundos con agua desionizada Posteriormente se introduce, por 30 se mundos, en Hanks BSS, 1X, con calcio, magnesio y rojo fenol. Este Hanks se prepara mezclando: 1 L de agua destilada 0.185 g de Cloruro de Calcio 0.09767 g de Sulfato de Magnesio Anhidro 0.4 g de Cloruro de Potasio
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0.06 g de Fosfato Monobsico de Potasio 0.35 g de Bicarbonato de Sodio 8 g de Cloruro de Sodio 0.04788 g de Fosfato Dibsico de Sodio 1 g de Glucosa 0.011 g de Rojo Fenol El pH de esta solucin debe ser ajustado a 7.4. Sin dejar secar, se cubre cada lmina con una mezcla compuesta por: 4.7 ml. de agua destilada 0.15 ml de Buffers Fosfato (0.06M) pH 6.8 0.15 ml de colorante Giemsa recin filtrado La coloracin se prolonga por espacio de 5 10 minutos y luego se practica un lavado con agua desionizada abundante y se dejan secar las lminas al aire libre. Finalmente se pega laminilla.
Tcnicas de Bandeo Cromosmico (Tomado de Jimnez, 2000) Para cada muestra, se gotea un promedio de 10 lminas, de las cuales a dos se les hace la tincin convencional para llevar a cabo el conteo de cromosomas y el anlisis morfolgico y cualitativo preliminar. Las restantes preparaciones se someten a maduracin a temperatura ambiente en oscuridad y se pueden realizar las tcnicas de bandeo cromosmico.
Bandas F (GTG) (Howell y Black, 1978) Reactivo Solucin de Tripsina (2.5% Difco). Se adicionan 0.3 ml de solucin de tripsina a 50 ml de Hanks HBSS sin Ca, Mg ni rojo fenol, a temperatura ambiente (IO C).
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Solucin Hanks HBSS con Ca, Mg y rojo fenol. Procedimiento Se utilizan lminas de 5 7 das de goteadas. Se cubren con solucin de tripsina en Hanks sin Ca, Mg ni rojo fenol durante 3 5 minutos a temperatura ambiente (20oC). Se lavan durante 5 segundos con agua desionizada y se sacuden. Se cubren con solucin Hanks con Ca, Mg y rojo fenol durante 30 segundos a temperatura ambiente (20oC). Se sacuden las lminas e inmediatamente se tien durante 10 minutos con una solucin de Giemsa al 3%.
Colorante para una lmina 4.85 ml de Buffer Fosfato pH 6.8 0.15 ml de colorante Giemsa recin filtrado Se lavan con agua desionizada y se dejan secar al aire. Se montan con ENTELLAN( despus de deshidratar con Xilol.
Bandas C (CBG) (Sumner, 1972) Procedimiento Se tratan lminas de 4 das de goteadas. Se sumergen en HCI (cido clorhdrico) 0.2 N por 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las lminas con agua destilada a chorro. Se colocan las lminas en un frasco Coplin con solucin de hidrxido de Bario, [Ba(OH)2] al 5% durante 7 a 8 minutos a 56oC. Se lavan rpidamente. Se incuban las lminas en solucin salina de sodio y citrato (2XSSCX) durante 1 hora a 53oC. Se lavan las lminas con agua destilada o desionizada. Se tien con Giemsa por 30 minutos.
Colorante para una lmina 4.5 ml de agua destilada 0.25 ml de Buffer Giemsa (pH 6.8) 0.25 de colorante Giemsa recin filtrado. Se lavan con agua destilada y se dejaron secar al aire.
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Se monta la preparacin permanente con EntellanR.
Bandas R (RBG) (PAI y Thomas, 1980) Procedimiento A cada frasco de cultivo de 5 ml se le adiciona 0.1 ml de 5Bromodeoxiuridina (BrdU), 7 horas antes de completar el perodo de incubacin. Se utilizan lminas de 2 3 das de goteadas. Lminas se colocan en una solucin de bisBenzimide (Hoechst 33258 Trihydrochloride de SIGNAR) durante 30 minutos. Se lava con agua desionizada y se sacude suavemente. Se adiciona a las lminas 8 a 10 gotas de Buffer Mclivaine a pH 6.85. Se expone a radiacin con lmpara de vapor de mercurio de 100 watt a 52oC durante 1 hora, en cmara hmeda y cubierta con laminilla Se dejan enfriar las lminas durante 5 minutos, se retiran las laminillas lavando con agua desionizada. Se colorean con una solucin Giemsa al 5% durante 10 minutos.
Colorante para una lmina 4.75 ml de Buffer Bandas R a pH 7.2 0.25 ml de colorante Giemsa recin filtrado. Se mont una preparacin permanente con EntellanR.
Bandas NOR (NOR-GTG. (Howell, Denton y Diamond, 1975 y 1978). Reactivos Solucin A Revelador coloidal. g de gelatina pura USP en 100 ml de agua desionizada. 1 ml de cido frmico
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Se disuelve la gelatina en el agua en agitacin constante a 37 oC durante 10 minutos, al cabo de los cuales se adiciona el cido (la solucin permanente estable por 2 3 semanas). Solucin B Solucin acuosa de nitrato de plata. 0.5 g de AgNO3 en 1 ml de agua desionizada.
Estas dos soluciones deben conservarse en frascos oscuros y/o cubiertos con papel de aluminio, en nevera a 4oC la solucin B y a temperatura ambiente la solucin A. Procedimiento Colocar las lminas en un soporte de varillas de vidrio. Adicionar 2 3 gotas de la solucin coloidal reveladora en cada lmina y distribuir la solucin suavemente con laminillas para evitar la impregnacin excesiva del colorante. Agregar 4 gotas de solucin de nitrato de plata y mezclar las soluciones dejando caer y levantando varias veces la laminilla sobre la mezcla. Dejar caer completamente la laminilla. Incubar a 67oC durante 2 minutos colocando la lmina sobre una bandeja esmaltada previamente precalentada a 67oC. En 30 segundos la mezcla se torna amarilla y en 2 minutos la lmina toma un color dorado oscuro. Retirar de la incubadora y lavar con agua desionizada. Dejar secar al aire y montar en Entellan (Merck) despus de 5 minutos en Xilol. Los cromosomas pueden ser contrastados con tincin Giemsa durante 2 minutos. Aplicar la tincin de bandas G (GTG) para la identificacin inequvoca de los cromosomas portadores de los NOR, segn el protocolo antes descrito. Si los cromosomas han sido sobreteidos con plata la aparicin de las bandas G se bloquea (Howell y Black, 1978).
Bandas Q (Casperson, 1979) Procedimiento Quinacrina dihydrochloride al 0.5% en agua destilada. 25 mg de Quinacrina en 50 ml de agua destilada. Colorear la lmina por 15 minutos y lavar con agua corriente.
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Para mirar al microscopio con luz ultravioleta, se utilizan laminillas en buffer fosfato pH= 6.8 7.0; tambin se puede utilizar agua destilada. No hay requisito de envejecimiento de lminas. Debe realizarse el registro fotogrfico con pelcula de asa 400. -
Leccin 19: Tcnicas de Bandeo en Cromosomas Vegetales (Prctica de laboratorio) Tomado de Fukui y Nakayama, 1996) Protocolo para Banda C Aqu se describe detalles de losprotocolos para banada C segn Gill et al. El cual ha sido modificado despus por Giradles et al. Y rutinariamente es utilizado en el laboratorio con excelentes resultados y en varias especies de plantas. 1. Germinar las semillas en platos de petri con papel filtro durante 3 a 4 das. 2. Colectar las raices de 1.5 a 2.5 cm de longitud y pretratarlas con 0.05% de colchicina durante 3 horas a temperatura ambiente. Preparar solucin de colchicina disolviendo 0.5 g de colchicina en 100 ml de agua destilada. Esta solucin Stock puede ser guardada por varios meses y puede ser diluido 1:9 con agua antes de usarla Nota: Los resultados de ndice mittico con pretratamientos de colchicina es mucho ms bajo que los obtenidos con pretratamiento de agua congelada,,pero la morfologa de los cromosomas y contraste de bandas es mucho mejor. 3. Fijar en etanol: cido actico glacial (3:1) por 1 hora, las metafases pueden ser conservadas por varias semanas o meses a 4 C. Para cromosomas meioticos fijar las anteras en estado de divisin con pretratamiento de etanol: cido actico glacial.(3:1) 4. Realizar el aplastamiento en cido actico al 45%. De 2 a 3 minutos antes someterlos el tejido a pretratamiento con cido actico, posteriormente chequear las metafases al microscopio. 5. Remover la lmina y secarla al aire 6. Introducir la lmina inmediatamente dentro de etanol 99%, las lmimas pueden permanecer en etanol toda la noche y ser coloreadas al da siguiente. 7. Secar las laminas por varios minutos.
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8. Incubar las lminas por 2.5 minutos en 0.2 N Hcl en bao Mara a 60 C . Preparar la solucin Stock de HCl 2N con 83.3 ml de HCl concentrado por 500 ml de agua destilada y diluir 1:9 antes de usar, para obtener una solucin de 0.2 N. Nota: e tiempo y la temperatura de el tratamiento es critico para obtener buen contraste en las bandas 9. Lavar con suficiente agua 10. Encubar las laminas por 7 minutos en Ba(OH) 2 a temperatura ambiente. Preparar la solucin saturada de Ba(OH)2 en agua destilada y agitarla por 30 minutos a temperatura ambiente y filtrarla antes de utilizarla Nota: la solucin debe ser fresca cada vez que se utilice. 11. Lavarla con cuidado en agua destilada 12. Encubar las lminas por 1 hora en 2X SSC en bao Maria dentro de la solucin por 1 hora. Para preparar solucin Stock 20 X SSC , mezcle 88.2 g sodio tri-sodio.citrato 2-hydrate y 175.3 de cloruro de sodio por litro de agua destilada. Nota : esta solucin puede permanecer por varios meses. Diluir 1:9 con agua destilada antes de usar par obtener la solucin de tratamiento de 2XSSC. 13. Coloque las placas directamente de la solucin 2XSSC dentro de la solucin colorante con una solucin de Giemsa en Buffer fosfato pH 7.2. 14. Lave rapidamente las laminas con agua destilada y squelas al aire. 15. Para tener una lminas permanentes colocarlas en xileno y pegarlas con solucin de Permount. Las lminas pueden permanecer por varios aos sin perder contraste.
Protocolo para Banda NORs El protocolo descrito es el que se usa rutinariamente y los resultados son satisfactorios. En Vicia faba la coloracin es exclusiva para las regiones organizadoras nucleolares. 1. Pretratamiento de los pices de las races con agua congelada por 24 horas 2. Fijar en etanol-cido actico glacial (3:1) a temperatura ambiente por 1 3 das, este se puede congelar hasta el momento de utilizarlas. 3. Colorear los pices en 1% de aceto-carmin por 1-2 horas a temperatura ambiente o por toda la noche en congelacin. Para preparar la solucin de aceto carmin al 1% mezclar 1% de carmin en 10 ml de cido actico 45% y agitar por toda la noche, la solucin se guarda sin ser filtrada y puede utilizarse por varios aos. 4. Realizar el squash en cido actico al 45% 5. Colocar la lmina en una nevera a 80 C por 3 minutos
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6. Encubar las lminas en cido actico 45% caliente por 3 minutos en bao Maria a 50 C 7. Trasladar las lminas a etanol 95% a temperatura ambiente por 10 minutos. 8. Las lminas se secan toda la noche. Despus de 1 a 8 dias las laminas pueden ser utilizadas para banda C.
Protocolo para Banda G El siguiente protocolo es segn Yang y Zhang, el cual es usado para inducir tipo de banda G en centeno, cebada y frijol. 1. Usar tratamiento fro a 4 C por 12-24 horas, cuando las races tengan mas o menos 1 cm de largo. 2. Fijar el meristemo apical en etanol:cido glacial (3:1) por 0.5 h. 3. Lave rpidamente con agua 4. Digerir el meristemo con 3% de celulosa y 3% pectinasa (disolver en aguan destilada) por 2 3 horas a 25 C. 5. Lavar rpidamente con agua destilada.+ 6. Descartar el agua y colocar los meristemos en un plato 7. Adicional una cantidad considerable de fijador para producir la suspensin celular. 8. De 8 a 10 gotas se colocan sobre una lmina. que ha estado congelada 9. Fije al calor, esto permitir que haya una mejor expansin de los cromosomas, luego seque al aire las laminas por una semana. 10. Encubar las laminas en solucin 1% EDTA-tripsina (contiene 8 g de NaCl, 0.4 g de KCl, 1g de glucosa, 0.6g de NaHCO3, 0.1 g de tripsina, y 0.2 g de EDTA por 100 ml de agua destilada) por 5 a 8 minutos a 34 C. 11. Lavar brevemente con agua destilada. 12. Colorear con solucin Giemsa (1:20) por 5 minutos.
Leccin 20: Determinacin nmero cromosmico y nmero fundamental (Prctica de Laboratorio) El complemento cromosmico diploide, 2n se determina en aquellos ejemplares que presentan mayor ndice mittico En un equipo de vdeo conectado a un microscopio Leitz se hace lectura de las lminas en 3 recorridos horizontales hasta contabilizar entre 20 a 50 metafases por ejemplar. Se debe de observar y anotar las posibles perdidas o ganancias de cromosomas; Lo importante en el momento de conteo cromosmico es escoger aquellas
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metafases se encuentren completas, es decir que no se observe que estn incompletas por accin de la solucin hipotnica La decisin de contar 20 50 metafases se hace en el momento de la lectura de las lminas si en el momento de contar 20 metafases la variacin entre los diferentes metafases es representativa determinacin se procede a continuar con el conteo y llegar a 50 metafases. A continuacin se muestra como ejemplo la tabla correspondiente en la determinacin del nmero cromosmico en las especies Pseudoplatystoma sp: En la determinacin del nmero modal se contabiliza la totalidad de las diferentes entidades cromosmicas si sobrepasan el nmero modal propuesto, en ocasiones deben de realizarse un anlisis microscpico ms minucioso para aclarar el porque de la variacin; en ocasiones puede corresponder a fragmentos cromosmicos acntricos origen de fragilidad cromosomica y/o presencia de cromosomas supernumerarios o cromosomas B. Por su parte el nmero fundamental corresponder al numero total de brazos presentes en aquellas metafases completas.
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CAPITULO 5: LECTURA Y ANLISIS DE LMINAS
Introduccin En este capitulo se darn las directrices necesarias para realizar los diferentes pasos en la determinacin de nmero cromosmico y elaboracin de los cariotipos en Giemsa y bandas al igual que de los ideogramas respectivos, es decir es totalmente practico y de atencin personalizada.
Leccin 21: Clasificacin de cromosomas y elaboracin de Cariotipo Giemsa e ideograma (Prctica de Laboratorio) CARIOTIPO En esta leccin se elaborara el cariotipo correspondiente a la coloracin Giemsa, pero para esto es importante aclarar el concepto de cariotipo, pues esto permitir trabajar minuciosamente en la consecucin del mismo. Cariotipo es el conjunto de cromosomas ordenados y colocados por parejas en cromosomas homlogos. Se disponen en diferentes categoras dependiendo de la clasificacin segn posicin de centrmero, adems dentro de cada una de las categoras estn organizados por tamao en forma descendente. A continuacin se dan las directrices para la elaboracin del cariotipo (tomado de Camacho 1999)
CLASIFICACION DE LOS CROMOSOMAS Se localizaron 50 metafases para cada una de las especies. Se establecen las estructuras bsicas del cromosoma: brazos, centrmero y telmeros en un microscopio con un aumento ptico 1000X y un programa de digitalizacin de imgenes. Se imprimen las imgenes escogidas y se miden los brazos de los cromosomas con un calibrador de precisin 0.025 mm. Los datos son procesados en hoja de clculo Excel 7.0. Posteriormente los cromosomas se clasifican segn el ndice relacin de los brazos, entendindose ste como la longitud del brazo largo dividido sobre la longitud brazo corto. Las categoras metacntricos para los valores entre 1 - 1.7; submetacntricos entre 1.7 3; subtelocntricos entre 3 7; acrocntricos 7. Se corrobora sta clasificacin con el ndice centromrico, entendindose ste como la longitud del brazo corto dividido sobre la longitud total
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del mismo cromosoma X 100. Las categoras metacntricos para los valores entre 50 37.5; submetacntricos 37.5 25.0; subtelocntricos 25.0 1.25 y acrocntricos 12.5 (Levan, 1964).
ELABORACION DEL CARIOTIPO Se estima la longitud relativa de cada uno de los cromosomas en cada metafase. Se define como longitud relativa, a la longitud de un cromosoma con relacin a la longitud total del complemento diploide. Para Delgado et al (1992) Hrl = RL x 1000 Dcl / 2 En donde Hrl =Longitud relativa haploide de un cromosoma o de un brazo en particular; RL = longitud real medida en el cromosoma o en el brazo; Dcl = longitud del complemento diploide, obtenido con la sumatoria de todos los cromosomas o de los brazos de una metafase especfica. esto se considera el criterio de
Leccin 22: Lectura lminas con tratamientos bandas cromosomicas (Prctica de Laboratorio) Al igual que en la determinacin del nmero cromosmico, se hace necesario la lectura de las lminas en busca de las mejores metafases, que corresponden a aquellas en donde no estn superpuestos los cromosomas y que el nmero de cromosomas sean acordes al nmero definido como 2n. Es de gran importancia recalcar que las metafases escogidas sern aquellas que cumplan con todas las expectativas de contraste y definicin de las diferentes bandas, es decir, por ejemplo si se trata de Banda C que sta se encuentre lo suficientemente definida y el contraste entre las tonalidades de Banda C positiva y Banda C negativa sean las necesarias para poder establecer los patrones de Banda; para cada una de las bandas se harn mencin en su momento al observarlas en laboratorio.
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Leccin 23: Elaboracin de cariotipo con bandas (Prctica de Laboratorio)
Despus de escoger las mejores metafases, sern digitalizadas y se identificaran con precisin los pares de cromosomas homlogos para elaborar el cariotipo se utilizara como base el obtenido en Giemsa, de la misma forma se distribuirn los cromosomas en grupos Metacentricos, Submetacentricos, Subtelocentricos y Acrocentricos dispuestos de mayor a menor longitud en cada una de las categoras. Tambin seran elaborados ideogramas correspondientes a los patrones de bandas.
Leccin 24: Tcnicas de Fluorescencia in situ
Generalmente la Citogentica ha venido trabajando con la identificacin de los cromosomas por medio de las bandas cromosmicas, como se ha mencionado anteriormente; han sido muchas especies las que se han caracterizado por medio de estas tcnicas, pero sin embargo en ocasiones se hace necesario de incluir otro tipo de metodologas para la identificacin de los cromosomas. La Tcnica de Fluorescencia en Hibridizacin in situ es utilizada para poder localizar la posicin de genes dentro de los cromosomas o para localizar inequvoca los pares de cromosomas homlogos, y tambin es muy utilizado para identificar los cromosomas correspondientes a una especie en particular cuando se trabaja con hbridos en mejoramiento vegetal.
Principios Bsicos Una tcnica de hibridacin in situ (HIS) consiste bsicamente en apareamiento de determinado segmento de ADN o ARN con una secuencia de nucleotidos complementarios situados dentro de la clula, visualizando dentro de la clula la secuencia y situacin exacta. Para visualizar el segmento de ADN o ARN es necesario que este marcado con alguna molcula de fcil identificacin, funcionando como una sonda para detectar las secuencias complementarias de nucleotidos llamada secuencia blanco. O hbrido sonda/blanco que puede ser ADN/ADN ARN/ ARN o ADN/ARN. La Tcnica de hibridacin in situ a sido utilizada para localizar diversas secuencias de nucleotidos, como un gen de copia nica, molculas de ARN mensajero o ADN
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viral insertado en un cromosoma.(Guerra, 2004) adems de mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas (http://www.iqb.es/monografia/fichas/ficha033.htm) La tcnica esta basada en el hecho de que el ADN esta formado por dos hebra complementarias y que fcilmente pueden ser separadas en hebras simples o desnaturalizarlas y posteriormente naturalizarlas volviendo al estado final de duplex. Las sondas se "marcan" con molculas fluorescentes (p.ejemplo con biotina) o fluorescena). Durante la renaturalizacin del ADN se tiene una sonda complementaria disponible en forma de cintas cerca al cromosoma, para que la hibridacin in situ se pueda llevar a cabo, esto es en el lugar exacto en donde la secuencia ocurre naturalmente. Estas sondas se hibridan o unen al DNA complementario y, como estn marcadas con molculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se encuentran (fig 47) A diferencia de otras pruebas utilizadas para estudiar los cromosomas que requieren que las clulas se encuentren en divisin activa, la hibridacin fluorescente in situ puede ser llevada a cabo en clulas no activas. (http://www.iqb.es/monografia/fichas/ficha033.htm, Guerra, 2004)
Figura 47.Tcnica de hibridacin in situ(Tomado http://www.pathology.washington.edu/galleries/Cytogallery/insitu_cartoon.jpg)
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La sondas son secuencias de ADN aisladas que se encuentran representadas en cromosomas una nica vez o que aparecen en millares de copias en cada cromosoma. Estas secuencias pueden estar organizadas en el cromosoma en tandem, es decir, una seguida de otra formando bloques relativamente grandes de ADN blanco, o poder encontrar secuencias dispersas en los cromosomas, intercaladas o diversos otros tipos de secuencias. Las sondas utilizadas son de diferentes tipos, existen varias clases de ellas, se mencionaran dos puntos de vista para dicha clasificacin aun cuando no difieren grandemente. La FISH utiliza tres tipos de sonda (http://www.iqb.es/monografia/fichas/ficha033.htm) Sondas especficas de un locus: estas sondas se hibridan a una regin particular de un gen. Esta sonda es til cuando se ha aislado una pequea parte de un gen y se quiere averiguar en que cromosoma se encuentra. Sondas alfoides o centromricas: son sondas que contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas librerias de sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta manera, se consiguen imgenes en color que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas ms o menos oscuras. Esta tcnica es particularmente til para examinar anormalidades cromosmica.
Ahora mencionemos la clasificacin segn Guerra, 2004
Leccin 25: Tipos de Sondas Sondas de secuencias repetitivas organizadas en Tandem. Los primeros trabajos con HIS utilizaron como sonda secuencias de ADN que se encontraban en tandem. Entre esas las mas fciles de aislar y localizar fueron las ADNs satlite. O gen que codifica el ARN ribosomal 5S y una secuencia que codifica 45S de ARN ribosomal 28S, 18S y 5,8S generqalmente referidos como
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ADNr 5S y 45S respectivamente. Una caracterstica de la secuencia de los nucleotidos de estos genes es la alta conservacin evolutiva lo que significa que son muy similares en todas las eucariotas. Por ejemplo, una sonda de ADNr 45S producida a partir del genoma de trigo, denominada pTa71 (Gerlach y Bedbrook, 1979) puede ser utilizada para localizar Un ADN ribosmico, de otras secuencias repetitivas, organizadas en tandem y de funcin conocida, tambin ha sido ampliamente estudias, una de ellas y la mas conservada es una secuencia de ADN telomrico (Richards et al, 1993). Este ADN ocurre caractersticamente en regiones terminales de cada cromosoma, excepcionalmente se ha encontrado en otras regiones terminales de cada cromosoma, excepcionalmente se ha encontrado en otras regiones cromosmicas principalmente prximo a centromeros en algunos animales (Guerra,2004) y plantas (Guerra y Kenton, 1996; Kondo y Tagashira, 1998) Una segunda pero menos conservada evolutivamente, es una secuencia de ADN centromerica, que marca apenas una regin de centromeros. Una regin centromerica y particularmente compleja contiene generalmente gran diversidad de secuencias distintas (Tyler-Smith y Florida, 2000). Diversos otros tipos de secuencias repetidas en tandem tambin han sido utilizados como sondas, destacando los ADN satlites y microsatlites (HeslopHarrison, 2000) Un ADN satelite esta compuesto por unidades formadas por pocas centenas de pares de bases, repetidas un milln de veces o ms en cada genoma. Generalmente, un genoma eucariota presenta varias secuencias satlites diferentes, pudiendo ser algunas secuencias exclusivas de una nica especie o de un grupo de especies relacionados. Su localizacin generalmente coinciden con los bloques de heterocromatina detectados por la tcnica de bandeamiento por la tcnica de bandeamiento C. Entretanto diferentes bandas C o una nica banda C puede ser formados por diferentes secuencias satlites. Un microsatlites esta formado por unidades de 1-5 nucleotidos repetidas un nmero variado de veces en muchas regiones del genoma, algunos de estos sitios alcanzan un nmero de repeticiones suficientes para ser visualizadas por la hibridacin in situ.
Sondas de ADN repetitivo disperso Mas all de las secuencias repetitivas organizadas en tandem, hay un gran nmero de secuencias moderadas o altamente repetitivas dispersas a lo largo de los cromosomas. Estos secuencias estn generalmente relacionadas con
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elementos transponibles. En la mayora de las eucariotas, gran parte del genoma se deriva de elementos transponibles. Una secuencia ms abundante en el genoma humano, Alu, posee cerca de 280 pb formando un dimero con subunidades ligeramente diferentes. Esa secuencia esta representada por ms de un milln de copias esparcidas por todos los cromosomas, ocurriendo, en media, una copia cada tres kb (Strachan e Read, 1999) Las secuencias repetitivas dispersas son tan abundantes que cuando hibridizxan in situ, marcan uniformemente todo el genoma. Estas secuencias pueden ser utilizadas para distinguir cromosomas de una especie, en un hbrido interespecifico, o distinguir un genoma ancestral diploide en una especie alopoliploide. Por ejemplo en avena un hexaploide con 2n=42 se encuentra una secuencia repetitiva que marca igualmente un tercio (14) de sus cromosomas y marca tambin los 14 cromosomas de una especie prxima diploide. Esto sugiere que este diploide, es una especie muy prxima a uno de los dos ancestros de la avena hexaploide.
Sondas de secuencias nicas o de pocas copias. Con apropiados mtodos de aislamiento, amplificacin y deteccin de sondas, muchas secuencias nicas o de pocas copias han sido localizadas in situ. Esas secuencias pueden ser una copia complementaria de un ARN mensajero , un clon de una biblioteca geonmica, o ADN viral insertado no cromosmico, fragmentos de restriccin de tipo RFLPs, etc. El pequeo tamao es el principal factor limitante para detectar las secuencias de copia nica, pero son diferentes las estrategias que se han desarrollado para detectar este tipo de secuencias (Pedrosa et a., 2002,2003).
Sondas Genomica Una secuencia genomica esta constituida por un gran nmero de secuencias nicas y repetitivas, funciona de la misma manera que una secuencia reptitiva dispersa por todo el genoma, marcando todos los cromosomas por igual, con la ventaja de ser ms fcilmente obtenida. Esta tcnica se conoce como hibridacin genomica in situ GISH, a sido utilizada en el anlisis de hbridos interespecificos o estudios evolutivos de diversas especies poloploides (Stace y Bailey, 1999) En animales una sonda genomica tambin puede ser utilizada pero tiene mayor uso en estudios de poliploides, es decir en plantas.
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Por ejemplo, para distinguir cromosomas de dos especies que darn origen a un tetraploide original como el tabaco el ADN total de uno de los dos supuestos diploides es extrado, marcado e hibridizado con uno de los cromosomas del poliploide. Como uno de los dos genomas que forman un hbrido interespecfico generalmente son ms semejantes, el ADN marcado de uno de ellos podr hibridizar indistintamente con uno de los dos genomas. Para evitar eso , generalmente se adiciona un ADN marcado de una de las especies con un ADN de otra especie sin marcar y en concentracin ms alta. Este ltimo ADN funcionara como bloqueador o supresor de secuencias exclusivas de esta especie y de secuencias comunes a ambas. De esta manera apenas el genoma oriundo del diploide que esta siendo analizado aparecer marcado.
Sondas cromosmicas. Un conjunto de secuencias gnicas o no gnicas localizadas en determinado cromosoma puede ser reunido para formar una sola sonda capaz de pintar el cromosoma. Para eso es necesario de reunir un buen nmero de secuencias distintas y que estn distribuidas aleatoriamente por todo el cromosomas. De esta manera, fueron construidas sondas que marcan, distintamente, cada uno de los dos cromosomas humanos nmero 23 en toda su extensin. Esta tcnica se llama pintura cromosomica, ha tenido numerosas aplicaciones en citogentica clnica y en un estudio de evolucin de aves y mamferos. Estas tcnicas permiten tambin visualizar cromosomas en un ncleo interfsico, en donde se encuentran descondensados, formando territorios cromosmicos individualizados. Las sondas de tipo pintura son tambin conocidas para algunos otros mamferos, aves y drosophyla (Fush et al., 1998; Griffin et al., 1999). En plantas no ha sido posible aun pintar cada uno de los dos cromosomas de un cariotipo distintamente, adems no se conoce pinturas para algunos cromosomas (Schubert et al., 2001)
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CAPITULO 6: APLICACIONES DE LA CITOGENTICA Introduccin En el siguiente capitulo se encontrar una introduccin y algunas aplicaciones de las aplicaciones de la citogentica en el campo del diagnostico cromosmico. As, que este capitulo lo que fortalecer en los estudiantes es la fase de profundizacin ya que en el podrn darse una idea de la importancia de la citogentica y verla como una alternativa en el mejoramiento gentico. A continuacin se presentaran varios resmenes tanto de paginas Web como de artculos cientficos, cada uno de ellos sern debidamente referenciados bibliogrficamente Estos resmenes hacen parte entonces de los captulos 25 al 30. Los avances logrados durante este siglo XX en las reas de la citologa, la gentica y la bioqumica, han permitido desarrollar el rea en la "Citogentica". El principal objetivo de esta ciencia ha sido el estudio de las bases citolgicas que pudiesen explicar satisfactoriamente los fenmenos hereditarios. A su vez los recientes avances de la biologa molecular orientan esta rea hacia la citogentica molecular (http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/bandeos.htm).
Leccin 26: Tipos de heterocromatina en animales 1. Variabilidad cuantitativa del contenido de heterocromatina constitutiva (CBG) en el cariotipo del zorro azul ("alopex lagopus") Autores: J. Komisarek, K. Kiewel, M. Switonski, 1996 Resumen: El cariotipo del zorro azul (2n=50) tiene veinte cromosomas (diez parejas) con un brazo enteramente heterocromtico. Se ha descrito la variabilidad de tamao en estos brazos en cromosomas da bandeo CBG (Makinen et al., 1981) y utilizando anlisis complejo sinaptonmico (Switonslci et al., 1991). En el presente trabajo, 49 animales han sido bandeados con CBG. Se describen cuatro cariotipos distintos. En el primero los veinte cromosomas tenan brazos heterocromticos (grupo 1; 26 animales); en el segundo se encontr una carencia de brazo heterocromtico en un solo cromosoma (grupo 2; 15 animales); en el tercero, dos cromosomas no presentaron este brazo heterocromtico (grupo 3; 5 animales); y
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en el cuarto, en tres cromosomas faltaban brazos heterocromticos (grupo 4; 3 animales). Nuestra meta en el presente trabajo fue esclarecer si el tamao total de brazos CBG de estos cromosomas es constante o variable en esta especie. La longitud de los brazos heterocromticos y eucromticos de 10 parejas de cromosomas han sido medidos con el sistema de ordenador Multiscan 4.01 (Computer Scanning Systems Ltd, Poland), que estaba conectado a un microscopio Jenamed. En cada animal han sido analizadas tres metafases. La longitud relativa total de brazos CBG vari, entre los animales, de 0,53 a 1,04. Un anlisis de varianza unimodal demostr que esta variabilidad era significativa (p<0,01). La longitud total media de brazos CBG en cuatro grupos distintos era: 0,64, 0,75, 0,65 y 0,67 repectivamente. La aplicacin del anlisis de contraste demostr que la diferencia entre estos grupos, con la excepcion de grupo 4 vs grupo 3, era significativa (p<0,01 o p<0,05).
2. Homologis y Reorganizaciones Cromosmicas. Mediante la comparacin de su patrn de bandas G, se han determinado las homologas cromosmicas de dos especies del gnero Cebus (C. apella y C. capucinus) y de diferentes especies del gnero Ateles (A. belzebuth hybridus, A. b. marginatus, A. paniscus paniscus y A. p. chameck). Esta comparacin ha permitido determinar las reorganizaciones cromosmicas que explicaran las homologas detectadas: 3 inversiones pericntricas en el caso de las especies del gnero Cebus y 4 inversiones pericntricas, una paracntrica y una fusin en el caso de Ateles. La aplicacin de la tcnica de ZOO-FISH y bandas G secuenciales utilizando las sondas de todos los cromosomas humanos completos, ha permitido determinar las homologas entre la especie humana (HSA), Cebus apella (CAP) y Ateles belzebuth hybridus (ABH). La comparacin de los cromosomas o segmentos cromosmicos homlogos de las especies comparadas, ha permitido determinar las reorganizaciones cromosmicas que explicaran las homologas detectadas, y las bandas implicadas en dichas reorganizaciones. Las reorganizaciones cromosmicas detectadas han sido: a) 11 fisiones, 10 fusiones, 12 inversiones pericntricas, 9 activaciones/inactivaciones centromricas y 3 inversiones paracntricas al comparar HSA y CAP; b) 19 fusiones, 11 fisiones, 18 activaciones /inactivaciones centromricas y 6 inversiones pericntricas al comparar HSA y ABH; y c) 17 fusiones, 11 activaciones/inactivaciones centromricas, 5 inversiones pericntricas, 3 fisiones y 3 inversiones paracntricas al comparar CAP y ABH. Se ha analizado la relacin existente entre las bandas implicadas en reorganizaciones cromosmicas evolutivas de la especie humana y de CAP con la localizacin de lugares frgiles y
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bandas sensibles al efecto de las radiaciones ionizantes en ambos cariotipos. Aplicando el test de la Ji cuadrado, se ha podido concluir que las coincidencias observadas no son estadsticamente significativas. Se ha determinado tambin el cariotipo ancestral de los Platyrrhini, as como las homologas de estos cromosomas ancestrales con los del cariotipo humano.
3. Anlisis Cualitativo de la Heterocromatina Constitutiva. Se ha realizado el anlisis cualitativo de la heterocromatina constitutiva de 15 especies de primates Simiiformes: Homo sapiens, Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Hylobates syndactylus, Macaca fascicularis, M. tibetana, Papio leucophaeus, P. sphinx, Cercopithecus aethiops, C. sabaeus, C. albogularis, Cebus apella, Ateles belzebuth hybridus, Aotus azarae y A. nancymai. Las tcnicas utilizadas para realizar este anlisis han sido: a) digestin in situ con los enzimas de restriccin AluI, HaeIII, RsaI y Sau3A y b) tincin con el par DA/DAPI en cromosomas sin bandeo previo, en cromosomas con bandeo C previo, y en cromosomas con bandeo G/C previo. La homogeneidad en la heterocromatina intersticial y terminal (HIT), y la heterogeneidad en la heterocromatina de localizacin centromrica (HC) observadas en la mayor parte de las especies analizadas, parece indicar un origen evolutivo relativamente reciente de la HIT e independiente del de la HC, que tendra un origen ms antiguo.
4. Estudio de la Heterocromatina en Cromosomas Fijados de Bvidos Domsticos (Bos taurus, Ovis aries y Capra hircus) Autor: Jos Luis Fernndez Garca
Universidad de Extremadura ( Espaa ) ISBN: 84-7723-397-7
Nmero de pginas: 352
Resumen: En el presente trabajo, hemos utilizado las tcnicas clsicas (bandeo-CBG y GTG), los bandeos fluorescentes secuenciales CDD y bandeos con endonucleasas de restriccin para estudiar, detectar y caracterizar la
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heterocromatina sobre cromosomas fijados de tres especies de bvidos domsticos, vacuno (Bos taurus, L.), ovino (Ovis aries, L.) y caprino (Capra hircus, L.). Hemos obtenido los cariotipos de bandeo-C, -G, -R, -QFH y NOR ponindose de manifiesto la conservacin estructural de los diferentes patrones de bandeo en los bvidos domsticos en estudio. Se han analizado las equivalencias cromosmicas entre ellas, permitindonos hacer una mejor descripcin de sus cariotipos y paliar las deficiencias puestas de manifiesto por otros autores en ovino y caprino. Con estas tcnicas se ha demostrado una localizacin, distribucin y composicin aparentemente homognea de la cromatina de la regin centromrica. Sin embargo, algunos trabajos mostraban que la heterocromatina puede presentar variaciones heteromrficas, siendo difcil identificar a los cromosomas implicados en estas variaciones. Esto fue una consecuencia de la ambigedad identificadora de la tcnica de bandeo-CBG en estas especies, sobre todo si tenemos en cuenta su gran nmero de cromosomas acrocntricos. Nuestros resultados con las tcnicas clsicas no difieren de los publicadas por otros investigadores. La composicin de la heterocromatina de las tres especies fue similar, como lo demuestran nuestras observaciones de cromosomas teidos con la tcnica fluorescente secuencial (CDD). As, la presencia de fluorescencia intensa con CMA3 sobre la heterocromatina centromrica mostr que contiene heterocromatina enriquecida en pares de bases GC. Adems, detectamos polimorfismos inter- e intraespecficos. Asimismo, el bandeo-R obtenido confirm que durante el proceso evolutivo tuvieron lugar pequeas modificaciones del patrn de bandas, que han sido utilizadas para separar la Subfamilia caprinae de la bovinae. Por otro lado, una mejor caracterizacin de la heterocromatina de los cromosomas fijados de los bvidos analizados en este trabajo ha sido obtenida por el tratamiento con Endonucleasas de Restriccin, produciendose bandeos informativos de las diferencias del ADN satlite contenido en las reas heterocromticas. Los efectos observados permitieron caracterizar diferentes fracciones de ADN satlite localizado sobre la heterocromatina constitutiva de los cromosomas del complemento de las tres especies. Endonucleasas como AluI y DdeI produjeron modelos de bandeo-C diferentes en bovino frente al de caprinos y ovinos, indicando diferencias de ADN satlite entre ambas subfamilias. Por otro lado, otras endonucleasas de restriccin produjeron patrones de bandeo -G o -C que diferan menos entre especies, salvo excepciones encontradas para los cromosomas sexuales. Por todo ello, bajo la heterocromatina
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subyace una organizacin estructural de las diferentes fracciones del ADN satlite que, en unos casos, han mostrado una intensa conservacin de las dianas de restriccin durante la evolucin y, en otros casos, se han mostrado fuertes divergencias. Estas divergencias han sido utilizadas por la evolucin como un camino cuyas ltimas consecuencias se desconocen en la actualidad. La aplicacin de bandeos clsicos de buena resolucin, bandeos de restriccin y la utilizacin de cromosomas marcadores para una o varias endonucleasas de restriccin junto con el apoyo de otras tcnicas tiles en produccin animal, serviran para determinar con mayor precisin si estas divergencias evolutivas tienen aplicaciones zootcnicas.
Leccin 27: Cambios cromosmicos en animales
5. Efecto de las Anomalas Cromosmicas Sobre la Fertilidad en Bovinos Corredor y Jimnez 2005 Las mutaciones cromosmicas son variaciones en el nmero o la estructura de los cromosomas normales de una especie, originadas durante el ciclo de divisin celular pudiendo generarse tanto en el tejido somtico como en el germinal. Como consecuencia se produce reduccin de la fertilidad o infertilidad en los animales portadores debido a la produccin de gametos no funcionales, mortalidad embrionaria, o anomalas en el desarrollo del sistema re productivo. Este artculo hace una revisin de las mutaciones cromosmicas reportadas con ms frecuencia en bovinos destacando su efecto sobre la reproduccin de los animales portadores y la transmisin a su descendencia.
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6. Translocacion Robertsoniana (1;29) en Bovinos Criollos Colombianos Snchez, Jimnez y Bueno 2006
Mediante anlisis cromosmico a partir de cultivos de linfocitos de sangre perifrica se detect la translocacin robertsoniana rob(1;29) en una muestra de 177 animales (110 hembras y 67 machos), de las siete razas bovinas criollas colombianas. El cromosoma t(1;29) fue identificado mediante la tcnica de bandeo cromosmico RBG. Se encontraron 2 toros y 2 hembras de la raza casanareo, 3 toros de la raza chino santandereano, 5 hembras y un macho de la raza romosinuano, portadores heterocigotos de la translocacin, y una hembra de la raza casanareo result homocigoto para la translocacin. El 8,9% de los individuos incluidos en el estudio presentaron la translocacin rob(1;29), con variaciones en la frecuencia entre las razas analizadas que oscilan entre 0 y 22.2%. Los animales heterocigotos portadores de la translocacin rob(1;29) son fenotpicamente normales, poseen una libido y aptitud para el servicio normal; sin embargo, presentan reduccin de la fertilidad debido a la produccin de gametos no funcionales y aumento de la mortalidad embrionaria.
7. Variacin cromosmica y de cantidad del genoma en poblaciones de Rhodnius pallescens (Hemiptera: Reduviidae) de Colombia A. M. Gmez1, M. A. Duque1, N. Jaramillo1, O. Triana1, R. Prez2, F. Panzera2, 3 1 Grupo de Chagas, Sede de Investigacin Universitaria (SIU), Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. 2 Seccin Gentica Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica, Montevideo, Uruguay. 3 Centro de Investigaciones sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI). Instituto Nacional de Salud Pblica (INSP). Cuernavaca, Morelos, Mxico. II Simposio Latinoamericano de Citogentica 2007
R. pallescens se distribuye desde Meso-Amrica hasta la regin central Colombia. En Panam esta especie es considerada el principal vector Trypanosoma cruzi, agente etiolgico de la enfermedad de Chagas, y uno de vectores secundarios de mayor importancia en Colombia. A pesar de
de de los su
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importancia epidemiolgica, el conocimiento de su variabilidad gentica a lo largo de su distribucin geogrfica es limitado. Tal variabilidad puede ser estimada mediante el uso de diferentes marcadores genticos, incluyendo anlisis cromosmicos y de la cantidad de genoma. El objetivo de este trabajo fue evaluar el grado de variabilidad cariolgica y el contenido haploide de ADN por clula de diferentes poblaciones de R. pallescens de Colombia. Se analiz el patrn de bandeo C de los cromosomas y el comportamiento meitico a partir de las gnadas de 81 machos de 12 poblaciones distribuidas en la costa caribe, el golfo de Urab y la regin central de la cordillera central andina de Colombia. La tincin se realiz con yoduro de propidio y se determin en citmetro de flujo Coulter Epics XL. La cuantificacin mediante citometra de flujo se aplic sobre 39 individuos a los que previamente se les haba analizado su patrn de bandeo C. Se usaron linfocitos humanos (2C= 6.436 pg) como control para estimar la cantidad haploide en picogramos de ADN (1C). Entre los resultados obtenidos 1) se identificaron 2 patrones cromosmicos o citotipos caracterizados por diferencias en la cantidad y distribucin de la heterocromatina constitutiva en el complemento cromosmico (2n=20 autosomas + XY en machos); 2) el citotipo A mostr entre 4 y 12 autosomas con bloques de heterocromatina que se localizan mayormente en uno de los extremos, con una cantidad relativa de ADN por clula haploide (C) de 0.65 + 0.04 pg; 3) el citotipo B presenta entre 14 y 16 autosomas con heterocromatina localizada en uno o ambos extremos, con un valor C de 0.71 + 0.03 pg. Este trabajo demuestra, por primera vez en el gnero Rhodnius, una importante variacin cromosmica y de contenido gentico al interior de R. pallescens, que se relaciona con el origen geogrfico
8. Estudio cariolgico preliminar del tigrillo, Leopardus tigrinus (Felidae), en Venezuela A. Clavijo1, M. Aguilera2 y T. Caldera3. II Simposio Latinoamericano de Citogenertica, 2007
RESUMEN De todos los carnvoros existentes, los felinos son los predadores ms especializados y eficaces. La especie Leopardus tigrinus pertenece a lo que se conoce como Linaje Ocelote y que actualmente se encuentra clasificada por la IUCN como casi amenazada, debido a la prdida del hbitat y cacera. Son escasos los conocimientos citogenticos de esta especie, por lo tanto el objetivo principal de este trabajo fue determinar el cariotipo y los patrones de bandas NOR
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de un ejemplar macho en cautiverio (Mrida, Venezuela) a partir de cultivos de linfocitos. El anlisis citogentico mostr un complemento cromosmico de 2n=36, FN=68. Los 34 cromosomas somticos son submetacntricos y el par sexual es metacntrico. La estructura cromosmica y el bandeo NOR muestran semejanzas con las otras especies del gnero Leopardus y con otros gneros de la familia Felidae.
Leccin 28: Caracterizacin citogentica de algunas especies animales
9. Caracterizacin Citogentica en Bfalos En el sector agropecuario de Colombia, se ha utilizado actualmente como una alternativa en este sector la cra de bfalos para la produccin de leche, ya que sta tiene una proporcin mayor en cuanto a protena y grasa, por lo cual la hace apta y muy apetecible para la elaboracin de productos lcteos derivados. En Fredonia (Antioquia) se llev a cabo una evaluacin cariotpica de bfalas para definirlas en cuanto a si pertenecan al grupo de bfalos de ro o de pantano, tambin se busc la existencia de hbridos, los cuales podran ser un obstculo al implementar programas de produccin de leche y carne que ofrecen, adems de ser muy eficientes en trabajos de traccin. Dotacin cromosmica A nivel mundial, se ha reportado que el bfalo de ro posee una dotacin cromosmica de 2n=50 y el bfalo de pantano 2n=48 (3). Tambin se ha reportado un hbrido subfrtil producto de las dos especies con un nmero cromosmico 2x=49 (3). En Colombia no existen registros que muestren con precisin el origen, la especie y la dotacin cromosmica de los bfalos que se encuentran en el pas a pesar de la existencia de cuatro grandes ncleos: el de la depresin Mompoxina, el de Ayapel (Crdoba), el del Valle del Cauca, el de Fredonia en Antioquia, el cual fue trasladado a finales del 2002 para Ayapel y el ncleo ms grande ubicado en el Magdalena Medio, administrado por el Fondo Ganadero de Caldas. Este estudio permitir determinar la posible existencia de hbridos entre las especies, requisito indispensable para establecer un programa de cra y mejoramiento de esta especie fornea, con el fin de evitar obstculos reproductivos que puedan causar erosin gentica en las dos especies posiblemente introducidas en nuestro pas.
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10. Caracterizacin Citogentica de Crocodylus acutus y Crocodylus intermedius en Colombia (Reptilia: Crocodylia: Crocodylidae) Autora: Camacho- Garzn, 2003 Tesis de Grado. Para Colombia se ha reconocido la presencia de nueve crocodileos entre especies y subespecies. De estas Crocodylus acutus, y Crocodylus intermedius, son consideradas en peligro de extincin, por lo cual se encuentran en apndice I de El Convenio sobre Comercio Internacional de Especies de Fauna y Flora en Peligro de Extincin (CITES); estas especies tienen una importancia econmica para las industrias peleteras, entre los aos 1920 y 1950 las poblaciones naturales fueron objeto de la caza indiscriminada para la explotacin comercial de su piel, la cual era muy cotizada en los mercados internacionales; esta situacin las llevo al punto denominado nivel de extincin comercial. En 1988 La Secretara de la Convencin CITES, asistida por el Grupo de Especialistas en cocodrilos de la Comisin para la Supervivencia de Especies de la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (IUCN/SSC/CSG), realiz una visita a Colombia, con el fin de evaluar, junto con las Autoridades Administrativas y Cientficas CITES de Colombia, el estado de desarrollo y aplicacin de la Convencin en el pas. El Gobierno Nacional dio en ese momento importancia a los programas de cra en condiciones controladas para especies de fauna silvestre, y en particular la de varias especies de cocodrilos, as que en 1992 se inicio el proyecto Estado, Distribucin, Sistemtica y Conservacin de los Crocodylia Colombianos con el propsito de evaluara las poblaciones naturales para C. intermedius y C acutus. La recuperacin de los Crocodylus en Colombia se convirti en un objetivo nacional, pues son especies estratgicas no slo desde el punto de vista econmico, a travs de su uso sostenible, sino ecolgico dada la importante funcin que ejercen en los ecosistemas acuticos de las tierras bajas de las reas en que solan encontrarse En 1999 el gobierno Colombiano formulo el proyecto titulado Conservacin de Crocodylus intermedius en Colombia y fue presentado a CITES en Lisboa Portugal y en la actualidad se desarrolla el proyecto Caracterizacin Gentica de las Poblaciones de las Especies del Gnero Crocodylus de Colombia dentro del Programa Diversidad Genmica y Gestin Sostenible de Fauna Silvestre adscrito al Departamento de Biologa y a la Estacin Roberto Franco de la Universidad Nacional de Colombia
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Teniendo en cuenta, entonces, la importancia econmica que tienen estas especies para Colombia, la disminucin de sus poblaciones naturales y los esfuerzos iniciados para procurar su conservacin, se propuso caracterizar citogenticamente a C acutus y C,. intermedius con el propsito de determinar los complementos cromsomicos y contribuir a la determinacin de la variabilidad gentica, que se constituye en uno de los aspectos claves para la recuperacin, la conservacin y el uso sostenido del recurso natural. Segn metodologa descrita por Camacho-Garzn y Burbano se realizaron cultivos celulares in vitro de linfocitos y se analizaron extendidos en coloracin Giemsa y patrones de bandas NOR, C y G. Los hallazgos citogenticos correspondieron para los dos especies a un nmero cromosmico 2n=32, frmula cariolgica 9:1:3:3 y un nmero fundamental de 58; los resultados coinciden con otros autores que han trabajado con el orden crocodylia. Pero con respecto a bandas cromosmicas no fue as. En el presente trabajo se determino como banda NOR caracterstica para C. intermediusla presencia de una constriccin secundaria en el par cromosmico 1 y 14 y una gran cantidad de precipitado de AgNO3 que se ubico principalmente en posicin intersticial en brazo largo del cromosoma 2; adems se estableci por primera vez fragilidad cromosmica en brazo corto del par cromosmico 2 Se observ banda C para C intermedius predominante en brazos largos de los pares cromosmicos 4, 5, 8 y 9, la presencia del cromosoma 16 que fue totalmente heterocromtico, adems de ausencia de banda para los cromosomas 7 y 10 ; la banda G correspondi principalmente a grandes bloques tanto en brazos cortos como largos en los cromosomas 5,6,7,8,9,10 y 11, adems se observo banda telomrica G negativa en brazo largo para el cromosoma 1. Para C acutus no se realizo tratamientos de bandas debido a la dificultad de consecucin del material biolgico, pero si se determino la presencia de fragilidad cromosomita para brazo corto del cromosoma 2, lo que representara la posibilidad de encontrar NOR activo al igual que lo observado en C intermedius. Los hallazgos encontrados en este trabajo permiten establecer una gran similitud entre los complementos cromosmicos de las dos especies y deja ver la posibilidad de hibridizacin entre C intermedius y C acutus. Sea cual sea la causa de la hibridizacin, natural o artificial, sta amenaza la integridad gentica de las especies, pues la hibridizacin se considera como un proceso en donde la diversidad gentica propia de cada especie se va perdiendo y aun ms cuando se trata de especies en exinticin y con propsito de programas de conservacin, como en el caso de C intermedius.
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Los resultados aqu presentados cumplen con los objetivos CITES para especies comerciales, ya que estos pueden ser usados para elaborar un plan de manejo de las dos especies.
11. Caracterizacin Citogentica y Relaciones Biogeogrficos en Poblaciones Colombianas de Pseudoplatystoma fasciatum y Pseudoplatystoma tigrinum (Pises:Siluriformes: Pimelodidae) Camacho-Garzn, 1999 Trabajo de Grado. Resumen En Colombia, el gnero Pseudoplatystoma con sus dos especies nativas Pseudoplatystoma fasciatum (bagre rayado) y Pseudoplatystoma tigrinum (bagre tigre) representan un pez de alto valor comercial debido principalmente a la calidad y exquisitez de sus carnes. En nuestro pas estas especies ocupan el segundo lugar en explotacin pesquera y el primero en varias regiones como el Magdalena y Cauca. Por la sobre pesca a la cual son sometidas las especies, se encuentran en un punto de riesgo para la renovacin natural, pues es muy significativo que el aporte de este pez a la captura total de la cuenca Magdalena-Cauca haya disminuido de 15.960 toneladas (37%) en 1977 a 366.01 toneladas (4.9%) en 1997. Con el propsito de comercializar el bagre rayado en el sector agropecuario, especficamente en la piscicultura y el de acostumbrar a los animales al consumo de alimentos concentrados se han iniciado varias programas de cra en condiciones controladas; adems entre los aos 1991 y 1994 se produjeron 37.000 alevinos de P. fasciatum los cuales fueron empleados en programas de fomento y repoblacin en la Cinaga de la Zapatosa, Cesar Colombia. En Colombia como en Venezuela se han llevado a cabo hibridaciones entre P. fasciatum y P. tigrinum y de estas especies con otras como Learius maratus; en tales procedimientos no se han tenido en cuenta las caractersticas genticas de las especies involucradas, aumentando no slo las prdidas econmicas y de tiempo sino tambin de material gentico; con la hibridacin se corre el riesgo de modificar procesos en la evolucin de las poblaciones naturales o silvestres, pues
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si el hbrido es liberado y se adapta al medio puede desplazar a sus progenitores llevndolos a la extincin de las especies parentales. Teniendo en cuenta, entonces, la importancia que tiene el gnero Pseudoplatystoma para Colombia a nivel econmico; la disminucin de sus poblaciones naturales; y el hecho, de no tener claridad en su clasificacin taxonmica se propuso caracterizar citogenticamente a, P. tigrinum P. fasciatum y sus poblaciones en Colombia. Segn metodologa estandarizada por Camacho-Garzn y Burbano se realizaron cultivos celulares in Vitro de linfocitos de peces. Se analizaron extendidos en colaboracin Giemsa y patrones de bandas NOR, C y G. Los hallazgos citogenticas corresponden para las dos especies a un nmero cromosmico 2n=56, frmula cariolgica 9:8:5:6 y un nmero fundamental NF=112; los resultados no son iguales a los reportados por otros autores quienes trabajaron en estas especies en Venezuela y Brasil, Quero y Kossowski (1883) analizaron 90 metafases en 3 ejemplares e informan un nmero cromosmico 2n=56 y frmula cariolgica 8:7:7:6 para P. fasciatum, Fenocchio y Bertollo (1992) analizaron 240 metafases en 6 ejemplares e informan un nmero cromosmico 2n=56, frmula cariolgica de 9:7:5:7 y 9:8:4:7 para P. fasciatum y P. tigrinum respectivamente. Las diferencias encontradas en este estudio corresponden principalmente al nmero de ejemplares (52) y metafases (1950) analizadas, adems se pudo apreciar mucho mejor los brazos cortos de los cromosomas subtelocntrico y acrocntricos para tratarse de cromosomas obtenidos a partir de cultivos celulares. Con respecto a las bandas cromosmicas, se determin como banda NOR caracterstica para P. fasciatum la presencia de banda intersticial en brazo largo de los cromosomas 1, 10 y 18; banda telomrica en brazo corto y largo de los cromosomas 10 y 18 respectivamente; y en el cromosoma 11 en donde la banda abarc la mayor parte del brazo corto. Para P. tigrinum la banda NOR correspondi a banda intersticial del brazo largo en los cromosomas 10, 18 y 23 en posicin telomrica en brazo corto del 10, en el cromosoma 11 la banda ocupa la mayor parte del brazo corto. Se estableci por primera vez marcadores citogenticas para especies en banda NOR, que correspondi ala presencia de banda intersticial en brazo largo del cromosoma 1 y 23 para P. fasciatum y P. tigrinum respectivamente. Se observ banda C para P. fasciatum en posicin centromrica en todos los cromosomas acrocntricos y algunos metacntricos adems banda telomrica en brazos largos de los cromosomas submetacntricos con excepcin del 11 y 16 y
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algunos subtelocntricos como el 20, 21 y 22. En P tigrinum la banda C correspondi a banda en todo el brazo corto de los cromosomas acrocntricos y de grandes bloques de heterocromatina en brazos largos de cromosomas metacntricos. Se estableci por primera vez banda G para estas dos especies y tambin para el Orden de los Siluriformes. Los hallazgos citogenticas en banda G corresponden a la ausencia de banda para P. fasciatum, muy probablemente porque la organizacin de la heterocromatina y eucromatina esta en pequeos segmentos no permitiendo la visualizacin de los isocoros; par P. tigrinum por el contrario si se observ patrones de banda G los cuales correspondieron a banda intersticial en todos los cromosomas, adems en cromosomas subtelocntricos y acrocntricos se encontraron tambin en grandes bloques abarcando gran parte de los brazos cromosmicos. Por otra parte, en trminos de evolucin, con los resultados observados en banda G se pueden postular dos hiptesis; la primera, que de un genoma como el de P tigrinum se haya derivado el de P fasciatum, para esto debi ocurrir integracin de secuencias repetidas eliminando los patrones de isocoros llevando a un patrn similar de no compartamentalizacin del DNA; por otra parte como segunda hiptesis, lo que pudo haber ocurrido fue que a partir de un genoma como el de P. fasciatum se haya derivado el de P. tigrinum ocurriendo un proceso de heterocromatizacin, por amplificacin de DNA altamente repetitivo, dando un patrn de compartamentalizacin del DNA. Tambin uno de los hallazgos ms importantes encontrados fue la caracterizacin citogentica de ejemplares hbridos entre P. fasciatum y P. tigrinum, los cuales fueron producto de reproduccin bajo condiciones controladas en una estacin pisccola. Estos ejemplares presentaron caractersticas diferentes a la de sus progenitores, se observ una inestabilidad cromosmica reflejada en una mayor fragilidad cromosmica y fusin telomrica. En el ejemplar H011MSM se observ un nmero cromosmico 2n=56 y frmula cariolgica de 9:8:5:6 igual a la de sus progenitores; el ejemplar H010MSM, present un nmero cromosmico 2n=56 y frmula cariolgica 9:7:7:5 diferente a la de sus progenitores. En el cariotipo banda C de na de las metafases del ejemplar H010MSM, se observ la presencia de tetrasoma del cromosoma 1 y prdidas inespecficas del 2, 26 y 27; el primer par del 1 y los pares 5, 6, 11 y 14 correspondieron a P. tigrinum y el segundo par del cromosoma 1 y el par 3, a P fasciatum. Los pares 10 y 12 podran corresponder a cualquiera de las dos especies progenitoras puesto que presentan el mismo patrn de bandeamiento. Este anlisis permiti una mejor apreciacin del proceso de hibridacin entre P.
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fasciatum y P. tigrinum. Los resultados encontrados en estos ejemplares fueron explicados por un modelo propuesto por primera vez para el proceso de la hibridacin, modelo no relacionado con ningn otro en Colombia. Adems se analiz un ejemplar de P. tigrinum del ro Amazonas, el nmero cromosmico fue de 2n=56 y frmula cariolgica 11:6:6:5; los patrones de banda NOR correspondieron a banda en posicin telomrica en todos los cromosomas. La banda C correspondi principalmente a banda en posicin telomrica en brazos largos y cortos de la mayora de los cromosomas y en posicin centromrica en algunos cromosomas metacntricos y submetacntricos. Los resultados no son similares a los encontrados en P. tigrinum del ro Meta no a los encontrados por Fenocchio y Bertollo (1992). Un hecho relevante, es que los hallazgos citogenticas encontrados en el ejemplar del ro Amazonas, pueden representar una variacin intrapoblacional al compararlos con el trabajo de Fenocchio y Bertollo (1992), la variacin tanto en frmula cariolgica como en banda C es notoria; estas diferencias son de gran importancia dado que los ejemplares muestreados por estos autores correspondieron a animales recolectados en el ro Solime Amazonas. Los hallazgos encontrados en este trabajo permiten recomendar tanto a Instituciones estatales como privadas adoptar los estudios citogenticas para la implementacin de futuras acciones respecto a la conservacin, manejo y utilizacin de estas y otras especies en las actividades de repoblacin o mejoras genticas, adems de recomendar un estudio citogentica en los ejemplares utilizados como parentales y en su progenie para evitar contaminacin biolgica que vaya en detrimento de las poblaciones naturales.
12. Aportes a la Estandarizacin de la Tcnica para Obtencin de Cromosomas de la Rana Colostethus subpunctatus (Anura: Dendrobatidae) Autoras: Corts y Rodrguez, 2004 Trabajo de Grado.
Resumen Los estudios citogenticos en los Anuros comenzaron desde los aos 70, en Colombia pocos de estos estudios se han realizado porque los citogenetistas han centrado sus trabajos en especies que tienen un inters de tipo comercial; adems
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por la falta de estandarizacin de tcnicas que hacen que el trabajo citogentico sea dispendioso. Sin embargo, estos estudios son importantes porque son una herramienta para definir estados taxonmicos de las especies y contribuyen a su conocimiento. El estudio de Colostethus subpunctatus es importante debido a que es una especie endmica de la zona de Boyac y Cundinamarca y es una de las tres especies que se puede encontrar en la zona urbana de Bogot, por tales razones el inters en esta especie ha aumentado. Recientemente se han realizado investigaciones sobre taxonoma, densidad poblacional y ecologa de la especie, sin embargo la citogentica no ha sido abordada, de manera que con este trabajo se contribuye a su conocimiento. Como resultado de este estudio se estandariz una metodologa para la obtencin de cromosomas a partir de crnea, que utiliza la inyeccin intraperitoneal combinada con la inmersin directa en colchicina, donde se obtiene un nmero de metafases adecuado para estudios citogenticos. Colostethus subpunctatus presenta un nmero cromosmico de 2n=24 y como frmula cariolgica 4M+8SM+10ST+2T, la cual determina un nmero fundamental NF= 46.
Leccin 29: Cariotipo en plantas
13. Algunos Principios Sobre Gentica y Citologa Arbrea (http://www.fao.org/docrep/03650s/03650s02.htm) KE GUSTAFSSON Y FRANOIS MERGEN
Resumen La citogentica proporciona las bases de la variacin inherente y es esencial para determinar la constitucin cromosmica y la naturaleza de la variacin gentica de las especies arbreas. Qu papel desempea la poliploidia y los cambios estructurales de cromosomas en variedad es y especies? Qu diferencias genticas resultan de cambios en el equilibrio cromosmico o de cambios estructurales y en qu medida se debe la variacin a mutaciones puntuales?
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Los gneros de gimnospermas con valor dasonmico tienen cromosomas grandes, la poliploidia es rara y los cariotipos dentro de los gneros son similares. En las Pinaceae los nmeros bsicos de cromosomas son 10, 11, 12 y 13, lo que ha inducido a Khoshoo a sacar en conclusin que el nmero bsico original era 10 y que los nmeros bsicos mayores han surgido por fragmentacin de cromosomas. Esto aparece claro en Pseudolarix y Podocarpus. El nmero bsico de 12 pares de cromosomas es caracterstico, sin embargo, de la mayora de los gneros de las Pinaceae, siendo posible que los gneros con nmeros bsicos inferiores se hayan originado por una unin de cromosomas derivada de una translocacin asimtrica. Se ha visto que la variacin del nmero bsico de cromosomas en ciertos gneros de angiospermas proviene de ambos fenmenos: fragmentacin y unin de cromosomas. Es rara la poliploidia en las Pinaceae, si bien los poliploides se dan en la naturaleza y pueden ser inducidos. Mergen descubri que tanto los poliploides espontneos como inducidos, se retrasan en crecimiento y tienen una baja supervivencia. Los prolijos experimentos de Hyun sobre poliploides inducidos en conferas proporcionan nuevos datos necesarios. KE GUSTAFSSON es Director del Instituto de Gentica Forestal, El Real Colegio de Montes, Estocolmo, Suecia. FRANOIS MERGEN es Profesor de Gentica Forestal, Universidad de Yale, Escuela de Montes, New Haven, Connecticut, E.U.A. Otros miembros del equipo de trabajo fueron G. Sirn (FAO) y K. Sax (E.U.A.), Jefe de la Seccin 1 de la Consulta quien prepar el resumen. El gran tamao de los cromosomas en las Pinaceae las hace muy sensibles a la radiacin ionizante. Hace ya muchos aos que Gustafsson averigu que dosis relativamente bajas de rayos X daaban las semillas de pino. Estos hechos deben ser tenidas en cuenta en la mejora gentica por mutacin y al comparar el valor relativo de la mutagnesis por radiacin y qumica. Contrastando con las gimnospermas, los gneros de angiospermas de valor forestal varan mucho en el nmero bsico de cromosomas que va de 6 a 41 pares. Los cromosomas son relativamente pequeos y la poliploidia es frecuente. La poliploidia inducida puede ser interesante en las especies forestales de estos gneros como lo es para producir nuevos tipos de rboles y arbustos ornamentales. Uno de los aspectos ms prometedores de la gentica forestal es la produccin de hbridos F entre especies de habitats distintos. Especies de conferas que han estado aisladas geogrficamente por miles de generaciones pueden ser cruzadas y han producido hbridos vigorosos y relativamente frtiles, como lo demuestran
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los cruces entre el alerce europeo y el japons (Larix decidua y L. leptolepis) y entre las especies de pinos blancos asiticos y americanos. Tambin se ha comprobado un vigor hbrido semejante entre especies americanas y europeas de Populus y Platanus. El empleo de la radiacin ionizante como agente mutagnico ha sido de gran valor en la mejora de las plantas agrcolas, a pesar de que las mutaciones deseables sean raras. Pero el largo ciclo vital de las especies forestales y el espacio necesario para probar el vigor y calidad de los mutantes deseados hace de la mejora por mutacin un programa largo y caro. Quiz la seleccin en masa al tiempo de germinar la semilla pueda aplicarse cuando se seleccione por resistencia a la enfermedad, tal como se hizo con tanto acierto con los cereales tratando las semillas en germinacin con la toxina del patgeno. La correlacin entre la sensibilidad a los rayos X y el vigor inherente en las semillas de Zea, de reciente descubrimiento, puede servir para seleccionar los segregados genticos superiores en poblaciones hbridas de rboles forestales.
14. Karyology and Cytotaxionomy of Genus Passiflora (Passifloraceae) Melo, Cervi y Guerra, 2000 Resumen Los cromosomas de 31 especies de Pasiflora, distribuida en los subgneros Astrophea, Calopathanthus, Distephana, Dysosmia, pasiflora, Plectostemma an Tacsonia fueron analizados. Se observaron 3 diferente cariotipos 2n=12, 24,36 2n=18,72 y 2n=20. El cariotipo de estas especies esta constituido casi siempre por cromosomas metacntrico y submetacentricos con variabilidad en la simetra del cariotipo. En el grupo con X=6, representado por el subgenero Plectostemma, seis especies con diploidia 2n= 12 uno tetraploide con 2n=24 y tambin pueden haber poliploides derivados de nmero 6. Dos pequeos bloques de heterocromatina , son cromomicina positiva, el cual identifico un gran par de cromosomas largos en P. Capsularis y P. Rubra, especies relacionadas muy cerradas, mientras P. Tricuspis muestra cuatro cromosomas con bloques proximales. En el grupo con x=9, representado por el subgnero Passiflora, 20 especies con 2n=18 y uno con 2n= 72 fueron estudiados. Estos presentan cromosomas largos los cuales pueden ser x=6. En el anlisis
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meiotico de tres grupos representativos (P. Foetida, P. Suberosa, y P cincinnata) siempre se present segregacin regular de cromosomas , excepto en P. Jilekki en donde el tetravalente fue observado. El anlisis de la variacin de cromosomas dentro del gnero y la familia sugieren que el nmero base de Pasiflora puede ser X1= 6 o X1= 12 tambin X2 = 9 es solamente una base numrica importante.
15. Estudios Cromosmicos en Capsicum (solanaceae) II. Anlisis Cariotipico de C. Parvifolium y C. Annuum var. Annuum Eduardo A. Moscone - 1993
Como parte de los estudios cromosmicos emprendidos en Capsicum L. (Moscone, 1990), en la presente contribucin se analiza el cariotipo de otros de sus integrantes: C. parvifolium Sendt., especie silvestre leosa que habita el norte de Brasil, en los estados de Baha y Pernambuco (A. T. Hunziker, com. Pers.), la cual se encontraba cariolgicamente inexplorada; C. annuum L. var. Annuum, el representante ms importante entre los 5 del gnero que son cultivados en todo el mundo (cf. Eshbaugh, 1976; A. T. Hunziker, 1879), siendo originario de Amrica (Heiser and Smith, 1953; Pickersgill, 1971). Estudios cromosmicos previos en esta ltima entidad ponen de manifiesto la existencia de una variacin cariotpica interpoblacional de magnitud (Chennaveeraiah and Habib, 1966; Datta, 1968; Ming and Dehua, 1986; Pickersgill, 1971, 1977), por lo que se consider de inters revisar, con fines comparativos, de muestras cultivas en Argentina.
16. Citogentica vegetal: avanos e contribuio para o estudo da biodiversidade M. L. R. Aguiar Perecin. Departamento de Gentica, ESALQ, Universidade de So Paulo, Brasil. E-mail: mlrapere@esalq.usp.br II Simposio Latinoamericano de Citogentica, 2007
RESUMO A citogentica vegetal tem se renovado com novas tcnicas de biologia molecular e contribudo para um melhor entendimento da estrutura do genoma e evoluo do caritipo, e se tornado uma rea importante para a abordagem da biodiversidade.
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A citogentica tem se renovado com novas tcnicas decorrentes do aperfeioamento da hibridao molecular in situ, da imunofluorescncia e de mtodos de gentica molecular, que tm permitido o isolamento, seqenciamento e mapeamento cromossmico de diferentes tipos de seqncias de DNA. Portanto, a citogentica tem contribudo para um melhor entendimento da estrutura do genoma e evoluo do caritipo de plantas e animais. Nesta reviso, se far uma abordagem de alguns aspectos deste desenvolvimento. Nos ltimos anos, a rea de citogentica vegetal cresceu na Amrica Latina, o nmero de peridicos indexados aumentou e no nossa inteno apresentar aqui, uma retrospectiva histrica, mas apenas abordar a contribuio da rea para o estudo da biodiversidade. No se pode deixar de citar, no entanto, a contribuio de lderes, como Brieger (Gurgel, 1985), e Hunziker e Saez (Hunziker, 2000), cujo trabalho resultou na formao de inmeros pesquisadores.
Leccin 30: Variaciones cariotpicas y otros estudios cariotpicos en plantas
17. Structural Variability and Chromosome Numbers Variation in Natural Populations of Silla autumnalis (lilaceae) Guilln y Ruiz. 1984.
Resumen Se han detectado variacin cromosmica en poblaciones naturales de Silla autumnalis . La poliploidia se ha dado a partir del diploide (2n=14, X=7) hasta un nivel decaploide (2n=70), en estos estudios se han reportado tambin la presencia de cromosomas B los cuales son mitoticamente estables en todos los anlisis.
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18. Anlisis filogentico en alopoliploides Phylogenetic analysis in allopolyploids P. Speranza. Ing. Agr., M.Sc., PhD. Universidad de la Repblica, Facultad de Agronoma, Av. Garzn 780, Montevideo 12900, Uruguay. pasp@fagro.edu.uy II Simposio Latinoamericano de Citogentica, 2007
Resumen Los alopoliploides han sido tradicionalmente estudiados por los citogenetistas. Durante mucho tiempo, la fuente ms confiable de informacin para determinar el origen de los alopoliploides, ha sido el anlisis del comportamiento meitico de hbridos interespecficos. Actualmente, la reconstruccin filogentica formal se basa en la cladstica y tcnicas relacionadas, las cuales no resultan directamente aplicables al estudio de entidades hbridas. Dado que los alopoliploides son hbridos por definicin, su anlisis filogentico requiere un tratamiento especial que posibilite el aprovechamiento del gran poder resolutivo de las tcnicas disponibles. En esta presentacin se discutir el alcance de diferentes herramientas tradicionales y moleculares y su anlisis cladstico para el estudio filogentico de alopoliploides.
19. Analysis of Active Nucleolus Organizing Regions in Caspsicum (solanaceae) by Silver Staining Moscone, Loidl, Ehrendorfer y Hunziker, 1995
Resumen La actividada nucleolar de 22 ejemplares de 9 especies diploides de Capsicum fueron analizadas en metafases somticas ey ncleos interfasicos. Ellas fueron: C chacoense, C pavifoliun, C. Frutescens, C, chinense, C, annuum var. Annuum, C. Baccatum var. pendulum, C. pubescens, todos con 2n= 24, y C. Mirabile var. C. Mirabile y C. Campytolodium con 2n= 26. La coloracin de plata fue aplicado primeramente en C Capsicum dando , marcadores tiles en la identificacin de cromosomas en combinacin con otras tcnicas de bandeo ya empleadas en este genero. Para dos de las ocho regiones organizadoras nucleolares, fueron encontrados en el complemento diploide de la taxa estudiada. La regin
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organizadora nucleolar fue localizada como constriccin secundaria de cromosomas la cual tenia coloracin convencional o banda )banda C o banda fluorocromo) Polimorfismos de AgNORs y satlites ocurrieron frecuentemente. El nmero y posicin de los loci de r-ADN no solo entre sino dentro de las poblaciones. El nmero Se estableci NORs en posicin homologa entre las especies. Los datos obtenidos son relacionados con previas conclusiones de relaciones filogenticas en Capsicum.
20. Variaciones cromosmicas en Aloe vera J. Imery-Buiza Laboratorio de Gentica Vegetal, Departamento de Biologa, Escuela de Ciencias, Universidad de Oriente. Apdo. 245, Cuman 6101, Venezuela. jimery@sucre.udo.edu.ve. II Simposio Latinoamericano de Citogentica, 2007
Aloe vera (L.) Burm.f. (=A. barbadensis Mill.), conocida popularmente como loe, sbila o zbila, es una hierba suculenta empleada mundialmente por sus mltiples propiedades medicinales (Davis, 1997). Es una de las casi 400 especies descritas para el gnero Aloe L., nativas de frica, Arabia e Islas del Ocano ndico (Newton, 2004). En Amrica, A. vera fue introducida por los espaoles a finales del siglo XVI, y en la actualidad, es un omponente importante de la riqueza etnobotnica de nuestros pueblos, existiendo adems, una considerable actividad agroindustrial en varias Islas del Caribe y en otros pases de la zona trrida continental (Hodge, 1953; Rowley, 1997). Al igual que la mayora de las especies domesticadas, A. vera ha experimentado las consecuencias del establecimiento de grandes plantaciones en monocultivo, una creciente incidencia de plagas y enfermedades, y la necesidad de incrementar la produccin y calidad a fin de satisfacer la demanda de materia prima. Ejemplo de esto, es la bacteriosis registrada en pases como Araba (De Laat et al., 1994), Mxico (Aranda y Fucikovsky, 1999) y Venezuela (Gonzlez et al., 1998; Hernndez et al., 2001, 1999; Contreras et al., 2001; Lugo y Medina, 2001; Guevara, 2004; Guevara et al., 2002), llegando a niveles econmicamente preocupantes, debido a la muerte de hasta 2 % de las plantas cultivadas. Es este sentido, el Laboratorio de Gentica Vegetal de la Universidad de Oriente (Venezuela), inici en el ao 2000, un programa de
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mejoramiento gentico orientado al logro de genotipos con mayor endimiento foliar, precocidad y tolerancia a Erwinia chrysanthemi. Para ello, entre otros estudios bsicos, fue necesario realizar evaluaciones citogenticas que permitieran conocer los recursos locales y la bsqueda de variabilidad potencialmente aprovechable. En el presente trabajo se describen las anormalidades cariolgicas reconocidas en poblaciones naturalizadas del oriente venezolano y las variaciones cromosmicas generadas mediante mutagnesis, poliploida y su combinacin con la hibridacin interespecfica.
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Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en la leccin No. ____, as como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en las lecciones siguientes. Los tems a tener en cuenta son: 1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo induvidual y colaborativo en el desarrollo de esta leccin. 2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin 3) Evaluacin del material usado en la actividad de la leccin: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado. 4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.
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Fuentes Documentales de la Unidad 2 FUENTES DOCUMENTALES Camacho-Garzn, J, 1999. Caracterizacin Citogentica y Relaciones Biogeogrficas en Poblaciones Colombianas de Pseudoplatystoma fasciatum y Pseudoplatystoma tigrinum (Pisces: Siluriformes: Pimelodidae). Trabajo de grado. Departamento de Biologa. Universidad Nacional de Colombia. Bogot Colombia. Camacho-Garzn, J, 2003. Caracterizacin Citogentica de Crocodylus acutus y Crocodylus intermedius en colombia (Reptilia: Crocodylia: Crocodylidae) Tesis Magister. Universidad Internacional de Andaluca. Sede Antonio Machado de Baeza. Espaa Cienc. Rural, Apr. 2006. vol.36 no.2 Santa Maria Mar.
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192

Citogenetica

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agricolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del

l curso Citogentica Aplicada al Mejoramiento

LUZ MERY BERNAL Acreditador

Bogot septiembre de 2009

Fuentes Documentales de la UNIDAD 1

118 118 118 123 130 139 141

144 145 146 146 148

152 152 156 159 166 170

Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 2

Fuentes Documentales de la UNIDAD 2

Figura 10. Estructura del ADN en forma de cuentas de collar de perlas 27

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

Denominacin de Leccin 14 Denominacin de Leccin 15

Nombre de la Unidad Introduccin

Denominacin de captulo 5 Denominacin de Leccin 21

Variaciones cariotpicas y otros estudios cariotpicos en plantas

UNIDAD 1 MATERIAL GENTICO

CAPITULO 1: MATERIAL GENTICO

Base nitrogenada Enlace fosfodiester

Figura 2. Estructura-y-organizacion-de-los-acidos-nucleicos. l (Modificada de http://pdf.rincondelvago.com/ htm)

Figura 3. Estructura qumica de un nucletido (tomado de http://www.ucn.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.html#composicion)

Figura 5 Modelos de replicacin del ADN (tomado de http://html.rincondelvago.com/duplicacion-de-adn.html)

Figura 6. Replicacin de ADN (Tomado de http://html.rincondelvago.com/duplicacion-de-adn.html)

Figura 7. Sntesis de ARNm

Figura 8. Representacin de la capucha del ARNm. Tomado de http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/capuchado%20rna%20mensajero. html

Figura 9. Doble hlice del ADN Tomado de (http://www.biotech.bioetica.org/clase1-14.htm#_Toc95371667)

Figura 12. Estructura del a) tetrmero y b) octmero que constituyen el nucleosoma

Figura 13. Estructura del nucleosoma http://www.ciencia.net/enciclo/a/images/adn00.gif

Figura 15. Solenoide, segundo grado de compactacin del ADN http://www.ciencia.net/enciclo_imprimir.jsp?id=5125

Figura 18: cromosoma. Mxima condensacin del ADN http://www.educa.aragob.es/iespseza/ciencias/jesus_delgado/Cromosoma.jpg

CAPITULO 2: CICLO CELULAR Y CROMOSOMAS

Figura 20. Fases del ciclo celular (tomado de http:// efn.uncor.edu/dep/biologia/introbiol/ciclo.htm)

Figura 23. Anafase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases)

Figura 24. Telofase mittica (tomado de http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/mitosis/mitosis.htm#fases)

Figura 27. Estructura Telomerica a) Tomado de http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Telomere.png/200pxTelomere.png y b) http://www.ifir.edu.ar/~divulgon/setiembre03/imagenes/telomer.jpg

Tabla 2. Algunas secuencia de telmeros conocidas

Oxytricha, Euplotes Plasmodium

Figura 28. Metafase de Clolosthetus puntatus Cortesa Cortes y Rodrguez 2004

Figura 29. Cromosoma politnico. (Tomado de www.ucm.es/.../grupod/mitosis/MDtrans.jpg)

Figura 31. Cromosomas politnicos en anfibios Tomado de http://biologia.fciencias.unam.mx/bioanim3/04ovogen/sld023.htm

Alteraciones congnitas de origen cromosmico

Patata Tabaco Algodn Manzana

Genotoxicidad por Agentes Fsicos: ionizantes y no ionizantes.

Dentro de estos estn las radiaciones

CAPITULO 3: MTODOS DE OBTENCIN DE CROMOSOMAS

Factores de necrosis tumoral Interferones

Acido Flico Mioinositol Biotina Sacarosa (g/L) pH

0.5 100.0 0.5 5.5

100.0 0.01 5.6

Tabla 7. Fitohormonas utilizadas para el cultivo de clulas vegetales.

CLASE Auxinas Citokininas

REGULADOR AIA ANA 2,4 D Zea Zea-ribsido

KIN BAP AG3 N: Natural

GIBERELINAS GA3: Ac. giberlico GA1, GA4, GA7: (giberelinas)

TCNICAS EN ANIMALES TCNICAS DE CULTIVOS PARA ANLISIS CITOGENTICA

Tabla 9. Productos requeridos para cultivos de diferentes especies animales.

0.3 0,05 03 03 0.20.3

Medio Hams F10

Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 1

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http://www.lamolina.edu.pe/cirgebb/Lineas%20de%20investigacion.htm http://www.uco.es/organiza/servicios/publica/az/php/az.php?idioma_global=0&r evista=54&codigo=758 http://es.wikipedia.org/wiki/ADN http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/duplicacion%20dna3.html

UNIDAD 2 BANDAS CROMOSMICAS Y DIAGNSTICO CROMOSMICO

CAPITULO 4: MATERIAL GENTICO