Manual INVIMA 1 Corregido

TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN 2. CAPITULO 1: GENERALIDADES 2.1 Precauciones en el laboratorio de microbiologa alimentos 2.2 Recomendaciones previas a los anlisis 2.3 Condiciones que deben reunir los medios de cultivo y reactivos en su preparacin. 3. CAPITULO 3: PROCEDIMIENTOS ANALTICOS 3.1 Preparacin y dilucin de los homogenizados de las muestras 3.2 Recuento de microorganismos aerbios mesfilos 3.3 Recuento de microorganismos aerbios termfilos 3.4 Recuento de microorganismos anaerobios estrictos y facultativos 3.5 Recuento de esporas aerobias estrictas y facultativas 3.6 Recuento de esporas anaerobias estrictas y facultativas 3.7 Recuento de mohos y levaduras 3.8 Recuento de Estafilococo coagulasa positiva 3.9 Recuento de Bacillus cereus 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 Recuento de esporas clostridium sulfito reductor Recuento de Clostridium perfrinfens Determinacin de termonucleasa Determinacin de coliformes en alimentos (NMP) Determinacin de coliformes de origen fecal en alimentos (NMP) Determinacin de coliformes en agua envasada (NMP) Determinacin de coliformes de origen fecal en agua envasada (NMP) Determinacin de Pseudomona aeruginosa en agua envasada (NMP) Deteccin de Salmonella Deteccin de Vibrio cholerae Deteccin de Listeria monocytogenes Prueba de esterilidad comercial
4. CAPITULO 3: ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD 4.1 Programa interno de garanta de calidad en el laboratorio
5. CAPITULO 4: REACTIVOS
FRMULAS Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
5.1 Preparacin de medios de cultivo 5.2 Preparacin de reactivos
6.
ANEXOS
7. BIBLIOGRAFA
INTRODUCCIN
El presente Manual recoge las tcnicas oficiales tradicionales utilizadas en el control de calidad e inocuidad de alimentos y algunos tipos de bebidas alcohlicas.
El Manual de Tcnicas de Anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos est dedicado a la comunidad dedicada al anlisis microbiolgico de Alimentos.
2. CAPITULO 1: GENERALIDADES
2.1 PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Lavarse bien las manos antes de empezar a trabajar, si hay heridas o rasguos en la piel cubrirlas con una cura o algo apropiado. Llevar siempre bata de laboratorio No comer, beber ni fumar en la mesa del laboratorio Las mesas de trabajo deben tener superficies lisas para limpiar y desinfectar con facilidad antes y despus de terminar el trabajo diario. Se pueden desinfectar con hipoclorito de sodio al 2%, fenol al 5% o tego. Colocar tapones de algodn a las pipetas antes de esterilizar Una vez utilizadas las pipetas, colocarlas inmediatamente en una solucin desinfectante (hipoclorito de sodio al 2%) Enfriar el asa de inoculacin dejndola airear de 10-15 segundos para no crear aerosoles microbianos al introducirla caliente a los cultivos. Colocar en un recipiente adecuado todo el material contaminado para esterilizar en el autoclave, antes del proceso de lavado
Si el material contaminado se derrama, agregar hipoclorito de sodio al 2% sobre el rea contaminada y cubrir con toallas de papel absorbente por lo menos 15 minutos antes de limpiar. Ser cuidadoso. La mayora de los microorganismos que se manejan en el
laboratorio pueden ser patgenos.
2.1 RECOMENDACIONES TCNICAS PREVIAS A LOS ANLISIS Iniciar el anlisis tan pronto como sea posible, despus de haber llegado la muestra al laboratorio Las muestras perecederas, deben ser refrigeradas entre 0-5C, siempre que no sea posible su anlisis en las primeras horas despus de recibidas. Si las muestras llegan congeladas deben mantenerse en este estado hasta su anlisis y deben analizarse en un periodo no superior a 7 das. Las muestras congeladas se deben descongelar para su anlisis en su envase original, (o en el recipiente que llegaron al laboratorio) durante un tiempo mximo de 18 horas en un refrigerador entre 2-5C; mantenerlas en nevera entre 0-5C y comenzar el anlisis una vez conseguida la descongelacin completa. Si la muestra congelada puede ser fcilmente triturada (helados) no es necesario descongelarla. Las muestras slidas y lquidas deben ser completamente mezcladas antes de su anlisis. Las muestras no perecederas deben almacenarse en un lugar fresco, protegido de la luz, humedad y contaminacin y deben analizarse en un plazo mximo de 3 das. El material a utilizar en el anlisis, debe ser esterilizado con anterioridad al procesamiento o anlisis de las muestras. Se deben preparar los medios de cultivo de acuerdo con el nmero de muestras a analizar. Marcas las cajas y tubos con el nmero correspondiente a cada muestra por analizar. Trabajar lo ms cerca posible del mechero, flameando la boca de los frascos y tubos.
Desinfectar con alcohol antisptico, el sitio por donde se vaya a extraer la muestra para la preparacin de las diluciones. Utilizar pipeta por dilucin No calentar las pipetas en el mechero. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20 minutos, es preferible que sea inferior a los 10 minutos. La temperatura del medio debe ser la correcta (45-50C) de tal manera, que al mezclarlo con la dilucin del alimento no sean inactivados los grmenes. Hacer siempre controles de esterilidad del medio de cultivo y del agua de dilucin empleada.
2.2 CONDICIONES QUE DEBEN REUNIR LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EN SU PREPARACIN Para que un mtodo analtico de alimentos tenga un significado semejante en cualquier lugar donde se utilice, es fundamental que los medios de cultivo, los componentes de ellos, y los reactivos sean de caractersticas comparables. Se recomienda en general utilizar los medios deshidratados que ofrecen las firmas comerciales, por razones de conveniencia y porque su preparacin es ms uniforme. Sin embargo, los laboratorios que no puedan conseguir un determinado medio preparado por una firma comercial, podr utilizar otro o prepararlo a partir de los componentes bsicos, teniendo en cuenta las especificaciones o requisitos que se describen a continuacin. Los componentes se aaden en las cantidades correctas con agua destilada a temperatura ambiente, en un recipiente adecuado. Los componentes que estn en pequea concentracin, o que son poco solubles, es mejor aadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas o soluciones alcohlicas o alcalinas. En algunos casos, ciertos componentes, como los hidratos de carbono, suspensin de yema de huevo y sulfito sdico deben prepararse aparte del resto de los componentes del medio y esterilizarse a menudo por filtracin para ser aadidos despus en condiciones aspticas, al resto del medio esterilizado en el autoclave.
El anterior proceso es necesario para evitar degradaciones no deseables o reacciones que tendran lugar de otro modo durante el proceso normal de tratamiento trmico en el autoclave. Los componentes pueden ser disueltos completamente por calentamiento hasta la ebullicin si el medio contiene agar, agitando fuertemente. El medio debe ser enfriado hasta aproximadamente la temperatura ambiente si se trata de un caldo, o hasta 50C si el medio contiene agar. Ajustar el pH del medio con solucin de NaOH HCl 0.1N a un valor predeterminado de tal forma que se obtenga el pH final deseado, despus de la esterilizacin. El medio se distribuye en tubos, frascos, u otros recipientes en la forma y cantidad necesarias. Si se va a distribuir en placas inmediatamente despus de la
esterilizacin, el medio puede esterilizarse en el mismo recipiente en el cual se prepar. En muchos casos, el medio recin preparado y esterilizado se distribuye en cajas de petri para uso inmediato en cultivos en superficie. En estos casos las cajas deben secarse antes de su inoculacin para evitar la difusin y confluencia de las colonias. El secado del medio de cultivo, puede hacerse en cabina de flujo laminar, con las cajas destapadas o en una incubadora a 37C durante 4 horas con las tapas en su lugar y la superficie del agar hacia arriba. Los frascos de dilucin se esterilizan a 121C durante 15 minutos.
Como la
evaporacin del diluyente durante la esterilizacin puede disminuir la cantidad deseada, los recipientes deben llenarse con volumen predeterminado, de modo que despus de la esterilizacin el volumen final sea el deseado +/-2%. Se deben hacer pruebas de selectividad y productividad peridicamente a los medios de cultivo utilizados.
3. CAPITULO 2 : PROCEDIMIENTOS ANALTICOS
3.1 PREPARACIN Y DILUCIN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS
El procedimiento comnmente empleado para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en los alimentos consiste en la preparacin de una
suspensin homognea de alimento y de microorganismos que permita la preparacin de las diluciones que posteriormente podrn ser utilizadas en diversos mtodos de recuento. Cuando los alimentos son slidos es necesaria la utilizacin de aparatos elctricos de trituracin y mezcla como el homogenizador o la licuadora.
Equipo y materiales
Cabina de flujo laminar Homogenizador o aparato similar Licuadora, con sus vasos de vidrio o metal esterilizable, de un litro de capacidad Balanza de una capacidad no inferior a 2500 g y una sensibilidad de 0.1 g Refrigerador a 0 5C Pipeteador Bolsas de plstico estriles para homogenizador Frascos de dilucin aforados a 99 ml Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm Pipetas de 1 ml, 10 ml y 11 ml, estriles Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, sacabocados, morteros con sus respectivos pistilos, etc., previamente esterilizados.
Gradillas.
Medios de Cultivo y Reactivos:
Agua peptonada al 0.1% estril (reactivo 1)
Procedimiento: Mtodo 1
1. Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogenizacin antes de preparar las diluciones. Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. 2. Abrir asptica y adecuadamente la muestra. 3. preparar diluciones consecutivas de la muestra, (10-4, 10-2, 10-3, 10-n , etc.) segn el criterio establecido para cada una de ellas, asi:
4. Para muestras lquidas preparar la dilucin 10-4 de midiendo 11 ml de la muestra en un frasco de dilucin que contenga 99 ml del agua peptonada 0.1% 5. Para muestras slidas: macerar, picar, mezclar y pesar 11 g representativos de la muestra total, en el frasco de dilucin conteniendo 99 ml de agua peptonada 0.1%, previamente tarado, para obtener una dilucin 10-4. 6. Agitar vigorosamente el frasco, dejar en reposo 10 minutos. 7. Preparar la dilucin 10-3, transfiriendo 1 ml de la dilucin 10-4, con pipeta de 1 ml a un tubo de dilucin que contenga 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente. 8. Preparar la dilucin 10-2, transfiriendo 1 ml de la dilucin 10-3 con pipeta de 1 ml, a un tubo de dilucin que contenga 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente. 9. Repetir estos pasos hasta obtener el nmero de diluciones necesarias. dilucin sucesiva disminuir 10 veces la concentracin. Cada
El rango de diluciones preparadas puede modificarse en funcin a la cifra de microorganismos esperada. Se deben sembrar siempre tres diluciones consecutivas.
Mtodo 2
1. Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogenizacin antes de preparar las diluciones. Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. 2. Abrir asptica y adecuadamente la muestra. 3. Mezclar muy bien para asegurar la homogenizacin de la muestra antes de preparar las diluciones. 4. Pesar en la bolsa para homogenizador previamente tarada, 11 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior) 5. Aadir 99 ml de agua peptonada 0.1% para obtener una dilucin de 10-4 6. Para alimentos con un elevado contenido de grasa (superior al 20%), es necesario aadir un 1% de Tween 80 o de otro tensoactivo no txico. 7. Colocar la bolsa en el homogenizador hacer funcionar el aparato por 2 minutos, el tiempo mximo de homogenizacin depender del tipo de alimento. sobrepasar los 3 minutos. 8. Pipetear 1 ml de dilucin 10-4 en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada 0.1% para obtener la dilucin 10-2 agitar cuidadosamente. No debe
9. Pipetear 1 ml de dilucin 10-2 en 9 ml de agua peptonada 0.1% obteniendo as la dilucin 10-3 agitar cuidadosamente.
10. Repetir estos pasos hasta obtener el nmero de diluciones necesarias. dilucin sucesiva disminuir 10 veces la concentracin.
Cada
3.2 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERBIOS MESFILOS
Mtodo de recuento en placa (SPC)
Es el mtodo comnmente utilizado para determinar el nmero de clulas viables o de unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento. Es el indicador ms amplio en alimentos, ya que incluye todos los gneros aerbios y facultativos que crecen en medios simples a una temperatura entre 20C y 45C.
Este recuento se considera como indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin, permite tambin obtener informacin sobre la alteracin incipiente de los alimentos y su probable vida til.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35 C +/- 2 C Bao de agua o incubadora a 45 50C Refrigerador a 0 5C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles
Medios de cultivo y reactivos
Agar plate Count (Agar peptona de casena glucosa extracto de levadura) (medio 1)
Procedimiento
1.
Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.
2.
Transferir por duplicado, alcuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estriles.
3.
Verter en las cajas de petri, 15 ml de Agar plate Count fundido y mantenido a 45C
4. Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj 5. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count. 6. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count. 7. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35C +/2C durante 48 horas.
Clculo e interpretacin de los resultados
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonia (ufc) g ml Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y mayores de 300 colonias, contar las cuatro cajas, calcular el recuento para cada una de las diluciones y sacar el promedio entre las dos.
Ejemplo: 10-4: caja 1 = 330 colonias caja 2 = 350 colonias
350 + 330 x 10 = 3.400 2 10-2: caja 1 = 26 colonias caja 2 = 28 colonias
26 + 28 x 100 = 2.700 2
Media aritmtica : 3.400 + 2.700 = 3.050 2
Reportar el recuento como 3.050 ufc / g ml
Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilucin de mayor concentracin, informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de dilucin ms concentrada.
Ejemplo: 10-4: Ausencia de colonias Reportar el recuento como menor de 10 ufc /g /ml 10-2 (Si se ha sembrado 0.1 ml de la dilucin 10-4) Ausencia de colonias
Reportar el recuento como menor de 100 ufc /g /ml
En el caso de que dos diluciones consecutivas estn dentro del rango de 30-300 colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones y se reporta la media aritmtica de los dos valores obtenidos, a menos que el recuento mayor contenga dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor.
Ejemplos: (a)
10-1: 290 colonias = 2.900 10-2: 40 colonias = 4.000
4.000 = 1.3 ( menos de 2) 2.900 Reportar media aritmtica : 3.450 ufc/g
(b) 10-1: 170 colonias = 1.700
10-2: 35 colonias = 3.500
3.500 = 2.05 (mayor de 2) 1.700 Reportar el recuento menor: 1.700 ufc/g
3.3 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERBIOS TERMFILOS
Es el mtodo utilizado para determinar el nmero de clulas viables o de unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento, que incluye todos los gneros aerbios y facultativos que crecen en medios simples a temperaturas entre 45C y 65C
Los microorganismos termfilos son importantes en los alimentos conservados o preparados trmicamente por su alta resistencia al calor. Este recuento determina si el tratamiento trmico del alimento fue ptimo.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 55C +/- 2C Bao de agua o incubadora a 45 50C Refrigerador a 0 5C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles
Agar plate Count (Agar peptona de casena glucosa extracto de levadura) (medio 1)
Procedimiento
1.
Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado
2.
3.
Verter en las cajas de petri, 15 ml de Agar plate Count fundido y mantenido a 45C
4.
Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces, b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj, c. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento(a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj
5.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count.
6.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count.
7.
Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 55C +/2C durante 72 horas.
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonia (ufc)/g ml
3.4 RECUENTO
DE
MICROORGANISMOS
ANAEROBIOS
ESTRICTOS
FACULTATIVOS
Este recuento es til como indicador de la existencia de condiciones favorables para la multiplicacin de microorganismos anaerobios productores de intoxicaciones alimentarias.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C Bao de agua o incubadora a 45-50C Refrigerador a 0- 5 C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Campana de anaerobiosis
Agar cistena, (medio 2)
Procedimiento
1.
2.
3.
Verter en las cajas de petri, 15 ml de agar cistena regenerado por 20 minutos como mnimo en bao de agua hirviente y enfriado a 50C
4.
Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
5.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar cistena.
6.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar cistena.
7.
Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35C +/2C durante 72 horas, en la campana de anaerobiosis.
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonias(ufc)/ g ml
3.5 RECUENTO DE ESPORAS AEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS
Este grupo de microorganismos est presente, por lo general, en las materias primas empleadas en la preparacin de conservas y es sealado como agente causante de su alteracin.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C
Bao de agua o incubadora a 45-50C Refrigerador a 0- 5 C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles
Agar plate Count (Agar peptona casena glucosa extracto de levadura) (medio 1)
Procedimiento
1.
Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.
2.
Pasteurizar las diluciones durante 10 minutos a 80C +/-5C y enfriar rpidamente en agua
3.
4.
Verter en las cajas de petri 15 ml de agar plate Count, fundido y mantenido a 45C
5.
Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj b. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a) c. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
6.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count.
7.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count.
8.
Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35C +/2C duante 72 horas.
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonia(ufc) g ml
3.6 RECUENTO DE ESPORAS ANAEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS
Este grupo de microorganismos est presente en materias primas empleadas en elaboracin de conservas.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C Bao de agua o incubadora a 45 50C Refrigerador a 0- 5C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Campana de anaerobiosis
Agar cistena (medio 2)
Procedimiento
1.
2.
Pasteurizar las diluciones durante 10 minutos a 80C +/-0.5C y enfriar rpidamente en agua.
3.
4.
Verter en las cajas de petri, 15 ml de agar cistena regenerado por 20 minutos como mnimo en bao de agua hirviente y enfriado a 50C
5.
Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente: a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj
6.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar cistena
7.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar cistena.
8.
Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35C +/2C durante 72horas, en la campana de anaerobiosis.
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonia(ufc) /g ml
3.7 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
Los mohos y levaduras tienen algunas caractersticas similares a las bacterias cuando contaminan los alimentos, tales como la capacidad de alteracin y la produccin de metabolitos txicos.
Los hongos (mohos y levaduras) se ponen en evidencia en condiciones desfavorables para el crecimiento bacteriano como: pH bajo, alto contenido de sales y azcares, bajo contenido de humedad y baja temperatura de almacenamiento.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 22 C +/-2C Bao de agua o incubadora a 45-50C Refrigerador a 0 5C Contador de colonias Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles
Agar OGY (Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura) (medio) Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol (medio 4) Solucin de oxitetraciclina al 0.1% (reactivo 2) Solucin de Gentamicina al 0.05% (reactivo 3)
Procedimiento
1.
2.
3.
Verter en las cajas de petri, 15 ml de agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) o agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol, fundido y mantenido a 45C
4.
Mezclar el inculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio. La manera ms indicada de mezclar el inculo con el medio es la siguiente:
a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces
b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Mover la caja 5 veces haciendo ngulo recto sobre el movimiento (a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj. 5. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar OGY o Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol. 6. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar OGY o agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol 7. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 22C +/2C (temperatura ambiente) durante 5 7 das
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 20 y 100 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin. Se reporta como unidades formadoras de colonia(ufc) /g ml
Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 20 y mayores de 100 colonias, contar las cuatro cajas, calcular el recuento para cada una de las diluciones y sacar el promedio entre las dos.
3.8 RECUENTO DE ESTAFILOCOCO COAGULASA POSITIVA
La presencia de Staphylococcus aureus en un alimento se interpreta como indicativo de contaminacin a partir de piel, boca y fosas nasales de los manipuladores de alimentos, material, equipos sucios y materias primas de origen animal contaminados. Las intoxicaciones estafilocccicas son causadas por la ingestin de alimentos que contienen una de las enterotoxinas producidas por el Staphylococcus aureus alimento. en el
Equipo y Material
Bao de agua a 45 50C Refrigerador a 0 5C Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Varillas de vidrio de hockey Gradillas Tubos tapa rosca
Agar base selectivo para estafilococo segn Baird Parker (medio 5) Caldo infusin cerebro corazn, B.H.I. (medio 6) Plasma deshidratado de conejo, E.D.T.A Solucin salina estril al 0.85% (reactivo 4) Telurito de potasio al 3.5% (reactivo 5) Emulsin de yema de huevo al 20% (reactivo 6)
Procedimiento
1. Preparar las placas de Agar Baird Parker, dejar solidificar y secar la superficie de las placas. 2. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. 3. Pipetear 0.1 ml de cada una de las diluciones sobre la superficie del Agar 4. Extender el inculo sobre la superficie del Agar, con la ayuda de la varilla de hockey, hasta que la superficie quede seca 5. Invertir las placas e incubarlas a 35C +/-2C durante 48 horas 6. Seleccionar las placas que presenten entre 20 y 200 colonias aisladas y contar las colonias negras y brillantes, con bordes reducidos blancos, rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco, zona de precipitado. 7. Tomar un minuto de 3 colonias y realizar la prueba de coagulasa.
Prueba de coagulasa
1. Transferir el nmero de colonias a confirmar a un nmero igual de tubos que contienen 5 ml de caldo de infusin cerebro corazn (BHI) 2. Hacer un control positivo sembrando una cepta de estafilococo coagulasa positiva en un caldo BHI 3. Incubar a 35C +/-2C durante 18-24 horas 4. Pasado este tiempo, transferir 0.3 ml de cada uno de los cultivos de caldo infusin cerebro corazn (BHI) a tubos que contienen 0.3 ml de plasma deshidratado de conejo E.D.T.A 5. Transferir a un tubo 0.3 ml de plasma deshidratado de conejo como control negativo 6. Incubar a 35C +/-2C 7. Observar cada hora, durante 6 horas. En caso negativo descartar hasta las 24 horas 8. Una vez finalizado el tiempo de incubacin, hacer la lectura con base en los tubos que presentan coagulacin del plasma comparndolos con los controles positivo y negativo
9. Sobre el nmero total de colonias despus de las 48 horas de incubacin y la proporcin de colonias confirmadas por la prueba de la coagulasa, hacer el clculo de estafilococo coagulasa positiva, utilizando como factor de correccin la relacin: Colonias positivas Colonias examinadas Ejemplo: Recuento en 10-2 :
35 colonias = 3.500
Colonias examinadas = 5 Colonias positivas = 4
3.500 x 4 = 2.800 ufc/ g /ml 5
Ausencia de colonias; expresar los resultados como: Estafilococo coagulasa positiva < 100 ufc / g ml
3.9 RECUENTO DE BACILLUS CEREUS
Bacillus cereus es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado, comn en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un nmero alto, mayor de 106 colonias/g, en un alimento puede ocasionar intoxicacin alimentaria.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C Bao de agua a 45 50C Refrigerador a 0-5C Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Varillas de vidrio de hockey Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca
Agar selectivo para cereus segn Mossel (medio 7) Agar almidn (medio 8) Agar gelatina (medio 9) Agar leche (medio 10) Caldo carbohidrato rojo de fenol, (glucosa, xilosa, arabonosa) (medio 11) Caldo nitrato (medio 12) Caldo Smith, (Acetil metil carbinol) (medio 13) Solucin de polimixina (reactivo 7) Reactivo de Griess (reactivo 8) Solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40% (reactivo 9) Solucin alfa naftol (reactivo 10) Cloruro de mercurio sublimado al 15% (reactivo 11) Polvo de zinc
Colorantes para tincin de Gram (reactivos No. 12) Emulsin de yema de huevo al 10% (reactivo 6)
Procedimiento
1. Preparar las placas de Agar selectivo para cereus (15 ml de medio aproximadamente por placa), dejar solidificar y secar la superficie de las placas. 2. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 3. Pipetear 0.1 ml de cada una de las diluciones sobre la superficie del Agar 4. Extender el inculo sobre toda la superficie del Agar, con la ayuda de la varilla de hockey, hasta que la superficie quede seca 5. Invertir las placas e incubarlas a 35C +/- 2C durante 18-24 horas 6. Contar las colonias rosadas(manitol negativo) que presenten un halo denso (lecitina positiva) sobre un fondo rojo violeta. 7. Tomar como mnimo 3 colonias tpicas y colorearlas por el mtodo de Gram. Se observan bacilos Gram positivos, con extremos cuadrados, en cadenas cortas o largas, con esporas elipsoidales, centrales o subterminales de pared fina que no deforman el bacilo.
Confirmacin bioqumica de las colonias de Bacillus cereus
Inocular con asa los tubos de los caldos glucosa, xilosa, arabinosa, el caldo nitrato y el cado glucosa tamponado. Sembrar por estra el Agar leche, Agar almidn y Agar gelatina Incubar a 35C +/- 2C durante 48 horas Pasado este tiempo revelar las pruebas bioqumicas:
Reduccin de Nitratos:
Aadir a cada uno de los tubos, unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta. El color rojo representan una prueba positiva de reduccin de nitratos. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba con polvo de zinc.
A los tubos negativos de la prueba de Griess; agregar una pequea cantidad de polvo de zinc, agitar.
Color rojo: No reduccin de nitratos Color del reactivo: Reduccin de nitratos Fermentacin de carbohidratos (glucosa, xilosa y arabinosa):
Observar el cambio de color, segn el indicador de pH utilizado Rojo de fenol: vira de amarillo a rosado cuando la reaccin es positiva Andrade: vira de rosado a amarillo cuando la reaccin es positiva
Produccin de Acetil-metil-carbinol segn Smith:
Comprobar la presencia de acetilmetilcarbinol en el caldo glucosa tamponado. Aadiendo 0.6 ml de la solucin de alfa naftol al 5% y 0.2 ml de una solucin de hidrxido de potasio al 40%, agitar suavemente. La produccin de un color definido rosa a rojo indica una reaccin positiva.
Hidrlisis de la casena:
La aparicin de una zona clara alrededor de la estra realizada en Agar leche indica hidrlisis de la casena.
Hidrlisis de almidn:
Cubrir la superficie de la placa de Agar almidn con solucin de lugol. La aparicin de una zona clara alrededor de la estra indica la hidrlisis del almidn.
Hidrlisis de la gelatina:
Verter sobre la superficie de la placa de Agar gelatina, cloruro de mercurio al 15% y eliminarlo despus de cinco minutos, lavar con agua corriente, la reaccin es positiva cuando una zona clara rodea la estra.
Bioqumica del Bacillus cereus
Fermentacin de Manitol
Fermentacin arabinosa
de
Presencia de lecitinasa Fermentacin de glucosa Reduccin de Nitrato Fermentacin de xilosa
Hidrlisis de la gelatina Hidrlisis de la casena Hidrlisis de almidn Acetil-metil-carbinol
+ sin gas
+ -
+
+ +
Sobre el nmero total de colonias despus de las 48 horas de incubacin y la proporcin de colonias confirmadas por las pruebas bioqumicas, hacer el clculo utilizando como factor de correccin la siguiente relacin: Colonias positivas Colonias examinadas
Ejemplo: 10-2 : 6 colonias
= 600
colonias examinadas = 3 colonias positivas =2
600 x 2 = 400 ufc / g /ml 3
Ausencia de colonias; expresar el resultado como: Bacillus cereus < 100 ufc / g ml
3.10
RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR
Este anlisis es considerado como el recuento indicador ms importante de las bacterias anaerobias esproformadoras. Varias especies del gnero Clostridium tienen la
propiedad de reducir el in sulfito a sulfuro, que en presencia de citrato frrico u otra sal de metales pesados dan colonias negras.
Equipo y material
Bao de agua a 45-50C Refrigerador a 0-5C Campanas de anaerobiosis Pipetas de 1 ml estriles Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca de 150 x 15 mm estriles
Agar sulfito polimixina sulfadiazina, SPS (medio 14) Agar triptosa sulfito cicloserina (medio 15) Reactivo coloracin de Gram (reactivos 12)
Procedimiento
1.
2. 3.
Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones en tubos estriles Calentar los tubos con cada una de las diluciones, a 80C por 10 minutos. Enfriar rpidamente en agua corriente
4. 5. 6. 7.
Adicionar 10-12 ml de Agar SPS o Agar sulfito cicloserina. Dejar solidificar Adicionar una segunda capa de medio. Dejar solidificar Incubar a 35C +/-2C por 72horas Observar diariamente los tubos, debido a la produccin de color negro por la formacin de H2S que puede invadir el medio siendo difcil su lectura
8.
Hacer la lectura con base en los tubos que presenten 5-50 colonias de color negro
9.
Calcular el nmero total de colonias multiplicndolo por el inverso de la dilucin
3.11
RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Clostridium perfringens es un contaminante comn de los alimentos crudos y de los ingredientes de muchos alimentos. Este microorganismo, por su capacidad de producir
esporas resistentes puede sobrevivir en bajo nmero en algunos alimentos tratados trmicamente y al ser almacenados inadecuadamente o recalentados, se pueden incrementar y producir un brote de intoxicacin.
Equipo y material
Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C Bao de agua a 46C +/-0.5C Refrigerador a 0-5C Campanas de anaerobiosis Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca estriles
Agar sulfito polimixina sulfadiazina, SPS (medio 14) Agar triptosa sulfito cicloserina (medio 15) Agar TSN-Agar selectivo para Clostridium perfringens segn Marschall (medio 16) Agar movilidad nitratos (medio 17) Agar lactosa gelatina (medio 18) Caldo de carne cocida (medio 19) Caldo tioglicolato (medio 20) Reactivo de Griess (reactivo 8) Reactivo coloracin de Gram (reactivos 12) Perxido de hidrgeno al 3% (reactivo 13)
Procedimiento
1.
Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado, mezclando cuidadosamente sin agitar
2. 3.
Pipetear por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en cajas de petri Verter en cada caja 15 ml de Agar SPS Agar triptosa sulfito cicloserina y mezclar en la forma recomendada
4. 5. 6.
Colocar las placas con la tapa hacia arriba en la campana de anaerobiosis Incubar a 35C +/-2C por 48 horas Seleccionar las placas que presenten entre 20-200 colonias y contar todas las colonias negras.
Identificacin bioqumica de Clostridium perfringens
Elegir como mnimo 3 colonias tpicas (negras) y sembrar cada una en caldo tioglicolato o caldo de carne cocida. Incubar en bao de agua a 46C +/-0.5C durante 3-4 horas Comprobar la pureza de los cultivos haciendo frotis y coloracin de Gram A partir del Caldo tioglicolato o caldo de carne, sembrar por puncin las pruebas bioqumicas. Incubar a 35C durante 24-48 horas, no es necesario incubar en anaerobiosis
Prueba de catalasa: Tomar aproximadamente 3 ml de cada uno de los cultivos de Caldo tioglicolato o Caldo de carne y mezclar en otro tubo con 0.5 ml de perxido de hidrgeno al 3%. Si se liberan algunas burbujas de gas se considera una reaccin positiva. Movilidad nitratos: Observar el tipo de crecimiento a lo largo de la lnea de picadura. Los microorganismos no mviles producen un crecimiento que se limita a la lnea de picadura, mientras que un crecimiento difuso en el medio indica que el microorganismo es mvil.
Comprobar la presencia de nitritos en el medio movilidad-nitratos aadiendo a cada un de los tubos, unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta: El color rojo representa una prueba positiva de reduccin de nitratos. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba con polvo de zinc.
A los tubos negativos de la prueba de Griess, agregar una pequea cantidad de polvo de zinc, agitar.
Color rojo: No reduccin de nitratos
Color del reactivo: Reduccin de nitratos Lactosa gelatina: La fermentacin de la lactosa se evidencia por el cambio de color del medio a amarillo y adems hay produccin de gas. Una vez leda la fermentacin de la lactosa, colocar los tubos lactosa-gelatina en refrigeracin por 10 minutos y observar la licuefaccin de la gelatina, en caso de ser negativa, incubar 24 horas adicionales. Coloracin de Gram: Bastones grandes Gram positivos, con los extremos redondeados, con o sin esporas subterminales no deformantes.
Bioqumica de Clostridium perfrigens
Movilidad Catalasa Fermentacin de lactosa Reduccin de Nitrato Licuefaccin de gelatina
+(sin gas) + +
Sobre el nmero total de colonias despus de las 48 horas de incubacin y la proporcin de colonias confirmadas por las pruebas bioqumicas, hacer el clculo utilizando como factor de correccin, la siguiente relacin:
Colonias positivas Colonias examinadas
Ejemplo: Recuento en 10-1 :
8 colonias = 80
Colonias examinadas = 5 Colonias positivas =3
80
3 = 48 ufc/g /ml
Ausencia de colonias: Expresar los resultados como: Recuento de Clostridium perfrigens: < 10 ufc / g/ ml
3.12
DETERMINACIN DE LA TERMONUCLEASA
El Staphylococcus aureus produce la enzima desoxirribunucleasa, que es termoestable, caracterstica exclusiva de esta bacteria. El hallazgo de esta enzima en un alimento es indicador de un abundante desarrollo de Staphylococcus aureus y de posible presencia de enterotoxina estafilocccica.
Equipo y material Incubadora a 35C +/- 2C Bao de agua hirviendo Refrigerador a 0-5C Cajas de petri estriles Pipetas Pasteur estriles Tubos capilares con extremos abiertos Gradillas Tubos tapa rosca estriles
Medios de cultivo y reactivos Agar Azul de toluidina, DNA (medio 21) Caldo infusin cerebro corazn, B.H.I (medio 6)
Procedimiento:
1. Transferir el nmero de colonias a confirmar a un nmero igual de tubos que contienen 5 ml de caldo infusin cerebro corazn (BHI). 2. Hacer un control positivo, sembrando una cepa conocida de Staphylococcus termonucleasa positiva en un caldo BHI.
3. Hacer un control negativo, sembrando una cepa de Micrococcus en un caldo BHI 4. Incubar a 35C +/- 2 durante 18 a 24 horas 5. Preparar las placas de Agar azul de toluidina (DNA). Dejar solidificar y secarlas 6. Una vez solidificado el medio, con la ayuda de los tubos capilares de 2mm de dimetro, practicar varias perforaciones, eliminando por aspiracin los tapones de medio 7. Pasado el tiempo de incubacin de los cultivos en BHI colocarlos por 15 minutos en un bao de agua hirviendo. 8. Colocar con la pipeta de pasteur, 3 microlitros en cada perforacin 9. Incubar las placas a 37C durante 3-4 horas 10. Un halo rosa alrededor de la perforacin, que se extiende ms o menos 1 mm, indica una reaccin positiva.
3.13
DETERMINACIN DE COLIFORMES EN ALIMENTOS.
NMERO MS
PROBABLE (NMP)
Este
grupo
de
microorganismos
comprende
varios
gneros
de
la
familia
Enterobacteriacea; est ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo. Tambin es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente.
Su presencia en alimentos es signo de mala calidad higinica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores, recontaminacin despus del proceso y an de contaminacin fecal.
Equipo y material Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/- 2C Pipetas bacteriolgicas de 1 ml estriles Asa de inoculacin Gradillas Cajas de petri Tupos tapa rosca de 150x180 mm Tubos de fermentacin (Durham)
Medios de cultivo y reactivos Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22) Agar eosina azul de metileno segn Levine E.M.B.(medio 23) Agar Endo (medio 24) Agar violeta cristal rojo neutro bilis (V.R.B.A.) (medio 25)
Procedimiento
Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.
Prueba Presuntiva
1. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos con caldo lactosado bilis verde brillante al 2%, utilizando tres tubos por cada dilucin. 2. Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35C +/-2C por 24-48 horas 3. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en el tubo de Durham. Si a las 24 horas todos los tubos muestran produccin de gas, continuar con la prueba confirmativa.
Prueba confirmativa
1. Confirmar que los tubos con produccin de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% de la prueba presuntiva, con positivos a organismos del grupo coliforme, sembrando por estra una asada de cada uno de los tubos en la superficie de una placa de Agar eosina azul de metileno (EMB), Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA), o Agar Endo, 2. Incubar las placas invertidas a 35C +/- 2C por 24 horas 3. Pasado este tiempo se hace la lectura de las colonias tpicas de coliformes. 4. Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilucin. 5. Para obtener el NMP, proceder de la siguiente manera: Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos en los que se confirm la
presencia de coliformes.
Buscar en la tabla del NMP (tabla 16) y anotar el
resultado correspondiente al nmero de tubos positivos de cada dilucin. 6. Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo o ml de alimento utilizar la siguiente frmula:
NMP de la tabla x factor de dilucin intermedio = NMP / g ml 100
Ejemplo:
Si se obtuvieron los siguientes datos en la prueba confirmativa: tubos positivos en la dilucin 10-1 1 tubo positivo en la dilucin 10-2 1 tubo positivo en la dilucin 10-3
3 4 5
Tabla NMP 2: 1: 1 = 20
Aplicando la frmula:
20 x 100 = 20 coliformes / g /ml 100
Expresar los resultados como NMP de coliformes /g /ml
3.14
DETERMINACIN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL EN ALIMENTOS
NMERO MS PROBABLE (NMP)
Se utiliza para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes del intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros orgenes.
Equipo y material Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Bao de agua con rotacin, graduado a 44.5C +/-0.5C Asa de inoculacin Gradillas Tupos tapa rosca de 15 x 150 mm y de 18 x 150 mm
Tubos de fermentacin (Durham) de 50 x 10 mm
Medios de cultivo y reactivos Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22) Caldo Triptfano (medio 26) Reactivo de Kovac`s (reactivo 14)
Procedimiento:
Prueba de Mac-kenzie:
1. A partir de los tubos positivos, con produccin de gas de la prueba presuntiva del NMP de coliformes, transferir de cada tubo una asada de cultivo en: a. Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% conteniendo un tubo de fermentacin de Durham b. Caldo Triptfano 2. Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44.5C +/-0.5C por 48 horas, en bao de agua con rotacin, teniendo cuidado de que el nivel de agua del bao sobrepase el nivel del medio de cultivo. 3. Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente manera: a. Observar la produccin de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% b. Revelar el caldo Triptfano, de los tubos gas positivo, adicionando 0.2 ml del reactivo de kovac`s, agitar suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amlico indicando la presencia de indol cuando la prueba es positiva o el color original de medio cuando la prueba es negativa 4. Considerar como coliformes de origen fecal lo que demuestren positividad en ambas pruebas: gas positivo e indol positivo 5. Confrontar los resultados con la tabla de NMP (tabla 16).
Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales g ml
3.15
DETERMINACIN
DE
COLIFORMES
EN
AGUA
TRATADA
ENVASADA
Este
grupo
de
microorganismos
comprende
varios
gneros
de
la
familia
Enterobacteriacea, est ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo. Tambin es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Su presencia en agua tratada envasada es signo de mala calidad higinica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores, recontaminacin despus del proceso y an de contaminacin fecal.
Equipo y material Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/-2C Pipetas bacteriolgicas de 1 ml estriles Asa de inoculacin Gradillas Tubos tapa rosca de 150 y 20 x 180 mm
Medios de Cultivo Caldo lactosado doble concentracin (medio 27) Caldo lactosado simple concentracin (medio 28) Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22) Solucin amortiguadora de fosfato (reactivo)
Prueba presuntiva:
1. Pipetear 10 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado doble concentracin. 2. Pipetear 1 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado simple concentracin. 3. Pipetear 1 ml de la muestra en un tubo que contiene 9 ml de solucin amortiguadora de fosfatos para obtener la dilucin 10-1 4. Pipetear 1 ml de la dilucin 10-1 en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado simple concentracin 5. Incubar los tubos a 35C +/-2C por 48 horas
6. Pasadas las 48 horas, examinar y anotar los tubos que muestren produccin de gas, la cual se observa por desplazamiento del medio de cultivo en el tubo de fermentacin (Durham) 7. Si a las 24 horas todos los tubos muestran produccin de gas, continuar con la prueba confirmativa.
Prueba confirmativa:
1. Confirmar los tubos de caldo lactosado, que hayan presentado produccin de gas, transfiriendo 0.1 ml una asada de cada uno de los tubos a tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado bilis verde brillante al 2% 2. Incubar los tubos a 35C +/-2C por 24-48 horas 3. Pasado este tiempo anotar los tubos que hayan presentado fermentacin con produccin de gas, constituyendo una prueba positiva. 4. Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilucin. 5. 5. Buscar en la tabla de NMP (tabla 17) y anotar el resultado correspondiente al nmero de tubos positivos de cada dilucin. Informar el valor correspondiente al nmero de tubos positivos para organismos coliformes en 100 ml de agua.
Expresar los resultados como NMP de coliformes en 100 ml
3.16
DETERMINACIN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL EN AGUA ENVASADA
Se utiliza para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes del intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros orgenes.
Equipo y material Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Bao de agua con rotacin, graduado a 44.5C +/-0.5C Asa de inoculacin Gradillas Tupos tapa rosca de 15 x 150 mm y de 18 x 150 mm Tubos de fermentacin (Durham) de 50 x 10 mm
Medios de cultivo y reactivos Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22) Caldo Triptfano (medio 26) Reactivo de Kovac`s (reactivo 14)
Procedimiento
Prueba de Mac-kenzie:
1. A partir de los tubos positivos, con produccin de gas de la prueba presuntiva del NMP de coliformes, transferir de cada tubo una asada de cultivo en:
a. Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% conteniendo un tubo de fermentacin de Durham b. Caldo Triptfano 2. Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44.5C +/-0.5C por 48 horas, en bao de agua con rotacin, teniendo cuidado de que el nivel de agua del bao sobrepase el nivel del medio de cultivo. 3. Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente manera: a. Observar la produccin de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% b. Revelar el caldo Triptfano, de los tubos gas positivo, adicionando 0.2 ml del reactivo de kovac`s, agitar suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amlico indicando la presencia de indol cuando la prueba es positiva o el color original de medio cuando la prueba es negativa. 4. Considerar como coliformes de origen fecal los que demuestren positividad en ambas pruebas: gas positivo e indol positivo 5. Confrontar los resultado con la tabla de NMP (tabla 17)
Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales /g /ml
3.17
DETERMINACIN DE PSEUDOMONA AERUGINOSA EN AGUA TRATADA
ENVASADA. NMERO MS PROBABLE (NMP)
Son bacilos Gram negativos, que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, agua, suelo, hortalizas, aves y productos marinos. La Pseudomona
aeruginosa es la especie ms importante en la alteracin de los alimentos refrigerados debido a su carcter psicrotrfico.
Equipo y material Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35C +/- 2C Pipetas bacteriolgicas de 1 ml estriles Asa de inoculacin Gradillas Tubos tapa rosca de 18 x 150 y 20 x 180 mm Lmpara de luz ultravioleta de onda larga.
Medios de cultivo Caldo asparagina doble concentracin (medio 29) Caldo asparagina simple concentracin (medio 30) Caldo acetamida o Agar acetamida inclinado (medio 31) Solucin amortiguadora de fosfato (reactivo 15)
Prueba presuntiva:
1. Pipetear 10 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina doble concentracin 2. Pipetear 1 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina simple concentracin. 3. Pipetear 1 ml de la muestra en un tubo que contiene 9 ml de solucin amortiguadora de fosfatos para obtener la dilucin 10-1 4. Pipetear 1 ml de la dilucin 10-1 en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina simple concentracin 5. Incubar los tubos a 35C +/-2C por 48 horas 6. Pasadas las 48 horas, examinar los tubos bajo la luz ultravioleta con onda larga en cuarto oscuro.
7. La produccin de un pigmento fluorescente constituye una prueba presuntiva positiva.
Prueba confirmativa
1.
Confirmar los tubos de caldo asparagina, que hayan presentado fluorescencia, transfiriendo 0.1 ml de cada uno de ellos en tubos que contienen 10 ml de caldo acetamida o sembrando por picadura y estra en agar acetamida.
2. 3.
Incubar los tubos a 35C +/-2C por 36 horas Pasado este tiempo anotar los tubos que hayan presentado color rosado-violeta, producido por la elevacin del pH debido a la produccin de amoniaco, constituyendo una prueba positiva.
4.
Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos en cada dilucin y obtener el resultado en la tabla de NMP (tabla 17).
Expresar los resultados como NMP de Pseudomona aeruginosa en 100 ml
3.18
DETERMINACIN DE SALMONELLA
La nica va de entrada de la Salmonella en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de suma importancia el anlisis de los alimentos para detectar su presencia. Todas las especies deben ser consideradas como potencialmente patgenas para el hombre. La presencia de Salmonella sp en productos procesados trmicamente, indica tratamiento inadecuado o contaminacin pos proceso.
An no es posible recomendar un solo mtodo para el aislamiento y la identificacin de Salmonella, que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos. Los mtodos que se utilizan son similares en principio; comprenden varias etapas sucesivas: enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, siembra en placas con medios
slidos selectivos y diferenciales, caracterizacin bioqumica de las colonias sospechosas, confirmacin serolgica y tipificacin por medio de bacterifagos.
Equipo y material Incubadora a 35C +/-2C
Bao de agua a 43C +/-0.2C Refrigerador a 0-5C Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Grdillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca estriles Pipeteador Frascos estriles con capacidad de 500 ml Cabina de flujo laminar Asa de inoculacin Bolsas de plstico estriles Homogenizador o aparato similar Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g sensibilidad 0.1 g Instrumentos para preparar las muestras Cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, morteros con sus respectivos pistilos estriles Lminas portaobjetos
Agua destilada estril Agua de peptona tamponada (medio 32)
Agar bismuto sulfito segn Wilson Blair (medio 33) Agar verde brillante lactosa-sacarosa, con novobiocina (BPLS) (medio 34) Agar xilosa, lisina desoxicolato, XLD (medio 35) Caldo selenito-cistina (medio 36) Caldo tetrationato (medio 37) Agar citrato de Simmons (medio 38) Agar hierro triple azcar (TSI) (medio 39) Agar fenil-alanina (APP) (medio 40) Agar motilidad (medio 41) Agar urea (medio 42) Caldo Triptfano (medio 26) Caldo lisina (medio 43)
Caldo nitrato (medio 12) Caldo rojo de metilo Voges Proskauer, (MR-VP) (medio 44) Reactivo para oxidasa (reactivo 16) Polvo de zinc Reactivo de Griess (reactivo 8) Rojo de metilo (reactivo 17) Solucin acuosa de verde brillante al 0.1% (reactivo 18) Solucin de yodo y yoduro potsico (reactivo 19) Solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40% (reactivo 9) Solucin de cloruro frrico al 10% (reactivo 20) Solucin de alfa-naftol (reactivo 10) Reactivos para coloracin de Gram (reactivo 12)
Procedimiento
El aislamiento de salmonella incluye cuatro etapas fundamentales: I. II. III. IV. Enriquecimiento no selectivo Enriquecimiento selectivo Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial Identificacin
I: Enriquecimiento no selectivo 1. Pesar en la bolsa para stomacher previamente tarada 25 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior 2. Aadir 225 ml de agua de peptona tamponada (medio de enriquecimiento no selectivo) 3. Cuando se analiza leche en polvo, utilizar agua destilada adicionada de 5 ml de solucin verde brillante al 0.1% 4. Colocar la bolsa en el stomacher y hacer funcionar el aparato por 2 minutos, el tiempo mximo de homogenizacin depender del tipo de alimento. sobrepasar los 3 minutos. 5. Incubar a 35C +/-2 por 18 24 horas 6. Realizar controles positivo y negativo con cepas conocidas No debe
II.
Enriquecimiento selectivo
1. Transferir 1 ml de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo selenito cistina. 2. Incubar en bao a 43C +/- 0.2 por18-24 horas 3. Transferir 1 ml de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo tetrationato, adicionado de 0.2 ml de solucin de yodo y 0.1 ml de solucin acuosa de verde brillante al 0.1% 4. Incubar en bao de agua 43C +/-0.2 por 18-24 horas
III.
Siembra en placa con medios selectivos y diferenciales
Se deben utilizar mnimo dos medios selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y selectivo, para el aislamiento del microorganismo. El laboratorio puede utilizar el medio diferencial de su eleccin, se recomienda el Agar bismuto sulfito, el Agar Verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el Agar XLD.
1.
A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo, sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con Agar verde brillante lactosa-sacarosa, Agar bismuto sulfito o Agar XLD.
2. 3. 4. 5.
Incubar las placas a 35C +/- 2 durante 24-48 horas Escoger 3 colonias tpicas sospechosas de Salmonella (lactosa negativa) Aislarlas en Agar selectivo para garantizar su pureza Proceder a su identificacin
IV.
Identificacin de Salmonella
La identificacin de cultivos sospechosos de pertenecer al gnero Salmonella sp incluye dos etapas seguidas: Comprobacin de las colonias sospechosas mediante pruebas bioqumicas determinativas Identificacin serolgica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros. Identificacin de Salmonella mediante pruebas bioqumicas
Coloracin de Gram:
Hacer frotis de cada una de las colonias seleccionadas y colorearlas por el mtodo de Gram. Salmonella: bacilo Gram negativo, no esporulado. Prueba de la Oxidasa:
En una caja de petri, colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa. Hacer un extendido, con asa de vidrio o palillo de madera, de una colonia sospechosa, sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, siguiendo una lnea de 3 a 6 mm de longitud. Si se produce un cambio de color a azul o violeta indica una prueba positiva. Fermentacin de carbohidratos: Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos glucosa, lactosa y sacarosa. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas Si se produce un cambio de color, segn el indicador de pH utilizado, la reaccin es positiva.
Prueba de la Lisina decarboxilasa:
Inocular con asa el tubo con el aminocido L-lisina, colocar una capa de aceite mineral estril Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas El cambio de color a prpura indica una prueba positiva
Movilidad
Inocular con asa recta por puncin central, a una profundidad de a de pulgada, tubos con Agar movilidad. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas
El crecimiento es positivo si el microorganismo migra de la lnea de siembra y se difunde a travs del medio. Cuando es inmvil slo crece en la lnea de siembra.
Reduccin de nitrato
Inocular con asa recta tubos de caldo nitrato. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas. Revelar la prueba de nitrato aadiendo unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta. La aparicin de un color rojo, indica presencia de nitritos (positividad); en el caso de que no ocurra cambio de color aadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato residual. La
aparicin de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto una reaccin negativa.
Reaccin en Agar hierro triple azcar:
Inocular cada uno de los tubos de Agar TSI, sembrando por estra la parte inclinada y por picadura la columna del medio. Incubar a 35C +/- 2C por 24- 48 horas. Los cultivos de Salmonella producirn una reaccin K/A con produccin de gas y produccin de H2S. Reaccin en Agar citrato de Simmons:
Inocular cada uno de los tubos de Agar Citrato de Simons, sembrando por picadura la columna del medio. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. Una reaccin positiva estar dada por un viraje del color verde a azul intenso.
Reaccin en Agar LIA:
Inocular cada uno de los tubos de Agar LIA, sembrando por doble picadura la columna del medio y por estra la superficie. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas. Los cultivos de Salmonella producirn una reaccin K/K. Reaccin en Agar urea:
Inocular cada uno de los tubos de Agar urea, sembrando por estra la parte inclinada. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas Se observa una reaccin positiva cuando el color del medio vira a rosado violeta.
Determinacin de fenilalanina (APP):
Inocular cada uno de los tubos de Agar fenilalanina, sembrando por estra la parte inclinada. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas Revelar aadiendo 3 a 5 gotas de cloruro frrico al 10% sobre la estra de crecimiento. Un color verde indica positividad de la reaccin. Produccin de Indol
Inocular cada uno de los tubos de Caldo Triptfano. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas. Revelar aadiendo 3 a 5 gotas de reactivo de Kovac`s. Un anillo color cereza en la superficie del medio indica una reaccin positiva. Rojo de metilo Voges Proskauer (MR-VP)
Inocular dos de los tubos con Caldo MR-VP. Incubar a 35C +/- 2C por 24-48 horas.
Revelar el rojo de metilo (MR) agregando a uno de los tubos 4 a 6 gotas de rojo de metilo. Un color rojo indica positividad de la reaccin.
Revelar el Voges Proskauer (VP), aadiendo en el otro tubo 0.6 ml de alfa naftol al 5% y 0.2 ml de solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40%. Agitar el tubo
suavemente y dejar en reposo por 10 minutos. Un color rojo indica positividad de la reaccin.
3.19
DETERMINACIN DE VIBRIO CHOLERAE
El Vibro cholerae pertenece a la familia Vibrionaceae, gnero Vibrio.
Es un bacilo
pequeo, curvo, mvil mediante un flagelo polar nico, no encapsulado, no esporulado, Gram negativo, aerobio y anaerobio facultativo, oxidada positivo.
El Vibro cholerae 01 es agente causal del clera, enfermedad diarreica producida por una toxina segregada por el microorganismo en el intestino, suele presentarse en comunidades donde las prcticas de higiene son muy deficientes. El vibrio cholerae 01 se
divide en 2 biotipos, el Clsico y el Tor y puede pertenecer a los serotipos Ogawa, Inaba e Hikojima.
Equipo y material Incubadora a 35C +/- 2C Refrigerador a 0 5C Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Frascos estriles con capacidad de 500 ml Cabina de flujo laminar Pipeteador Microscopio Asa de inoculacin Gradillas Bolsas de plstico estriles Homogenizador o aparato similar Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g sensibilidad 0.1 g Instrumentos para preparar las muestras Cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, morteros con sus respectivos pistilos estriles Lminas portaobjetos Tubos tapa rosca estriles
Medios de cultivo y reactivos Agua de peptona alcalina (medio 45) Agar Tiosulfato citrato sales biliares sacarosa. T.C.B.S. (medio 46) Agar nutritivo con NaCl al 1% (medio 47) Agar infusin cerebro corazn, (BHI) (medio 48) Caldo de peptona azcar 1%: glucosa, sacarosa, arabinosa, manosa, manitol, e inositol (medio 49) Caldo L-lisina 1%, L-arginina 1%, L-ornitina 1% (medio 50) Agar hierro triple azcar (TSI) (medio 39) Agar Kliger (medio 51) Caldo nitrato (medio 12)
Reactivo de Griess (reactivo 8) Polvo de zinc Desoxicolato sdico 0.5% (reactivo 21) Reactivo para Oxidasa (reactivo 16) Reactivos para coloracin de Gram (reactivo 12) Antisueros (Polivalente, Inaba, Ogawa) Preparacin de la muestra para el anlisis Pescado entero: remover la carne alrededor de las tripas, agallas y piel, para conformar la unidad de muestra necesaria para el anlisis. Moluscos: preparar una muestra de 10 a 12 animales 20 a 30 animales pequeos que incluya el licor de conchas, para conformar la unidad de muestra necesaria para el anlisis. Crustceos: extraer la carne para conformar la unidad de muestra Frutas y vegetales: enjuagar cada fruta o vegetal con el agua peptonada
alcalina (225 ml) en una bolsa plstica estril Frutas pequeas: utilizar 5 unidades (ejemplo 5 tomates) Frutas grandes: utilizar una unidad (ejemplo meln, sanda) Vegetales con hojas: tomar mnimo 5 hojas externas completas.
Procedimiento
1. Pesar 25 g del total de la muestra en un Erlenmeyer o frasco que contenga 225 ml de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente. 2. Incubar a 35C +/- 2C por 6 8 horas 3. Pasado el tiempo de incubacin, sin mezclar el frasco o Erlenmeyer, realizar un barrido de la superficie del cultivo con el asa y sembrar en superficie por agotamiento en Agar Tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (T.C.B.S.) 4. Incubar a 35C +/-2C por 18-24 horas 5. Pasado este tiempo observar las colonias tpicas de V.cholerae en el Agar TCBS las cuales son grandes, (2-3 mm) lisas, amarillas y ligeramente aplanadas, con el centro opaco y la periferia translcida. 6. Tomar un mnimo de 3 colonias y sembrar en Agar nutritivo o en Agar BHI por estra e incubar a 35C +/-2C por 18-24 horas
7. Pasado este tiempo realizar la prueba de la oxidasa y de la cuerda de la siguiente manera:
Prueba de la Oxidasa:
En una caja de petri, colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa. Hacer un extendido con asa de vidrio o palillo de madera de una colonia sospechosa, sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, siguiendo una lnea de 3 a 6 mm de longitud. Reaccin positiva: azul violeta Reaccin negativa: No hay cambio de color Hacer controles positivo negativo con cepas conocidas. Prueba de la cuerda:
Elegir una colonia del Agar nutritivo o Agar BHI, emulsificarla sobre una lmina portaobjeto, con ayuda de un asa, en una gota de suspensin acuosa al 0.5% de desoxicolato sdico. En 60 segundos se forma una masa mucoide, que al ser elevada del portaobjeto, por medio del asa, forma hilos. Si la prueba de la oxidasa y de la cuerda son positivas; a partir de las colonias de Agar nutritivo o Agar BHI realizar las pruebas bioqumicas. Identificacin de Vibrio cholerae mediante pruebas bioqumicas
Fermentacin de carbohidratos
Inocular con asa los tubos con caldo carbohidrato azcar 1%:
glucosa, sacarosa,
arabinosa, manosa, manitol e inositol. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. Si se produce un cambio de color, segn indicador de pH utilizado, la reaccin es positiva. Prueba de la decarboxilacin de aminocidos
Inocular con asa cada uno de los tubos para los aminocidos L-lisina, L-arginina, Lornitina, colocar una capa de aceite mineral. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. El cambio de color a prpura indica una prueba positiva.
Reduccin de Nitratos
Inocular los tubos con Caldo nitrato. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. Aadir a cada uno de los tubos, unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta: El color rojo representa una prueba positiva de reduccin de nitratos. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba del polvo de zinc. A los tubos negativos de la prueba de Griess, agregar una pequea cantidad de polvo de zinc y agitar. Un color rojo indica la no reduccin de nitratos, el color del reactivo indica la reduccin de nitratos.
Reaccin en Agar hierro triple azcar
Inocular cada uno de los tubos de Agar TSI, sembrando por estra la parte inclinada y por picadura la columna del medio. Incubar a 35C +/-2C por 48 horas. Los cultivos de V.cholerae producirn una reaccin A/A sin produccin de gas, ni produccin de H2S. Reaccin en Kliger
Inocular cada uno de los tubos de Agar Kliger, sembrando por estra la parte inclinada y por picadura la columna del medio. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. Los cultivos de V.cholerae producirn una reaccin K/A sin produccin de gas ni H2S. Coloracin de Gram
Bacilos curvos Gram negativos Bioqumica de V. Cholerae
Oxidasa Glucosa Sacarosa Arabinosa Manosa Manitol
+ +(sin gas) + + +
Inositol Lisina Ornitina Arginina Nitratos
+ + +
Una vez identificadas las cepas por sus caractersticas bioqumicas, se procede a la identificacin serolgica.
Identificacin de Vibrio cholerae mediante pruebas serolgicas
1. Tomar una colonia aislada en Agar nutritivo o Agar BHI y emulsificarla con una gota de solucin salina 0.85% sobre una lmina portaobjeto. 2. Tomar otra colonia aislada en Agar nutritivo o Agar BHI y emulsificarla con una gota de antisuero polivalente sobre una lmina portaobjeto 3. Mezclar por minuto 4. Una reaccin positiva est dada por la aglutinacin con el antisuero polivalente, no se debe observar aglutinacin con la solucin salina. 5. Si se observa aglutinacin con el antisuero polivalente, realizar la prueba con los sueros Inaba y Ogawa. Interpretacin de las pruebas serolgicas Si se observa aglutinacin con el antisuero Ogawa se informa Vibro cholerae 01 serotipo Ogawa; Si se observa aglutinacin con el antisuero Inaba se informa Vibro cholerae 01 serotipo Inaba Si se observa aglutinacin con el antisuero Ogawa y con el antisuero Inaba se informa Vibro cholerae 01 serotipo Hikojima. Pruebas serolgicas
Polivalente + + + -
Inaba + + NR
Ogawa + + NR
Interpretacin V.cholerae 01 serotipo Inaba V.cholerae 01serotipo Ogawa V.cholerae 01 sereotipo Hikojima V.cholerae NO 01
NR: No se realiza
3.20
DETERMINACIN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
La principal va de entrada de Listeria monocytogenes en el cuerpo humano es la oral, por esto es de gran importancia el anlisis de los alimentos para detectar su presencia. An no es posible recomendar un solo mtodo para el aislamiento y la identificacin de L. Monocytogenes que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos. Los
mtodos que se utilizan son en esencia similares en principio; comprenden varias etapas sucesivas: enriquecimiento selectivo, siembra en placas de Agar selectivo, identificacin de las colonias con pruebas bioqumicas, confirmacin serolgica y tipificacin por medio de bacterifagos.
La presencia de L. Monocytogenes en productos procesados trmicamente, indica tratamiento inadecuado o contaminacin pos-proceso.
Equipo y material Centrfuga Cabina de flujo laminar Refrigerador a 0-5C Erlenmeyer con capacidad de 500 ml Incubadora a 30C y 35C +/-2C Bao de agua a 80C Microscopio Microscopio estereoscopio Homogenizador o aparato similar Balanza de una capacidad no inferior a 2.500 g y sensibilidad de 0.1 g Pipeteador Bolsas de plstico estriles para homogenizador Pipetas bacteriolgicas de 1 ml y 10 ml Asa de inoculacin Gradillas Cajas de petri Tubos de ensayo estriles Lminas portaobjetos
Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas, esptulas, sacabocados, morteros, pistilos, etc., previamente esterilizados.
Medios de cultivo y reactivos Caldo de enriquecimiento para Listeria, EB (medio 52) Agar Oxford en placa, OXA (medio 53) Agar Palcam en placa (medio 54) Agar triptosa con cido nalidixico en placas, ATN (medio 55) Agar tripticasa soya con extracto de levadura en placa, TSAYE (medio 56) Caldo de infusin cerebro corazn (medio 6) Agar movilidad nitrato modificado Hatano Schuch (medio 57) Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre desfibrinada de cordero* (medio 58) Agar Columbia doble capa al 5% de sangre desfibrinada de cobayo** (medio 59) Caldo carbohidrato rojo de fenol para los hidratos de carbono: xilosa, ramnosa manitol (medio 60) Agar infusin cerebro corazn, con superficie inclinada (medio 48) Caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (1)(medio 61) Caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (2)(medio 62) Agar triptosa, con superficie inclinada (medio 63) Solucin de acriflavina HCl al 0.5% en agua destilada (reactivo 22) Solucin de cido nalidxico sal sdica al 0.5% en agua destilada (reactivo 23) Solucin de cicloheximida al 1% en solucin al 40% de etanol-agua (reactivo 24) Perxido de hidrgeno al 3% (reactivo 13) Colorante de tincin de Gram (reactivo 12) Reactivo de Griess (reactivo 8) Polvo de zinc Solucin de xilosa al 5% (reactivo 25) Solucin de ramnosa al 5% (reactivo 26) Solucin de manitol al 10% (reactivo 27) Solucin salina estril 0.85% (reactivo 4) Solucin acriflavina al 1% en hidrxido de sodio 0.1N (reactivo 28)
Solucin de cido nalidxico sal sdica al 2% en hidrxido de sodio 0.1N (reactivo 29) Solucin de acriflavina al 0.2% en hidrxido de sodio 0.1N (reactivo 30) Hidrxido de sodio 0.1N (reactivo 31) Buffer FA-Difco
Kit de sueros tipificadores de Listeria Procedimiento para productos lcteos
La tcnica utilizada para el aislamiento e identificacin de L. Monocytogenes es la recomendada por la FDA, modificada en algunos aspectos.
El aislamiento de Listeria incluye tres etapas fundamentales: I. II. III. Enriquecimiento selectivo Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial Identificacin
I.
Enriquecimiento selectivo
1. Pesar en la bolsa para stomacher previamente tarada 25 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior) 2. Aadir 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB) 3. Colocar la bolsa en el stomacher y hacer funcionar el aparato por 2 minutos, el tiempo mximo de homogenizacin depender del tipo de alimento. No debe sobrepasar los 3 minutos. 4. Incubar a 30C +/-2C durante 24-48 horas
II.
Siembra en placa con medios selectivos a las 24 y 48 horas
1. Transferir una asada del cultivo obtenido en el caldo de enriquecimiento (EB) a placas con Agar Oxford y Palcam, aislar por agotamiento. 2. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas 3. Las colonias tpicas de L. Monocytogenes en las placas de Agar Oxford son de color verde negro con un halo negro, debido a la hidrlisis de la esculina.
4. Las colonias tpicas de L. Monocytogenes en las placas de Agar Palcal son de color verde grisceo con un halo marrn negro sobre un fondo rojo cereza, debido a la hidrlisis de la esculina y no fermentacin del manitol. 5. Otras bacterias pueden formar halos negros, pero el desarrollo de color toma ms de dos das. 6. Seleccionar 3-5 colonias tpicas de Listeria en cada placa de Agar utilizado. Primera purificacin
1.
Con asa recta tocar suavemente cada colonia seleccionada, sembrarla por agotamiento en una placa con Agar triptosa cido nalidxico (ATN).
2. 3.
Incubar a 35C +/- 2C por 18-24 horas Observar a las 24 horas las colonias crecidas en el Agar (ATN) por el mtodo de iluminacin de Henry con ayuda de un estereoscopio.
4. 5. 6.
Realizar control positivo: cepta L. Monocytogenes Realizar control negativo: cepa Streptococcus faecalis Las colonias de L. Monocytogenes son pequeas, de borde ntido, ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz incidente oblicua, exhiben superficie azulada.
7.
Las colonias de S. faecalis son amarillas hasta amarillas rojizas tornasoladas.
Segunda purificacin
1.
Tomar una colonia tpica de Listeria de cada placa de Agar (ATN) repicarla por agotamiento en una placa con Agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE).
2. 3.
Incubar a 35C +/-2C por 18-24 horas Adicionalmente realizar cultivos en fase estacionaria de cepas estndar de Staphylococcus aureus (CAMP +) y Rhodococcus equi
4. Transferir una asada de cada una de las cepas estndar a tubos con 5 ml de caldo de Infusin cerebro corazn. 5. Incubar a 35C +/-2C por 18-24 horas
III: Identificacin de Listeria
La identificacin de cultivos sospechosos de pertenecer al gnero Listeria incluye dos etapas seguidas:
Comprobacin determinativas.
de
las
colonias
sospechosas
mediante
pruebas
bioqumicas
Identificacin serolgica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros. Identificacin de Listeria mediante pruebas bioqumicas
A partir de los cultivos puros obtenidos en el Agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE) realizar las siguientes pruebas:
Mtodo de iluminacin de Henry
Observar las colonias con la ayuda de un estereoscopio. Un procedimiento sencillo es disponer de una fuente de luz blanca un espejo plano y un trpode. La luz debe de incidir sobre el espejo formando un ngulo de 45C y reflejarse hacia arriba atravesando la placa del Agar en un ngulo de 45 observar la placa mirndola desde arriba. Las colonias de L.monocytogenes son pequeas, de borde ntido, ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz indicente oblicua, exhiben superficie azulada.
Catalasa
Colocar en un portaobjeto una gota de perxido de hidrgeno al 3%
Suspender la colonia Observar si se producen o no burbujas de gas.
L. monocytogenes: catalasa (+) produce burbuja de gas
Coloracin de Gram
L.monocytogenes: bacilos o cocobacilos grampositivos En cultivos viejos: bacilos o cocos gramnegativos.
Descartar los cultivos que no cumplan con las siguientes caractersticas: a. Catalasa (+) b. Bacilos o cocobacilos grampositivos
Movilidad y reduccin de nitrato
Inocular con asa recta por puncin central tubos con Agar movilidad-nitrato modificado Hatano Schuch. Incubar a temperatura ambiente 2 5 das.
L.monocytogenes: crecimiento tpico en forma de sombrilla
Descartar los tubos que no presenten esta apariencia
Revelar la prueba de nitrato despus de la lectura de la movilidad, comprobar la presencia de nitritos en el medi de movilidad-nitrato, aadiendo unos miligramos del reactivo de Griess, la aparicin de un color rojo, indica presencia de nitritos (positiblidad); en el caso de que no ocurra cambio de color aadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato residual. La aparicin de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto una reaccin negativa.
Color rojo: no reduccin de nitrato Color del reactivo: reduccin del nitrato.
L. monocytogenes:
Nitrato (-) Crfecimiento tpico de sombrilla
Nota: Actualmente la prueba de reduccin de nitratos es opcional. Hemlisis
Dibujar una rejilla con 20-25 cuadrculas por placa en el fondo de una caja de petri con Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre de cordero Tomar una colonia tpica y sembrarla por picadura en una de las cuadrculas Incubar a 35C +/-2C por 24 horas Realizar controles positivo y negativo
L. monocytogenes: presenta ligera beta hemlisis L. ivanovii: presenta zonas bien delimitadas y amplias de hemlisis L. innocua: no muestra hemlisis
Este procedimiento tambin se puede realizar sembrando una colonia del cultivo puro en placas con Agar Columbia doble capa adicionado con 5% de sangre de cobayo.
Incubar a 35C +/-2C por 24 horas Prueba de CAMP.
Sembrar lneas verticales paralelas, de cultivos frescos de Staphylococcus aureus CAMP (+) y Rhodococcus equi, sobre placas delgadas y frescas con Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre de cordero.
Inocular horizontalmente (ngulo 90) las muestras en estudio y los controles positivos y negativos, a 1 2 mm de los cultivos anteriores, sin tocarlos. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas. Se observa mejor a las 24 horas.
Considerar la reaccin positiva para CAMP cuando se presenta una zona clara de beta hemlisis en la interseccin de la muestra en estudio con la cepa de Staphylococcus aureus o Rhodococcus equi.
La hemlisis de L. Monocytogenes se intensifica cerca al cultivo de S.aureus.
La
hemlisis de L. Ivanovii se realza cerca al cultivo del R. Equi. La hemlisis de L. Seeligeri se intensifica cerca al S. Aureus. Las otras especies de Listeria al no ser hemolticas presentan una reaccin de CAMP negativa. Prueba de CAMP. Reacciones de las diferentes especies de Listeria. Especies Interaccin Hemoltica Staphylococcus Aureus L.monocytogenes L.ivanovii L.innocua L. welshimeri L. seeligeri + + Rhodococcus equi - + -
Raras cepas son S+ y R+, pero la reaccin R+ es mucho menos pronunciadas que la de la L. Ivanovii Tomado del Manual de Bacteriologa Analtica FDA. L. Monocytogenes 1995 Fermentacin de Carbohidratos
Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos xilosa, ramnosa y manitol. Incubar a 35C +/-2C por 24-48 horas Descartar a los 7 das de incubacin Observar el viraje del indicador, generalmente ocurre a las 48 horas.
L.Monocytogenes
Xilosa(-) Manitol (-) Ramnosa (+)
Prueba Serolgica
Esta prueba sirve como evidencia corroborativa en la determinacin del organismo como agente etiolgico de la enfermedad. La identificacin final no se puede hacer sin la caracterizacin morfolgica, serolgica y bioqumica. Ms del 90% de L. Monocytogenes pueden ser serotipificadas con sueros tipo 1, tipo 4. Prueba rpida en lmina
1.
Realizar dos transferencias sucesivas del cultivo en estudio en un tubo con la superficie inclinada de Agar triptosa o infusin cerebro corazn.
2. 3.
Incubar a 35C +/-2C por 18-24 horas Adicionar al cultivo obtenido, 3 ml de buffer (FA), mezclar para desprender el cultivo
4. 5. 6.
Transferir esta suspensin a un tubo estril Calentar la suspensin con el organismo a 80C por 1 hora Centrifugar por 30 minutos a 1600 revoluciones por minuto
7.
Retirar 2,2 2,3 ml del fluido y resuspender los organismos con la porcin restante del lquido y continuar con las instrucciones de la casa fabricante correspondiente utilizada.
Los laboratorios que realicen la deteccin rutinaria de Listeria en alimentos deben utilizar pruebas bioqumicas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serolgica para determinar si son Listeria. La identificacin definitiva de Listeria, como pertenecientes a un determinado serotipo requiere el envo de cepas a un centro especializado en tipificacin.
Tipificacin mediante Bacterifagos
Desde el punto de vista epidemiolgico es una prueba muy til y es realizada por laboratorios especializados. Bioqumica de Listeria Monocytogenes
Catalasa Nitratos Motilidad CAMP Xilosa
+ +(sombrilla) +(con S.aureus) -
Manitol Ramnosa Esculina Prueba de Anton Hemlisis
+ + + +
Expresar los resultados como: L.Monocytogenes/ 25g: positivo o negativo Procedimiento para productos crnicos
La tcnica utilizada para productos crnicos es la recomendada por el Ministerio de Agricultura del Brasil. I. Enriquecimiento selectivo primario
1. Homogenizar 25 g de la muestra a analizar con 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (1) adicionado con 0.225 ml de solucin de acriflavina al 1% en hidrxido de sodio 0.1N. 2. Incubar a 30C +/-2C por 18-24 horas
II.
Enriquecimiento selectivo secundario
1. Transferir 0.2 ml del cultivo obtenido en el caldo LEB (1) a un tubo con 10 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (2) adicionado con 0.1 ml de solucin de acriflavina al 0.2% en hidrxido de sodio al 0.1N. 2. Incubar a 30C +/-2C por 18-24 horas 3. Transferir una asada del cultivo LEB(2) a placas con Agar Oxford y Palcam 4. Seguir la misma pauta utilizada en la tcnica de la FDA a partir del numeral Purificacin.
3.21
PRUEBA DE ESTERILIDAD
Esterilidad comercial de un alimento tratado trmicamente, es el estado que se consigue aplicando calor suficiente, solo o en combinacin con otros tratamientos apropiados, con el objeto de liberar el alimento de microorganismos patgenos capaces de reproducirse en l en condiciones normales, no refrigerados, en las que se mantendr durante su distribucin y almacenamiento.
Este procedimiento analtico determina si los alimentos envasados en recipientes hermticamente cerrados cumplen con el requisito de esterilizacin comercial al que se sometieron y se aplica a todos aquellos alimentos catalogados como comercialmente estriles.
Equipo y material Cabina de flujo laminar Refrigerador a 0-5C Incubadora a 35C +/-2C Incubadora a 55C +/-2C Microscopio Campana de anaerobiosis Pipetas bacteriolgicas de 1 ml Gradillas Pipeteador Lminas portaobjetos
Sobres generadores de anaerobiosis Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm Instrumentos para preparar muestras: cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras,
cucharas, esptulas, sacabocados, etc., previamente esterilizados.
Medios de cultivo y reactivos Caldo Infusin cerebro corazn, con almidn al 0.1% BHI (medio 64) Colorantes tincin de Gram (reactivos 12)
Procedimiento
El anlisis de esterilidad incluye las siguientes etapas:
I. II. III. IV. V. I.
Preparacin de la muestra Preincubacin de las latas Preparacin de las latas para el anlisis Anlisis del contenido de la lata Lectura al microscopio Preparacin de la muestra
Las dos latas que componen la muestra deben pertenecer al mismo lote de produccin. 1. Retirar las etiquetas de las latas 2. Lavar las latas con agua tibia jabonosa 3. Enjuagar con agua tibia y secar con toallas limpias desechables 4. Envolver cada lata en papel de filtro, con el objeto de descubrir cualquier escape del producto. 5. Marcar las latas con fecha, nmero de muestra y temperatura de incubacin. II. Preincubacin
1. Incubar una lata a 35C +/-2C durante 10 das y otra lata a 55C +/-2C durante 10 das.
2. Observar las latas cada dos das, con el objeto de descubrir cualquier escape del producto (microfugas). 3. Separar y examinar inmediatamente aquellas que muestren abombamiento o escape de material. 4. Agitar las latas no alteradas e invertir su posicin. III. Preparacin de las latas para su Anlisis
1. Desinfectar con alcohol al 70% todas las latas a examinar
2. Flamear rpidamente la parte que va a abrirse. abombadas.
No hacerlo nunca con latas
3. No abrir la tapa o fondo que lleva impreso el nmero de control, cdigo o lote 4. Abrir la lata trabajando en la cabina de flujo laminar y eliminar totalmente la tapa. 5. Cubrir la lata abierta con la base de una caja de petri estril. IV. Anlisis del contenido de la lata
Transferir aproximadamente 2 gramos del producto (tomando todas las partes representativas) a cada uno de los 6 tubos que contienen 10 ml de Caldo de infusin cerebro-corazn, adicionados de 0.1% de almidn. Incubar 3 tubos en anaerobiosis y 3 tubos en aerobiosis a la misma temperatura de preincubacin (35C +/-2C y 55C +/- 2C) por 72 horas. Realizar un frotis directo del producto sobre la lmina limpia y desengrasada y colorearla con Gram, contar las clulas bacterianas por campo. Un nmero elevado indicar
psimas condiciones de higiene durante la preparacin del producto y/o utilizacin de materias primas muy contaminadas.
V.
Lectura
Hacer frotis de cada tubo sembrado y colorear con Gram para determinar el tipo de grmenes presentes. Considerar que el producto es estril cuando mximo, un tubo aerobio muestre desarrollo.

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TABLA DE CONTENIDO

4. CAPITULO 3: ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD 4.1 Programa interno de garanta de calidad en el laboratorio

FRMULAS Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y

5.1 Preparacin de medios de cultivo 5.2 Preparacin de reactivos

laboratorio pueden ser patgenos.

3. CAPITULO 2 : PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

3.1 PREPARACIN Y DILUCIN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS

Medios de Cultivo y Reactivos:

Agua peptonada al 0.1% estril (reactivo 1)

3.2 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERBIOS MESFILOS

Mtodo de recuento en placa (SPC)

Medios de cultivo y reactivos

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.

Clculo e interpretacin de los resultados

Ejemplo: 10-4: caja 1 = 330 colonias caja 2 = 350 colonias

350 + 330 x 10 = 3.400 2 10-2: caja 1 = 26 colonias caja 2 = 28 colonias

Media aritmtica : 3.400 + 2.700 = 3.050 2

Reportar el recuento como 3.050 ufc / g ml

Reportar el recuento como menor de 100 ufc /g /ml

10-1: 290 colonias = 2.900 10-2: 40 colonias = 4.000

4.000 = 1.3 ( menos de 2) 2.900 Reportar media aritmtica : 3.450 ufc/g

(b) 10-1: 170 colonias = 1.700

10-2: 35 colonias = 3.500

3.500 = 2.05 (mayor de 2) 1.700 Reportar el recuento menor: 1.700 ufc/g

3.3 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERBIOS TERMFILOS

Medios de cultivo y reactivos

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado

Clculo e interpretacin de los resultados

Medios de cultivo y reactivos

Agar cistena, (medio 2)

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado

Clculo e interpretacin de los resultados

3.5 RECUENTO DE ESPORAS AEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS

Medios de cultivo y reactivos

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.

Clculo e interpretacin de los resultados

3.6 RECUENTO DE ESPORAS ANAEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS

Medios de cultivo y reactivos

Agar cistena (medio 2)

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado

Clculo e interpretacin de los resultados

3.7 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

Medios de cultivo y reactivos

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado

a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces

Clculo e interpretacin de los resultados

3.8 RECUENTO DE ESTAFILOCOCO COAGULASA POSITIVA

Medios de cultivo y reactivos

Colonias examinadas = 5 Colonias positivas = 4

3.500 x 4 = 2.800 ufc/ g /ml 5

3.9 RECUENTO DE BACILLUS CEREUS

Medios de cultivo y reactivos

Confirmacin bioqumica de las colonias de Bacillus cereus

Produccin de Acetil-metil-carbinol segn Smith:

Bioqumica del Bacillus cereus

Presencia de lecitinasa Fermentacin de glucosa Reduccin de Nitrato Fermentacin de xilosa

Hidrlisis de la gelatina Hidrlisis de la casena Hidrlisis de almidn Acetil-metil-carbinol

Ejemplo: 10-2 : 6 colonias

colonias examinadas = 3 colonias positivas =2

600 x 2 = 400 ufc / g /ml 3

RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

Medios de cultivo y reactivos

Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado