Les outils de biologie molculaire (Partie I)

Pr.ass N.Aboussair nisrineaboussair@yahoo.fr

OBJECTIFS

Connatre le principe de lextraction des acides nucliques. Citer les diffrentes classes des enzymes utilises pour ltude des acides nucliques . Expliquer le mcanisme daction de ces diffrentes enzymes. Connatre la technique de sparation des acides nucliques par lectrophorse ainsi que la notion de carte de restriction.

PLAN
I. II. III. IV. Introduction Extraction des acides nucliques Les outils enzymatiques. Sparation des acides nucliques par lectrophorse Conclusion
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VII.

I. INTRODUCTION
Lensemble des techniques danalyse et de diagnostic molculaire repose sur quelques principes fondamentaux issus du mtabolisme cellulaire (rplication de lADN, correction des erreurs, hybridation, enzymes de restriction .) et la physique des acides nucliques (dnaturation, renaturation). La connaissance des outils de biologie molculaire a un grand intrt pour le diagnostic des pathologies gntiques, tumorales et infectieuses.

PLAN
I. II. III. IV. Introduction Extraction des acides nucliques Les outils enzymatiques. Sparation des acides nucliques par lectrophorse Conclusion
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VII.

I. Extraction des acides nucliques

Nature du spcimen
En diagnostic , le spcimen le plus utilis est le sang +++ Autres milieux sont utiliss couramment (culture, urines, organes , biopsies ). En mdecine lgale : salive, cheveux, sperme Extraction dADN fossile : tissus mous (momies) ou durs (os, dents).

I. Extraction des acides nucliques

Mode de recueil

Les spcimens doivent tre recueillis strilement +++ Un spcimen de sang par exemple doit tre collect sur tube EDTA (anticoagulant chlateur de calcium).

I. Extraction des acides nucliques

Les diffrentes tapes
Ex: Extraction dADN partir dun prlvement sanguin

Lyse des globules rouges Lyse des globules blancs Dgradation des protines (protinase K) Extraction proprement dite (phnol chloroforme , hautes concentrations de sels). Prcipitation de lADN (thanol absolu froid).

Les diffrentes tapes

Lyse des globules rouges

Centrifugation

Lyse des globules blancs

Les diffrentes tapes

Dgradation des protines (protinase K)

Centrifugation

Les diffrentes tapes

Extraction proprement dite (phnol chloroforme , hautes concentrations de sels).
A partir du lysat , les protines et les autres protines sont prcipites par de hautes concentrations en sels Les dbris et les enzymes sont limins par centrifugation. LADN est prcipit par lalcool LADN forme un prcipit cotonneux blanchtre = mduse +++

Prcipitation de lADN (thanol absolu froid)

La mduse est sche .

Par la suite on va la dissoudre dans un tampon basique (Tris-EDTA).

LADN peut tre conserv +4 pendant plus dun an.

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Estimation de la qualit et de la quantit dADN

Cette estimation est indispensable aprs extraction dADN partir dun matriel biologique. Elle seffectue par spectrophotomtrie dans lultra-violet 260 nm. Il est indispensable de mesurer galement labsorption 280 nm. Cette dernire longueur donde permet destimer la contamination ventuelle de lextrait par des protines. La formule suivante permet de calculer la concentration dADN : Concentration en g/ml = 50 X facteur de dilution x DO 260nm Le rapport DO (260nm) / DO (280nm) doit tre compris entre 1,7 et 2. Si le rapport est < 1.7, il existe une contamination par les protines.
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PLAN
I. II. III. IV. Introduction Extraction des acides nucliques Les outils enzymatiques. Sparation des acides nucliques par lectrophorse Conclusion
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VII.

Les outils enzymatiques

Ce sont les enzymes utilises pour ltude des acides nucliques :

A. Les nuclases. B. Les polymrases. C. Les ligases. D. Les enzymes ajoutant ou enlevant un groupement phosphate.

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Les outils enzymatiques

A. Les nuclases

1. Les endonuclases

2. Les exonuclases

3. Les enzymes de restriction

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A. Les nuclases

Endonuclases : hydrolysent une liaison ester interne.

extrmit 5

Endonuclase a b

extrmit 3

OH

5 Exonuclase

Exonuclase
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A. Les nuclases

Exonuclases : librent par hydrolyse le nuclotide situ lextrmit 5 ou 3

extrmit 5

Endonuclase a b

extrmit 3

OH

5 Exonuclase

Exonuclase
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A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont des endonuclases produites par diverses bactries. On distingue 3 types (I, II et III). Les enzymes de restriction type I et III coupent lADN distance du site de reconnaissance et parfois plusieurs milliers de bases. Les enzymes de restriction type II hydrolysent lADN lintrieur du site de reconnaissance.

A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction type II

A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction type II
Les coupures peuvent tre cohsives avec prolongement 3 ou 5 lorsuelles sont asymtriques ou bien non cohsives bouts francs

A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction type II

Rentrante

Sortante ou protrusive

A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction type II

A. Les Nuclases : enzymes de restriction

Les enzymes de restriction type II

A. Les nuclases
DNase

A. Les nuclases
La nuclase S1

B. Les polymrases Les ADN Polymrases :

polymrase I fragment de Klenow Taq polymrase Transcriptase reverse

Les ARN polymrases

B. Les polymrases
Les enzymes recopiant lADN ou lARN ont les proprits suivantes : 1. 2. 3. Elles synthtisent le nouveau brin dans le sens 5-3 Cette synthse se fait de faon complmentaire et antiparallle Elles ncessitent la prsences de nuclotides triphosphates ou de dsoxynuclosides triphosphates
A C G T A T C G A T A T A A C G G T-G-C-A-T-G-A-C-C-G-T-G-G-A-C-T-T-A-A-A C

Amorce

dNTPs

5 3

A-C-G-T-A-C-T-G-G-C-A-C-C-T-G-A-A-T-T-T-G-C-A-T-T-G-C-A

ADN polymrase Extension

C. Les LIGASES

Les ligases sont capables de lier de

faon covalente dADN en une. deux molcules

Formation de liaisons phospho

Diester entre 3OH et 5P.

Elles sont extraites de bactries.

ADN Ligase

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D. Les enzymes ajoutant ou enlevant un groupement phosphate

Enzymes enlevant un groupement phosphate

Enzymes ajoutant un groupement phosphate

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D. Les enzymes ajoutant ou enlevant un groupement phosphate

PLAN
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VII.

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

lectrophorse est une opration consistant sparer les molcules dun mlange en soumettant ce mlange un champs lectrique au sein dun gel constitu dun polymre (agarose ou polyacrylamide) dont les mailles vont servir de tamis. Les fragments dADN chargs ngativement vont migrer vers le ple positif. Ils vont migrer lentement sils sont longs car ils sont ralentis par leffet filtrant du gel. Lorsque la migration est stoppe , les fragments seront spars du plus long (plus prs du dpt de mlange) au plus court . On peut visualiser le rsultat obtenu en ajoutant (dans le gel de migration ) du bromure dthidium , molcule ayant beaucoup daffinit pour lADN et fluorescent en orange sous une lumir incidente. Il suffit alors de dposer le gel dlectrophorse sur un transilluminateur UV pour visualiser la sparation des fragments. Il est possible de dnombrer et de mesurer la taille des fragments amplfis en utilisant un marqueur de taille .

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

chantillon dans les puits

TAMPON

Electrode

Electrode

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

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Sparation des acides nuclques par lectrophorse Nombre de kb (chelle Log)

Migration mm

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

Carte de restriction dun segment dADN

: carte des sites de restriction

Sparation des acides nuclques par lectrophorse

Carte de restriction

Sparation des acides nuclques par lectrophorse 10 kb 7 kb 3 kb 8 kb 2 kb 5 kb 3 kb 2 kb EcoRI 3kb 5kb ENZYME Hind III ENZYME Eco RI

ENZYMES Eco RI +Hind III Hind III 2kb

Conclusion