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Quim. Nova, Vol. 27, No.

4, 623-630, 2004 APLICAES SINTTICAS DE LIPASES IMOBILIZADAS EM POLMEROS Roberto Dalla-Vecchia Curso de Farmcia, Centro de Cincias da Sade, Universidade do Vale do Itaja, 88302-202 Itaja - SC Maria da Graa Nascimento* e Valdir Soldi Departamento de Qumica, Universidade Federal de Santa Catarina, CP 6154, 88040-900 Florianpolis - SC Recebido em 19/5/03; aceito em 21/11/03; publicado na web em 27/05/04

SYNTHETIC APPLICATIONS OF IMMOBILIZED LIPASES IN POLYMERS. The application of biocatalysis is a promising field related to new technologies for organic synthesis. The development of immobilization techniques is very important due to the multiple or repetitive use of a single batch of enzymes and the ability to stop the reaction rapidly, at any stage, by removing the enzymes. In most cases, after immobilization, enzymes and microorganisms maintain or even increase their activity and stability. This work presents an overview of the common methods for lipase immobilization in polymers and applications of these systems to obtain compounds of synthetic interest. Keywords: lipases; immobilization; polymers.

INTRODUO Muito da histria da bioqumica refere-se pesquisa em enzimas. Em 1926, James Sumners isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease, que catalisa a hidrlise da uria em NH3 e CO2. As enzimas desempenham a funo de catalisar as reaes nos organismos. Com exceo de alguns RNAs (ribozimas) que so catalisadores durante seu prprio processamento, todas as enzimas so protenas, as quais aumentam a velocidade de uma reao por um fator de 1014 vezes mais do que uma reao no catalisada1. O termo biotransformao pode ser aplicado para modificaes especficas ou interconverses na estrutura qumica, realizadas por enzimas presentes nas clulas ou na forma isolada. A biotransformao difere da fermentao, na qual o substrato convertido a produtos atravs de um caminho metablico bastante complexo na clula. As enzimas podem ser encontradas em clulas animais ou de plantas, bem como em microrganismos. Entretanto, quando a permeabilidade da membrana celular insuficiente para a passagem do substrato ou quando ocorrem reaes laterais indesejveis, necessrio conduzir a biotransformao com enzimas isoladas ou purificadas. As enzimas apresentam vrias propriedades que as tornam atrativas como catalisadores para biotransformaes. So catalisadores versteis, existindo um processo enzimtico equivalente para cada tipo de reao orgnica2. Atualmente, mais de 3.000 diferentes enzimas tm sido identificadas e muitas isoladas em sua forma pura. Vrias tm sido obtidas na forma cristalina e a seqncia de aminocidos, bem como a estrutura tridimensional determinadas atravs de cristalografia de raios-X e RMN-2D3. A aplicao de biocatalisadores na indstria objeto de muitas investigaes, devido alta atividade cataltica em comparao com os catalisadores convencionais, e ao fato de atuarem com alta eficincia em condies reacionais bastante suaves. A utilizao de enzimas como catalisadores em reaes sintticas em meio orgnico no recente; as primeiras so do incio do sculo XX. Entretanto, o interesse por estes sistemas ressurgiu aps
*e-mail: graca@qmc.ufsc.br

a publicao dos trabalhos de Zaks e Klibanov, no incio dos anos 804-7. As enzimas apresentavam pouca utilidade em sntese orgnica devido, principalmente, idia pr-concebida de que somente o meio aquoso era propcio para manter a conformao estrutural cataliticamente ativa. Entretanto, sabe-se atualmente que muitas enzimas (ou complexos enzimticos) so cataliticamente ativas em ambientes hidrofbicos, com eficincia similar quela encontrada em solues aquosas, ou em certos casos at superior. Acredita-se que as enzimas sejam cataliticamente ativas em meio orgnico porque permanecem na sua forma original, e no se desdobram em meio no-aquoso. Esta caracterstica deve-se, em parte, ao aumento das interaes eletrostticas entre os grupos integrantes da enzima em solventes orgnicos e baixa constante dieltrica da maioria deles e, tambm, ao aumento do nmero de ligaes de hidrognio intramoleculares8. As enzimas esto sujeitas inativao por fatores qumicos, fsicos ou biolgicos, podendo ocorrer quando estocadas ou durante o uso. Para que a catlise seja eficiente em um determinado processo, h necessidade de proteg-las da interao com o solvente, meio no qual realizada a reao, pois o mesmo poderia provocar a inativao, impossibilitando a catlise da reao. Frente a este problema, novas tcnicas de imobilizao tm sido desenvolvidas para fornecer a estabilidade das enzimas e facilitar sua recuperao e reutilizao9. A utilizao destas tcnicas tem sido crescente nos ltimos vinte anos e, com isso, novas informaes tericas e aplicaes prticas esto surgindo9. O uso de biocatalisadores imobilizados tambm crescente em escala industrial, especialmente na indstria farmacutica, de detergentes, couros e panificao, entre outras10-12. As enzimas hidrolticas (proteases, celulases, amilases e lipases) so as mais freqentemente usadas na qumica orgnica. Entre as vrias razes que as tornam uma opo particularmente atrativa, podese citar ampla disponibilidade, baixo custo, condies suaves de sntese, facilidade de uso porque no necessitam cofatores e ampla especificidade para substratos2. Aplicaes analticas tambm tm se beneficiado das reaes enzimticas em meio orgnico. Lima e Angnes13 mostraram vrias aplicaes envolvendo reaes enzimticas com biossensores amperomtricos, os quais so empregados para a resoluo de problemas analticos em diversas reas, como clnica, na anlise de alimentos e de amostras ambientais13.

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O presente artigo descreve os principais mtodos de imobilizao de lipases, evidenciando o uso de polmeros como materiais de suporte e exemplos de aplicaes destes sistemas na qumica orgnica sinttica. LIPASES As lipases (triglicerol acil-hidrolases, EC 3.1.1.3) so classificadas como hidrolases e atuam sobre ligaes ster presentes em acilgliceris, liberando cidos graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de esterases14. A diferenciao entre uma lipase e uma esterase (EC. 3.1.1.1) est no fato de que a primeira catalisa reaes de substratos insolveis em gua, enquanto que uma esterase age em substratos solveis15. Entretanto, a diferenciao entre lipases e esterases ainda no est completamente definida. Em 1958, Sarda e Desnuelle propuseram definir as lipases a partir de sua caracterstica cintica, que a propriedade de ativao na presena de substratos insolveis em gua e emulsionados, ou seja, na presena de uma interface lipdeo/gua. Segundo estes autores, as lipases seriam ativadas na presena de steres emulsionados, enquanto as esterases no apresentariam esta ativao, exercendo sua funo hidroltica sobre substratos solveis em gua16. As lipases so encontradas em tecidos de vrios animais e plantas, e podem ser produzidas por fermentao usando vrias espcies de microrganismos, tais com os fungos Aspergillus mucor, Rhizopus penicillium, Geotrichum sp, por leveduras de Tulopis sp e Candida sp e bactrias como Pseudomonas sp, Achromobacter sp e Staphylococcus sp. Do ponto de vista econmico e industrial, os microrganismos so preferveis do que as lipases de fontes animais e plantas, devido ao alto custo do seu isolamento17. Entre as lipases, as de Humicola lanuginosa, Rhizopus delemar18, Geotrichum candidum19,20, Mucor miehei21,22, Pseudomonas glumae23, Candida rugosa (anteriormente denominada Candida cylindracea)24,25, Candida antarctica26, Chromobacterium viscosum27, lipase pancretica de cavalo28, lipase pancretica humana29 e lipase pancretica bovina 30 tm sua estrutura determinada. A massa molecular destas enzimas varia de 20-75 kDa. Seu ponto isoeltrico varia em uma faixa de 3,6 e 7,6, sendo majoritariamente acdicas, com pI entre 4 e 531,32. O stio cataltico formado pela trade cataltica Ser-His-Asp/ Glu, que se repete em todas as estruturas e freqentemente protegido na molcula por uma tampa hidrofbica ou lid que ao interagir com a interface lipdeo/gua sofre uma mudana conformacional, expondo o stio ativo. A presena da tampa na estrutura da enzima e a propriedade de ativao interfacial passaram a ser fatores determinantes para a caracterizao de lipases21. Estudos de raio-X realizados por Uppenberg et al.33 com a lipase da Candida antarctica revelou a existncia de uma tampa similar recobrindo a trade cataltica Ser-His-Asp. Mais recentemente, entretanto, observou-se que a presena da tampa no est necessariamente correlacionada com a ativao interfacial, sendo que as lipases de Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Candida antarctica B, que apresentam a tampa em suas estruturas, no sofrem ativao interfacial34. Por outro lado, as cutinases, enzimas consideradas lipases verdadeiras, no apresentam a tampa e no precisam da interface para exercer a atividade hidroltica35. As lipases so muito utilizadas em sntese orgnica devido sua grande disponibilidade e baixo custo. Alm disso, no requerem cofatores, atuam em uma faixa de pH relativamente grande, so muito estveis neste meio, apresentam especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enantiosseletividade. Possuem a habilidade de

catalisar reaes de esterificaes, transesterificaes (acidlise, interesterificao, alcolise), aminlise e tiotransesterificao em solvente orgnico anidro, sistema bifsico e em soluo micelar com alta especificidade. O deslocamento do equilbrio na reao, no sentido direto (hidrlise) ou inverso (sntese), controlado pela quantidade de gua presente na mistura reacional. As lipases tm sido extensivamente investigadas com relao s suas propriedades bioqumicas e fisiolgicas e, mais recentemente, para aplicaes industriais10,36. Nos ltimos anos, com o intuito de aumentar a atividade cataltica de lipases, foram apresentados na literatura vrios procedimentos de imobilizao ou modificaes na estrutura nativa, sendo que estes processos envolvem diferentes graus de complexidade e eficincia. Os mtodos de imobilizao requerem uma interao fraca ou a formao de ligaes covalentes entre a lipase e o suporte2. A engenharia gentica de lipases envolve a modificao do gene que codifica para a enzima. Esta tecnologia inclui a habilidade de isolar e expressar os genes de interesse e modificar algum aminocido que ocupe um stio importante para a atividade cataltica da enzima9,29. MTODOS DE IMOBILIZAO DE ENZIMAS O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tem sido importante por proporcionar a reutilizao das enzimas, facilitar a separao dos produtos e aumentar a estabilidade em solventes orgnicos37. O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em comparao sua forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada dever exibir uma atividade cataltica superior. Alm disso, no devero ocorrer alteraes estruturais, bem como modificaes no stio ativo36. A imobilizao pode inibir ou aumentar a atividade e estabilidade da enzima, porm no existe uma regra que prediga a manuteno destes parmetros aps o processo de imobilizao37. Na literatura, inmeros mtodos2,9 tm sido descritos e utilizados para contornar os possveis problemas de instabilidade e otimizar as vrias aplicaes. Em reaes qumicas e bioqumicas, o uso de enzimas puras pode ser dispendioso e seu descarte aps o uso economicamente invivel. Alm disso, a recuperao do meio reacional pode ser difcil2. A imobilizao pode ocorrer atravs da adsoro ou ligao da enzima em um material insolvel, pelo uso de um reagente multifuncional atravs de ligaes cruzadas, confinamento em matrizes formadas por gis polimricos ou encapsulao atravs de uma membrana polimrica. A Figura 1 mostra, esquematicamente, a classificao dos mtodos utilizados para imobilizao de enzimas38.

Figura 1. Mtodos de imobilizao de enzimas. Reproduzida da ref. 38, com permisso de H. Bungay

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PARMETROS QUE INFLUENCIAM NA IMOBILIZAO DE ENZIMAS PARA USO EM MEIO ORGNICO A heterogeneidade do sistema biocataltico, em meio orgnico, implica em uma relao mtua entre os diferentes componentes do sistema (Figura 2).

Figura 2. Relao mtua entre os vrios componentes envolvidos em uma reao biocatalisada, na presena de solvente orgnico. Reproduzida da ref. 39, com permisso da Elsevier

Quando um biocatalisador ou uma preparao enzimtica selecionado para determinada reao, o tipo de solvente, a quantidade de gua e a solubilidade dos substratos e produtos devem ser avaliadas e otimizadas. A simples relao entre dois componentes pode levar a uma interpretao errnea39. A gua , talvez, o componente mais importante quando o biocatalisador utilizado em meio orgnico. Est bem documentado na literatura que uma quantidade mnima de gua, que dependente do tipo de solvente e das caractersticas do suporte utilizado, absolutamente necessria para a solvatao da enzima ou dos substratos e produtos. Entretanto, o excesso de gua pode favorecer a reao de hidrlise e no a de sntese39,40. As enzimas necessitam de uma pequena quantidade de gua para reter a sua conformao tridimensional ativa, mesmo quando esto ligadas covalentemente a um suporte7,8,41,42. A gua contribui ainda para a integridade estrutural, polaridade do stio ativo e estabilidade da protena, e pode tambm limitar a solubilidade de substratos hidrofbicos em torno da enzima43. Halling sugeriu o uso da atividade termodinmica da gua (aw) para definir a relao entre a gua e os outros componentes do sistema reacional. O teor de gua no catalisador mais importante para manter a atividade cataltica do que a quantidade total contida no sistema. A atividade cataltica da lipase de Rhizomucor miehei em diferentes solventes orgnicos foi muito pequena para valores fixos de aw44. O efeito da atividade da gua em reaes biocatalisadas por lipases tem sido mostrado em vrios trabalhos45-52. A influncia da natureza do solvente tem sido interpretada em termos de vrios fenmenos, tais como a mudana na rigidez da enzima causada por solventes com alta constante dieltrica e interaes inicas na protena53,54. O solvente pode estabilizar as cargas no estado de transio atravs da modificao da polaridade do stio ativo, bem como a variao da energia livre total, que esto associadas com diferentes energias de solvatao do solvente27,55. Na literatura, no existe um consenso claro com referncia escolha do parmetro para descrever quantitativamente o efeito do solvente, em reaes catalisadas por enzimas. Porm, o parmetro mais freqentemente utilizado o log Poct, definido como o logaritmo do coeficiente de partio do solvente no sistema octanol/gua56. Segundo Laane et al.56, os solventes que possuem log Poct 2 so hidroflicos e no so adequados para a bioctalise, porque perturbam fortemente a interao gua-biocatalisador, inativando-o ou desnaturando-o. Os solventes com log Poct entre 2 e 4 so menos

hidroflicos, perturbam fracamente a interao gua-biocatalisador e afetam a sua estrutura de maneira imprevisvel. Os solventes que possuem log Poct superior a 4 so hidrofbicos e no perturbam a camada de gua, deixando o biocatalisador no seu estado ativo . Parmetros como constante dieltrica ()54,55, polarizabilidade57, bem como o parmetro de solubilidade de Hildebrand ()58 e o de solubilidade tridimensional59 uma derivao do parmetro de Hildebrand so propostos para verificar a influncia do solvente nas reaes catalisadas por enzimas imobilizadas ou no. Costa et al.60 discutiram os principais aspectos relacionados com a influncia do solvente sobre a enantiosseletividade de hidrolases, principalmente as lipases. O efeito do solvente nas reaes biocatalisadas tambm foi mostrado por outros autores48,50,61-63. O material usado como suporte para a imobilizao afeta a quantidade de gua total nas proximidades da enzima, e a partio dos reagentes e/ou produtos na mistura reacional64. Gray et al. verificaram que a atividade da lipase de Candida cylindracea, ligada ou no covalentemente em um suporte, diminuiu quando a quantidade de gua era reduzida no sistema65. A imobilizao em suportes hidroflicos pode reduzir a atividade enzimtica, devido a mudanas conformacionais. Os materiais hidroflicos podem reduzir a solubilidade de substratos hidrofbicos em regies hidroflicas, e o acesso dos substratos ao stio ativo. Em alguns casos a matriz pode impor uma barreira estrea, resultando em rigidez na estrutura da enzima66. Para ser efetivo na imobilizao o suporte deve deixar a enzima acessvel aos substratos, manter sua atividade por um longo perodo e permitir que o sistema (suporte/enzima) seja regenerado ao final do processo, sem que ocorram perdas na atividade enzimtica. APLICAES DE LIPASES IMOBILIZADAS Imobilizao via ligao: adsoro O procedimento de adsoro de uma protena muito simples, e um dos mtodos mais utilizados. A enzima imobilizada em um suporte slido por ligaes de baixa energia, tais como interaes de van der Waals ou hidrofbicas, ligaes de hidrognio e inicas, entre outras. Vrios materiais podem ser usados para este propsito e a escolha de um deles depende de suas propriedades, como fora mecnica, estabilidade fsica e qumica, carter hidrofbico/hidroflico, capacidade de adsoro de enzima e custo9. Balco et al.67, em 1996, publicaram uma compilao de mtodos de imobilizao, mostrando que vrios materiais podem ser utilizados, tais como polietileno, polipropileno, celite, resina sinttica, celulose, sefadex, entre outros. Paiva et al.68, recentemente, apresentaram uma reviso enfocando os aspectos cinticos dos diversos mtodos de imobilizao de lipases, especialmente o desempenho cataltico dos derivados imobilizados em reatores. O sucesso e a eficincia da adsoro de uma enzima em um suporte, que em geral na superfcie, depende de vrios parmetros, tais como tamanho da protena a ser adsorvida, rea superficial do adsorvente e, principalmente, da porosidade e tamanho do poros 9. O uso de suportes porosos vantajoso porque a enzima adsorvida no interior dos poros. A eficincia depende tambm da concentrao da enzima. A quantidade de enzima adsorvida por quantidade do suporte aumenta com a concentrao do biocatalisador, atingindo um patamar de saturao. Este processo, em geral, realizado temperatura constante e isotermas de adsoro so obtidas, as quais seguem as equaes de Langmuir ou Freundlich37. Na literatura existe um grande nmero de publicaes com aplicaes de lipases imobilizadas por adsoro fsica. Por exemplo, Carta

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et al.42 estudaram a imobilizao da lipase de Candida cylindracea (atualmente denominada de Candida rugosa) em Nylon 6, que muito simples e facilmente reproduzida. Os autores mostraram que este sistema pode ser usado para catalisar a sntese de steres derivados do cido propinico em n-hexano, com rendimentos elevados. O uso de aditivos ou solventes durante o processo de imobilizao, com o intuito de melhorar a eficincia, tem sido descrito na literatura69. Por exemplo, a resina de troca inica, Dowex 66, foi utilizada para imobilizar a lipase de Pseudomonas fluorescens. Quando a imobilizao foi realizada sem um pr-tratamento do suporte, a adsoro foi muito baixa. Porm, quando se adicionou 50% de um solvente polar, tal como etanol ou iso-propanol, a adsoro aumentou para 96-97%. O mesmo efeito foi observado por Montero et al.70, pois o prtratamento do suporte com o solvente afetou a adsoro da protena e a atividade aps imobilizao na hidrlise do leo de oliva. Os autores sugeriram que o solvente polar absorve as molculas de gua do suporte, favorecendo a adsoro da protena. Basri et al.71 imobilizaram a lipase da Candida rugosa em trs suportes diferentes, Amberlite XAD7, poli(metilmetacrilato)(PMMA) e celite. A adsoro da protena nestes suportes e nas condies testadas ocorreu em aproximadamente 30 min com 60, 30 e 20% de adsoro, respectivamente. A atividade da enzima imobilizada nos suportes foi testada na reao de esterificao do cido oleico com n-butanol. Parmetros como razo molar, efeito de solvente, variao do doador acila, bem como diferentes lcoois, foram analisados. Bosley e Peilow72 estudaram o efeito da massa das lipases de Rhizomucor miehei, Humicola sp, Rhizopus niveus e Candida antarctica B suportadas em poli(propileno). Foi observada uma pequena diminuio na eficincia da esterificao do cido oleico com octanol para a lipase de Humicola sp, quando comparada com a de Rhizomucor miehei, aps imobilizao. Segundo os autores, podem ter ocorrido distores na conformao da enzima, devido alta afinidade com a superfcie do suporte. Com a lipase de Candida antarctica B, a eficincia foi elevada utilizando-se pequenas quantidades do biocatalisador. Mougard e Legov73 estudaram a esterificao do retinol (vitamina A) com succinato de metila utilizando lipases de Candida antarctica imobilizada em resina acrlica, Rhizomucor miehei imobilizada em resina aninica Duolite 568N, e pancretica de porco (LPP), Candida rugosa e Rhizopus arrizus na forma livre. Segundo esses autores, a reao foi dependente do solvente, sendo o primeiro processo descrito para a sntese de um derivado do retinol. O produto obtido um carreador de cido lctico (Esquema 1). Abbas e Comeau74 verificaram a habilidade cataltica da lipase da Mucor sp imobilizada em Amberlite IRC50 na sntese de steres aromticos em cicloexano a 30 C. Os cidos propinico, butrico e caprico, e os lcoois metanol, etanol, allico, butanol, isoamlico, geraniol, citronelol e farnesol foram utilizados em quantidades equimolares. Os rendimentos foram diferenciados dependendo da afinidade da lipase em relao cadeia do cido e/ou do lcool. Con-

verses rpidas e com altos rendimentos, 92 e 98%, foram observadas para o caprato de metila e caprato de etila, respectivamente, aps 4 h de reao. Rendimentos de 95, 100 e 93% foram obtidos para o butirato de butila, caprato de butila e caprato de alila, respectivamente, aps 24 h de reao. Outros estudos descritos na literatura incluem lipases imobilizadas em poli(propileno)70, poli(metil-metacrilato)71, poli(estireno)75, poli(cloreto de vinila)76, quitosana77 e quitina 77 e poli(vinil acetato (VAC)-divinilbenzeno(DVB)) 78. Modificao por ligao covalente no suporte ou por ligao cruzada A utilizao de protenas modificadas quimicamente teve incio no final da dcada de 50, sendo que a tcnica foi originalmente desenvolvida para auxiliar na elucidao da estrutura de protenas. Desde o final da dcada de 70, muitos trabalhos de modificao de protenas para uso em sntese tm sido apresentados com o objetivo de alterar e melhorar as propriedades da lipase nativa79. O procedimento envolve a modificao qumica de um resduo de aminocido, atravs da formao de uma ligao covalente da enzima com um material insolvel em gua, pela fixao da enzima em matriz por ligao covalente ou pela formao de ligaes cruzadas numa matriz, contendo a enzima e usando vrios agentes bifuncionais. O poli(etilenoglicol) (PEG) tem sido extensivamente utilizado como um modificador de protenas. As protenas podem ainda ser alteradas com derivados de poli(etilenoglicol) ativado, os quais so usualmente sintetizados a partir do monometxipolietileno glicol com um grupo hidrxi no final da cadeia. A Figura 3 mostra dois tipos de modificadores para a preparao de PEG-protena usados em biotecnologia e em aplicaes biomdicas, um em forma de cadeia, PEG2, e outro em forma de pente obtido pela combinao do anidrido maleico e monometxipolietileno, PM. Os modificadores reagem com o grupo amino do resduo de lisina e/ou com o grupo amino terminal na molcula de protena. O uso de PEG2 na resoluo de lcoois e sntese de lactonas mostrado no Esquema 2 79. Palomo et al.80 imobilizaram a lipase de Mucor miehei (LMM) em diferentes resinas epoxi funcionalizadas com diferentes grupos (epoxi-iminodiactico-Sepabeads, IDA, epoxi-etilenodiaminaSephabeads, EDA, e quelatos epoxi-cobre-Sephabeads, IDA-Cu2+) e adsorvida via ativao interfacial em suporte octadecil-Sepabeads. A enzima imobilizada nos diversos suportes foi utilizada na resoluo do cido (R,S)-2-butiril-2-fenilactico, em diferentes condies de temperatura e pH. As propriedades catalticas, atividade, especificidade e enantiosseletividade foram dependentes do tipo de suporte utilizado. A lipase imobilizada em octadecil-Sefabeads reagiu predominantemente com o enantimero R e, nos demais suportes, IDA-Cu2+, IDA e EDA com o S80. Os valores de ee e E, foram dependentes da temperatura e pH (Esquema 3).

Esquema 1. Reao de esterificao do retinol com succinato de dimetila catalisada por lipases . Reproduzida da ref. 73, com permisso da Elsevier

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Figura 3. Dois tipos de modificadores: (a) em forma de cadeia PEG1 e PEG2; (b) em forma de pente PM13 e PM100. Reproduzida da ref. 79, com permisso da Elsevier

como atividade da enzima (em diferentes valores de pH e temperaturas) e estabilidade (trmica, operacional e estocagem). Foi verificado que a atividade especfica original da lipase foi mantida em 63%. Porm, o pH timo foi modificado de 8,5 para 9,0 e a temperatura de 30 para 37 C aps a imobilizao. Tan et al.82 obtiveram monoglicerdeos (MG) por hidrlise do leo de palma utilizando lipases imobilizadas em membranas de quitosana (QTS), lcool poli-vinlico (PVA) e QTS/PVA, utilizando glutaraldedo ou epicloridrina como agente de ligao cruzada. A lipase de Rhizopus oryzae imobilizada na membrana QTS/PVA foi mais ativa na reao de hidrlise, quando comparada com as de QTS e PVA. Os rendimentos de MG foram de 35-52%. Zacchima et al.83 modificaram a lipase da Candida rugosa com metxi(polietileno glicol)-p-nitrofenil carbonato (NPC-mPEG). A lipase modificada reteve em 98% a atividade hidroltica, em comparao com a no modificada. Com este sistema, o laurato de benzila foi obtido com 100% de rendimento, aps 6 h em tolueno. Amorim et al.84 imobilizaram a lipase da Candida cylindracea em filmes de quitosana de diferentes fontes, Syncephalastrum racemosum e de crustceos, utilizando glutaraldedo como agente multifuncional. A lipase imobilizada reteve em 47 e 42%, respectivamente, a sua atividade cataltica inicial, aps quatro ciclos reacionais na hidrlise do palmitato de p-nitrofenila (pNNP), a 37 C. Confinamento em matriz polimrica ou em cpsulas A imobilizao de um biocatalisador via incluso ou microencapsulao consiste em confinar uma protena em um polmero insolvel ou em uma microcpsula. A microencapsulao muito similar ao processo de incluso, embora neste caso a enzima seja totalmente envolvida pelo sistema. Neste sistema cria-se uma cela artificial delimitada por uma membrana porosa. Molculas grandes, tais como enzimas, no so capazes de se difundir atravs desta membrana, enquanto que pequenas molculas, como substratos e produtos, se difundem. A vantagem da utilizao desta tcnica que a enzima no interage quimicamente com o polmero evitando, assim, a desnaturao. Contudo, a transferncia de massa atravs da membrana pode ser um problema. A velocidade de difuso dos substratos e produtos atravs da membrana um fator limitante e geralmente so necessrias altas concentraes de substratos a fim de limitar esta influncia. As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em substratos de baixa massa molar, pois estes compostos se difundem pela membrana e se aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador9. Filmes de polissulfonato de sdio (PSS), poli(xido de etileno) (PEO) e blendas PSS/PEO com diversas composies foram utilizados para a imobilizao de lipases de diferentes fontes e procedncias. Estes sistemas foram usados como catalisadores na esterificao do cido lurico com n-pentanol, em hexano. A Tabela 1 mostra os resultados obtidos na obteno de laurato de n-pentila com lipases imobilizadas na blenda PSS/PEO 80:20. Rendimentos elevados foram obtidos com as lipases de Mucor miehei e de Rhizopus oryzae (Amano F-AP 15), 80 e 98%, respectivamente. Com as outras lipases foram obtidos rendimentos inferiores a 50%, e este resultado pode estar relacionado com a atividade diferenciada de cada lipase, bem como com a interao entre enzima e suporte85. A lipase de Rhizopus oryzae (F-AP 15) foi imobilizada em blendas de PSS/PEO com diferentes composies, utilizadas na obteno do laurato de n-pentila (Tabela 2). A lipase F-AP 15 imobilizada na blenda PSS/PEO 100:0, foi pouco efetiva como biocatalisador para esta reao. Este resultado, segundo os autores, pode estar associado s interaes entre enzima e suporte, as quais provocaram mudanas conformacionais na estru-

Esquema 2. Resoluo de lcoois e sntese de lactonas com lipases modificadas. Reproduzida da ref. 79, com permisso da Elsevier

Esquema 3. Resoluo do cido (R,S)-2-butiroil-2-fenilactico catalisada por lipase de Mucor miehei imobilizada em diferentes resinas epxi. Reproduzida da ref. 80, com permisso da Elsevier

Kilin et al.81 imobilizaram a lipase pancretica de porco (LPP) em matriz obtida por ligaes cruzadas entre o lcool poli-vinlico (PVA) e o dicloreto de adipola e utilizaram este sistema no estudo da reao de hidrlise da tributirina. Foram avaliados parmetros

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Tabela 1. Valores de percentagem de converso (c,% ) em steres obtidos com lipases de diferentes fontes imobilizadas na blenda PSS/ PEO ( 80:20)85 Enzimas Mucor javanicus Candida rugosab Pseudomonas spb Candida rugosac Pancreatica de porcoc Aspergillus nigerb GreasexTM Rhizomucor mieheid Thermomyces lanuginosusd Mucor mieheid Rhizopus oryzaeb
b

Sigla M AY LPS LCR LPP A LIZ LIL PAL F-AP 15

Converso (%)a 6 9 13 22 25 28 28 38 38 80 98

com diferentes propores, foram obtidas pela fotopolimerizao entre 2-hidrxietil metacrilato (HEMA) e 2-metacrilamido-fenilalanina (MAPA) na presena de ,-azobisisobutironitrila (AIBN) como iniciador. A incorporao do MAPA resultou em aumento da hidrofobicidade da membrana (Figura 4).

(a) obtida por RMN1H, [enzima]: 50 mg/g suporte, tempo de reao: 24 h, solvente: n-hexano; (b) Amano; (c) Sigma e (d) Novozymes tura nativa, ou devido a interaes entre o PSS com os resduos de aminocidos do stio ativo. Na presena de 2% de PEO, a converso em ster foi de 85%, indicando que interaes de carter mais hidrofbico tipo enzimapolmero devem predominar neste sistema. A partir da composio da blenda PSS/PEO 80:20, os produtos foram obtidos com rendimentos elevados (98%), evidenciando que a lipase manteve sua atividade cataltica. Anlises de TGA da blenda PSS/PEO 80:20 com a lipase de Rhizopus oryzae mostraram que o sistema estvel at a temperatura de 190 C, considerando que no foi observada nenhuma perda de massa at esta temperatura85. Arica et al.86 prepararam membranas de poli(2-hidrxietilmetacrilato-co-metacrilamido-fenilalanina (poli(HEMA-MAPA). Estas, Tabela 2. Valores de percentagem de converso (c,%) em steres obtidos com a lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em blendas de PSS/PEO85 PSS/PEO (% m/m) 100:0 98:2 95:5 90:10 80:20 70:30 50:50 40:60 20:80 0:100 Converso (%)a 57 85 89 96 98 98 98 98 98 98
Figura 4. Estrutura da membrana poli(HEMA-MAPA). Reproduzida da ref. 86, com permisso da Elsevier

(a) obtida por RMN1H, [enzima]: 50 mg/g suporte, tempo de reao: 24 h, solvente: n-hexano, temperatura: 35 C

As membranas foram utilizadas para a imobilizao da lipase de Candida rugosa e foi determinada a atividade na hidrlise do leo de oliva. Foram analisados parmetros como a concentrao de grupos hidrofbicos no suporte relacionado com a capacidade de adsoro da enzima, condies de adsoro em funo do pH, temperatura e reutilizao do sistema. O efeito da razo molar HEMA/ MAPA na capacidade de imobilizao e na atividade enzimtica mostrado na Tabela 3. Com o aumento da densidade de fenilalanina, a capacidade de adsoro foi de 74 para 135 g de lipase/cm2 de membrana. O sistema com 312 mol de fenilalanina/g de membrana de poli(HEMA/ MAPA-3) apresentou uma densidade mxima de grupos hidrofbicos e resultou em grande capacidade de adsoro, com pequena reduo na atividade da enzima86. Queiroz e Nascimento87 imobilizaram a lipase de Pseudomonas sp (LPS) em dois polmeros, poli(xido de etileno) (PEO) e em gel de gar. Estes sistemas foram utilizados na resoluo do R,Smandelato de metila com acetato de vinila como agente acilante, em vrios solventes orgnicos. O mtodo foi bastante efetivo usando a lipase imobilizada em filme de PEO. O grau de converso foi aproximadamente de 50% e ambos os enantimeros foram obtidos com pureza ptica >99% (Esquema 4). A lipase da Chromobacterium viscosum (LCV) foi imobilizada em organo-gel de gelatina formado com microemulso gua-leo (MBGs)88, que uma matriz predominantemente hidrofbica. A atividade do derivado imobilizado determinada na reao de esterificao do cido decanico com n-octanol foi dependente da composio do organo-gel. As mudanas mais significativas foram ob-

Tabela 3. Influncia de diferentes composies de membranas poli(HEMA/MAPA) na atividade da lipase de Candida rugosa na reao de hidrlise do leo de oliva, a 35 C. Reproduzida da ref. 86, com permisso da Elsevier Tipo de membrana Razo molar HEMA/MAPA 77 39 26 Densidade de fenilalanida (mol g-1 de membrana) 104 208 312 Quantidade de enzima adsorvida (g cm-2 ) 074 103 135 Atividade enzimtica U cm-2 de membrana 0549 0815 1040 Reteno de atividade (%) 78 83 81

Poli(HEMA/MAPA-1) Poli(HEMA/MAPA-2) Poli(HEMA/MAPA-3)

Vol. 27, No. 4

Aplicaes Sintticas de Lipases Imobilizadas em Polmeros

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Esquema 4. Acilao enzimtica do R,S-mandelato de metila. Reproduzida da ref. 87, com permisso da Elsevier

servadas com a alterao dos valores de R (R=[H2O] / [surfactante]). Valores entre 60-80 foram os mais adequados, por apresentarem maior estabilidade fsica e atividade para a LCV. Os solventes utilizados para a formao do organo-gel e no meio reacional tambm influenciaram na atividade da enzima. Outros trabalhos na literatura utilizaram este sistema em reaes biocatalisadas por lipases89-93. O uso de agentes gelificantes naturais, como gelatina, agarose e k-carragenanas, tem sido testado para a formao de organo-gel de microemulso, bem como hidrogis (sem surfactante e leo). Stamakis e Xanakis94 utilizaram estes gis como matrizes para imobilizao de lipases. A lipase da Pseudomonas cepacia manteve sua atividade cataltica quando confinada nestes sistemas, na esterificao do cido lurico com propanol. Neste estudo, foram avaliados parmetros como natureza e concentrao do agente gelificante, concentrao do biocatalisador e concentrao do substrato, que influenciam a atividade cataltica. Foram obtidos rendimentos elevados para o laurato de propila (80%) com o organo-gel de agarose e kcarragenana. Os sistemas puderam ser reutilizados por cinco vezes e a atividade foi dependente do biopolmero utilizado na formao do organo-gel. As microcpsulas podem tambm ser utilizadas para diversas finalidades, como imobilizao por encapsulao de culturas de clulas, de agentes bioqumicos, e para a liberao controlada de frmacos e aromatizantes95. O procedimento mais comum utilizado para a encapsulao envolve a unio de dois ou mais polmeros, em especial polissacardeos, como alginatos e carragenanas que so encontrados em algas marinhas. Estes formam gis em contato com cloreto de clcio e potssio e so muito utilizados para incluso de protenas96. A quitosana, um biopolmero de elevada massa molecular usualmente preparado pela purificao e desacetilao da quitina, apresenta grande possibilidade de formar filmes, fibras e membranas de microcpsulas97. A associao da quitosana com alginato da clcio leva formao de cpsulas, que so utilizadas para encapsulao de enzimas77. A lipase de Rhizomucor miehei foi imobilizada em cpsulas de quitosana/alginato/glutaraldedo98 e utilizada na esterificao do cido lurico com lcoois de C2 a C12. A presena de ramificaes prximas ao centro nucleoflico do lcool tambm foi analisada. As converses mais elevadas foram obtidas com lcoois lineares de C3 a C6 com converses entre 84-90% e C8-C12 entre 23-50%. Com os lcoois ramificados terc-butanol, 1-metil-butanol no foi observada formao de produtos. Com o 3-metil-butanol, a converso foi de 80%98. O mtodo de confinamento e microencapsulao de enzimas na catlise de diferentes reaes tem sido mostrado por vrios autores99-101. CONCLUSES As lipases so biocatalisadores muito importantes que vm sendo

utilizados para catalisar uma srie de reaes de grande valor sinttico. A imobilizao por adsoro, ligao covalente e/ou multifuncional, em matrizes polimricas ou por encapsulao, apresenta-se como tcnica importante para a utilizao em meio orgnico e, muitas vezes, com aumento na atividade e estabilidade. Embora cada mtodo apresente vantagens e desvantagens, a escolha da estratgia dever considerar as relaes entre suporte-enzima-substrato-solvente orgnicogua, para a manuteno das propriedades catalticas e da estrutura tridimensional das lipases. Estes sistemas tm sido utilizados com sucesso para a sntese de lactonas, obteno de monoglicerdeos, resoluo de aminas, cidos e lcoois racmicos, e na sntese de steres de cadeias curtas, mdias e longas, e aromticos. Mesmo considerando como significativos os avanos cientficos nesta rea, novas metodologias para imobilizao de lipases e de outros biocatalisadores e as possveis aplicaes em sntese orgnica ainda podero ser mais exploradas. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem UFSC, UNIVALI, CAPES-PICDT (R. Dalla-Vecchia) e CNPq (M. G. Nascimento e V. Soldi) pelo apoio financeiro e Amano e Novozymes, pela doao das lipases. REFERNCIAS
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