ELISA

Dra Morella Bouchard Instituto de Inmunologa Clnica Universidad de Los Andes

ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Dra Morella Bouchard Instituto de Inmunologa Clnica Universidad de Los Andes

Interaccin Antgeno Anticuerpo

ANTGENO

ANTICUERPO

Puentes de Hidrgeno Enlaces Inicos

Fuerzas que participan en la Interaccin Antgeno Anticuerpo

Interacciones hidrofbicas

Fuerzas de van der Waals

Enlaces Inicos

Caractersticas del Ac relacionadas con el reconocimiento del Ag

Especificidad Diversidad Afinidad y Avidez

RESPUESTA HUMORAL

ELISA
Descrita por Engvall y Perlman en 1971 Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una fase slida y el otro se marca con una enzima. La enzima reacciona con un sustrato formando un producto coloreado

Ventajas del ELISA

Muy sensible Gran nmero de muestras procesadas simultneamente. Resultados rpidos Utilizacin de reactivos menos txicos Menor costo Cuantificacin de sustancias diversas:
hormonas frmacos citoquinas metabolitos mediadores de inflamacin agentes infecciosos, etc. toxinas protenas

Fundamento del ELISA

Ag o Ac Conjugado: Ag o Ac fijado a + en la + Ac unido a + SUSTRATO una fase ENZIMA muestra slida CAMBIO DE COLOR

Componentes del ELISA

FASE SLIDA Antgeno o Anticuerpo Conjugado: ENZIMA SUSTRATO

SOPORTE SLIDO
Material del Soporte Nitrocelulosa Formas disponibles Membranas, Lminas Placas, Lminas Unin No covalente

Polivinilo

Covalente

Poliestireno

Placas, Lminas, Perlas Membranas, Lminas, Perlas

Covalente

Ltex, nylon, celulosa y sefarosa

Covalente

ANTGENO
Completo Extracto total Fraccin Purificada Pptido sinttico Protena recombinante

Anticuerpos Policlonales
Heterogneos Reconocen eptopes diferentes del Ag Producidos por numerosos clones de Linfocitos B

Anticuerpos Monoclonales
Homogneos Especificidad nica Producidos por un nico clon de Linfocitos B

BLOQUEO
Buffer de bloqueo
Casena

Composicin

Desventajas
Deteriora rpidamente. Enmascara algunos antgenos Deteriora rpidamente. Enmascara algunos antgenos Podra generar algunos residuos

5% p/v leche sin grasa

Casena/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de Tween20

Tween 20 Gelatina BSA

O,2 %de Tween Gelatina 0.2% (2mg/ml) 3% de BSA,

Relativamente costoso

MUESTRA
Suero Orina

Saliva LCR Heces Otros

ENZIMAS
Peroxidasa Fosfatasa alcalina -galactosidasa Penicilinasa Ureasa Glucosa oxidasa

SUSTRATOS
Requerimientos del sustrato
Solubles en agua Fcil de manipular No txicos, no mutagnicos Bajo costo

Formacin de colores por la accin enzimtica sobre diferentes cromgenos

-Nitrofenil Fosfato (NPP) Amarillo Prpura Rojo

Fosfatasa Alcalina

5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato / nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)

Naftol AS-TR posfato /fast red RC

2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6cido sulfnico)

Verde Naranja Azul Marrn Rojo Azul

-fenilendiamino (OPD)
3,35,5-tetrametilbencidina base o Dihidrocloruro (TMB)

Peroxidasa

3,3-Diaminobencidina (DAB) 3-amino-9-Etilcarbazole (AEC) 4-cloro-1-Naftol (4C1N)

Lavados
Utilizados para separar los componentes unidos de los libres Generalmente: De 3 a 6 lavados por cada etapa Duracin de 30 seg a 1 min c/u Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2

Revelacin de la actividad enzimtica

Incorporacin de cidos o bases fuertes para detener la reaccin La cantidad de producto enzimtico formado se determina leyendo la densidad ptica (DO) con un espectrofotmetro

FASES DEL ELISA

1. Titulacin de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para sensibilizar la placa. 2. Sensibilizacin 3. Lavado 4. Bloqueo 5. Lavado 6. Incubacin de las placas con las muestras y controles positivos y negativos 7. Lavado 8. Incubacin del conjugado 9. Lavado 10.Incubacin del sustrato 11.Detenimiento de la reaccin enzimtica 12.Lectura de las placas

TIPOS DE ELISA
DIRECTO INDIRECTO COMPETITIVO TIPO SANDWICH MTODO AVIDINA-BIOTINA

ELISA INDIRECTO

Antgeno Buffer de bloqueo Anticuerpo

Conjugado Anticuerpo-Enzima Sustrato

ELISA SANDWICH
S

Anticuerpo fijado al pozo

ELISA SANDWICH
S
lavado

Anticuerpo fijado al pozo

Adicin de la muestra con Antgeno a ser medido

ELISA SANDWICH
S
lavado lavado

E E E

Anticuerpo fijado al pozo

Adicin de la muestra con Antgeno a ser medido

Adicin del conjugado enzimaAnticuerpo secundario

ELISA SANDWICH
S S
lavado

lavado

lavado

E E E

E E E

Anticuerpo fijado al pozo

Adicin de la muestra con Antgeno a ser medido

Adicin del conjugado enzimaAnticuerpo secundario

Adicin del sustrato y medicin del color

ELISA SANDWICH
S S
lavado

lavado

lavado

E E E

E E E

Anticuerpo fijado al pozo

Adicin de la muestra con Antgeno a ser medido

Adicin del conjugado enzimaAnticuerpo secundario

Adicin del sustrato y medicin del color

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Incluir controles: Control del PBS (blanco) Control Negativo Control Positivo Bajo Control Positivo Alto

Paciente

10

1 A

2
Control negativo

3
1/64 1/256 1/1024 1/4096 1/64

9 10 11 12 A B C D E F G H

B C D E F G H

B L A N C O S
1

Control positivo

1/256 1/1024 1/4096

3
11

4
12

5
13

6
14

7
15

8
16

9 10 11 12
17 18 19 20

Paciente

REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE CUALITATIVO Positivo Negativo REPORTE CUANTITATIVO ng o g/ ml Unidades internacionales de ELISA (EIU)

REPORTE DE RESULTADOS

Pruebas cuantitativas: Empleo de controles negativos, positivos bajos y positivos altos para construir curva de calibracin.

REPORTE DE RESULTADOS
Semicuantitativa
Valor mnimo = positivo Promedio de los Controles Negativos

23 Desviaciones estndar

PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA TCNICA DE ELISA EN EL IDIC

ANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOS Toxoplasma Cisticerco Amibas CMV Hepatitis A-B-C Helycobacter pylori Epstein Barr Rubeola HIV ANTGENOS TUMORALES ACE CA125 APS AFP AUTOANTICUERPOS ANA Anticuerpos antitiroideos PROTENAS PLASMTICAS PCR FR Anticardiolipinas

GRACIAS