frecuencias de los genotipos de C / T -13 910 y G / A -22 018 polimorfismos en una poblacin del Caribe colombiano no se corresponden con

la persistencia de la lactasa prevalencia reportada en la regin Evelyn Mendoza, Microbiol 1 , Adriana Carolina Hernndez, Biol. Microbiol- 2 , Ricardo Wilches, Master 3 , Lourdes Luz Varela, PhD (C) 4 , Jos Luis Villarreal, microbiologa de una , Luis Alejandro Barrera, PhD 5 , Daniel Antonio Villanueva, PhD 6 1. Profesor de Investigacin, Grupo de Investigacin en Bioqumica patolgica (GRUBIOPAT), Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. e-mail: evemendoza5@hotmail.com joseluisvillarrealcamacho@hotmail.com 2. Investigador del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM), Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia. e-mail: adrianacarolina@gmail.com 3. estudiante de doctorado, GradSchool de la Evolucin, Ecologa y Sistemtica de la Universidad de Munich, Planegg, Martinsried, Alemania. e-mail: wilches@bio.lmu.de 4. Profesor de Gentica, el Grupo de Investigacin en Bioqumica patolgica (GRUBIOPAT), Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. e-mail: lourdesvarela@hotmail.com 5. Director del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM), Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia. e-mail: abarrera@javeriana.edu.co 6. Director, Grupo de Investigacin en Bioqumica patolgica (GRUBIOPAT), Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. e-mail: danielvillanueva@unilibrebaq.edu.co Recibido para su publicacin el 11 de marzo, Aceptado para su publicacin 03 de junio 2010 2009 RESUMEN Introduccin: El C / T -13 910 y G / A -22 018 polimorfismos localizados aguas arriba del gen de la lactasa son indicadores fiables de la persistencia de la lactasa en el derivado de las poblaciones caucsicas. Evaluacin de la presencia y distribucin de estos polimorfismos en otras poblaciones es fundamental para el desarrollo de ensayos de genotipificacin y la comprensin del mecanismo evolutivo detrs de este rasgo en varias poblaciones humanas. Objetivo: Genotipado la C / T -13 910 y G / A -22 018 polimorfismos en una muestra de individuos colombianos del Caribe. Materiales y mtodos: Los polimorfismos fueron identificados a travs de Polymerase Chain Reaction / fragmentos de restriccin polimorfismo de la longitud. Los fragmentos amplificados fueron digeridos con Hinf I y Hha I. Arlequn 3.1 se utiliz para determinar las frecuencias allicas y genotpicas, el equilibrio de Hardy Weinberg, y el desequilibrio de ligamiento. Resultados: las frecuencias genotpicas fueron CC (81,4%), CT (18,6%), y TT (0%) para el C / T 13910 polimorfismo. Las frecuencias fueron AA (55,5%), GA (45,5%), y AP (0%) para el A / D 22018 polimorfismo. No hay desequilibrio de ligamiento se encontr entre los dos loci. Slo el locus que contiene el C / T -13910 polimorfismo se encontr en equilibrio de Hardy Weinberg. Conclusin: La distribucin allica y genotpica observada en este estudio de genotipificacin por primera vez en una poblacin del Caribe colombiano indican un patrn de distribucin diferente de la de los caucsicos europeos del Norte y no corresponden a la prevalencia de la persistencia de lactasa reportado para las poblaciones del Caribe. Palabras clave: polimorfismo gentico; alelos; lactasa; Genotipo; Frecuencias; Genotipado.

Las Frecuencias genotpicas de los polimorfismos C/T-13910 y G/A-22018 EN UNA Poblacin Caribea colombiana no corresponden Con la prevalencia de lactasa Persistencia Que se inform en la regin RESUMEN Introduccin: Los polimorfismos C / T -13 910 y A / D -22018 , Que se localizan Corriente arriba del gen de la lactasa hijo predictores confiables de la Persistencia de lactasa en Poblaciones derivadas de caucsicos. Conocer la Presencia y Distribucin de polimorfismos en organismos europeos de normalizacin Otras Poblaciones es fundamental Para El Desarrollo de MTODOS de Diagnstico de lactasa Persistencia comprender prrafo y los Mecanismos evolutivos de Este fenotipo en Seres Humanos. Objetivo: los polimorfismos Genotipificar C / T -13 910 y A / D -22018 en Una Muestra de SUJETOS caribeos Colombianos. Materiales y mtodos: Los polimorfismos en s identificaron MEDIANTE la digestin de Productos amplificados, Que se hiz Con Hinf I y Hha I. Se Us El Programa Arlequn versin 3.1 prr Las determinar Frecuencias allicas y genotpicas, El Equilibrio de Hardy-Weinberg y El desequilibrio de ligamiento. Resultados: Para El polimorfismo C / T -13910 Las Frecuencias genotpicas were CC (81,4%), CT (18,6%) y TT (0%), MIENTRAS Que Para El polimorfismo G / A -22 018 were AA (55,5%), GA (45,5%) y GG (0%). No Se Encontro desequilibrio de ligamiento Entre los loci Que contienen los polimorfismos y only El polimorfismo C / T -13910 esta en Equilibrio de Hardy-Weinberg en comparacion Con A / D -22018 . Conclusin: Las Distribuciones allicas y genotpicas observadas en Este primer Estudio de genotipificacin en Una Muestra de la Poblacin Caribea Muestra colombiana patrn de las Naciones Unidas de Distribucin Diferente del Encontrado en Poblaciones caucsicas del norte de Europa y no se corresponden Con la prevalencia de lactasa Persistencia Que se ha Informado en caribeos. Palabras clave: Polimorfismo Gentico; alelos; lactasa; Genotipo; Frecuencias; Genotipificacin. Existen dos fenotipos de la lactasa en humanos. El primero es conocido como de tipo adulto hipolactasia primaria. Se caracteriza por una disminucin en la actividad de la lactasa despus del destete, manteniendo slo el 5-10% de la actividad enzimtica en la edad adulta 1 . La segunda es la persistencia de la lactasa, debido a la alta actividad de la lactasa mantiene hasta la edad adulta. Slo una minora de la poblacin mundial mantiene actividad de la lactasa, observ principalmente en los europeos del norte 2,3 . En los individuos con un adulto-tipo hipolactasia primaria, las manifestaciones de la alteracin de la digestin de la lactosa incluyen la flatulencia, diarrea y dolor abdominal, que son consecuencia del metabolismo de la lactosa por la microflora del colon. Este cuadro clnico se conoce como intolerancia a la lactosa 4 . El estndar de oro para el diagnstico de tipo adulto hipolactasia principal es la evaluacin de la actividad de la lactasa mediante biopsia intestinal 5 . Este mtodo es invasivo, incmodo, y slo se evala la actividad en un rea muy pequea en la superficie de la mucosa intestinal. En busca de una, eficiente y menos invasivo mtodo diagnstico ms sensible, Enattah et al. 6 , estudi una cohorte de 196 individuos no relacionados de origen finlands, reportando un 100% de correlacin fenotipo de la persistencia de la lactasa con la presencia del alelo T de un SNP localizado 13.910 pb corriente arriba del gen de la lactasa. Este C / T -13910polimorfismo est localizado en el intrn 13 del gen MCM6 (C / T -13.910 ). Adems, encontraron una alta correlacin

(96%) entre la persistencia de lactasa y la presencia del alelo A en el SNP G / A, ubicado en el intrn 9 de la MCM6, 22.018 pares de bases antes del gen de la lactasa (G / A -22.018 ). Una alta correlacin entre T -13910 , A -22018 y el fenotipo persistencia de la lactasa tambin se ha informado en una poblacin brasilea de ascendencia caucsica 7 y muchos pases de Europa 8010 . Por otra parte, en lactosa persistant frica subsahariana y Oriente Medio poblaciones, como una alta correlacin no fue encontrada. Por otra parte, SNPs novela exclusiva en estas poblaciones mostraron asociacin con la persistencia de la lactasa 11-13 . El comportamiento de las frecuencias allicas de estos dos SNPs en la poblacin colombiana es hasta ahora desconocido.Histricamente, esta poblacin ha sido considerada como la mezcla de tres grupos tnicos principales: los africanos, amerindios, y los blancos 14 . Informacin acerca de la prevalencia de estos alelos en diferentes subpoblaciones colombiano aclarar si es til para el genotipo durante la evaluacin clnica de la persistencia de lactasa. Hemos destinado a la determinacin del genotipo C SNPs / T -13910 y G / A -22 018 en una poblacin del Caribe colombiano. Las frecuencias observadas para estos SNPs se presentan y discuten a la luz de la colombiana e internacional la informacin existente. MATERIALES Y MTODOS Se realiz una encuesta en 367 individuos entre 17 y 69 aos de edad (media: 30 1), 156 cumplieron con los criterios de inclusin: haber nacido en el Caribe colombiano sin vnculos familiares entre ellos, y fueron sus padres y abuelos Tambin naci en el Caribe. Todas las personas seleccionadas firmaron un formulario de consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el Comit de tica de la Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. ADN se obtuvo a partir de sangre venosa mediante el Asistente DNA de Genomic Purification Kit (Promega, EE.UU.). la identificacin de polimorfismos se realiz mediante reaccin en cadena de la polimerasa / fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (PCR / RFLP). Para identificar los alelos del SNP C / T -13.910 , un fragmento de 201 pb se amplific primero utilizando los cebadores: 5'-GCTGGCAA TACAGATAAGATAATGGA-3 'y 5'-CTGCTTT GGTTGAAGCGAAGAT-3' (11).Reaccin se llev a cabo en un volumen total de 20 mL, con Tris HCl 1X pH 9.0, MgCl 2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM, Taq polimerasa 1,5 U / M y una de cada cebador (Invitrogen , EE.UU.). PCR inici con un paso de desnaturalizacin de 95 C durante 10 minutos seguido de 35 ciclos de 95 C durante 1 min, 59 C durante 1 min y 72 C durante 1 minuto, y un ciclo de elongacin final a 72 C durante 8 minutos. producto de PCR se digiri con Hinf I (New England Biolabs, EE.UU.). y la digestin de los productos de amplificacin se corrieron en un gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron con bromuro de etidio. Las muestras que slo presenta un punto de ebullicin 201 (C) o un fragmento de 177 pb (T) fragmento se interpreta como genotipo CC y TT, respectivamente, mientras que las muestras que present dos fragmentos de 201 pb y 177 pb fueron interpretadas como el genotipo CT. La regin de 271 pb que contena G/A-22018 SNP se amplific con los cebadores: 5'CTCAGTGATCC TCCCACCTC-3 'y 5'-CCCCTACCCTATCAG TAAAGGC-3' (Invitrogen, EE.UU.) 15 . Las condiciones de PCR fueron las mismas que para C/T-13910, pero la reduccin de los ciclos de amplificacin a 34 y con una temperatura de anillamiento de 62 C. producto de PCR se digiri con Hha I (New England Biolabs, EE.UU.) y se visualizan como se describe para los otros SNP. Las muestras que slo present un fragmento de 271 pb (A) o un fragmento de 196 pb (G) se interpretaron como el genotipo AA y AP, respectivamente, mientras que las muestras que aparecen dos fragmentos de 271 pb y 196 pb fueron interpretadas como el genotipo GA. y genotpicas frecuencias allicas, as como de Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento (LD)

se determin utilizando la versin 3.1 del software Arlequin con intervalo de confianza del 95% 16 . RESULTADOS Genotipo y frecuencias de los alelos encontrados en este estudio se muestran en las Tablas 1 y 2 , respectivamente. De los genotipos que se encuentran, los haplotipos siguientes fueron inferidas con sus respectivas frecuencias: CA (69%), GC (22%), AT (8%) y TG (1%).

frecuencias allicas para los genotipos CC, CT, AA, y la Asamblea General se utilizaron para analizar el equilibrio de Hardy-Weinberg. Slo SNP C / T -13910 estaba en equilibrio de Hardy-Weinberg (p = 0,367;> 0,05). Del mismo modo, LD se analiz y la segregacin independiente se encontr para C / T -13910 y G/A-22018 (p = 0,335;> 0,05). DISCUSIN Se determin la frecuencia de los dos SNPs asociados con la persistencia de la lactasa en los europeos de una muestra de mestizos de la poblacin del Caribe colombiano. Al revisar la distribucin genotpica de SNP G / A -22 018 en la tabla 1 , cabe sealar que la totalidad de los individuos tienen la dominante A -22018 alelo, que se une a la persistencia de lactasa en las poblaciones europeas del Norte. Si este alelo iban a realizar la misma funcin en la poblacin estudiada, el 100% de estas personas sera persistentes tambin. Esto no es coherente con los datos de frecuencia de la persistencia de la lactasa fenotipo reportado para las poblaciones del

Caribe (60%) y tampoco con los datos reportados para las poblaciones andinas de Colombia en la que la influencia de la raza blanca la poblacin europea ha sido mayor 17,18 . Estos datos tambin difieren de la frecuencia del e indicativo de la persistencia en los europeos, el alelo T dominante de SNP C/T- 13.910 . El contraste entre la alta frecuencia del alelo A -22018 y la baja frecuencia de alelo T -13 910 , ambos asociados a la persistencia de la lactasa en la poblacin del norte de Europa, podra explicarse por las diferencias en las fuerzas evolutivas que actan sobre cada uno de los SNPs. De hecho, slo C / T -13910 se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg. Por otra parte, esta diferencia no puede explicarse como consecuencia de una seleccin sesgada de la poblacin, porque los criterios de inclusin fueron estrictos. Nuestro T identificados -13.910 frecuencia del alelo est en estrecha concordancia con la que se encuentra en varias poblaciones de frica, donde es muy baja o nula y no puede explicar las frecuencias reportadas de persistencia de la lactasa en las poblaciones de tales 11 . Este hallazgo llev a Ingram et al. 12 , para sospechar que la causa de la persistencia de la lactasa en los africanos vinieron de diferentes SNPs. En efecto, un puado de SNPs, en las inmediaciones de la C / T -13.910, que se encuentran en diferentes poblaciones de lactasa persistentes, entre ellos los africanos y de Oriente Medio pastores, se han identificado y probado funcionalmente. Estos nuevos SNPs, a saber, el G -13 907 , G -13 915 y C -14010 alelos constituyen causas putativas de persistencia de la lactasa en las poblaciones europeas no 13,19 . Los estudios realizados en otras poblaciones de relieve la importancia de la composicin tnica en la bsqueda de asociaciones fenotipo-genotipo. Ming et al. Hai 20 , estudi SNP C / T -13.910 en las poblaciones de China y no encontr concordancia con los fenotipos de la lactasa, que lleg a la conclusin de que el alelo T, en esta frecuencia baja (1,9%), no se puede utilizar como factor de prediccin de lactasa persistencia. Por el contrario, Bulhoes et al. 7 , se muestra en concordancia Brasil entre los polimorfismos C / T 13910 , A / D -22018 lactasa persistencia y, segn lo revelado por la absorcin de la lactosa en el intestino. Sin embargo, 19 de los 20 individuos genotipo fueron de origen caucsico. El hecho de que la historia demogrfica de la poblacin objeto de estudio incluye la mezcla de tres grupos tnicos principales fundadores, a saber, amerindios, europeos y africanos 14,21 , es central para entender la ausencia de LD los SNPs estudiados. Estudios recientes en las poblaciones del Norte de Europa 6 , donde LD fuerte entre ambos loci es una consecuencia positiva de inferir de seleccin en curso con concomitante autostop del alelo A 22018 con la mutacin T -13910 22,23 , nos puede ayudar a descartar la papel de la seleccin que acten en este barrio genmica en la poblacin mexicana. Otros anlisis en nuestra cohorte, incluyendo ms marcadores en la vecindad genmica estn obligados a comprobar si la falta observada de LD se correlaciona con la historia demogrfica de la poblacin estudiada. En aquellas poblaciones que han demostrado una alta asociacin entre el genotipo y el fenotipo, genotipo se utiliza como un mtodo de diagnstico 6,24 . Un estudio de asociacin implica que la distribucin genotpica tiene que ser conocido. Las frecuencias de los genotipos encontrados muestran que los alelos estudiados no se predictores de la persistencia de la lactasa en la poblacin estudiada. Teniendo en cuenta que la presencia de los caucsicos europeos, africanos, amerindios y otros grupos tnicos, como los Judios sefarditas y los turcos, han influido en la composicin de la poblacin colombiana en varias regiones del pas 21 , es de esperar que los futuros documentos C / T 13 910 y A / D -22018 anlisis de SNPs de otras muestras de la poblacin colombiana revelar haplotipos diferentes composiciones y segregaciones alelo. Sugerimos que las frecuencias genotpicas y anlisis de asociacin se llevar a cabo para evaluar el comportamiento de los SNPs en Colombia y su potencial para ser utilizado como una herramienta de diagnstico para la persistencia de la lactasa.

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen Marena Rodrguez para la evaluacin de pruebas genticas y el Dr. Jorge Luis Bilbao por sus valiosas observaciones a este manuscrito. REFERENCIAS 1. Sahi T. hipolactasia y persistencia de la lactasa. Resea histrica y la terminologa. Scand J Gastroenterol. 1994; 29 Suppl 202: 1-6. 2. Holden C, Mace R. El anlisis filogentico de la evolucin de la digestin de la lactosa en los adultos. Hum Biol. 1997; 69: 605-28. 3. Hollox EJ H, Poulter, Zvarik M, V Ferak, Krause una camiseta, Jenkins et al. La lactasa diversidad de haplotipos en el viejo mundo. J Hum Genet am. 2001; 68: 160-72. 4. Lee H, Krasinski S. Humanos disminucin de lactasa del adulto: una actualizacin. Nutr Rev. 1998; 156: 1-8. 5. Dahlqvist A. Anlisis de las disacaridasas intestinales. Scand J Clin Lab Invest. 1984; 44: 169-72. 6. Enattah NS, T Sahi, E Savilahti, JD Terwilliger, L Peltonen, Jrvel I. Identificacin de una variante asociada con hipolactasia adultos tipo. Nat. Genet. 2002; 30: 233-7. 7. CA Bulhoes, Goldani HA, FS Oliveira, mate EE.UU., RB Mazzuca. La correlacin entre la absorcin de la lactosa y la C / T y G -13 910 / A -22 018 mutaciones de la hidrolasa de la lactasa-floricina (LCT) en el gen hipolactasia tipo adulto. Braz J Med Biol Res. 2007; 40: 1441-6. 8. M Krawczyk, Wolska M, S Schwartz, Gruenhage M, Terjung B, P Portincasa, et al. La concordancia de las pruebas genticas y el aliento para intolerancia a la lactosa en un centro terciario de referencia. J Dis Gastrointestin hgado. 2008; 17: 135-9. 9. CJE Ingram, CA Mulcare, Y Itan, Toms MG, Tragar DM. Lactosa la digestin y la gentica evolutiva de la persistencia de la lactasa. Hum Genet. 2009; 124: 579-91. 10. Y Itan, Powell A, MA Beaumont, Burger J, Thomas MG. Los orgenes de la lactasa persistentes en Europa. PLoS Biol Comput. 2009; 5: e1000491. 11. CA Mulcare, Weale ME, Jones B AL, Connell, Zeitlyn D, Tarekegn, et al. El alelo T del polimorfismo de nucletido nico 13,9 kb corriente arriba del gen de la lactasa (LCT) (C-13, 9kbT) no predice o hacer que el fenotipo de la lactasa-la persistencia de los africanos. J Hum Genet am. 2004; 74: 1102-1110. 12. CJE Ingram, MF Elamin, CA Mulcare, ME Weale, Tarekegn A, Raga A, et al. Un nuevo polimorfismo asociado con tolerancia a la lactosa en frica: las mltiples causas para la persistencia de la lactasa? Hum Genet. 2007; 120: 779-88. 13. Imtiaz F, E Savilahti, Sarnesto A, Trabzuni D, K Al-Kahtani, Kagevi I, et al. variante T/G-13915 aguas arriba del gen de la lactasa (LCT) es el fundador del alelo hipolactasia tipo adulto en una poblacin rabe (s). J Med Genet. 2007; 44: E89. 14. Bedoya G, P, Montoya, Garca J, Soto I, S Bourgeois, Carvajal L, et al. Adicin dinmica de los hispanos: un cambio en la ascendencia gentica nuclear de una poblacin de Amrica del Sur aislar. PNAS. 2006; 103: 7234-9. 15. M Coelho, Luiselli D, G Bertorelle, Lopes AI, S Seixas, G-Destro Bisol, et al. Microsatlites variacin y evolucin de la persistencia de la lactasa humanos. Hum Genet. 2005; 117: 329-39. 16. Excoffier L, G Laval, ver S. Schneider Arlequin. 3.0: un paquete de software integrado para la gentica de poblaciones de anlisis de datos. Evol Bioinform. En lnea de 2005; 1: 47-50. 17. Sociedad Americana de Nutricin Clnica. La aceptabilidad de los productos lcteos y leches en poblaciones con una alta prevalencia de intolerancia a la lactosa. Am J Clin Nutr. 1988; 48: 10861098. 18. ngel LA, E Calvo, Muoz Y. Prevalencia de hipolactasia Tipo Adulto e intolerancia al estilo de lactosa en Adultos Jvenes. Rev Gastroenterol Col. 2005; 20: 35-47. 19. Enattah NS, TG Jensen, Nielsen M, R Lewinski, M Kuokkanen, Rasinpera H, et al. introduccin Independiente de dos alelos persistencia de la lactasa-en la poblacin humana refleja la historia diferentes de la adaptacin a la leche de la cultura.J Hum Genet am. 2008; 82: 57-72.

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