Full Text
Full Text
DISERTASI
SRI HERNAWATI
DISERTASI
SRI HERNAWATI
DISERTASI
Oleh :
SRI HERNAWATI
090970133
LEMBAR PENGESAHAN
Oleh
Promotor :
Ko Promotor I Ko Promotor II
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg,M.Si
Nip : 19550705 198003 1 005 Nip. 19591114 198603 2 002
Mengetahui
Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran
Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga
Panitia Penguji :
Anggota :
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat
Penelitian Disertasi ini menjadi salah satu persyaratan yang harus ditempuh oleh
dan perbaikan dari banyak pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati,
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh. selaku promotor yang dengan penuh
penuh kesabaran, memberikan bimbingan dan saran sehingga ujian disertasi ini
dapat diselesaikan.
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si, selaku Ko-Promotor I yang dengan penuh
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg, M.Si. selaku Ko-Promotor II yang dengan
Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. H. Fasich, Apt. yang telah memberi
kepada saya untuk mengikuti Pendidikan Program Doktor pada Program Ilmu
kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk menjadi mahasiswa
Airlangga.
telah banyak membantu dalam kelancaran proses pelaksanaan ujian disertasi ini.
Jember yang telah banyak membantu saya dalam menempuh Program Doktor
Prof. M. Coen Pramono D., drg., SU., Sp. BM, Dr. Hari Basuki Notobroto,
Mkes, dr, Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM, Prof. Dr. Aulanni’am, Drh.,
DES, Prof. Dr. Sukardiman., Drs., M.S yang telah banyak memberikan saran dan
bimbingan yang sangat berharga mulai penyusunan pra usulan penelitian hingga
Universitas Airlangga.
tidak lupa kepada seluruh saudara dan keluarga besar saya ucapkan terimakasih
yang tak terhingga. Terimakasih atas semua kebaikan dan doa yang telah
diberikan.
terima kasih banyak atas cinta dan pengorbanan yang telah kalian berikan selama
menyelesaikan pendidikan.
Saya ucapkan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu dalam
terselesaikannya disertasi ini. Saya berharap disertasi ini akan dapat memberikan
semua pihak yang telah membantu penyelesaian disertasi ini. Amien Ya Rabbal
Allamin.
Penulis
RINGKASAN
Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima
(Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga
Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,
VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis
P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 dan K1. Hasil uji
korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2
dengan penurunan ekspresi VEGF, tetapi ada korelasi negatif antara penurunan
ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif
antara peningkatan wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.
Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ada mekanisme kerja ekstrak buah
delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif
dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
SUMMARY
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the
world, every year the number of events increases. In developing countries, these
events have a high number. The developments in the field of surgery, radiation
and chemotherapy have improved dramatically, but the results are still relatively
encouraging. In facts, patients who have a long life are still less than 50%. The
occurrence of cancer could be due to apoptosis resistance. Apoptosis is an
efficient mechanism to eliminate cells that are unnecessary and potentially
dangerous so as to save the organism. Pomegranate (PGL) is one of medicinal
plants that have anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate
extract (PGL) can kill cells undergoing transformation into squamous cell
carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF
and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of the research was
to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica
granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a
transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild.
expression of Bcl-2 with increased expression of p53 wild, and there is a positive
correlation between the increase in p53 wild with increased expression of
apoptosis.
The conclusion of the research was that there was a mechanism of action of
pomegranate extract (PGL) to apoptosis through the intrinsic pathway, and there
was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and
VEGF expression.
ABSTRAK
Kesimpulan penelitian ini adalah ada mekanisme kerja ekstrak buah delima
(PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah
antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
ABSTRACT
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world. The
developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have not yielded
significant results. Patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity that
have a long life is still less than 50%. One occurrence of cancer was caused by
cell apoptosis and mutation. Pomegranate (PGL) is an alternative and one that has
the medicinal plants as anticancer activity. This fact has the expectation that
pomegranate extract (PGL) standardized to kill the cells undergoing
transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with
decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild,
apoptosis. The purpose of this study was to experimentally test the mechanism of
action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal
cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2,
VEGF, p53 and Apoptosis Wild.
The research method used was experimental laboratories, thirty male mice
aged 5 months were randomly divided into 5 groups: 2 groups of control (K0,
K1), 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure of benzopirene with a dose of 0.04
mg benzopirene/ 0.04 ml olium olivarum for 4 weeks, 3 times a week. Usage of
ellagic acid, PGL, mahkota dewa with a dose of 75 mg / kg bb mice every day for
4 weeks. Examinations were done by using imunohistokimia and tunnel as say
techniques.
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL........................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iv
UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ vi
RINGKASAN .................................................................................................. x
SUMMARY .................................................................................................. xii
ABSTRAK .................................................................................................. xiv
DAFTAR ISI .................................................................................................. xvi
DAFTAR TABEL ............................................................................................ xx
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xxi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xxvi
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xxvii
DAFTAR TABEL
Halaman
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 5.33 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis
dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wild
p53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara
wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53
dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2
dengan VEGF ........................................................................... 104
Gambar 5.34 Kerangka hasil penelitian ....................................................... 105
Gambar 6.1 Kerangka temuan baru ............................................................. 128
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
BAB 1
PENDAHULUAN
kode oleh gen tersebut akan overaktif dan dapat berkembang menjadi kanker
Lebih dari 90% dari karsinoma rongga mulut berasal dari sel skuamosa
merupakan daerah karsinoma sel skuamosa yang paling umum yaitu sebesar
karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang telah metastasis luas, didapatkan
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan kanker yang sering terjadi
herbal tidak jauh berbeda. Keduanya untuk membunuh sel kanker, namun
efek yang ditimbulkan kedua sistem pengobatan ini sangat berbeda. Tanaman
obat dengan sifat alamiahnya akan meningkatkan daya tahan tubuh penderita
obat herbal dalam menangani sel kanker merupakan cara pengobatan dengan
telah banyak diteliti secara invitro dan sedikit penelitian yang di lakukan
secara invivo .
gunakan mencit Strain Sw iss Webster (Balb/c) jantan, lokasi paparan pada
reaktif BP-7, 8-diol-9, 10-oxide yang dapat berikatan secara kovalen dengan
basa guanin DNA sehingga terjadi mutasi genetik (Sattar et al.,1999). Hal ini
(B(a)P) yang banyak terdapat dalam asap rokok, asap kendaraan, asap dari
proses pembakaran bahan organik dan makanan yang diasap atau dipanggang.
Pada sel yang mengalami transformasi mutasi gen p53 akan mengubah
Mutasi gen p53 menyebabkan inaktivasi wild p53 sehingga siklus sel
tidak berhenti pada fase G1 tetapi berlanjut ke fase S dan G2 atau M. Hal ini
mengandung DNA cacat. Pada proses apoptosis wild p53 berperan memicu
faktor transkripsi terhadap p21 dan memicu aktivitas Bax dan menekan Bcl-2.
satu peran penting apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang
tidak diperlukan, mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang tidak
diperlukan dan berbahaya. Pada sel kanker program apoptosis ini mengalami
terhadap aktivasi Bax). Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein
pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada
Dewasa ini telah dilakukan berbagai upaya penelitian guna pencarian obat
obat Indonesia termasuk delima atau Punica G ranatum L inn ( PGL), yang
banyak diteliti secara invitro tapi masih jarang diteliti secara invivo. Apabila
efek ekstrak buah delima (Punica Granatum L) pada mencit (Mus Musculus)
Strain Sw iss W ebster (Balb/c) dapat terungkap, maka ekstrak buah delima
di dalam buah delima adalah punicalagin dan ellagic acid (EA). Ekstrak buah
delima terstandar yang baik umumnya mengandung 40% atau lebih ellagic
acid. Ekstrak buah delima (PGL) dengan standar 40% ellagic a cid dapat
apoptosis dan antioksidan secara invitro (Seeram et al., 2006; Jurenka, 2008).
pada biakan sel karsinoma skuamosa lidah manusia dengan dosis 250 ug/ml
et al.,2010).
sebagai bahan antikanker melalui hewan percobaan yang sedang dalam proses
ellagic acid kepada hewan coba yang sedang dalam proses kearah karsinoma
untuk ekspresi Bcl-2, VEGF, wild p53 dan metode tunnel assay untuk sel
menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi ?
menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi ?
meningkatkan ekspresi wild p53 pada sel mukosa rongga mulut mencit
mengalami transformasi ?
terhadap hambatan / degradasi sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit (Mus m usculus) St rain Sw iss
apoptosis.
onkogenesis pada sel mukosa rongga mulut mencit (Mus m usculus) Strain
benzopirene.
rongga mulut.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Karsinogenesis
dapat mempengaruhi DNA atau suatu protein yang berperan pada pengaturan
(Sudiana, 2008).
Karsinogenesis dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan
Munculnya kanker dapat dipicu oleh beberapa faktor seperti, bahan kimia,
pada suatu kelompok gen yang disebut gen kanker. Protooncogene secara
sel secara tidak normal dan terus-menerus, akhirnya terjadi kanker. Salah satu
10
inisiasi, stadium promosi dan stadium progresi (fase pr evaskuler dan f ase
vaskuler).
secara langsung, tetapi biasanya ditandai dengan perubahan ekspresi gen dari
sel yang terinisiasi. Perubahan ini diduga terjadi interaksi perubahan genetik.
Sudiana, 2008).
kanker terjadi sebagai akibat terganggunya sistem regulasi atau siklus sel.
Secara fisiologi sel tumbuh dan berdiferensiasi, ada unsur genetik yang
progenitor normal. Salah satu unsur penting dalam gangguan sistem regulasi
terjadinya disregulasi sel pada batas dimana terjadi pertumbuhan otonom dan
normal. Setelah beberapa waktu atau beberapa tahun, terjadi invasi membran
neoplasma ganas yang berasal dari epitel. Neoplasma diartikan sebagai massa
merupakan sel yang telah berubah struktur dan fungsi, sehingga sel tersebut
rongga mulut, secara klinis terlihat sebagai plak keratosis, ulserasi, tepi lesi
sel epitel skuamosa. Terlihat sel-sel yang atipia disertai perubahan bentuk ret
basaloid, susunan sel menjadi tidak teratur, dan membentuk tumor nest yang
membentuk keratin.
(KSSRM)
rongga mulut adalah syphilis, candida dan virus (Suaitha and Gabriel, 2004).
(HIV) dan virus H uman P apilloma (HPV). Hubungan lansung infeksi virus
terhadap kejadian kanker rongga mulut hingga saat ini belum jelas (Sunitha
Karsinogen dari radiasi ada langsung dan tidak langsung. Secara tidak
yang ada di dalam sel, sehingga terbentuk suatu bahan yang dikenal sebagai
radikal bebas. Radikal bebas yang terbentuk dapat memicu mutasi DNA
Bahan kimia yang bersifat karsinogenik memiliki sifat yang sama, yaitu
memicu terjadinya mutasi gen. Bahan kimia akan mengadakan ikatan dengan
KSSRM dapat terjadi akibat fungsi protein yang abnormal, akibat mutasi gen.
Proliferasi berlebihan dan tidak terkendali dari sel yang abnormal dapat
terjadi akibat gangguan siklus sel. Apoptosis yang mengalami kegagalan juga
suppressor gene, apoptosis gene serta DNA repair gene (Epstein and Waal,
2008).
umumnya merupakan interaksi antara faktor gen dan faktor lingkungan (gen-
gen s upresor t umor (TSG), faktor-faktor lain yang terlibat antara lain;
pada individu terjadi proliferasi secara berlebihan, maka akan terjadi massa
banyak sel yang diproduksi dalam satuan waktu. Kedua, penurunan jumlah
berbagai protooncogen yang merangsang sel dan gen penekan tumor (TSGs)
replikasi sel pada sel yang cacat atau rusak secara genetik melalui
apoptosis. Gen p53 tidak bisa berfungsi akan menyebabkan proses apoptosis
tidak bisa berjalan sehingga sel yang cacat akan terus berproliferasi
(Lumongga, 2008).
kerusakan DNA, agar sel-sel dengan lesi DNA tersebut tidak dilipatgandakan.
Apoptosis berfungsi sebagai salah satu kontrol dalam siklus sel. Kegagalan
satu faktor yang mendasari pertumbuhan kanker yang makin lama makin
besar. Selain akibat instabilitas genetik dan akumulasi kelainan genetik, juga
akibat perubahan terhadap aturan yang ditentukan pada checkpoint siklus sel
fungsi apoptosis. Hingga saat ini khemoterapi maupun radiasi yang ditujukan
untuk membunuh sel kanker melalui apoptosis, tetapi seperti telah diuraikan
tentang jalur apoptosis dapat membantu untuk memberikan terapi yang lebih
2.2.1 Apoptosis
Apoptosis merupakan mekanisme alamiah yang dialami oleh sel. Ada dua
jaringan atau organ lebih lanjut. Alasan kedua adalah untuk menghancurkan
seperti sel yang terinfeksi oleh virus, sel dengan kerusakan DNA maupun
dikendalikan secara ketat oleh berbagai gen, baik gen yang bersifat apoptotik
maupun anti apoptotik. Apoptosis terjadi melalui 3 fase yaitu; fase inisiasi,
oleh reseptor dari kompleks sinyal yang menginduksi kematian DISC (Death
maka kerusakan sel bermula pada caspase 8 yang melepaskan DISC, yang
Kematian sel yang diprogram. Proses kematian sel ini sangat berkaitan
dengan suatu enzim yang dikenal telomerase. Pada sel embrional enzim ini
mengalami aktivasi, sedangkan pada sel somatik enzim ini tidak mengalami
Telomer yang terletak pada ujung kromosom merupakan salah satu faktor
yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer
ini akan mengalami pemendekan pada waktu sel melakukan pembelahan diri.
Bila ukuran telomer mencapai ukuran tertentu (level kritis) sebagai akibat dari
diri lagi. Selanjutnya akan terjadi fragmentasi kromosom dan akhirnya sel
Pada sel ganas, pemendekan telomer sampai pada level kritis tidak akan
terjadi, karena pada sel ganas terjadi aktivitas dari enzim ribonukleoprotein
(telomerase) secara terus menerus, dimana enzim ini sangat berperan pada
ukuran telomer pada ujung kromosom dapat dipertahankan. Pada sel normal,
aktivitas telomerase waktunya terbatas, tetapi pada sel kanker enzim ini
waktu pembelahan diri. Oleh karena itu, maka sel ganas dapat bersifat
Terjadinya apoptosis yang dipicu oleh aktivitas wild p53 karena sel
yang bersangkutan memiliki gen yang cacat (gene defect). Kecacatan gen
dalam suatu sel dapat dipicu oleh banyak faktor antara lain bahan kimia,
radikal bebas, maupun virus (oncovirus). Gen yang cacat dapat memicu
aktivitas beberapa enzim seperti PKC dan CPK-K2. Dimana kedua enzim
2011).
halnya CDK yang muncul pada fase S adalah CDk-2, CDK-4, CDK-6.
Cyclin adalah suatu protein yang dihasilkan oleh sel, dimana protein ini
dapat muncul dan hilang pada fase siklus sel, cyclin pada fase M adalah
cyclin A dan cyclin B, pada fase G-1 adalah cyclin-D dan cyclin-E.
dengan terjadinya penekanan semua CDK pada fase siklus sel, maka
siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu
membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA sel yang bersangkutan
b. Jalur sitotoksik
sel yang memiliki gen cacat (gene defect). Dengan adanya kecacatan gen
ini, maka sel tersebut akan mengekspresikan protein asing. Protein asing
dipermukaan sel tertentu. Hal ini terjadi karena ada beberapa sel yang
receptor terhadap Ig-G), antara lain sel killer. Dengan adanya reseptor
Adanya ikatan sel killer akan melepaskan suatu enzim yang disebut
ke dalam sel tersebut. Granzyme yang berada di dalam sitosolik dari sel
yang merusak DNA yang berada di dalam inti, sehingga sel mengalami
karena dipicu oleh adanya sel tumor atau sel kanker. Pada sel tumor atau
kanker akan diikat oleh ligand yang berada di permukaan NK-cell atau
pada sel tersebut terjadi aktivasi suatu protein yang disebut sebagai Fas
DNA-se. DNA-se masuk ke dalam inti dan merusak DNA sehingga sel
(Sudiana, 2008).
Jalur utama apoptosis ada dua yaitu jalur intrinsik (mitokondria ) dan
jalur ekstrinsik (death receptor pathway). Kedua jalur terhubung satu dengan
lain, molekul di jalur yang satu dapat mempengaruhi molekul di jalur yang
lain. Selain itu ada jalur tambahan yang melibatkan sitotoksisitas yang
dimediasi oleh sel T dan pembunuhan sel yang bergantung pada perforin
/granzim tetapi yang paling berperan dalam bidang onkologi adalah jalur
intrinsik dan jalur ekstrinsik (Nurhayati dan Lusiyanti, 2006; Kresno, 2011).
a. Jalur Intrinsik
b. Jalur Ekstrinsik
keluaga TNF. Receptor dari keluarga memiliki domain ekstra sel yang
kaya akan cystein dan memiliki domain sitoplasmik yang disebut death-
permukaan sel ke jalur persinyalan intrasel. Saat ini telah diketahui ada
adalah TRADD (TNF r eceptor as sociated de ath dom ain). FADD dan
domain efektor kematian (death efffector dom ain). Pada saat ini
reseptor kematian dapat dihambat oleh protein yang disebut c-FLIP yang
(Kresno, 2011).
2.2.2 Nekrosis
Nekrosis adalah kematian sel, yang terjadi pada kasus jejas berat dan
akut (misalnya anoksia yang mendadak) atau jejas karena faktor fisiko kimia
yang ekstrim (misalnya panas, detergen, basa kuat, dan radiasi). Tetapi
patologik (misal iskemia otak) atau kerusakan jantung yang disebabkan oleh
sitokin dan toksin, kematian sel dapat terjadi kedua-duanya melalui nekrosis
seluler. Hal ini menyebabkan membran plasma pecah yang berakibat pada
inflamasi. Organel juga bengkak dan pecah, sedang inti masih utuh meskipun
Lebih jauh faktor kondensasi kromatin tidak bergantung kaspase AIF ini bisa
kematian sel seperti nekrosis ini diatur oleh program kematian intrinsik yang
proteolitik non kaspase yang tergantung serin protease yaitu calpain atau cat
2006).
dan faktor kematian sel (apoptosis) yang dipengaruhi oleh protooncogene dan
dan jumlah sel dari populasi sel yang aktif melakukan siklus sel atau aktivitas
manusia dewasa jumlah sel relatif tetap. Mitosis pada manusia dewasa
bertujuan untuk menggantikan sel yang mati karena proses apoptosis atau
2. Fase (fase i nterval), fase antara akhir mitosis dan awal mitosis yang
fase M (mitosis). Jeda antara akhir fase M dengan awal S disebut fase G-
1, sedangkan jeda akhir fase S dengan awal fase M disebut fase G-2.
Sehingga siklus sel dikenal ada empat fase, yaitu fase M, G-1, S dan G-2.
sel dan derajat diferensiasi. Derajat diferensiasi sel makin jelek, sifat kanker
sangat tergantung pada waktu sel (cell c ycle tim e) yaitu waktu yang
pembelahan sel dikendalikan oleh suatu protein regulator yaitu cyclin dan
pembelahan sel dihambat oleh inhibitor, antara lain ; p2, p21, p27 dan p57.
2.4.1 Bcl-2
Regulasi dalam apoptosis antara lain adalah anggota keluarga Bcl-2. Ada
18 anggota keluarga Bcl-2 yang diketahui sampai saat ini, dibagi dalam tiga
pertama diwakili oleh Bcl-2 dan Bcl-xl yang memiliki fungsi sebagai anti
Bcl-2 menghambat apoptosis dan memperpanjang masa hidup sel saat ada
sel terhadap proses apoptosis. Bcl-2 dan Bax merupakan protein yang penting
dalam menentukan sel untuk proses apoptosis. Bcl-2 merupakan protein yang
sel. Keseimbangan antara Bcl-2 dan Bax adalah merupakan hal yang penting
2006).
Dimana protein ini bekerja untuk menekan fungsi protein Bax pada membran
pRb, wild p53. Protein pRb dan wild p53 dapat bekerja di dalam inti sel,
pembelahan sel. Selain itu wild p53 juga mempunyai peran dalam pengaturan
kematian sel (apoptosis), yaitu merusak sel yang memiliki urutan nukleotida
Secara fisiologi pada sel, ada suatu sistem yang mengatur susunan
tersebut dikenal dengan DNA repair. Kerja dari sistem ini adalah dengan
ultraviolet, maka akan muncul suatu respons sel yang disebut sebagai NER
(Nucleotidie Excision Repair). Secara konseptual kerja NER ini dibagi dalam
lima fase, yaitu (1) Damage recognition (b) Incision (c) Excision (d)
Synthesis repair dan (e) Ligation. Oleh karena itu, secara normal sel yang
hanya dapat melakukan proliferasi dan diferensiasi adalah sel yang DNA-nya
Selain p21 ekspresinya dikendalikan oleh wild p53, yang bekerja dengan
pada siklus pembelahan sel, seperti p15 dan p16. Namun, pengaturan ekspresi
dari protein p15 dan p16 sampai saat ini belum jelas. Akan tetapi, target kerja
dari kedua protein tersebut telah diketahui dengan jelas, yaitu menghambat
CDK-4 dan CDK-6 pada fase G-1. Kinase yang bekerja memicu aktivitas
wild p53 untuk memodulasi protein Bax pada proses apoptosis, antara lain
Wild p53 adalah suatu tumor s uppressor gene dengan Berat Molekul
diekspresikan pada semua jaringan tubuh. Struktur wild p53 terdiri atas
Daerah DNA binding spesifik berguna untuk menempel wild p53 pada DNA
terminal berfungsi untuk menempel wild p53 pada rantai tunggal DNA
menyebabkan wild p53 dapat berfungsi untuk aktivasi GADD45 pada proses
Fungsi protein wild p53 mendeteksi sintesis DNA yang salah atau
mekanisme kerja wild p53 adalah menghentikan siklus sel pada fase G1
melalui cell cycl e inhibitor. Wild p53 memicu transkripsi p21, peran p21
apoptosis dapat melalui aktivasi Bax dan menghambat aktivitas gen yang anti
Mutasi gen p53 pada umumnya adalah point mutation akan mengubah
protein wild p53 baik sebagai materi antiproliferasi, maupun sebagai pengatur
proses apoptosis. Aktivitas wild p53 dapat diatur oleh Murine Double Minute
2 (MDM2). MDM2 dapat mengikat terminal amino (ujung N) dari wild p53,
menyebabkan wild p53 tidak stabil dan dikeluarkan dari inti sel ke
sitoplasma, menekan aktivitas wild p53 dan menyebabkan degradasi wild p53
yang diperantai proteosome. Gene MDM2 diregulasi secara positif oleh wild
p53 sehingga membentuk lingkaran umpan balik (Hui et al., 2004). Ekspresi
pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada
al., 2008).
2.6.1 Angiogenesis
oleh beberapa faktor angiogenesis seperti tirosin k inase ,reseptor antara lain
transduksi sinyal seperti jalur tyrosine kinase. Diantara jalur-jalur itu, dalam
darah. Aktivasi jalur Natch terbukti menghambat proliferasi dan migrasi sel
2011).
ditemukan basic f ibroblast growth f actor (bFGF) yang mitogenik bagi sel
endotel vaskuler dan bersifat angiogenesis kuat. Bukti bahwa bFGF bersifat
dan menambah volume kanker 2 kali lipat; 3) bukti lain yang mendukung
sifat angiogenik bFGF adalah apabila cDNA dari bFGF ditransfeksikan pada
jaringan yang rusak ; 6) Molekul adhesi atau integrin berfungsi sebagai kait
diregulasi secara ketat oleh beberapa faktor proagiogenik (VEGF) dan faktor
kadar tinggi. Hal ini sejalan dengan bukti-bukti yang menyatakan bahwa
(Kresno, 2011).
mikro atau faktor epigenetik, misal hipoksia, sitokin, faktor pertumbuhan dan
khemokin, maupun kelainan genetik, misalnya mutasi gen p53. PTEN dan
aktivasi onkogen (diantaranya ras, EGFR dan her-2). Pengikatan VEGF pada
2.7 Benzopirene
pada batu bara, minyak bumi, asap rokok, gas buangan motor dan makanan
adalah salah satu senyawa yang paling banyak diteliti karena sangat
yaitu pertama senyawa yang secara langsung bersifat genotoksik dan kedua
menjadi produk larut air. Efek samping konversi ini dihasilkan elektrofilik
yang dapat beeaksi dengan beberapa nukleofilik yang ada yaitu protein, DNA
dan RNA, di sinilah awal terjadinya mutasi genetik (Walum et al., 2000).
dalam sel mengalami reaksi epoksidasi pada posisi 7,8 oleh Mixed Function
membran retikulum endoplasma dan DNA inti sel. Senyawa 7,8 arenoksida
B(a)P akan diubah menjadi senyawa non toksik jika menjadi 7-hidroksil
B(a)P melalui reaksi non enzimatik. Senyawa 7,8 arenoksida B(a)P akan
menjadi karsinogen dikatalis oleh enzim epoksida hidrolase menjadi 7,8 diol,
yaitu 7,8 diol - 9,10 oxide yang merupakan senyawa yang sangat reaktif.
menjadi oncogene terjadi dengan cara mengikat basa guanin DNA sehingga
dilarutkan dalam media yang memiliki sifat lipophilic dan hydrophilic (Faust
et al.,1994).
dengan konjugasi ke glucuronides dan sulfate e sters dan quinones bisa juga
Chemical Formula : C 20 H 12
Chemical Structure :
2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (National Plant Data Centre,
2000)
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Subkelas : Rosidae
Ordo : Mytales
Famili : Lythraceae
Genus : Punica
Spesies : P. granatum L
Delima (Melayu)
Lekokae (Timor).
Ada 3 jenis delima yaitu; delima merah, delima putih dan delima hitam,
buahnya berwarna ungu tua yang sering dipakai sebagai penelitian adalah
dijumpai pada buah-buahan dan sayuran yang berwarna biru, ungu dan merah
(Seeram et al.,2005).
bersifat kemopreventif dan kemoterapi pada sel kanker prostat, kanker usus
et al.,2005).
yang ditemukan pada delima adalah organic dan phenolic a cid, sterols dan
terhadap hampir separuh dari aktivitas antioksidan jus delima, daun, batang
2006).
Walaupun tidak dapat langsung diabsorbsi oleh tubuh karena ukurannya yang
12 jam setelah diabsorbsi dan urolithin dapat dideteksi dalam darah dan urin
hingga 48 jam setelah pemberian dosis tunggal. Ekstrak buah delima dan jus
al., 2009).
antioksidan, antiinflamasi dan dapat mencegah destruksi gen p53 oleh sel
kanker. Ellagic acid dapat berikatan dengan sel kanker dan membentuk suatu
molekul kompleks, sehingga sel kanker menjadi inaktif. (Seeram et al., 2005).
Gambar 2.6 Struktur Kimia Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram
et al., 2005)
kimia yang mampu menginduksi kanker, ellagic acid juga memiliki aktivitas
anti bakteri dan antiviral. Fungsi lain dari ellagic acid adalah sebagai bahan
yang mampu melindungi kerusakan sel karena radikal bebas. Kemampuan ini
komposisi lain buah delima yang juga merupakan antioksidan yang cukup
kuat, yaitu anthocyanidin (Seeram et al., 2005; Lansky and Newman, 2007).
buah-buahan dan sayuran yang berwarma biru, ungu dan merah seperti
delima, bayam merah dan kol merah. Anthocyanidin dapat ditemukan dalam
cairan sel (tidak seperti klorofil dan carotene yang menempel pada membran
sel). Warna pigmen dapat berubah-ubah sesuai dengan pH dari cairan sel.
Cairan sel yang sedikit asam akan membuat pigmen berwarna ungu.
Empat kandungan kimia dalam buah delima merah (PGL), yaitu ellagic
acid, caffeic acid, luteolin dan punicid acid secara individual menunjukkan
aktivitas anti kanker pada sel kanker prostat secara invitro. Namun bila
Delima (PGL) telah dikenal sejak lama di seluruh dunia karena memiliki
manfaat yang sangat luas bagi kesehatan. Secara garis besar, aktivitas yang
Antiinflamasi
dapat dilmanfaatkan untuk memperkaya kasanah bahan obat. Pohon dan buah
delima dapat dibagi menjadi beberapa kompartmen anatomi, seperti biji, sari
buah, kulit, dan bunga, batang dan akar, di mana kandungan masing-masing
kematian sel terganggu. Keganasan memerlukan pola terapi yang bersifat non
sitotoksik pada sel normal (Lansky and Newman, 2007) Fraksi polifenol yang
kaya akan flavonoid yang dimiliki delima telah terbukti memiliki aktivitas
payudara dan prostat serta memiliki aktivitas anti angiogenik, baik invitro
yang sama, tannin delima hanya mampu mengurangi sebesar 55% dan
menemukan kombinasi ekstrak buah delima yang berasal dari berbagai bagian
buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak tunggal bagian buah
(VEGF) pada kanker payudara, hal ini disebabkan karena produksi faktor
Pada penelitian secara invitro pada kanker prostat ekstrak buah delima
dibandingkan dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus blueberry, jus
jeruk dan t eh hijau (Azadzoi and Siroky, 2009). Perbedaan aktivitas tersebut
berbeda.
menghambat invasi dan proliferasi sel kanker prostat, mengganggu siklus sel,
Penelitian ini juga menemukan bahwa kombinasi ekstrak delima yang berasal
dari berbagai bagian buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak
tunggal bagian buah (Albrecht et al., 2004; Lansky and Newman, 2005).
Whole ekstrak delima (PGL) yang dilakukan penelitian pada sel line
Empat kandungan kimia dalam buah delima, yaitu ellagic ac id, caffeic
(VEGF) pada kanker payudara (Tio et al ., 2003). Hal ini disebabkan karena
2006).
sel kanker melalui reseptor estrogen subtype ERα dan ERβ, ERα dan ERβ
kemopreventif pada berbagai jaringan dan sel kanker pada, payudara, kolon,
terhdap kerusakn DNA, oksidtif atau oksidasi LDL, perubahan ekspresi faktor
pertumbuhn dan juga melalui ekspresi p53, NF-kB dan gen-gen responsif
begitu juga dengan menggunakan cell line MCF-7 (human breast cancer)
kanker Terhadap sel-sel payudara manusia secara invitro. Ellagic acid salah
satu konstituen jus delima dan minyak biji dilaporkan bekerja melawan
kanker kulit, pankreas, payudara, prostat, kolon, usus, kandung kemih (Sai
kanker melalui reseptor laminin sebagai media pada proses apoptosis dengan
dengan sel kanker melalui jalur fas- ligand (Burlado et al., 2010).
dan ferulic ac id pada T47D cell line kanker payudara manusia dengan
konsentrasi yang sama atau sedikit lebih rendah daripada yang diharapkan
radikal bebas melindungi organisme dari spesies oksigen reaktif (ROS), dari
reseptor estrogen (Hoang et al., 2010). Caffeid acid pada buah delima (PGL)
protektif terhadap kanker (estrogen ERβ), punicid acid dan caffeid acid dari
delima memodulasi Erα Sebagai antagonis dari kerja estrogen ERβ dan
dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus bluberry, jus jeruk dan teh
sebagai antioksidan adalah kulit, batang dan kulit batang. Pada buah delima,
aktivitas anti oksidan paling tinggi. Gallic ac id, tannins dan anthocyanins
bahwa konsumsi 250 ml PPJ setiap hari selama 4 minggu dapat memberikan
efek yang baik pada individu yang telah berumur dan meningkatkan kapasitas
antioksidan plasma dari 1,33 mmol menjadi 1,46 mmol (Gil et al., 2008).
mulut (KSSRM), hal ini di landasi bahwa ekstrak buah delima mempunyai
aktivitas antikanker pada kanker lain dan juga mempunyai komponen bahan
aktif lebih banyak sebagai antikanker dibanding ekstrak buah mahkota dewa,
yang hanya ada pada polyphenol saja. Disisi lain, ekstrak buah delima telah
Adalah salah satu tanaman obat tradisional Indonesia, sebagai obat anti
kanker yang sudah di jual di pasar. Obat anti kanker ekstrak biji mahkota
dewa di jual oleh PT Mahkota Dewa Jakarta, dalam penelitian ini dipakai
sebagai kontrol. Kandungan zat aktif biji mahkota dewa antara ; alkaloid,
antimikroba, hal ini berkaitan dengan toksisitas tanaman yang cukup tinggi
kanker HM3KO dengan Ica 19.95 kurang lebih 3,57 ug/ml. sehingga dapat
Ekstrak biji mahkota dewa dosis 250 ug/ml dan 500ug/ml dapat
mahkota dewa pada cell line ca kolon bersifat sitotoksi melalui peningkatan
2.10 Imunohistokimia
berikatan dengan antibodi. Prinsip metode ini adalah perpaduan antara reaksi
imunologi dan kimiawi yaitu reaksi antigen-antibodi dan reaksi antara enzym
dan substrat. Antibodi yang digunakan adalah spesifik untuk antigen tersebut
dan dilabel dengan enzim. Enzim yang dapat digunakan untuk melabel adalah
naftol yang berwarna biru dan DAB (3,3 diaminobenzidine) yang berwarna
sedemikian rupa sehingga hubungan struktur jaringan atau sel lebih mudah
diamati Keuntungan lain sediaan yang sudah jadi dapat disimpan secara
(Wasito, 2001).
berbagai kelebihan antara lain biotin yang mudah berikatan dengan berbagai
protein dan ikatan yang amat kuat antara streptavidin dengan biotin.
Keuntungan lain adalah dapat mengeliminasi ikatan lain yang non spesifik,
sehingga tidak terjadi berbagai reaksi non spesifik yang sering terjadi pada
ikatan dengan avidin. Oleh karena itu streptavidin biotin dianggap lebih
suatu marker pada sel langsung dilabel dengan enzym dan metode tak
langsung bila antibodi monoklonal tidak dilabel dengan enzim, tetapi dengan
Tunnel assay adalah salah satu metode pemeriksaan sel apoptosis yang
spesifik di mana teknik ini mampu mendeteksi putusnya rantai tunggal dan
rantai ganda DNA yang berhubungan dengan apoptosis. Rantai DNA yang
jelas dan terlokalisir sehingga menjadi deteksi apoptosis yang sensitive pada
sel. Sehingga dapat dibedakan antara sel nekrosis dengan apoptosis melalui
dengan apoptosis. Pada nekrosis juga terjadi putusnya rantai DNA dan tidak
akan membentuk warna yang sangat terang atau sangat muda, sehingga untuk
apoptotic nuclei dan apoptotic bodies, demikian pula dengan sel yang sedang
membelah juga tidak menghasilkan gugus 3-OH dalam jumlah besar sehingga
tidak tercat. Reagen ini dapat menyambung ujung 3-OH secara in situ dengan
nukleotida yang dilabel dan tidak dilabel secara kimia. Nukleotida yang
terkandung dalam reaction buffer disambung dengan ujung 3-OH dari DNA
BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL
Delima
(PGL)
R. Estrogen
R. Laminin
Wild p53 ↑ Fas-ligand
PLC
Bcl-2
PI3P CDK
Kaskade-
Cytocrom-C kaspase ↑
ER
Siklus sel
berhenti
Apaf-1 ↑ DNA-se ↑
Ca2+
Phospholipase A2 Kaskade-
Kaspase ↑
Phosphootydil Colin
DNA-se ↑
Lisophos- Asam
photydil C Arakidonat Apoptosis
Cox-2
Prostaglandin
Angiopoitin
VEGF
Angiogenesis↓
yang diteliti
tidak diteliti
menghambat
60
mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan 3 kali seminggu selama 4
9,10-epoxide yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA pada sel dari
sebagai anti apoptosis, dimana protein bekerja untuk menekan fungsi protein
Bax pada membram mitokondria. Jika terjadi mutasi pada Bcl-2, maka Bcl-2
akan overaktif sehingga protein Bax tidak berfungsi. Adanya aktivasi dari
antara lain protein 53 (p53) yang dikode oleh gen p53 (P53). Wild p53 dapat
mengaktifkan wild p53, wild p53 memicu faktor transkripsi terhadap p21, p21
yang disentesis akan menekan semua CDK dan siklus pembelahan sel
berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu Bax, protein Bax
DNA-se, kemudian DNA-se yang aktif menembus membran inti dan merusak
/ frragmentasi DNA yang mengalami mutasi / cacat dan akhirnya sel dengan
buah delima (PGL) terstandar akan masuk ke dalam sel yang mengalami
Aktivitas lain dari ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam
sebagai faktor pertumbuhan autocrine bagi sel kanker. Ektrak buah delima
mutlak diperlukan untuk pertumbuhan dan survival sel kanker. Sel kanker
3.3.1 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2
pada rongga mulut mencit Strain S wiss W ebster (Balb/c) yang mengalami
transformasi.
3.3.2 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF
pada rongga mulut mencit Strain S wiss W ebster (Balb/c) yang mengalami
transformasi.
3.3.3 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild
p53 pada rongga mulut mencit Strain Sw iss W ebster (Balb/c) yang
mengalami transformasi.
transformasi .
BAB 4
METODE PENELITIAN
K0 OO CMC OK0
S RA
CMC/K1 OK1
EA/P1 OP1
Benzopirene RA
PGL/P2 OP2
MD/P3 OP3
1 Minggu 4 Minggu 4Minggu Akhir
Minggu ke 9
Keterangan :
S : Subyek penelitian
R : Random
65
dan tidak diberi ekstrak buah delima. Dipapar olium olivarum (OO)
per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir minggu
dikorbankan.
CMC-Na 0,3% per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu Pada
kemudian dikorbankan.
CMC-Na 0,3 % satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir
kemudian dikorbankan.
diberi ekstrak buah delima (PGL) per oral. Dengan dosis 75 mg/kg/
bb/hari dilarutkan dalam CMC-Na 0,3% satu kali setiap hari selama
Kemudian diberi ekstrak buah mahkota dewa per oral dengan dosis,
sebelah kanan bawah di rongga mulut mencit (Strain Swiss Webster (Balb/c)
jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 30-
yang cocok untuk model karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM)
(Arumdina, 2008).
4.2.2 Replikasi
sebagai berikut :
Keterangan :
r : jumlah replikasi
4.2.3 Randomisasi
hingga umur dan berat badan memenuhi syarat untuk digunakan dalam
sebagai kelompok kontrol, dan 18 ekor mencit yang tersisa disiapkan untuk
random s ampling dan dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok K0, K1,
Variabel bebas :
Variabel penghubung
b. Ekspresi Bcl-2
c. Ekspresi VEGF
Variabel tergantung
Variabel kendali
a. Waktu penyuntikan
b. Tatalaksana pemeliharaan
jantan, secara fisik sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 30-50 gram.
Yogyakarta.
d. Estrak buah delima adalah hasil ekstraksi seluruh bagian buah delima
e. Ellagic acid adalah kristal ellagic acid merupakan salah satu komponen
bahan aktif ekstrak buah delima (PGL) yang memiliki aktivitas terapetik
g. Dosis adalah jumlah ekstrak buah delima, ellagic ac id, mahkota dewa
2010).
mukosa bukal sebelah kanan bawah yaitu 0,04 mg/0,04ml setiap 3 kali
j. Ekspresi wild p53 adalah pengukuran ekspresi wild p53 dengan cara
tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada sepuluh lapang
pembesaran 400x.
dilakukan terhadap sel yang imunoreaktif tercat coklat pada membran sel
dengan berat badan berkisar 30-50 gram, pakan mencit pellet per G
aqua, CMC-NA 0,3%, oleum olivarum, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol
antibodi pol iklonal (sigma) untuk wild p53, Bcl-2, VEGF (Bioworld
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah; kandang mencit terbuat
dari plastik ditutup kawat kasa dan dilengkapi tempat makan dan botol
,timbangan analitik, mikroskop, kaca obyek, kaca penutup, botol kecil tempat
dan ellagic acid 90% diproduksi oleh Xi, an Biof Bio-Technology Co,Ltd
(Room 1-111, High- tech V enture Park, No. 69 Jinye R oad, Gaoxin
b. Persiapan sedian
panas 100 ml dan diaduk dengan bantuan magnet stirrer sampai larut.
delima/kgbb/po/hari.
Contoh :
diperlukan :
→
Misalnya untuk bb mencit 30 gram (EA = 90%) = 2,5 mg
Swiss Webster ( Balb/c) jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5
bulan, berat badan berkisar 30-50 gram. Mencit diambil secara random.
yang sama.
alat dan bahan uji yang mempunyai sensitivitas dan spesifitas yang
3. Peneliti konsultasi pada tim promotor dan tenaga ahli atau konsultan
penelitian.
berdistribusi normal.
MANOVA.
0,05.
Mencit
(Balb/c)
Adaptasi
(1 minggu)
Paparan Benzopirene
(Mukosa bukal kanan RM mencit)
(4 minggu, 3 x per minggu)
K0 K1 P2 P1 P3
Dibiopsi
(akhir minggu ke 9)
Dikorbankan
Analisis Data
BAB 6
PEMBAHASAN
Pengobatan terhadap karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang selama ini
beberapa jenis kanker (Rizali dan Auerkari, 2003; Sismindari, 2005). Kondisi
tersebut sampai saat ini belum bisa diatasi secara memuaskan, sehingga
dasar herbal yang dapat mencegah dan membunuh sel kanker tanpa merugikan
Penanganan kanker tanpa merugikan sel yang normal dalam membunuh sel
kanker, perlu dilakukan penelitian terhadap obat herbal yaitu buah delima (PGL)
hal ini karena senyawa dari ekstrak buah delima menghambat pertumbuhan sel
kanker dan membunuhnya serta memutus pasokan zat makanan dan oksigen ke
jaringan sel kanker. Selain itu penanganan dengan obat herbal dalam menangani
sel kanker merupakan cara pengobatan dengan biaya murah . Ekstrak buah delima
(PGL) terhadap penyakit kanker banyak diteliti secara invitro dan sedikit
107
penelitian secara invivo akan tetapi untuk kejadian karsinoma sel skuamosa
rongga mulut belum pernah diteliti dan mekanisme kerja ekstrak buah delima
(PGL) terstandar terhadap sel kanker dan karsinoma sel skuamosa rongga mulut
tanaman obat, terus berlangsung hingga saat ini bahkan semakin meningkat.
Belum banyak hasil penelitian tanaman obat yang digunakan sebagai obat dalam
persyaratan tersebut tanaman obat harus melalui uji pra klinik dan klinik. Uji pra
wild p53, Bcl-2, VEGF dan apoptosis pada sel mukosa rongga mulut bukal
membuat model hewan coba sel yang mengalami transformasi ke arah keganasan
merupakan mutagenik karsinogen yang kuat dan reaktif (Kelley et al.,1997). Diol
oxide ini bersifat sangat reaktif dan akan membentuk ikatan kovalen dengan basa
guanin DNA (Wiese et al., 2001). Transformasi sel pada hewan percobaan dapat
olium olivarum 0,04 ml pada mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan.
buah delima (PGL) terstandar menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa
Gen Bcl-2 mengkode protein yang berperan sebagai antia poptosis dan
lain yang secara langsung atau tidak langsung terlibat dalam dalam proses
buah delima terstandar lebih kuat bila dibandingkan dengan ellagic acid , hal
ini membuktikan bahwa ekstrak buah delima adalah penghambat Bcl-2 yang
efektif Estrak buah delima (PGL) / whole ekstrak lebih kuat efeknya daripada
bentuk bahan aktif tunggal, ini menunjukkan adanya efek sinergistik atau
tambahan dari bahan aktif lainnya di dalam buah delima (PGL) (Seeram et
al., 2005).
Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein pro apoptosis (Bax)
mempunyai kesempatan lebih besar untuk berikatan dengan protein BH3 dan
ikatan ini merupakan inisiasi awal dari proses apoptosis (Shore et al., 2008),
menginduksi BH3 untuk melepas ikatan antara Bax dengan Bcl-2 sehingga
menerima rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat. Rangsangan
delima dapat meningkatkan kelarutan dan absorbsi ellagic acid dalam saluran
pencernaan. Selain itu polyphenol yang terdapat dalam ekstrak buah delima
2006).
Ellagic acid, senyawa dimer yang merupakan derivat gallic acid, berada
dalam buah delima dalam bentuk bebas sebagai ellagic acid-glycosides atau
terikat dalam bentuk ellagitannins (Seeram et al., 2004). Pemberian per oral
pada tikus, 15% ellagic acid diekskresikan melalui urin dan feses. Rendahnya
kelarutannya yang rendah dalam air. Selain itu diduga disebabkan karena
al., 2004).
hal ini disebabkan secara fisiologis sistem pertumbuhan sel dalam individu
penting dalam memicu aktivitas CTL dan sel NK, mempunyai fungsi
growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal Reseptor T irosin
ekspresi Bcl-2 mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL)
maupun ellagic ac id. Dari beberapa penelitian toksisitas dari mahkota dewa
diketahui titik tangkapnya. Ekstrak mahkota dewa bersifat sitotosik pada cell
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
yang diberikan pada tikus yang mengalami fibrosis hati diberikan secara
kronis setiap hari selama 28 hari menunjukkan tidak terjadi efek samping
darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada dan merupakan fenomena
yang kompleks yang mutlak di perlukan untuk pertumbuhan dan survival dari
untuk membentuk angiogenesis, ada hubungan dua arah antara Bcl-2 dan
VEGF.
proses desakan antar sel. Proses desakan antar sel yang meningkat akan
(Cho, 2007). Dengan pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar Bcl-2
Bcl-2 dengan kenaikan ekspresi wild p53, hasil ini dapat dijelaskan, wild p53
akan menekan CDK. Wild p53 juga akan memicu aktivitas Bax (pro
Benzopirene .
menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit akibat
jenis kanker, VEGF menunjukkan spesifitas sel sasaran yaitu spesifik bagi sel
endotel. VEGF selain meningkatkan proliferasi dan migrasi sel endotel juga
dan migrasi sel endotel diaktifkan oleh beberapa faktor angiogenesis seperti
dan venul yang mudah dibedakan (Dvorak, 2005). Penelitian dengan tehnik
(Roskoski,2007).
Proliferasi sel yang berlebihan pada sel kanker akan memicu pengeluaran
pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada, ini
dan survival sel kanker. Tanpa pembuluh darah baru yang menyediakan
nutrisi untuk kanker, kanker tidak akan tumbuh dan berkembang lebih besar
pasokan nutrisi ke sel kanker akan terputus, sel kanker tidak akan
2006).
VEGF pada berbagai kanker manusia. Aktivitas STAT3 berperan besar dalam
Pada penelitian ini, aktivitas yang dimiliki ekstrak buah delima (PGL)
acid. Hal ini disebabkan karena ekstrak buah delima (PGL) terstandar
yang lebih kuat dibanding ekstrak buah delima (PGL) dan ellagic acid, hal ini
mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL) maupun ellagic
acid.
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
et al., 2003).
(Kresno, 2011).
sel yang berlebihan pada sel kanker dan akan memicu sekresi VEGF, VEGF
6.3 Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi wild
p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Hewan Coba Akibat
Paparan Benzopirene
delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53 pada mukosa
0,081).
Wild p53 merupakan protein kelompok tumor supressor gene yaitu suatu
di dalam inti sel, khususnya pada proses pengendalian siklus pembelahan sel.
peningkatan p21 yang disentesis akan menekan semua CDK, terjadinya siklus
pembelahan sel sangat tergantung pada CDK. CDK ditekan dan tidak
berfungsi sehingga siklus pembelahan sel akan berhenti. Wild p53 akan
memicu aktivitas Bax (pro apoptosis), aktivitas Bax akan menekan Bcl-2 (anti
mutasi sehingga DNA sel yang mutasi rusak (fragmentasi) dan akhirnya sel
Gen p53 diketahui bermutasi pada sekitar 70% kejadian kanker (William,
peningkatan p21 akan menekan semua CDK, sehingga siklus sel berhenti.
Siklus sel berhenti wild p53 akan memicu Bax, aktivitas Bax akan menekan
antara lain peningkatan reseptor TRAIL R2/ DR2. Ekspresi DR5 diatur oleh
wild p53 sehingga bisa dihubungkan dengan wild p53, peningkatan wild p53
jalur ekstrinsik (melalui reseptor jalur kematian) dan intrinsik (melalui jalur
wild p53.
kerjanya lebih unggul dan bekerja secara sinergis dari satu bahan aktif buah
delima. Empat kandungan bahan aktif dari buah delima (PGL), yaitu ellagic
Peningkatan ekspresi wild p53 pada ellagic acid lebih rendah karena ellagic
dibandingkan dengan ellagic acid dan ekstrak buah delima (PGL). Hal ini
dan sel NK, mempunyai fungsi sitostatika untuk membunuh sel kanker dan
memblok reseptor growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal
diikuti kenaikan indeks apoptosis. Fakta- fakta ini yang menunjukkan hasil
peningkatan ekspresi wild p53, mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
et al., 2003).
hasil korelasi yang positif dan bermakna antara wild p53 dengan apoptosis.
Kenaikan ekspresi wild p53 diikuti kenaikan jumlah sel yang mengalami
apotosis. Wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis ) dan akan
menekan Bcl-2 (anti apoptosis), sehingga kenaikan ekspresi wild p53 diikuti
Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel Mukosa Rongga Mulut
mukosa rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene. Hasil penelitian ini
Kanker ditandai dengan proliferasi sel yang yang tidak terkendali, terjadi
berfungsi sebagai mekanisme pertahanan seperti pada reaksi imun atau ketika
sel rusak karena suatu penyakit atau gen toksik. Karakteristik apoptosis
dan sel akan mati tanpa lisis sehingga tidak merusak sel atau jaringan
integritas tubuh secara keseluruhan. Program ini memiliki peran yang penting
apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang berlebihan pada sel
beberapa jalur khusus apoptosis penting dalam terapi kanker untuk mencegah
Setiap sel akan merespon semua stres atau stimulus yang diterimanya
melalui berbagai macam cara baik melalui aktivasi sinyal kehidupan sampai
tersebut tergantung pada berbagai macam faktor dan kemampuan sel untuk
pada penelitian ini adalah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar ,
mengalami mutasi terus menerus akan replikasi secara tidak terkendali. Wild
p53 merupaka tumor supresor gen yang akan teraktivasi jika sel memiliki gen
yang cacat (gene defect). Fungsi dari wild p53 ini mencegah replikasi sel pada
sel yang rusak atau mutasi secara genetik melalui penghentian siklus sel pada
fase G1 atau interfase, sehingga sel mempunyai waktu untuk repair. Selain
itu gen ini juga berfungsi untuk mencetuskan apoptosis . (Lumangga, 2008;
Kresno, 2011).
meningkatkan wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis) dan
fragmentasi dan akhirnya sel dengan DNA yang mutasi mengalami kematian
(apoptosis).
protein intraselular lain yang secara langsung maupun tidak langsung terlibat
dalam proses apoptosis. Bcl-2 memberi tempat berlabuh bagi protein lain
Bax akan berhenti (Kresno, 2011). Dengan adanya penurunan ekspresi Bcl-2
menunjukkan over ekspresi protein IAP dan XIAP. Protein IAP untuk
terdapat korelasi positif antara wild p53 dengan apoptosis. Kenaikan ekspresi
wild p53 akan diikuti kenaikan ekspresi apoptosis. Hal ini membuktikan
Delima (PGL)
R. Estrogen
Angiogenesis ↓ Bax ↑
Bcl-2
Apoptosis
reaktif yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA sehingga terjadi
mutasi pada gen p53 sehingga wild p53 tidak berfungsi. Ekstrak buah delima
pada siklus sel, maka siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild
se, akan menembus membran inti dan merusak DNA yang cacat/mutasi.
Sehingga DNA sel yang cacat / mutasi akan fragmentasi (rusak) dan akhirnya
reseptor estrogen, ikatan antara delima dengan trasformasi sel melalui ikatan
apoptosis merupakan faktor esensial untuk mengatasi sel kanker dan memutus
suplai nutrisi dari sel kanker sehingga sel kanker bisa mati.
BAB 7
PENUTUP
7.1 Kesimpulan
jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan
ekspresi VEGF.
apoptosis.
6.2 Saran
senyawa lain dalam ekstrak buah delima (PGL) terstandar yang memiliki
antikanker.
kanker.
131
DAFTAR PUSTAKA
Bell C and Hawthorne S, 2008. Ellagic acid, pomegranate and prostate cancer
Mini review, 2008. J Pharm Pharmacol 60 (2) : 66-71.
Budhy TI, 2004. Karsinogenesis karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang
terinfeksi epstein-barr virus (EBV) berdasar ekspresi p53, c-myc dan
Bcl-2. Disertasi . Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga
Surabaya. Hal ; 33- 43
Budhy TI, 2008. Protein spesifik karsinoma sel skuamosa rongga mulut sebagai
marker deteksi dini. Majala Kedokteran Gigi, vol 23,No 3,
September 2008.
Celik I, Atilla Temur and Ismail Isik, 2009. Hepatoprotective role andantioxidant
capacity of pomegranate (punica granatum) flower infusion againts
trichloroacetic acid-exposed in rats. J Food and Chemical 47 (1):
145- 149.
Cerda B, Ceron II, Tomas-Barberan FA, Espin JC, 2003. Repeated oral
administration of high doses of the pomegranate, ellatannin,
punicalagin to rats for 37 day is not toxid. J Agric Food Chen, 51:
3493-34501.
Cotran RS. Kumar V, Collins T, 2005 Pathologic basic of disease 7th ed.
Philadelphia. WB Saunders Company : 260-325.
Epstein J and Waal IV, 2008. Oral cancer. Texbook of oral medicine, Burket
Eleventh Edition. BC Decker Inc Hamilton Press :153-167.
Faust RA,1994.Toxicity Summary For Benzo (a) pyrene. Prepared for oak ridge
reservation environmental restoration program. martin marieta
energy Sistems, Inc, For The US. Department Of Energy Under
Contrac N0 DE-AC05-840R21400 : 1-6.
Gil C, Wei J, Yang J, 2008. Pomegranate juice is potentially better than aple
Juice in improving antioxidant function in elderly subject. Nutr Res
: 28: 72-77.
Guo N, Faller DV, Vaziri C. 2002. Carcinogen Induced S-phase arrest is Chk 1
mediated and caffeine sensitive. Cell Growth Differentiation : 13:77-
86
Hoang N, Tran A, Bae YS, Song BH, 2010. Pomegrnate (punica granatum )seed
linolenic acid isomers concentration dependent modulation of
estrogen receptor activity. J Biological Eduction, Kyungpook
National University Teagu, Republic of Korea. Vol 35 ; 1-16.
Jung JE, Kim HS, Lee CS, Park DH, Myung Y, Lee MJ, Lee JW, Park JW, Kim
MS, Ye SK, Chung MH, 2007. Caffeic acid and its synthetic derivad
cape supressor tumor angiogenesis by blocking STAT3-mediated
VEGF expression in human carcinoma. Department of
Pharmaology College of Medicine, Soul National University, Soul
110-799. Korea. Carcinogenesis Vol 28 n0 8 :1780-1787.
Kelley DJ, Mestre JR, Subbaramaiah K, Sacks PG, Schantz SP, Tanabe T, Inoue
H. Ramonetti JT, Dannenberg AJ, 1997. Benzo (a) pyrene up
regulates cyclooxygenase-2 gene expression in oral epithelial eells.
Carcinogenesis 18 ( 4) : 795- 799.
Khan N, Afaq F, Kweon MH, Kim KM, Mukhtar H, 2007. Oral consumpsion of
pomegranate fruit extract inhibits growth and progression of primary
lung tumors in mice. Departement of Dermatology, University of
Wisconsin-Madison, Medical Sciences Center. 67 (7): 3475- 3482.
King RJB. 2000. Cancer Biology. Prentice Hall Pearson Education ,pp 50-158.
Kresno SB, 2011. Texbook Ilmu dasar onkologi. Edisi kedua. Badan Penerbit
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesi. Hal 66-129.
Lansky EP and Newman RA, 2007. Punica granatum (pomegranate) and its
potential for preventif and treatment of inflammation and cancer. J
Ethnopharmaceol 109: 177-206.
Martin KR, Trempus C. Saulnier M, Kari FW, Barret JC, French JE. 2001.
Dietary N-acetyl L-cystein modulates benzopyrene induced skin
tumor in cancer-prone p53 haplo insufficient Tg.c (vH-Ras) mice
carcinogenesis, 22 (9) ; 1373-1378.
Marzo L and Naval J, 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer
therapy. J Biochen Pharm 76: 939-46.
McCutcheon A, Udani J, Brown DJ, 2008. Scientific and clinical monograp for
pom wonderful pomegrante Juice.American Botanical Council .pp 1-
15.
Mendelsohn J, Holley PM, Israel MA, Gray JW, Thompson CB, 2008. The
moleculer basis cancer. 3ed Elsevier Saunders, Philadelphia.
Apoptosis, Autophagy and Necrosis. Pp : 205-220.
Mestas J, Hughes C, 2004. Of mice and not men; differences between mouse and
human immunology.J Immunol.172 : 2731:2738.
National Plant Data Center, 2000. USDA, Baton Rouge, LA. pp70874-4490,
USA.
Nurhayati S dan Lusiyanti Y, 2006. Apoptosis dan respon biologik sel sebagai
faktor prognosa radioterapi kanker. Pusat Teknologi Keselamatan
dan Metrologi Radiasi. Batan. Vol 7 : 57-66.
Pelengaris S, Khan M, 2006. DNA replikasi and cell cycle In The Molecular
Biology of Cancer.Toronto : Blackwell Publishing .pp 88-119.
Pindborg JJ, 2000. Texbool kanker dan pra kanker rongga mulut. EGC. Jakarta.
Hal :1- 38.
Pulmeriastuti H, 2006. Ekspresi fas, granzyme dan caspase 3 pada apoptosis sel
bursa fabrictus ayam pada infeksi virus gumboro. Disertasi. Program
Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya. Hal 8-39.
Roger JBK and Robin MW, 2006. Mutation DNA repair and genetic instability in
cancer biology III Edition. Gosport: Ashford Colour Press : 112. in
Infected Mice. PNAS. 102 (108) :13676-13680.
Safriadi M, 2008. Patologi mulut tumor neoplastik dan non neoplastik rongga
mulut.Textbook of Patologi Mulut.C.V Andi : 73-83.
Samali A, Fulda S, Adrienne MG, Osamu H, Srinivasula SM, 2010.Cell stress and
cell death.Int J Cell Biol :11-15.
Sartippour MR, Seeram NP, Rao JY, Moro A, Harris DM, Henning SM, Firouzi
A, Rettig MB, Aronson WJ, Pantuck AJ, Heber D, 2008.
ellagitannin-rich pomegranate extract inhibit angiogenesis in prostate
cancer invitro and invivo. Int J. Oncol 32 (2) : 43-50.
Sattar A, Hewer A. Philips DH. Camphell FC. 1999. Metabolic proficiency and
benzo (a) pyrene DNA adduct formation in APC mouse adenomas
and uninvolveld mucosa. Carcinogenesis. 20 (6) : 1097-1101.
Seeram NP, Lee R and Heber D, 2004. Bioavailability of ellagic acid in human
plasma after consumptionof ellagitannins from pomegranate (Punica
Granatum L) juice Clinica Chimica Acta 348 (2004) 63-68.
Seeram NP, Adam LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, Heber D. 2005.
Invitro antiproliferative, apoptosis and antioxidant activitics of
punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are
enhanced in combination with other polyphenol as found in
pomegranate juice. J of Nutr Biochem 16 : 360-367.
Seeram NP, Schulman RN, Heber D, 2006. Pomegranate ancient roots to modern
Medicine 1st Ed. Taylor and Francis Group, New York .pp 2-99.
Schubert YS, Lansky EP, Neeman I, 199. Antioxydant and eicosanoid enzyme
inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice
flavonoids. J Ethnopharmacol 66 :11-17.
Shore GC, Ngayem M, 2008. Bcl-2 Proteins and Apoptosis. Choose Your Partner.
Cell 135 : 1004-7.
Spector DJ, Robert DG, Lesli AI, 1998. Cell laboratory manual, subcellular
localization of gene and their product, Vol 3, Publisher, Cold Spring
Harbor Laborator1y Press. New York, USA : 151-161.
Sunitha Carpelio and Gabriel Rodrigues, 2004. Oral cancer a glance. The Journal
of Dental Sience. Volume 1 Number 2.
Valadares MC, Pereire ERT, Benfica PL, Paula JR, 2010. Assessment of
mutagenic and antimutagenic effects of Punica Granatum. In Mice
Brazillian Journal of Pharmaceutical Sciences vol 46 : 120 -125.
Wahyuni F, 2010. Karsinoma sel skuamosa yang didahului inflamasi kronis non-
spesifik. Departemen Penyakit Mulut,Universitas Sumatera. Hal:3-9.
Wiese FW, Thompson PA, Kadlubar FF, 2001. Carcinogen substrat specificity of
human Cox 1 and Cox 2. Carcinogenesis 22 (1 ) ; 5-10.
Yakovlev AG and Faden AI, 2004. Mechanism of neural cell death : implication
for development of neuroprotective treatment strategies. The
American Society for Exsperimental Neuro Therapeutic, 1 : 5-16.
Zhang S, Won YK.Ong CN, Shen HM. 2009. Anti cancer potential of
sesquiterpene lactoner bioctive and molecular mechanism. Curr
Med. Chem Anti Cancer Agent. 5 (3) : 239-249.
Lampiran 1
Lampiran 2
Lampiran 3
NPar Tests
Oneway
Descriptives
Berat Badan Awal (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
Std. Lower
N Mean Deviation Std. Error Bound Upper Bound Minimum Maximum
Kontrol Negatif 6 34.9333 2.33295 .95242 32.4850 37.3816 32.50 37.80
Kontrol Positif 6 36.7033 3.17227 1.29507 33.3742 40.0324 33.20 40.90
Benzopyrene + EA 6 34.8000 3.15468 1.28789 31.4894 38.1106 30.50 37.30
Benzopyrene + PGL 6 35.7833 4.73811 1.93432 30.8110 40.7557 30.60 41.00
Benzopyrene + MD 6 39.5500 1.77172 .72330 37.6907 41.4093 37.80 42.50
Total 30 36.3540 3.45316 .63046 35.0646 37.6434 30.50 42.50
ANOVA
Berat Badan Awal (gram)
Oneway
Descriptives
Berat Badan stlh paparan (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
Std. Std.
N Mean Deviation Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
Kontrol Negatif 6 36.2617 2.27895 .93038 33.8701 38.6533 33.15 38.50
Kontrol Positif 6 34.7367 3.68468 1.50426 30.8698 38.6035 30.00 38.90
Benzopyrene + EA 6 33.3650 3.39049 1.38416 29.8069 36.9231 29.05 36.67
Benzopyrene + PGL 6 34.8050 4.90675 2.00317 29.6557 39.9543 29.08 41.00
Benzopyrene + MD 6 38.8717 1.87223 .76434 36.9069 40.8365 36.79 41.75
Total 30 35.6080 3.68744 .67323 34.2311 36.9849 29.05 41.75
ANOVA
Berat Badan stlh paparan (gram)
Oneway
Descriptives
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
Std. Std.
N Mean Deviation Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
Kontrol Negatif 6 38.1533 2.31747 .94610 35.7213 40.5854 35.03 41.15
Kontrol Positif 6 34.6817 4.29698 1.75423 30.1723 39.1911 29.09 39.00
Benzopyrene + EA 6 34.2383 3.16824 1.29343 30.9135 37.5632 30.01 37.00
Benzopyrene + PGL 6 35.4683 4.86519 1.98620 30.3626 40.5740 30.00 41.32
Benzopyrene + MD 6 40.8300 3.11360 1.27112 37.5625 44.0975 37.45 45.48
Total 30 36.6743 4.23891 .77392 35.0915 38.2572 29.09 45.48
ANOVA
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
Multiple Comparisons
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
LSD
Mean 95% Confidence Interval
Difference
(I) Kelompok (J) Kelompok (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
Kontrol Negatif Kontrol Positif 3.47167 2.11718 .114 -.8888 7.8321
Benzopyrene + EA 3.91500 2.11718 .076 -.4454 8.2754
Benzopyrene + PGL 2.68500 2.11718 .216 -1.6754 7.0454
Benzopyrene + MD -2.67667 2.11718 .218 -7.0371 1.6838
Kontrol Positif Kontrol Negatif -3.47167 2.11718 .114 -7.8321 .8888
Benzopyrene + EA .44333 2.11718 .836 -3.9171 4.8038
Benzopyrene + PGL -.78667 2.11718 .713 -5.1471 3.5738
*
Benzopyrene + MD -6.14833 2.11718 .008 -10.5088 -1.7879
Benzopyrene + EA Kontrol Negatif -3.91500 2.11718 .076 -8.2754 .4454
Kontrol Positif -.44333 2.11718 .836 -4.8038 3.9171
Benzopyrene + PGL -1.23000 2.11718 .566 -5.5904 3.1304
*
Benzopyrene + MD -6.59167 2.11718 .005 -10.9521 -2.2312
Benzopyrene + PGL Kontrol Negatif -2.68500 2.11718 .216 -7.0454 1.6754
Kontrol Positif .78667 2.11718 .713 -3.5738 5.1471
Benzopyrene + EA 1.23000 2.11718 .566 -3.1304 5.5904
*
Benzopyrene + MD -5.36167 2.11718 .018 -9.7221 -1.0012
Benzopyrene + MD Kontrol Negatif 2.67667 2.11718 .218 -1.6838 7.0371
*
Kontrol Positif 6.14833 2.11718 .008 1.7879 10.5088
*
Benzopyrene + EA 6.59167 2.11718 .005 2.2312 10.9521
*
Benzopyrene + PGL 5.36167 2.11718 .018 1.0012 9.7221
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
Kelompok BCl2 VEGF P53 Apoptosis
Kontrol Negatif N 6 6 6 6
a,,b
Normal Parameters Mean .0000 .1333 .4500 .0833
Std. Deviation .00000c .10328 .33317 .13292
Most Extreme Differences Absolute .293 .393 .401
Positive .293 .393 .401
Negative -.207 -.227 -.265
Kolmogorov-Smirnov Z .718 .963 .983
Asymp. Sig. (2-tailed) .681 .312 .289
Kontrol Positif N 6 6 6 6
a,,b
Normal Parameters Mean .3667 .3500 .1333 .0500
Std. Deviation .10328 .10488 .08165 .05477
Most Extreme Differences Absolute .293 .183 .293 .319
Positive .207 .183 .207 .319
Negative -.293 -.183 -.293 -.319
Kolmogorov-Smirnov Z .718 .449 .717 .782
Asymp. Sig. (2-tailed) .681 .988 .682 .573
Benzopyrene + EA N 6 6 6 6
Normal Parametersa,,b Mean .0833 .2667 .3333 .2333
Std. Deviation .07528 .10328 .21602 .08165
Most Extreme Differences Absolute .254 .293 .121 .293
Positive .246 .207 .109 .207
Negative -.254 -.293 -.121 -.293
Kolmogorov-Smirnov Z .623 .718 .297 .717
Asymp. Sig. (2-tailed) .833 .681 1.000 .682
Benzopyrene + PGL N 6 6 6 6
a,,b
Normal Parameters Mean .0167 .1833 .3500 .3667
Std. Deviation .04082 .09832 .16432 .19664
Most Extreme Differences Absolute .492 .401 .286 .299
Positive .492 .266 .286 .299
Negative -.342 -.401 -.181 -.198
Kolmogorov-Smirnov Z 1.205 .981 .701 .733
Asymp. Sig. (2-tailed) .110 .291 .709 .655
Benzopyrene + MD N 6 6 6 6
Normal Parametersa,,b Mean .0000 .1500 .3833 .3167
Std. Deviation .00000c .10488 .19408 .17224
Most Extreme Differences Absolute .183 .226 .251
Positive .183 .161 .251
Negative -.183 -.226 -.190
Kolmogorov-Smirnov Z .449 .554 .615
Asymp. Sig. (2-tailed) .988 .919 .844
a. Test distribution is Normal.
b. Calculated from data.
c. The distribution has no variance for this variable. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test cannot be performed.
Between-Subjects Factors
Value Label N
Kelompok 0 Kontrol Negatif 6
1 Kontrol Positif 6
2 Benzopyrene + EA 6
3 Benzopyrene + PGL 6
4 Benzopyrene + MD 6
Descriptive Statistics
a
Box's Test of Equality of Covariance Matrices
Box's M 47.417
F 1.406
df1 20
df2 807.650
Sig. .111
Tests the null hypothesis that the observed covariance matrices of the
dependent variables are equal across groups.
a. Design: Intercept + klp
c
Multivariate Tests
Effect Value F Hypothesis df Error df Sig.
a
Intercept Pillai's Trace .923 66.307 4.000 22.000 .000
a
Wilks' Lambda .077 66.307 4.000 22.000 .000
a
Hotelling's Trace 12.056 66.307 4.000 22.000 .000
a
Roy's Largest Root 12.056 66.307 4.000 22.000 .000
Klp Pillai's Trace 1.446 3.539 16.000 100.000 .000
Wilks' Lambda .050 7.030 16.000 67.849 .000
Hotelling's Trace 9.530 12.210 16.000 82.000 .000
b
Roy's Largest Root 8.512 53.201 4.000 25.000 .000
a. Exact statistic
b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.
c. Design: Intercept + klp
a
Levene's Test of Equality of Error Variances
Pairwise Comparisons
95% Confidence Interval
a a
for Difference
Dependent Mean Std. Lower Upper
a
Variable (I) Kelompok (J) Kelompok Difference (I-J) Error Sig. Bound Bound
*
BCl2 Kontrol Negatif Kontrol Positif -.367 .035 .000 -.438 -.295
*
Benzopyrene + EA -.083 .035 .024 -.155 -.012
Benzopyrene + PGL -.017 .035 .635 -.088 .055
Benzopyrene + MD -1.163E-16 .035 1.000 -.071 .071
*
Kontrol Positif Kontrol Negatif .367 .035 .000 .295 .438
*
Benzopyrene + EA .283 .035 .000 .212 .355
*
Benzopyrene + PGL .350 .035 .000 .279 .421
*
Benzopyrene + MD .367 .035 .000 .295 .438
*
Benzopyrene + Kontrol Negatif .083 .035 .024 .012 .155
EA *
Kontrol Positif -.283 .035 .000 -.355 -.212
Benzopyrene + PGL .067 .035 .066 -.005 .138
*
Benzopyrene + MD .083 .035 .024 .012 .155
Benzopyrene + Kontrol Negatif .017 .035 .635 -.055 .088
PGL *
Kontrol Positif -.350 .035 .000 -.421 -.279
Benzopyrene + EA -.067 .035 .066 -.138 .005
Benzopyrene + MD .017 .035 .635 -.055 .088
Benzopyrene + Kontrol Negatif 1.163E-16 .035 1.000 -.071 .071
MD *
Kontrol Positif -.367 .035 .000 -.438 -.295
*
Benzopyrene + EA -.083 .035 .024 -.155 -.012
Benzopyrene + PGL -.017 .035 .635 -.088 .055
*
VEGF Kontrol Negatif Kontrol Positif -.217 .059 .001 -.339 -.094
*
Benzopyrene + EA -.133 .059 .034 -.256 -.011
Benzopyrene + PGL -.050 .059 .408 -.172 .072
Benzopyrene + MD -.017 .059 .781 -.139 .106
*
Kontrol Positif Kontrol Negatif .217 .059 .001 .094 .339
Benzopyrene + EA .083 .059 .173 -.039 .206
*
Benzopyrene + PGL .167 .059 .010 .044 .289
*
Benzopyrene + MD .200 .059 .002 .078 .322
*
Benzopyrene + Kontrol Negatif .133 .059 .034 .011 .256
EA Kontrol Positif -.083 .059 .173 -.206 .039
Multivariate Tests
Univariate Tests
Dependent Variable Sum of Squares df Mean Square F Sig.
BCl2 Contrast .589 4 .147 40.880 .000
Error .090 25 .004
VEGF Contrast .197 4 .049 4.638 .006
Error .265 25 .011
P53 Contrast .338 4 .085 1.845 .152
Error 1.145 25 .046
Apoptosis Contrast .469 4 .117 6.124 .001
Error .478 25 .019
The F tests the effect of Kelompok. This test is based on the linearly independent pairwise
comparisons among the estimated marginal means.
T-Test
Group Statistics
Kelompok N Mean Std. Deviation Std. Error Mean
BCl2 Kontrol Negatif 6 .0000 .00000 .00000
Kontrol Positif 6 .3667 .10328 .04216
T-Test
Group Statistics
BCl2 Equal variances 9.434 .012 -2.712 10 .022 -.08333 .03073 -.15181 -.01486
assumed
Equal variances -2.712 5.000 .042 -.08333 .03073 -.16233 -.00433
not assumed
T-Test
Group Statistics
T-Test
Warnings
The Independent Samples table is not produced.
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
BCl2 Equal variances 1.712 .220 1.907 10 .086 .06667 .03496 -.01123 .14456
assumed
Equal variances 1.907 7.707 .094 .06667 .03496 -.01449 .14782
not assumed
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
Apoptosis Equal variances 6.942 .025 -3.800 10 .003 -.31667 .08333 -.50234 -.13099
assumed
Equal variances -3.800 5.771 .010 -.31667 .08333 -.52255 -.11078
not assumed
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
T-Test
Group Statistics
Correlations
Correlations
N 30 30 30 30
**
VEGF Pearson Correlation .560 1 -.284 -.280
Sig. (2-tailed) .001 .128 .134
N 30 30 30 30
* *
P53 Pearson Correlation -.383 -.284 1 .372
Sig. (2-tailed) .037 .128 .043
N 30 30 30 30
*
Apoptosis Pearson Correlation -.359 -.280 .372 1
Sig. (2-tailed) .051 .134 .043
N 30 30 30 30
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).
Curve Fit
Model Description
Model Name MOD_2
Dependent Variable 1 Apoptosis
Equation 1 Linear
Independent Variable BCl2
Constant Included
Variable Whose Values Label Unspecified
Observations in Plots
N
Total Cases 30
a
Excluded Cases 0
Forecasted Cases 0
Newly Created Cases 0
a. Cases with a missing value in any variable are
excluded from the analysis.
Variables
Dependent Independent
Apoptosis BCl2
Number of Positive Values 23 11
Number of Zeros 7 19
Number of Negative Values 0 0
Number of Missing Values User-Missing 0 0
System-Missing 0 0
Regression
b
Variables Entered/Removed
Variables Variables
Model Entered Removed Method
a
1 P53 . Enter
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: Apoptosis
Model Summary
Adjusted R Std. Error of the
Model R R Square Square Estimate
a
1 .372 .138 .108 .17070
a. Predictors: (Constant), P53
b
ANOVA
Model Sum of Squares df Mean Square F Sig.
a
1 Regression .131 1 .131 4.501 .043
Residual .816 28 .029
Total .947 29
a. Predictors: (Constant), P53
b. Dependent Variable: Apoptosis
a
Coefficients
Standardized
Unstandardized Coefficients Coefficients
Model B Std. Error Beta t Sig.
1 (Constant) .112 .056 2.006 .055
Regression
b
Variables Entered/Removed
Variables Variables
Model Entered Removed Method
a
1 P53, Apoptosis . Enter
2 . Apoptosis Backward (criterion:
Probability of F-to-remove >=
,100).
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: BCl2
Model Summary
Adjusted R Std. Error of the
Model R R Square Square Estimate
a
1 .448 .201 .142 .14171
b
2 .383 .147 .116 .14383
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis
b. Predictors: (Constant), P53
c
ANOVA
Model Sum of Squares df Mean Square F Sig.
a
1 Regression .136 2 .068 3.398 .048
Residual .542 27 .020
Total .679 29
b
2 Regression .099 1 .099 4.806 .037
Residual .579 28 .021
Total .679 29
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis
b. Predictors: (Constant), P53
c. Dependent Variable: BCl2
a
Coefficients
Standardized
Unstandardized Coefficients Coefficients
Model B Std. Error Beta t Sig.
1 (Constant) .203 .050 4.092 .000
b
Excluded Variables
Collinearity
Statistics
Partial
Model Beta In t Sig. Correlation Tolerance
a
2 Apoptosis -.252 -1.358 .186 -.253 .862
a. Predictors in the Model: (Constant), P53
b. Dependent Variable: BCl2
Regression
b
Variables Entered/Removed
Variables Variables
Model Entered Removed Method
1 P53, Apoptosis, . Enter
a
BCl2
2 . P53 Backward (criterion: Probability
of F-to-remove >= ,100).
3 . Apoptosis Backward (criterion: Probability
of F-to-remove >= ,100).
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: VEGF
Model Summary
Adjusted R Std. Error of the
Model R R Square Square Estimate
a
1 .569 .323 .245 .10960
b
2 .566 .320 .270 .10779
c
3 .560 .313 .289 .10640
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2
b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2
c. Predictors: (Constant), BCl2
d
ANOVA
Model Sum of Squares df Mean Square F Sig.
a
1 Regression .149 3 .050 4.143 .016
Residual .312 26 .012
Total .462 29
b
2 Regression .148 2 .074 6.366 .005
Residual .314 27 .012
Total .462 29
c
3 Regression .145 1 .145 12.778 .001
Residual .317 28 .011
Total .462 29
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2
b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2
c. Predictors: (Constant), BCl2
d. Dependent Variable: VEGF
a
Coefficients
Standardized
Unstandardized Coefficients Coefficients
Model B Std. Error Beta t Sig.
1 (Constant) .200 .049 4.094 .000
c
Excluded Variables
Collinearity
Statistics
Partial
Model Beta In t Sig. Correlation Tolerance
a
2 P53 -.061 -.339 .738 -.066 .790
b
3 P53 -.082 -.475 .638 -.091 .853
b
Apoptosis -.090 -.532 .599 -.102 .871
a. Predictors in the Model: (Constant), Apoptosis, BCl2
b. Predictors in the Model: (Constant), BCl2
c. Dependent Variable: VEGF
Lampiran 4
Persiapan reagen :
Tahap fiksasi
H2O2 : 3%
Trypsin 0, 025% dalam PBS
Cara pewarnaan :
Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut- turut ke
dalam :
1. Xylol, selama 2 menit, sebanyak 2 kali
2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut : 1 menit, sebanyak 2 kali
3. Selanjutnya dimasukkan ke dalam etanol 95 % 1 menit ,sebanyak 2 kali
4. Setelah dimasukkan ke dalametanol 95% , kemudian dimasukkan ke dalam etanol 80 %
selama 1 menit.
5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70 % selama 1 menit
Tahap pencucian
1. Dicuci pada air mengalir selama 10 -15 menit
2. Setelah itu dimasukkan ke dalam larutan H202 3 % : selama 30 menit
3. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit )
4. Setelah itu dimasukkan ke dalam etanol 70% selama 1 menit.
5. Dicuci pada air mengalir , selama 10-15 menit
6. Dimasukkan ke dalm larutan H2O2 3% : 30 menit
7. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
8. Dimasukkan ke dalam larutan Tripsin 0, 025% selama 6 menit pada 37o C
9. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit)
10. Dimasukkan ke dalam anti p53, Bcl-2, VEGF (mouse anti rat 1: 50) : 30 menit
11. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
Tahap pelebelan
1. Dimasukkan kedalam sekunder antibody (rabbit anti mouse biotinilated antibody Label)
: 30 menit
2. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
3. Dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label :selama30 menit
4. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
5. Dimasukkan ke dalam substrat kromogen :selama5 menit
6. Dicuci dengan PBS 3 kali (a :2 menit), kemudian dibilas dengan aquadestilata
7. Dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin : 6 menit
8. Dicuci dengan air mengalir
9. Proses mounting
Lampiran 5
Persiapan reagen :
H2O2 : 3%
Proteinase K 60 ug /ml
Cara pewarnaan :
Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut :
1. Sayatan dimasukkan ke dalam xylol selama 2 menit, sebanyak 2 kali
2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut sebanyak 1 menit, selama 2 kali.
3. Dimasukkan ke dalam etanol selama 95% selama 1 menit, sebanyak 2 kali
4. Setelah itu dimasukkan kedalam etanol 80% selama 1 menit
5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70% selama 1 menit
6. Dicuci pada air mengalir selama 10-15 menit
7. Dibilas dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
8. Dimasukkan ke dalam proteinase K selama 15 menit
9. Dicuci dengan d H2O 2 sebanyak kali (2 menit)
10. Dimasukkan ke dalam 3% H2O2 selama 15menit
11. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
12. Dimasukkan ke dalam equilibrium buffer : 10 menit pada suhu kamar
13. Dimasukkan pada working strength TDT enzyme yang dilengkapi digoxygenin 37°C : 1
jam
14. Dimasukkan pada stop buffer selama15 menit
15. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a: 2 menit)
16. Dimasukkan pada anti digoxigenin peroxidase conjugate : 30 menit
17. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit)
18. Dimasukkan pada peroxidase substrat selama :10 menit
19. Dicuci dengan d H 2 O sebanyak 3 kali (a : 1 menit)
20. Dimasukkan pada Mayer Haematoxylin selama : 6 menit
24. Dicuci dengan d H 2 O
25. Proses mounting