GLOBALSCIENCEANDTECHNOLOGY(ISSN19843801) ESTUDOCOMPARATIVODEPROTOCOLOSDEEXTRAODEDNAEM DIFERENTESTECIDOSDETILPIADONILO(OREOCHROMISNILOTICUS) RejaneStubsParpinelli1 RicardoPereiraRibeiro2 Resumo:ODNAcorrespondematriaprimaparaqualquerconhecimentodegentica.Para seefetuarumbomdiagnsticomolecular,podeseutilizaroDNAextradodediferentestipos de tecidos, desde que com um elevado grau de qualidade.

ualidade. Sendo assim, considerando a praticidade,rapidezeeficinciaparaobtenodeDNAgenmico,efetuouseestetrabalho comointuitodeextrairDNAdediferentestecidos(nadadeiracaudal,msculoebrnquia)de tilpiadoNilo(Oreochromisniloticus)utilizandoosprotocolosFenol:Clorofrmio,NaCle CTAB.Asamostrasforamquantificadasemespectrofotmetroparadeterminaraquantidade deDNAesuapurezaatravsdarazoA260 eA280nm.Aanliseestatsticarevelouque,coma extraodeDNAdebrnquiaspelomtodoCTABedenadadeiraspelomtodoNaCl,obtm seosmelhoresrendimentosnaquantidadedeDNA.Entretanto,asamostrasmaispurasso obtidas com o uso de Fenol: Clorofrmio. Optase, portanto, para o uso em PCR, pela utilizaodomtodoNaClemnadadeirasdevidopraticidadeemobtenodaamostrae rapidezdoprocedimento.Todavia,quandonecessrioosequenciamento,aextraodoDNA dotecidonadadeirapelomtodoFenol:Clorofrmioaoporecomendada. Palavraschave:Oreochromisniloticus,protocolosdeextrao,DNAgenmico. Abstract: TheDNAistherawmaterialforanyknowledgeofgenetics.Tomakeagood moleculardiagnosis,itcanbeusedtheDNAextractedfromdifferenttypesoftissue,butwith ahighdegreeofquality.Therefore,consideringtheconvenience,speedandefficiencyfor obtainingDNA,thispaperaimstheDNAextractingfromdifferenttissues(tailfin,muscle and gill) of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) using the Phenol protocols: Chloroform, CTABandNaCI.Sampleswerequantifiedinspectrophotometertodeterminetheamountof DNA and itspuritybyreason A260 and A280 nm.Statistical analysis showedthatthe DNA extractionfromgillsbyCTABmethodandbythemethodoffinNaCl,offersthebestreturns intheamountofDNA.However,themostpuresamplesareobtainedwiththeuseofPhenol: Chloroform. It is chosen, therefore, for use in PCR, the use of the NaCl in fin due to practicality in obtaining the sample and speed of the procedure. However, when the sequencingisnecessarytoextractDNAfromtissuebypaddlemethodPhenol:Chloroformis therecommendedoption. Keywords:Oreochromisniloticus, protocolsforextraction,genomicDNA.

GraduaoemZootecniapelaUniversidadeEstadualdeMaring(UEM). email:rejane_uem@hotmail.com 2 GraduaoemZootecniapelaUniversidade Estadual deMaring; mestradoemGentica eMelhoramento AnimalpelaUniversidadeEstadualPaulistaJliodeMesquitaFilhoedoutoradoemEcologiadeAmbientes AquticosContinentaispelaUniversidadeEstadualdeMaring. email:rpribeiro@uem.br Recebidoem18/11/2008eAprovadoem05/12/2008

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R.S.Parpinellietal. INTRODUO OBrasilcontacomumanumerosae diversificadapopulaoeproduodepeixes, quepossui,assim,grandeimportnciaparaa segurana alimentar. Todavia, a produtividade pisccola vem sendo insuficiente para atender demanda atual, que vem contribuindo com valores crescentes, onde o cultivo surge como uma oportunidade para atendimento a essas necessidades(RIBEIROetal.,2008).Dados do IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis, 2005, revelam que a produo brasileiradaaqiculturacontinental,nosanos de2002a2004,teveincrementode18.065t, tendo aumentado de 162.665,5 para 180.730,5t. Comesteavanonosetoraqcola,areade melhoramento gentico tem aumentado a demandaporlinhagensqueapresentembom desempenhoaliadoadaptaoaoambiente de cultivo, atendendo, dessa forma, s perspectivas dos mercados consumidores, tanto para a industrializao quanto para a pescaesportiva(VALENTIM,2001). Dentrodatilapicultura,osestudosem gentica molecular atravs da extrao do DNA e utilizao de marcadores esto se tornandomuitocomuns,poisumapoderosa ferramenta que oferece informaes teis para o manejo de banco gentico e para o direcionamento de programas de melhoramento (MOREIRA, 2001; MELAMEDetal.,2002;POVHetal.,2003), sendoqueatilpiadoNiloapresentagrande potencial emtermos deengenharia gentica voltada ao melhoramento dos estoques (SUGANUMA,2004). Estudos bsicos sobre metodologias especficasquepossamotimizaraextraode DNAdeboaqualidadedeumaamostra,para queasregiesdesejadassejamlocalizadase amplificadas,sodegrandeimportnciapara odesenvolvimentodepesquisasnocampoda biologiamolecular(SOLLROetal.,2004).

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A espcie estudada, tilpia do Nilo Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758), nativada frica e foiintroduzida noBrasil em 1971, procedente da Costa do Marfim (CASTAGNOLLI, 1992). uma espcie bastante rstica, de hbito alimentar fitoplanctfago, que aceita, tambm, outros tipos de alimento, inclusive alimentos artificiais em todos os estgios de vida (SANTIAGO et al., 1987). uma espcie apreciadaempesquepagueseindstriasde filetagemgraassqualidadesorganolpticas einexistnciadeespinhosemYnoseu fil(MEURERetal.,2002). Para tanto, existem vrios protocolos que permitem a extrao de DNA de diferentes espcies animais e para diferentes tipos celulares, porm, alguns mais laboriosos e outros mais simplificados (FUNGARO e VIEIRA,2001). Para fins de PCR(Reao emCadeiadePolimerase),possvelutilizar mtodosrpidosesimplificados,umavezque essa tcnica requer quantidades mnimas de DNAeestenoprecisaapresentaraltograu de pureza. Entretanto, em se tratando de regiesgenmicasaseremsequenciadas,de extremaimportnciaqueesteDNAsejapuro, livredeprotenas. A maioria dos protocolos compartilham etapasqueincluemamaceraodostecidose lise das clulas, a extrao das protenas, lipdiosegrandepartedospolissacardeose, porfim,aprecipitaodoDNA(FUNGARO e VIEIRA, 2001). Segundo estes autores, a extrao deDNApodeserfeita apartir de qualquerclulaqueestejaconservada. Aps a extrao do DNA preciso quantificlo, e. Posteriormente. avaliar sua purezaeintegridade.Emumaboaextrao. apenas uma banda ntegra deve aparecer. Rastros podem indicar degradao do DNA ou excesso de protena, e outras bandas indicamapresenadeRNA. Os cidos nuclicos (DNA e RNA) absorvem luz no comprimento de onda de 260nm. Dessa forma, podem ser quantificados em espectrofotmetro. J as protenasabsorvemluznocomprimentode

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Estudocomparativode... onda de 280nm. Nesse sentido, a relao absorbnciade260nm/absorbnciaa280nm forneceumparmetrodequalidadedoDNA. Razo entre 1,8 e 2,2 considerada ideal. Valoresinferioresa1,8indicamexcessode protenas e, valores superiores, excesso de solventes orgnicos (FERREIRA e GRATTAPAGLIA,1998). A extrao de DNA tem sido realizada em diferentes tecidos de animais como sangue, smen e plos de touros de diferentes raas zebunas (COELHO et al., 2004), sangue de aves (CAMPOS et al., 2004), dentre outros. Outros estudos ainda enfatizamautilizaodestatcnicaempeixes da espcie Astyanax bimaculatus (PAIVA, 2001). A extrao de DNA tem sido realizada em diferentes tecidos de animais como sangue, smen e plos de touros de diferentes raas zebunas (COELHO et al., 2004), sangue de aves (CAMPOS et al., 2004), dentre outros. Outros estudos ainda enfatizamautilizaodestatcnicaempeixes da espcie Astyanax bimaculatus (PAIVA, 2001).Considerandoarapidezepraticidade paraobtenodaquantidadeedaqualidade do DNA genmico, se idealizou neste trabalho, comparar a extrao de DNA de nadadeira caudal, msculo e brnquias de tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus) utilizandoosprotocolos Fenol:Clorofrmio, Cloreto de Sdio (NaCl) 5M e CTAB (BrometodeCetiltrimetilamnio). MATERIAISEMTODOS Nesseexperimento,foramutilizadas tilpias do Nilo (Oreochromisniloticus),tendosido coletados dois animais (duplicatas) na Estao de Piscicultura da Universidade EstadualdeMaringCodapar,localizadano distrito de Floriano e posteriores anlises efetuadas no Laboratrio de Biologia Molecular Departamento de Zootecnia (DZO). Para a coleta e retirada de tecido da nadadeira, os animais foram anestesiados (benzocana0,01%)e,nocasodaretiradados

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tecidosbranquiaisemusculares,osanimais, posteriormenteanestesiaeinsensibilizao, foram sacrificados pela seco da medula espinhal. As amostras de nadadeira caudal, brnquias e msculos foram coletadas e conservadasemetanol70%,resfriadasauma temperatura de 4C, direcionadas ao laboratrioemantidasa20Cnegativopara posterior processo de extrao do material gentico.Asamostrasforammaceradascom nitrognio lquido (com o auxlio de pistilo para facilitar o processo de pesagem) e subdividasemporesde0,05g(comauxlio debalanadepreciso). Foramavaliadostrsprotocolosdeextrao de DNA baseados em diferentes tipos de solventesorgnicos: ProtocoloFenol:Clorofrmio A metodologia seguiu o protocolo proposto por BARDAKCI e SKIBINSKI, (1994) adaptado por POVH et al., 2005. Alquotas (0,05g) de tecidos da nadadeira, brnquia e msculo foram colocados em microtubos adicionandose 550 L de tampodelise(50mMdeTrisHCl,50mM deEDTA,100mMdeNaCle1%deSDS),30 LdeSDS20%(dodecilsulfatodesdio)e 5 LdeproteinaseK(200 g/ml),e,em seguida,incubadosem banhomaria55oC overnight.Depoisdesteperodo,adicionou se550 Ldefenolclorofrmio,sendo275 L de fenol e 275 L de clorofrmio. Efetuouseamistura das fases porinverso detubo,centrifugandoasportrsminutos 12000 rpm, sendo retirado o sobrenadante, colocandoo em tubo novo. Foi efetuada a adio de 500 L de fenol/clorofrmio, sendo 250 L de fenol e 250 L de clorofrmio;misturandonovamenteasfases por inverso de tubo e centrifugando as amostrasportrsminutosa12000rpm.Foi retiradoosobrenadantecolocandooemoutro tubo. Mais uma purificao foi realizada, porm, somente com clorofrmio. Foram misturadas novamente as fases porinverso detubo,centrifugandopormaistrsminutos

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R.S.Parpinellietal. 12000 rpm, transferindo o sobrenadante paraoutrotubo.ODNAfoiprecipitadocom aadiode1/10deacetatodesdio3M(pH 7,0) e 2,5X de etanol absoluto gelado, misturandoseasfasesporinversodetubo cuidadosamente. Em seguida, as amostras foramincubadasnofreezera20oCnegativos porumahora.Depoisderetiradasdofreezer, as mesmas foram centrifugadas por quatro minutos a 12000 rpm, descartando o etanol cuidadosamenteparanoperderopelletde DNA. Foi adicionado 500 L de etanol 70%centrifugandopormaiscincominutos 12000 rpm, e novamente descartando o etanol. Realizados estes procedimentos, as amostras foram deixadas na bancada para secarem temperatura ambiente por aproximadamente 40 minutos. Depois disto, foramadicionadosemcadatubo45 Lde tampoTE(10mMdeTrispH8,0e1mMde EDTA)etratadoscom3 g/mLdeRNAse. O DNA permaneceu por 40 minutos em banhomaria a 37oC, sendo, em seguida, conservado 20oC negativos at a quantificao, checagem e teste de amplificao. O perodo de tempo que equivalerealizaodesteprotocolodetrs dias. ProtocoloCloretodeSdio(NaCl)5M Este procedimento seguiu o protocolo que utilizaNaCl(SAMBROOKetal.,1989)com algumas modificaes. Para tanto, as sub amostrasforamcolocadasemmicrotubos,aos quaisadicionouse550 Ldetampodelise (50 mM de TrisHCl, 50 mM de EDTA, 100mMdeNaCle1%deSDS),30 Lde SDS20%(dodecilsulfatodesdio)e5 L de proteinase K (200 g/ml), em seguida, foram incubados em banhomaria 50C overnight.Posteriormente,adicionousenas amostras 600 L de NaCl/5M, foram misturadas as fases por inverso de tubo e centrifugadas por 10minutos 10000 rpm. Depois disto, foi retirado o sobrenadante e colocado em tubo novo. Em seguida, adicionouse 700 l de etanol absoluto

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gelado, homogeneizando as amostras at a visualizaodafitadeDNA.Posteriormente, asmesmasforamincubadasnofreezer20 o C negativos por uma hora. Depois de retiradas do freezer, as mesmas foram centrifugadas por 10minutos 12000 rpm, descartando o etanol cuidadosamente para no perder o pellet de DNA. Foram adicionados,ento,600 Ldeetanol70%, sendocentrifugadopormaiscincominutos 12000 rpm, e novamente descartando o etanol. Realizados estes procedimentos, as amostras permaneceram na bancada para secarem temperatura ambiente por aproximadamente40minutos.Depois deste intervalo, foramadicionados,emcadatubo, 45 LdetampoTE(10mMdeTrispH8,0 e1mMdeEDTA)etratadocom5 Lde RNAse.ODNApermaneceupor40minutos embanhomariaa37oC,sendoconservadoa 20oCnegativosataquantificao,checagem etestedeamplificao.Operododetempo queequivalerealizaodesteprotocolode doisdias. Protocolo CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamnio) Esteprotocoloseguiuopropostopor BOYCE e ZWICK (1989) com algumas modificaes. Os fragmentos dos tecidos foramcolocadosemmicrotuboscom500 L deCTAB(200mLdesoluodeCTAB:160 mLH2OmilliQ;16,36gNaCl;400mLb mercaptoetanol; 20 mL 1 M TrisHCl, pH 8,0; 8 mL 0,5 M Na2EDTA, pH 8,0; 4 g CTAB). A mistura foi posteriormente incubada em banhomaria 65C durante duashoras;sendoasuspensomisturadacom o vrtex em intervalos de20 minutos. Ao sobrenadante,foramadicionados500 Lde clorofrmio: lcool isoamlico (24:1)para a purificao domaterial genmico. Para500 Ldasoluo,adicionaramse480 Lde clorofrmio e 20 L de lcool isoamlico. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos 10000 rpm. Transferido o sobrenadanteparaosegundotubo,oDNAfoi

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Estudocomparativode... precipitado com a adio de 350 L de isopropanol resfriado a 20oC negativos, homogeneizadoemantidopor30minutosa 4C.Asamostrasforamacondicionadas por 30 minutos na geladeira e, em seguida, centrifugadas por 20minutos a 12000 rpm, descartandoosobrenadante.Emseguida,foi efetuadaalavagemdopelletcom750 Lde etanol70%,centrifugandologoapsa14000 rpm por dois minutos, descartando novamente o sobrenadante. Este procedimento foi repetido cuidadosamente por mais uma vez. As amostras permaneceram na bancada para secarem temperatura ambiente por aproximadamente 40 minutos. Depois deste intervalo, foram adicionadosemcadatubo45 Ldetampo TE(10mMdeTrispH8,0e1mMdeEDTA) e tratado com 5 L de RNAse. O DNA permaneceupor40minutosembanhomaria a370C,sendo,emseguida,conservadoa20oC negativos at a quantificao, checagem e teste de amplificao. O perodo de tempo queequivalerealizaodesteprotocolode umdia. O material extrado utilizando os trs mtodosdeextraodeDNAfoisubmetido leituradasabsorbnciasa280nme260nm de comprimento de onda para que fossem verificadas a pureza (sem excesso de protenas) e quantidade do DNA em cada amostra. Esse valor de absorbncia quando multiplicadopor50(1absorbnciaa260nm corresponde a 50 g/mL de DNA de fita dupla) e, pelo fator de diluio, fornece a concentrao de DNA em g/mL. A confirmaodapurezadoDNAfoiverificada pelarazodasabsorbncias260nme280nm para leitura do DNA e protena, respectivamente (BARBOSA, 1998). A quantidade de DNA foi determinada utilizandoaseguinteequao: [DNA]=50g/mLxDxA260

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Onde:[DNA]=quantidadedeDNA(g/mL); D = fator de diluio usado para fazer a leituraespectrofotomtrica;A260 =aleitura obtidanocomprimentodeondade260nm. A integridade do DNA genmico extrado foi avaliada em gel de agarose a 0,8%reveladocom0,5 g/mLdebrometode etdio evisualizado emtransluminador com luzultravioleta.Aeletroforesefoiconduzida em cuba horizontal, em 100 volts por 45 minutos,usandotampoTBE0,5X(500mM deTrisHCl,60mMdecidobricoe83mM de EDTA). A imagem foi capturada pelo sistemadaEDAS(Kodak1DImageAnalysis 3.5). A qualidade do DNA foi testada atravs de reaes de amplificaes utilizando a tcnica PCR. Para tanto, foi utilizado um par de primers especfico desenhado para o gene do hormnio do crescimento (GH) de tilpia Nilo, sendo a seqncia (5 CAGCGGTGTGTTTTTCATGT3 e 5 CGGTTCCCTTGACATCAAAT3) de acordocomaseqnciapublicadaporBERe DANIEL(1993),nmerodeacessoM97766 no GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Otamanhodefragmentoesperadocomouso deste par de primers foi de 652 pb, amplificandodesdeaporofinaldaregio promotoraatontron2(BLANCK,2008). Na anlise estatstica, foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualisado em esquema fatorial 3x3, tendo comofatoresasamostras dostrs tecidos e trsprotocolosdeextrao,sendoefetuadas 72repetiesparacadaprotocoloanalisado. Paraaanlisedosdados,foramutilizadosos valoresreais,notransformadosemlog,pois adiferenaentreambosfoiinsignificante.Os dados foram submetidos s anlises estatsticaseasmdiascomparadaspeloteste de Duncan a 5% de probabilidade, se utilizando o Sistema para Anlises Estatsticas e Genticas SAEG (UFV, 1999).

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Asvariveisabsorbnciasa260nme280nm, protocolo;Bj=efeitodotecido;AiBj=efeito quantidadeerazodoDNAforamanalisadas da interao entre espcie e tecido; e eijk = deacordocomomodeloestatstico: erroexperimental. Yijk=+Ai+Bj+(AB)ij+eijk RESULTADOSEDISCUSSO Os coeficientes de variao (CV) e Onde:Yijk =observaoreferenteaisimo protocolo, no jsimo tecido, na ksima teste F para cada fonte de variao e cada repetio; = mdia geral; Ai = efeito do varivelsoapresentadosnaTabela1.

Tabela1.Valoresdosquadradosmdios(QM),coeficientedevariao(CV)etesteFpara cadafontedevariaoecadavarivel. FontedeVariao A260nm A280nm Concentraode DNA(g/mL) Protocolode extrao(P) Tecido(T) Interao(PxT) CV(%) 3,187* 0,313* 48,16 0,978* 0,071* 43,19 19874420,0* 1905334,0* 48,12 0,431* 0,153* 7,85 0,094ns QM 0,035** 595539,1ns 3,445* Razo Abs260nm/Abs280nm

**

significativo(p<0,01);*significativo(p<0,05);nsnosignificativo(p>0,05)pelotestedeF.

Foi verificado que no houve diferena significativa entre os protocolos para as variveis A260nm e para a concentrao de DNA.Noentanto,paraasdemaisvariveis: efeito de tecido e efeito de interao entre protocolo de extrao e tecido, houve diferena significativa. Segundo (MARENGONIetal.,2006),trabalhandose com diferentes tecidos slidos de quatro espcies de peixes, de acordo com os mtodos Proteinase K (PK) e Brometo de

Cetiltrimetilamnio(CTAB),noseverificou efeito significativo para a interao entre espciesetecidosemrelaorazo,porm houve interao (p<0,05) em relao concentrao. OsvaloresmdiosdasvariveisA260nm e A280 nm, concentrao e pureza do DNA, obtidos para os diferentes protocolos de extraoetecidosestoexpostosnaTabela2.

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Estudocomparativode...

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Tabela2. Valoresmdiosdeabsorbnciaa260e280nm,concentraoepurezadoDNA (expressopelarazodasabsorbncias),extradosdetrsdiferentestecidosdetilpiadoNilo, deacordocomtrsmtodosdeextrao. Protocolo Nadadeira DNA(A260nm) Fenol:Clorofrmio NaCl CTAB Protena(A280nm) Fenol:Clorofrmio NaCl CTAB
B A

Tecido Msculo
B

Brnquia
A

0,309b 0,439a B 0,383ab

0,289a 0,177ab C 0,157b

B

0,620b A 0,497c A 0,808a

A A

0,160b 0,279a B 0,224ab

B B

0,153a 0,135a C 0,101a

B C

0,327b 0,340b A 0,443a

ConcentraodeDNA(g/mL) B Fenol:Clorofrmio 803,10a A NaCl 1097,92a B CTAB 956,67a

722,62a B 443,75ab C 394,55b

B

1552,29b A 1243,91c A 2020,00a

PurezadoDNA(RazoAbs260nm/Abs280nm) A A A Fenol:Clorofrmio 1,9a 1,9a 1,9a A C B NaCl 1,6c 1,3c 1,5c B b C b A CTAB 1,7 1,5 1,8b Mdiasseguidasdamesmaletraesquerdanaslinhas nodiferempelotestedeDuncan (p<0,05)paratecidodentrodomesmoprotocolodeextrao. Mdias seguidas damesma letra direita nas colunas nodiferem pelo teste de Duncan (p<0,05)paraprotocolodeextraodentrodomesmotecido. extrao que apresentou menor valor de absorbnciafoiparaaextraodeDNAde tecido muscular atravs do mtodo CTAB. Dentrodecadaprotocolodeextraoecada tecido, para o protocolo Fenol:Clorofrmio,ostecidosdanadadeirae domsculoforamiguaisentresi,diferindose significamente do tecido branquial. Para o protocolo NaCl,otecido danadadeira eda brnquia diferiu significamente do tecido muscular,jparaoprotocoloCTABtodosos tecidos diferiramse significamente entre si, com maior concentrao de DNA para brnquia.

Conformea leitura daabsorbncia a 260nmnohouvediferenasignificativapara o tecido da nadadeira entre o protocolo CTAB e os protocolos Fenol:Clorofrmio e NaCl,havendonoentanto,diferenasomente entre o protocolo Fenol:Clorofrmio e o protocolo NaCl, tendo este ltimo apresentado a maior absorbncia (0,439). Paraotecidomuscular,verificousediferena entre o protocolo Fenol:Clorofrmio e CTAB, onde para o primeiro obtevese a melhor mdia (0,289). Para as brnquias, houve diferena significativa entre os trs protocolos,sendoqueparaoprotocoloCTAB Paraaleituradaabsorbnciaa280nm aabsorbnciafoimaior(0,808).Omtodode notecidodanadadeira,adiferenaentreas Gl.Sci.Technol.,v.02,n.01,p.2233,jan/abr.2009.

29 R.S.Parpinellietal. mdiasseguiuomesmocomportamentoque overificadoparaaA260nm,assim,nohouve diferena entre o protocolo CTAB com os demais, sendo Fenol:Clorofrmio e NaCl diferentes entre si. No houve diferena significativaentreosprotocolosparaotecido muscular. Para brnquia, CTAB diferiu significativamenteentreFenol:Clorofrmioe NaCl.ParaoprotocoloFenol:Clorofrmio,a maiormdiafoiverificadaparaasbrnquias (0,327), no havendo diferena entre msculo e nadadeira. Para o protocolo Fenol:Clorofrmio,ostecidosdanadadeirae domsculoforamiguaisentresi,diferindose do tecido da brnquia. Para os protocolos NaCl e CTAB todos os tecidos foram diferentes entre si, com maior A280nm para brnquiaemenorparamsculo. ParaavarivelconcentraodeDNA (g/mL) no houve diferena entre os protocolos para nadadeira. Para o tecido muscular,Fenol:ClorofrmioeCTABforam diferentes. Todos os protocolos foram diferentesparaotecidobranquial,sendoque o protocolo CTAB apresentou maior rendimento, conforme j esperado devido a leituradaabsorbnciaa260nm.Aextrao feita pelo mtodo CTAB de brnquias apresentou o melhor rendimento (2020 g/mL) em relao aos demais tecidos, entretanto, no apresentou diferena ao comparloextraodeDNAdenadadeiras com NaCl (1097,92 g/mL). O menor rendimento de extrao foi obtido com o CTAB para o tecido muscular (394,55 g/mL).OsvaloresdeconcentraodeDNA aqui obtidos so superiores aos verificados por(MARENGONIetal.,2006)aocomparar osprotocolosFenol:ClorofrmioeCTABnos tecidos branquial, muscular e nadadeiras de peixes telesteos. Os autores observaram diferena nos mtodos de extrao somente paraotecidomuscular,oqualfoimenorque os demais tecidos avaliados. Analisando o protocolo Fenol:Clorofrmio, os tecidos da nadadeiraedomsculoforamiguaisentresi, diferindose do tecido branquial. Para o protocolo NaCl,otecido danadadeira eda brnquia diferiu significamente do tecido muscular,jparaoprotocoloCTABtodosos tecidosforamdiferentesentresi,commaior concentraodeDNAparabrnquia. Quanto pureza do DNA, houve diferenasignificativaentreostrsprotocolos dentrodostrstecidos,comvaloresvariando de 1,3 a 1,9; onde MACHADO, 2004, analisandoaextraodeDNAgenmicoem tecidosslidosdetilpiadoNilo,pacu,piaue curimba, encontrou valores de pureza de DNAquevariaramde1,7a1,8paraamostras defgado,rim,corao,brnquias,nadadeira emsculoparaoprotocoloCTAB.Dentrode cada protocolo de extrao, no houve diferena significativa entre tecidos para o mtodoFenol:Clorofrmio.Paraoprotocolo NaCl,todosostecidosforamdiferentesentre si,commaioremenorpurezaverificandose para os tecidos de nadadeira e msculo, respectivamente. JparaoCTAB,todos os tecidos diferiramse significamente, sendo observadooDNAextradodebrnquiamais puro;ondesegundoVALENTIMetal.,2003, afirmaramqueoprotocoloCTABtestadono foi adequado para a extrao do DNA de Lernaea, porm alteraes na concentrao dos componentes especficos utilizados no mesmo podem ser realizadas na busca de resultadospositivos. MARENGONI et al., (2006), trabalhando com peixes telesteos, encontraram valores depurezadeDNAde1,8,1,7e1,7paraos tecidos da nadadeira, do msculo e das brnquias,respectivamente,comautilizao do mtodo CTAB. POVH et al., 2005, encontraramvaloresdepurezaentre1,8e2,2 para variadas amostras de nadadeira caudal comFenol:Clorofrmio,corroborandocomas razes aqui verificadas. (BARRERO et al., 2008),trabalhandocomextraodeDNAde amostrasdebarbatanaselarvasdediferentes espcies de peixes (Brycon orbignyanus, Piaractusmesopotamicus,Oreochromis

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30 Estudocomparativode... niloticus, LeporinuselongatuseProchilodus lineatus), utilizando o mtodo NaCl e Fenol:Clorofrmio,encontraramvalorespara a espcie aqui estudada de 1,8 e 1,9 respectivamente. deverosersubmetidasaoseqenciamento,j que o excesso de impurezas tem alta interferncia noprocedimento. As extraes realizadas com Fenol:Clorofrmio e de brnquiascomCTABapresentaramnvelde O protocolo NaCl revelou amostras com purezas dentro do recomendado por maior grau de impureza. Dessa maneira, s FERREIRAeGRATTAPLAGLIA,1998. norecomendadoousodeDNAextrado Otestedeamplificaodasamostraspode com base neste protocolo em amostras que seravaliadonaFigura1.

Figura1.Geldeagarose1%contendoaamplificaodeumfragmento(652pb)dogeneGH de tilpia do Nilo. Canaletas que contm o nmero 1 correspondem ao protocolo Fenol:Clorofrmio;nmero2correspondeaoprotocoloNaClenmero3aoprotocolo CTAB. Letras queprecedem aosnmeroscorrespondemnadadeira (N),msculo(M) e brnquia(B).AcanaletaPMindicaopadrodepesomolecularde1KbPlus(Invitrogen).

Conforme o teste de amplificao, ficou objetivo destes estudos e o destino que os evidentequeostrsmtodosforameficientes animais amostrados deverotomar,pois,ao paraostrstecidostestados. analisarmos estoques de reprodutores e AconcentraodeDNAobtidaemtodosos matrizes de peixes, por exemplo, no seria tecidos e protocolos suficiente para a possvel a retirada de pedaos do tecido realizao de trabalhos que envolvam a branquial ou muscular, sendo necessrio gentica molecular, no entanto, alm de executar o sacrifcio destes animais. Nestes variveiscomoaconcentraoeapurezado casos, os mtodos em que fragmentos de DNA, se deve levar em considerao o nadadeirassousados,seriamamelhorsada, Gl.Sci.Technol.,v.02,n.01,p.2233,jan/abr.2009.

31 R.S.Parpinellietal. decidindose, portanto, somente entre os porseapresentarnumvalorindicadoideal,e mtodosdeextrao. porevitarosacrifciodosanimaisparacoleta Vriosprocedimentosdeextraode detecidomuscularebranquial. DNA tm sido descritos na literatura, observandose que mtodos padres so utilizados com algumas modificaes, visandosolucionarosproblemasespecficos daespcieemestudo.Deveselembrarainda que a forma de coleta e a conservao do tecido so consideradas de grande importncia para a obteno do DNA em concentrao e qualidade adequadas (SOLLROetal.,2004).ApurezadoDNA afetada significativamente pela condio do tecidoanteriorextraoeporessemotivo recomendaseutilizaromaterialmaisfresco possvel (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). CONCLUSES Analisandose os trs mtodos de extrao, dentro do mesmo tecido, os melhoresresultadosquantoaconcentraode DNAforamobtidosparaaextraodeDNA de brnquias e nadadeiras, utilizando os mtodos CTAB e NaCl, respectivamente. Podendooptarse,portanto,pelaextraodo DNA de nadadeiras, devido facilidade de obteno do tecido, sem a necessidade de sacrifcio dos animais, associados quantidadesatisfatriadeDNAesuapureza. Em relao pureza do DNA genmico encontrado,omtododeextraoatravsdo protocoloFenol:Clorofrmio,paraostecidos danadadeira,msculoebrnquia,pareceser orecomendadoparaestudosmolecularesem peixes,porapresentaremumgraudepureza considerado ideal. No entanto, sendo necessria a utilizao das amostras para reaesdeseqenciamento,aextraoCTAB com o tecido branquial apresentase mais puro,porm,omtodoFenol:Clorofrmiode tecidodanadadeirapareceserorecomendado REFERNCIAS BARBOSA,M.M.Quantificaoecontrole da qualidade do DNA genmico. In: MILACH, S. C. K. (Ed.). Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre: SandraMilach,1998.p.99106. BARDAKCI, F.; SKIBINSKI, D.O.F. ApplicationoftheRAPDtechniqueintilapia fish: species and subspecies identification. Heredity, Edinburgh, v.73, n.2, p.117123, 1994. BARRERO, N.L.; POVH, J.A.; RIBEIRO, R.P.; GOMES, P.C.; JACOMETO, C.B.; LOPES,T.S.ComparisionofDNAextraction protocols of fish fin and larvae samples: modified salt (NaCl) extraction. Revista Latinoamericana en Ciencias de la Agricultura y Ambientales, Ciencia e InvestigacinAgrria, v.35,n.1,p.6574, 2008. BER, D.; DANIEL, V. Sequence analysis suggests a recent duplication of the growth hormoneencoding gene in Tilapia nilotica. Gene,v.125,p.143150,1993. BLANCK,D.V. Polimorfismonontron1 PstIdogenedohormniodocrescimento em linhagens de tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus). 2008. 53 f. Dissertao(MestradoemZootecnianarea de Concentrao Produo Animal) UniversidadeEstadualdeMaring,Maring, 2008. BOYCE,T.M.;ZWICK,M.E.Mitochondrial DNAinbarkweevils:size,structure,and

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