ATP SINTETAS: ESTRUCTURA F (X) PARENTESCOS.

INTRODUCCIN
La ATP sintetasa mitocondrial posee dos componentes principales: *F1 pp localizada en la matriz mitocondrial, en bacterias en el citosol, y contiene cinco subunidades

{3a ,3b ,d ,g ,e }

*Fo, es un canal de protones que presenta tres subunidades en bacterias y muchas mas en cariotas. En hgado de ratn el Fo presenta un min. 8 polipptidos distintos. F1 ha sido estudiado profundamente con relacin a sus cadenas de nucletidos y a sus propiedades cinticas. Aunque hay un convenio que dice que existe un mnimo de seis lugares de cadena de nucletidos en F1, uno en cada una de las subunidades de a y b. Cuando son usados sustratos mas naturales o anlogos solo los sitios mas ligados son detectados y la estequiometra cae a menos de 6 moles de nucletidos por mol de F1. Este s entonces un pequeo convenio sobre cmo las subunidades de F1 trabajan mecnicamente durante la sintetizacin de ATP . algunos investigadores creen que es necesario entender la dinmica de las pequeas subunidades para entender el mecanismo enzimtico. Realizan el movimiento de un par de ab a otro especfico en torno al papel del ATP sinttico?, o bien lo hacen las pequeas subunidades limitando sus papeles a unir F1 a Fo y tal vez a regular el flujo de protones a F1. En este artculo podemos comprobar que las investigaciones no tienen resuelto este dilema. MATERIAL Y MTODOS: Incluye: Reactivos usados o uso de reactivos. Contrastar funciones. Preparaciones y cristales de F1. Tcnicas de biologa molecular. Pptido-sintetasa. Cristalografa de rayos-X. Todos los estudios estn referidos a la mitad de F1 del hgado de rata de ATP-sintetasa. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Estudios biofsicos: Modelo de la fig.1 en la estructura cuaternaria de F1 del hgado de rata de la molcula de ATPsintetasa obtenida con rayos-X. Basado en 3.6 A de reduccin. En el modelo, las subunidades b se ven desde arriba y a desde el botn cerrando al canal de protones (H*). Estos datos bioqumicos indican que a yace cerca de la molcula. Existen cinco estructuras distintas que nos son de inters. 1. Un sitio de tres subunidades bs sobre unos sitios de subunidades as (alternada).

2. Las subunidades b no interactan fsicamente. 3. En cambio, a interacta, pero slo cerca de las tres envolturas del eje. 4. En reas significativas de sus estructuras, interactan a y b.

5. Hay espacios vacos entre ellos (cavidades). Una sexta diferencia del modelo que puede tener implicaciones funcionales en la localizacin del fuerte espacio atmico para el agente mersalyl. Los tres espacios atmicos se sitan cerca de la interfase de ab. La subunidad b de la enzima del hgado de rata no tiene residuo de cistena, mientras que la subunidad a tiene dos, las cuales estn localizadas entre los temas del consenso del Walker A y B, aunque deben estar incluidos en cadenas de nucletidos. Estos resultados sugieren que las cadenas de nucletidos de subunidades a se sitan cerca de la interfase con subunidades b. Actualmente, los trabajos estn enfocados en definir la localizacin de los dominio de las cadenas de nucletidos, en difundir fuertes tomos de nucletidos anlogos entre simples cristales y en determinar si las coordenadas de cristalografa de un o ms de uno est ligando polipptidos de ATP se ajusta dentro de ellos, en la mitad de F1.

ESTUDIOS QUMICOS Y DE BIOLOGA MOLECULAR: Los dos tipos de estudios estn enfocados inicialmente en determinar si el tema del consenso Walker A en la subunidad b incluira la cadena de nucletidos, y si es as, la naturaleza de esa interaccin. Qumicos: 50 pptidos de aminocidos (Asp-Thr) estaban sintetizados, extendiendo esta referencia en la subunidad b. Conteniendo el tema del consenso de Walker A GX4 8GKT y el predictor entero del lazo flexible del correspondiente a la fusin con la Adenilata Kinasa. Este pptido se llama pp-50 (Fig. 2 a), perificado homogneamente para estructuras secundarias y para interactuar con Adenosil-trifosfato. Estos datos explican que en 10mM tris-HCl (tampn a pH=7.4), el pp-50 interactuaba con ATP y precipitaba. Significativamente, GTP e ITP (sacados de F1) tambin inducen este precipitado, dando pirofosfato. AMP (deja de estar unido a F1) no produce precipitacin. Esto sugiere que la mayor interaccin entre pp-50 y los ligandos que precipitaban inducan pirofosfato. Usando el anlogo del nucletido trinitrofenil, la interaccin entre pp-50 y el anlogo puede seguirse fluoromtricamente en soluciones sin precipitado pp-50.con lo cual TNP- ATP y TNPADP interactuan fuertemente con el pp-50 .mientras que TNP-AMP tiene poca capacidad de interaccin. Dando lugar a la misma conclusin de antes. En estudios biomoleculares se confirmo que en E.C. que la que una TNP-ATP y TNP-ADP era un fragmento mas largo de subunidad b. Al suprimir una seccin de b ( Gly Lys ) que contienen el consenso A y la espiral flexible de Gly (fig 2 a) la pp resultante despliega una marcada reduccin de afinidad por el TNP-ATP.(Kd de 5 a 60 mM) Uniendo los resultados vemos que se recalca que la regin de la subunidad b que contiene el Walker A y la espiral flexible de glicina esta probablemente relacionada directamente en unir tanto ATP como ADP y que dicha reaccin de unin implica un enlace de pirofosfato. Regin de b: receptor de pirofosfato .tambin muestran que no es la nica regin implicada en esta unin y su supresin no previene completamente la unin de nucleotidos mas bien disminuyendo la afinidad. ESTUDIOS BIOQUIMICOS:

Los estudios de la unin de nucleotidos se han llevado a cabo en un F1 con mucho detalle. se han establecido 3 criterios estrictos: Todos los preparados de F1 usados fueron expuestos previamente a un restablecimiento de la sntesis de ATP hacia F1 mermando sus vesculas de la membrana interior viendo que la enzima es competente restaurando la funcin fisiolgica normal. 2. Las muestras de F1 han sido expuestas a procedimientos inmunolgicos para liberarse de la pp inhibidora de la ATPasa , la cual es conocida por aumentar las cadenas de nucleotidos al F1. 3. Evitar el uso de muchos anlogos de nucleotidos hidrofbicos o fotoafines. Solo usan ADP, el sustrato natural de la sntesis del ATP , y AMP- PNP( anlogo del DTP no hidrolizable )
1.

Encuentran que 1 mol de F1 del hgado de rata intactos une irreversiblemente 4 moles de nucleotidos. Hay un solo lugar donde se detecte ADP (Kd 1 mM ) , un solo sitio AMP-PNP con una similar Kd y dos AMP-PNP con nivel mas bajo de Kd (20-30 mM). Significativamente AMP-PNP no tiene efecto en la unin sobre ADP y viceversa, indicando que estn separados y distinguidos de la superficie del F1. La enzima tambin contiene un sitio que une MG +2 no cambiable, demuestra que F1 distribuye nucleotidos y MG +2 asimtrico, una interpretacin mas simple es (fig. 3) que el par asimtrico ab (en contacto con pequeas subunidades) une ADP,AMPPNP y MG +2 mas fuertemente( que cualquier otro par ab el cual solo un AMP PNP ) Aunque el nucleotido que une mas fuertemente sitios en F1 es llamado nocatalitico esto significa que los nucleotidos de estos sitios no combinan durante la hidrlisis del ATP. Aun as el inters real de la reaccin fisiolgica es la sntesis del ATP y se da por sentado que el papel del gradiente de H+ es el de separar nucleotidos fuertemente unidos. Parece que estas separaciones tuviesen lugar desde el asimtrico ab, con las subunidades entonces especificadas los dos pares de ab restantes en secuencia para una fuerte unin de nucleotidos seguido de una liberacin de energa inducida. Hoy en da los experimentos estn enfocados en determinar la exacta localizacin de la subunidad de los cuatro nucleotidos reversibles que unen el F1 del hgado de rata y el efecto del gradiente de H+ electroqumico en la unin de estos nucleotidos as como sus efecto sobre nucleotidos unidos endgenamente no detectado en estos estudios.