Anda di halaman 1dari 7

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Protein adalah senyawa organik besar, yang mengandung atom karbon, hidrogen, oksigen dan nitrogen. Beberapa diantaranya mengandung sulfur, fosfor, besi atau mineral lain. Protein disusun dari 23 atau lebih unit yang sederhana yang disebut asam amino, artinya protein tersebut mengandung gugus asam atau karboksil (-COOH) dan gugus amino (-NH2) yang bersifat basa sehingga menyebabkan protein bersifat amfoter yaitu mampu bersifat dan bereaksi sebagai basa dan asam. Dengan demikian protein mempunyai mekanisme untuk mencegah perubahan pH yang tiba-tiba di dalam tubuh Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik, enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh (building blocks); perakitan building blocks tersebut menjadi protein, membran sel, serta DNA yang mengkodekan informasi genetik; dan akhirnya penggunaan energi untuk menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya kerja enzim-enzim yang terkoordinasi secara cermat Enzim protease dapat diisolasi dari bonggol nanas, hierarki taksonomi nanas adalah sebagai berikut : Kingdom Divisio Kelas Ordo Famili Genus Spesies : : : : : : : Plantae Spermatophyta Angiospermae Farinosae Bromiliaceae Ananas Ananas comosus (L) Merr

Jumlah enzim dari ekstrak suatu jaringan ditentukan secara kuantitatif berdasarkan efek katalisnya. untuk penentuan ini perlu diketahui beberapa faktor, yaitu : 1. Persamaan reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut 2. Dibutuhkan atau tidaknya kofaktor tertentu. 3. Pengaruh konsentrasi substrat dan kofaktor 4. pH optimum Daerah suhu saat enzim mantap dan mempunyai aktivitas yang tinggi. Ekstrak dari sel yang terpecah atau kultur jaringan biasanya mengandung protease. Protease dikeluarkan dari bagian subseluler sementara pada filtrat kultur mikroba, protease ini disekresi selama proses fermentasi. Protease ini harus dikeluarkan atau dinonaktifkan untuk mencegah terdegradasinya protein. Keadaan ini diperoleh dengan cara menginhibisi protease dan menurunkan suhu yang dapat menurunkan aktivitas enzim protease. Inhibitor Fenilmetansulfonil flourida Serin Enzim yang diinhibisi protease(simotripsin, tripsin,

trombinase, dan tiol protease atau EDTA Pepstatin A Leupeptin Aprotinin papain). Metaloprotease Asam protease seperti pepsin, renin, simosin, dan katepsin D. Serin dan tiol protease seperti papain, plasmin, dan katepsin D. Serin protease seperti plasmin,

kallikrein, tripsin, dan simotripsin. Metode Lowry didasarkan pada dua reaksi yang berbeda. Reaksi pertama adalah pembentukan kompleks ion tembaga dengan ikatan amida, membentuk tembaga tereduksi dalam larutan alkalin. Kompleks ini dinamakan Biuret kromofor. Reaksi kedua adalah reduksi reagen Folin-Ciocateu yang tereduksi berwarna biru dengan demikian dapat terdeteksi oleh spektrofotometer pada rentang 500-750 nm. Metode Lowry sensitif untuk berbagai macam senyawa yang

mengandung residu tirosin dan triptopan. Jika protein yang diuji memiliki kandungan yang tidak biasa, suhu standar substitusi diperlukan. 1.2 Identifikasi Masalah Dari latar belakang yang telah dikemukakan di atas, dapat diidentifikasikan masalah yang timbul dari percobaan ini yaitu: 1. Keberadaan protein yang beraktivitas protelitik dalam bonggol nanas 2. Tahapan-tahapan yang secara efektif dan efisien dapat memisahkan dan memurnikan protein tersebut 3. Penentuan aktivitas enzim protease 4. Karakterisasi enzim protease tersebut yang meliputi penentuan pH optimum dan penentuan kadar protein 1.3 Tujuan Percobaan Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar protein dari bonggol nanas berdasarkan metode Lowry, menguji aktivitas enzim dari bonggol nanas dengan menggunakan substrat N,N-dimetilkasein, mengisolasi enzim protease dari bonggol nanas, serta untuk memurnikan enzim protease dari bonggol nanas. 1.4 Kegunaan Percobaan Hasil percobaan ini diharapkan dapat berguna untuk: 1. Memberikan informasi tentang enzim protease yang berasal dari bonggol nanas. 2. Perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang ilmu biokimia. 1.5 1. Metodologi Percobaan Pengendapan protein dengan garam amonium sulfat Penambahan kadar garam (amonium sulfat) yang tinggi ke dalam suatu larutan (salting out) mengakibatkan terbentuknya suatu endapan protein. Hal ini diakibatkan oleh tingginya kelarutan dari garam amonium sulfat dalam air. Selain

itu, garam amonium sulfat memiliki berat jenis yang relatif rendah, dapat mencegah proteolisis dan gangguan bakteri, serta harganya yang murah sehingga banyak digunakan untuk presipitasi protein. 2. Sentrifugasi Sentrifugasi digunakan untuk pemisahan material yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan sedimentasi dari masing-masing partikel yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Pada sentrifugasi, partikel dan medium pensuspensinya ditempatkan dalam suatu medan gaya sentrifugal. Medan inilah yang menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi. Perpindahan partikel atau solut dalam suatu medan sentrifugal dinamakan sedimentasi dan kecepatan pergerakannya dinamakan kecepatan sedimentasi. Materi yang tersedimentasi pada dasar tabung dinamakan pelet atau residu dan cairan di atasnya dinamakan supernatan.

Gambar 1.1 Skema Alat Sentrifugasi

3.

Pemurnian protein dengan kromatografi kolom filtrasi gel

Kromatografi adalah suatu cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi. Berdasarkan kecepatan migrasi kromatografi dapat dibagi menjadi adsorpsi, partisi, penukar ion, dan penyaring molekul (filtrasi gel). Kromatografi kolom filtrasi gel merupakan suatu teknik pemisahan berdasarkan pada partisi molekul yang akan dipisahkan pada kolom yang berisi partikel-partikel senyawa polimer yang inert, berpori, dan mudah menyerap air. Apabila suatu larutan yang terdiri atas berbagai ukuran molekul dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi gel penyaring, molekul-molekul yang kecil akan masuk ke daalam pori-pori gel, sedangkan molekul-molekul yang besar akan ditolak masuk ke dalam pori-pori gel sehingga molekul yang besar akan keluar dari kolom pertama kali. Kecepatan pergerakan molekul-molekul yang besar ini sangat tergantung pada berat molekulnya. Sampel yang mempunyai berat molekul yanglebih nesar akan keluar lebih dahulu sebagai eluat dan diikuti oleh zat yang mempunyai berat molekul yang lebih rendah. Fase diam atau matriks yang digunakan pada percobaan ini adalah Sephadeks G-25.

Gambar 1.2 Alat Kromatografi Kolom Filtrasi Gel

4.

Penentuan aktivias enzim protease Penentuan aktivitas enzim protease biasanya dilakukan pada pH dan suhu

optimum serta konsentrasi substrat dan kofaktor yang berlebih, sehingga laju reaksi yang terjadi merupakan reaksi tingkat ke nol (zero order reaction) terhadap substrat. Dalam hal ini, laju reaksi permulaan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim sehinggga faktor pembatas laju reaksi (rate limiting factor) yang sebenarnya adalah konsentrasi enzim. Menurut perjanjian internasional, satu unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang menyebabkan transformasi satu mikromol (10-6 mol) substrat per menit pada suhu 25 C dalam keadaan optimum sistem tersebut. Unit aktivitas = serapan sampel serapan blanko 0,001 X waktu hidrolisis Aktivitas spesifik (spesific activity) adalah jumlah unit aktivitas enzim per miligram protein. Aktivitas spesifik enzim protease = unit aktivitas mg protein 5. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry Prinsip dari penentuan kadar protein denan metode Lowry, yaitu: a. reaksi biuret dimana Cu2+ tereduksi menjadi Cu+ b. Cu+ mereduksi reagen Folin Ciocceltau menghasilkan warna biru yang intensitasnya sebanding dengan kadar protein Metode Lowry ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu: Banyak senyawa yang bisa menghasilkan positif palsu. Reagen harus dibuat segar karena adanya peningkatan jumlah karbonat Memerlukan waktu yang cukup lama. Uji sensitif terhadap cahaya sehingga iluminasi selama uji harus dijaga

akibat dari pengaruh cahaya.

konstan untuk seluruh sampel. 1.6 Tempat dan Waktu Percobaan

Percobaan ini dilakukan di laboratorium Biokimia jurusan Kimia FMIPA Universitas Padjadjaran, jalan Raya Sumedang km 21 Jatinangor, pada hari rabu tanggal 02 dan 09 November 2011.