Extrao de DNA de plantas

AGRICULTURA
Eduardo Romano, Bilogo Molecular, M.Sc. Ana Cristina Miranda Brasileiro, Biloga Molecular, Ph.D.
CENARGEN/Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. romano@cenargen.embrapa.br

SOLUES PARA PROBLEMAS COMUMENTE ENCONTRADOS

isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos uma etapa importante na anlise da estrutura e organizao do genoma de plantas. Essas anlises necessitam, freqentemente,usar enzimas de restrio, que cortam o DNA em fragmentos, para ser que utilizado em Southern blot ou em construo de bibliotecas genmicas. Preparaes de DNA vegetal tambm so, comumente, utilizadas como substratos em reaes de PCR para estudos filogenticos ou no desenvolvimento de marcadores moleculares como os microsatlites e os gerados por RAPD. Independente do tipo de estudo molecular, as preparaes de DNA devem produzir amostras puras suficientes para no inibir os tratamentos enzimticos ou causar interferncias nos padres de migrao em gel de eletroforese. Algumas consideraes so importantes na obteno de DNA de boa qualidade e devem ser atendidas independente do mtodo utilizado. 1) As paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares. Essa etapa realizada geralmente pelo congelamento do tecido vegetal em nitrognio lquido e posterior quebra mecnica, com o auxlio de um pilo e de um almofariz, no caso de extrao em larga escala. Para extrao em pequena escala, utiliza-se um pequeno basto de vidro e um tubo
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Figura 1: Esquema representativo das etapas de extrao de DNA pelo mtodo CTAB.

de microcentrfuga. Nesse caso, as preparaes freqentemente se destinam a reaes de PCR e podem ser realizadas somente na presena de tampo de extrao, sem a adio de nitrognio lquido. 2) As membranas celulares devem ser rompidas para liberao do DNA. Essa etapa realizada pela ao de um detergente como SDS (dodecil sulfato de sdio) ou CTAB (brometo de cetiltrimetilamnio). 3) Deve-se evitar a ao de DNAses, que podem degradar o DNA. Com esse propsito, os tampes de extrao possuem pH por volta de 8,0, enquanto o pH timo para ao de DNAses endgenas fica por volta de 7,0. Outro expediente empregado a adio de EDTA (cido etileno diamono tetractico) no tampo de extrao. O EDTA uma substncia quelante de ctions divalentes, como Mg+2 e Ca+2 e, portanto, inibe a ao

de DNAses, que usam esses metais como cofatores (Sambrook et al., 1989). 4) cidos nuclicos devem ser separados das protenas. Para tanto, realiza-se de uma a vrias extraes com fenol e/ou clorofrmio, que desnaturam as protenas tornando-as insolveis fase aquosa, onde se encontram os cidos nuclicos. 5) O DNA deve ser protegido da ao de compostos fenlicos, que oxidam o DNA irreversivelmente, tornando este inacessvel s enzimas de restrio. A contaminao por compostos fenlicos pode ser evidenciada pela colorao do DNA que tende a ficar marrom. Para evitar o efeito oxidativo dos polifenis, deve ser adicionado ao tampo de extrao agentes anti-oxidantes, como PVP (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino) ou -mercaptoetanol.

6) Os cidos nuclicos devem ser separados de polissacardeos. Esses inibem a ao de enzimas de restrio (Shioda & Marakami-Muofushi, 1987) e tornam a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migrao do DNA em corridas eletroforticas. O detergente CTAB utilizado com essa finalidade, j que polissacardeos e cidos nuclicos possuem solubilidade diferenciada na presena desse detergente. Polissacardeos tambm podem ser removidos pelo emprego de gradiente de cloreto de csio (CsCl).

Vrios autores descrevem problemas no isolamento e purificao de DNA vegetal de boa qualidade (para uma reviso ver: Rogers & Bendich, 1994). Esses problemas so resultantes principalmente do co-isolamento de polissacardeos, substncias fenlicas e compostos secundrios. O mtodo mais utilizado com sucesso para diferentes espcies o baseado no uso do detergente CTAB. Esse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitao (Weising et al., 1995). A maioria dos

Tabela 1: Problemas comumente encontrados durante o isolamento de DNA de plantas; possveis causas e solues.
Problema encontrado Amostra de DNA marrom ou muito escura. Amostra de DNA com aspecto gelatinoso e excessivamente viscoso. O DNA, antes da digesto com enzimas de restrio, apresenta arraste vertical no gel. Causa Contaminao por polifenis. Soluo Adio de PVP-40 e/ou BSA no tampo de extrao, a concentrao de 1 a 2%. Aumento da concentrao de mercaptoetanol para at 5%. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio. Extrato de DNA via ncleos celulares.

Contaminao por polissacardeos.

DNA degradado por contaminao por DNAses ou por quebra Verificar o pH do tampo de extrao. mecnica durante a extrao com Este deve estar por volta de 8,0. Se o clorofrmio. pH estiver por volta de 7,0 facilitar a ao de DNAses durante a extrao Mistura das fases aquosa e de clorofrmio menos vigorosamente. Aplicar menos DNA no gel. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares; Aplicao de menos DNA no gel. Adicionar RNAse A, a uma concentrao final de 100g/mL e incubar a 37C por 20 minutos.

O DNA apresenta forma cnica no Excesso de DNA aplicado no gel. gel, em direo ao plo positivo. Contaminao por polissacardeos.

Aps a corrida, muito DNA retido Contaminao por no poo do gel. polissacardeos.

Aps digesto com enzima de Contaminao por restrio, a amostra apresenta polissacardeos. uma corrida com muito DNA nas Excesso de DNA aplicado no gel. laterais e pouco DNA no centro. O DNA no gel apresenta contaminao com RNA. Contaminao por RNA.

protocolos descritos na literatura utilizam o protocolo CTAB padro, com algumas modificaes, com vistas a resolver problemas especficos da espcie em estudo. Outros protocolos freqentemente empregados so variaes do descrito por Dellaporta e colaboradores (Dellaporta et al, 1983). Esses mtodos se fundamentam na precipitao simultnea de protenas e polissacardeos na presena de SDS e altas concentraes de acetato de potssio. Outro mtodo utilizado a extrao de DNA por meio de ncleos celulares. Essa estratgia baseada em uma prvia separao dos ncleos dos outros constituintes celulares. Esse procedimento pode resolver o problema de co-isolamento de constituintes indesejveis, como os polissacardeos e polifenis citoplasmticos. A principal desvantagem deste mtodo que a extrao de ncleos a partir de material congelado muito ineficiente. Outra desvantagem que esse mtodo mais laborioso do que os previamente mencionados. As preparaes de DNA obtidas por qualquer um desses mtodos podem sofrer uma posterior purificao por centrifugao em gradiente de densidade de CsCl. Essa purificao, apesar de laboriosa, eficiente na remoo de RNA, polissacardeos, protenas e outros contaminantes da amostra de DNA. Outra estratgia para purificao do DNA isolado a precipitao com acetato de amnio. Essa estratgia mais rpida, porm o DNA purificado de menor qualidade. Nesse artigo descrevemos um protocolo CTAB padro utilizado com sucesso em nosso laboratrio, em diferentes espcies, e dois protocolos de purificao (gradiente de CsCl e acetato de amnio). Apresentamos tambm uma tabela (tabela 1), onde so identificados os problemas comumente encontrados na extrao de DNA por meio do protocolo CTAB. Dessa forma, o leitor poder identificar o problema e tentar fazer as modificaes necessrias para melhorar a qualidade do DNA. Na tabela 2, esto listadas algumas espcies vegetais para as quais foram necessrias adaptaes de protocolos bsicos, visando resoluo de problemas especficos.
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Tabela 2 - Principais espcies vegetais para as quais foram necessrias adaptaes de protocolos bsicos, visando resoluo de problemas especficos (adaptado de Weising et al. 1995).
Espcie vegetal Protocolos Protocolos baseados na Protocolos Protocolos utilizando precipitao de envolvendo o mistos tampes CTAB protenas e isolamento de polissacardeos com ncleo aceato de potssio/SDS (Dellaporta) X X X X X

Abies alba (abeto) Betula alba (btula) Glycine max (soja) Gossypium hirsutum (algodo) Fragaria x ananassa (morango) Helianthus annus (girassol) Hordeum vulgare (cevada) Ipomoea batatas (batata-doce) Linum usitatissimum (linho) Lycopersicon esculentum (tomate) Musa acuminata (bananeira) Nelumbo spp. (ltus) Nicotiana tabacum (fumo) Oryza sativa (arroz) Picea abies (aberto) Pisium sativum (ervilha) Prunus persica (pessegueiro) Saccharum spp. (cana-de-acar) Solanum tuberosum (batata) Theobroma cacao (cacaueiro) Vicia faba (fava) Vitis vinifera (videira) Zea mays (milho)
Protocolos

X X X X X X X X

X X

X X X X X X X X X X X X X

X X X X

Isolamento de DNA total de plantas utilizando-se o mtodo CTAB (Figura 1) 1. Pese 3 g do material vegetal a ser analisado (calos, folhas, plntulas etc.), de preferncia fresco, e transfira para um almofariz contendo com nitrognio lquido. Com o auxlio de um pilo,

Para maiores informaes sobre tcnicas de isolamento e anlise de DNA de plantas, consulte o "Manual de Transformao Gentica de Plantas" (Brasileiro & Carneiro, 1998). Nele so apresentadas diferentes tcnicas utilizadas na transformao de plantas, assim como experimentos para a deteco de genes reprteres e anlise moleculares da integrao de genes em plantas. Para adquirir o manual, acessar via Internet a home page da Embrapa no endereo: http://www.spi.embrapa.br

pulverize o material at se obter um p fino. 2. Transfira rapidamente o p obtido para um tubo de polipropileno de 50 ml que contenha 15 ml de tampo CTAB [CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; -mercaptoetanol 0,2% (v/v)] pr-aquecido a 65oC. Feche o tubo e misture gentilmente at o p ficar homogeneamente distribudo. 3. Incube as amostras em banhomaria a 60oC por 30 minutos, agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido. 4. Retire o tubo do banho-maria e espere que a mistura atinja a temperatura ambiente. Adicione 15 ml de clorofrmio:lcool isoamlico (24:1; v/v). Feche o tubo e misture manualmente por 10 minutos. 5. Centrifugue a 5.000 g por 10 minutos a temperatura ambiente, para separar a fase orgnica da aquosa. 6. Remova a fase aquosa (fase superior) para um tubo novo de 50

ml. Evite pegar qualquer protena desnaturada presente na interface. 7. Repita a extrao com clorofrmio:lcool isoamlico mais uma ou duas vezes (etapas de 4 a 6), levando em considerao que mais extraes podem tornar a amostra mais pura, porm com maiores perdas de DNA. 8. Adicione RNAse A a uma concentrao final de 100 g/ml e incube a 37oC por 30 minutos. Essa etapa opcional e contribui para aumentar a pureza da sua amostra. 9. Adicione 0,6 volume de isopropanol ou 2,5 volumes de etanol absoluto, ambos a -20oC. Misture suavemente at formar um precipitado. 10. Se o complexo DNA-CTAB obtido formar uma rede de filamentos visveis, recupere o DNA com o auxlio de uma pipeta. Caso o DNA no forme uma rede visvel, centrifugue a amostra a 10.000 g por 20 minutos. Em uma boa preparao, o DNA no deve estar escuro. Sempre que possvel, evite a etapa da centrifugao para no co-precipitar o DNA e polissacardeos. 11. Descarte o sobrenadante e lave o precipitado com 5 ml de etanol 70% (v/v). Caso o precipitado se solte durante a lavagem, repita a etapa da centrifugao por 3 minutos(etapa 10). 12. Descarte o sobrenadante e seque o precipitado invertendo o tubo em um papel-toalha. 13. Dissolva o precipitado em 500 l de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e incube a 4oC por meia hora ou mais. A amostra pode ser ento armazenada a -20oC. 14. Uma purificao posterior pode ser realizada por tratamento com acetato de amnio ou por gradiente de cloreto de csio . Purificao de DNA total de plantas por tratamento com acetato de amnio 1. Dissolva o DNA isolado em 1,0 ml de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e adicione 500 l de acetato de amnio a 7,5 M. 2. Feche o tubo e misture suavemente por inverso para homogeneizar a soluo. Incube no gelo por 15 minutos. 3. Centrifugue por 30 minutos a 10.000 g a 4oC. Transfira o sobrena-

dante para um novo tubo. 4. Adicione 2 volumes de etanol absoluto ao sobrenadante e misture suavemente por inverso. Incube por 1 hora a -20oC. 5. Centrifugue por 10 minutos a 5.000 g a 4oC. 6. Lave o precipitado com etanol 70% (v/v) e centrifugue novamente nas mesmas condies por 3 minutos. 7. Seque o precipitado e dissolva em 500 l de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Conserve a soluo a -20oC. 8. Caso seja necessrio, proceda a uma repurificao por gradiente de cloreto de csio. Purificao de DNA total de plantas por gradiente de cloreto de csio (CsCl) (Figura 2) 1. Dissolva o DNA isolado em 6,5 ml de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e transfira a soluo para um tubo de ultracentrfuga de 10 ml. 2. Adicione 7 g de CsCl, feche o tubo e misture a soluo por inverso. Caso necessrio, aquea a soluo em um banho-maria a 30oC para facilitar a dissoluo. 3. Adicione 700 l de brometo de etdio a 0,1% (p/v). Feche o tubo e misture gentilmente por inverso para homogeneizar a soluo. A partir dessa etapa, proteja seu tubo com um papel-alumnio para evitar exposio luz ambiente, que po-

der danificar o DNA na presena do brometo de etdio. 4. Centrifugue a 45.000 rpm (rotor Vti65) por 16 horas, em uma ultracentrfuga, a 20oC. 5. Aps a formao do gradiente, visualize a banda correspondente ao DNA sob luz ultravioleta (320 nm). Colete cuidadosamente a banda com o auxlio de uma pipeta Pasteur e transfira para um novo tubo de vidro de 15 ml. 6. Remova o brometo de etdio adicionando soluo que contm DNA 1 volume de 1-butanol ou lcool isoamlico, ambos saturados em gua. Feche o tubo e misture gentilmente por inverso at que uma nica fase se forme. 7. Centrifugue por 3 minutos a 1.500 rpm (rotor SS34) a temperatura ambiente, para separar a fase orgnica da aquosa. Descarte a fase orgnica (fase superior), que contm o brometo de etdio, com o auxlio de uma pipeta Pasteur. 8. Repita a extrao por quantas vezes forem necessrias para eliminar qualquer vestgio de brometo de etdio (a cor rosa deve desaparecer completamente das fases orgnica e aquosa). 9. Remova o cloreto de csio precipitando o DNA pela adio de 2 volumes de gua destilada e 6 volumes de etanol absoluto. Incube por 30 minutos a 4oC. 10. Centrifugue a 12.000 rpm (rotor SS34) durante 30 minutos, a 4oC. Descarte o sobrenadante e dissolva o precipitado em 500 l de tampo TE (TrisHCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Conserve a soluo a -20oC.

11. Quantifique a amostra de DNA atravs de leitura espectrofotomtrica, medindo a absorbncia da soluo no comprimento de onda de 260 nm. A concentrao de DNA da amostra ser dada pela seguinte frmula: [DNA] = 50 g/ml x D x A260; onde: D o fator de diluio usado para fazer a leitura espectrofotomtrica e A260 a leitura obtida no comprimento de onda de 260 nm. Referncias Brasileiro ACM, Carneiro VTC (eds) (1998) Manual de Transformao Gentica de Plantas. Braslia, Embrapa-SPI/ Embrapa-Cenargen. 309 p. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21. Rogers SO, Bendich AJ (1994) Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant molecular biology manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a labaratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Shioda M, Marakami-Muofushi K (1987) Selective inhibition of DNA polymerase by a polysaccharide purified from slime of Phisarum polycephalum. Biocem Biophys Res Commum 146:61-66. Weising K, Nybom H, Wolff K, Meyer W (1995) DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton.

B
Figura 2: Purificao de DNA total de plantas por meio de gradiente de cloreto de csio. (A) Separao dos diferentes componentes presentes na soluo aps o isolamento do DNA total e ultracentrifugao em rotor de ngulo fixo. (B) Eliminao do brometo de etdio da soluo de DNA.

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