Tema 04.

Molculas de Histocompatibilidad
Las molculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas tras demostrarse que estaban relacionadas las reacciones de rechazo de tejidos y rganos trasplantados entre individuos de la misma especie. Sin embargo hoy sabemos que las molculas de histocompatibilidad juegan un papel esencial en la respuesta inmunolgica capturando y presentando antgenos a las clulas T sin cuya funcin sera imposible la defensa del organismo frente a todos aquellos microorganismos, principalmente virus, que consiguen entrar en las clulas de cada individuo. En el humano se denominan antgenos HLA (Histocompatibility Leucocyte Antigens) y una de las principales caractersticas de estas molculas es su extraordinario polimorfismo, esto es cada uno de los genes que las codifican pueden expresarse de mltiples maneras. Los loci genticos reguladores de la sntesis de estas molculas se agrupan en una regin denominada Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de padres a hijos de acuerdo con las leyes de Mendel. Aunque fueron originalmente descritas estas molculas como HLA por su implicacin en la histocompatibilidad de trasplantes por lo que tambin se le reconoci como antgenos presentes en los leucocitos, hoy sabemos que se pueden encontrar en la mayora de las clulas del organismo y que por su polimorfismo son responsable de la diversidad biolgica de cada miembro de la especie humana, por lo que su denominacin ms adecuada podra ser la de Molculas/marcadores Celulares de Diversidad (MCD). Los primeros trabajos sobre estas molculas fueron realizados por Gorer (1936) en ratones viendo como se produca rechazo de ciertos trasplantes entre ratones de distintas cepas endogmicas y la obtencin de aloantisueros mediante inmunizacin con clulas de entre distintas cepas. En el caso humano, el primer antgeno de histocompatibilidad descrito fue Mac (en la actualidad conocido como HLA-A02+*), descubierto por Jean Dousset en 1958, (Figura 5.1). Pronto el propio Jean Dausset y otros investigadores demostraron la existencia de una estrecha relacin entre estas molculas y la supervivencia de riones trasplantados. En la actualidad, son ya centenares los antgenos de este tipo que se han definido en humanos gracias a la intensa colaboracin establecida entre los laboratorios que trabajan en histocompatibilidad, a travs de los Workshops Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran peridicamente. En este captulo estudiaremos la estructura de estas molculas y la organizacin de los genes que las codifican. Tambin se estudiarn las funciones de estas molculas en la presentacin de pptidos a los receptores TCR de las clulas T y su implicacin en la eliminacin de timocitos potencialmente autorreactivos. Por otra parte se estudiara el alcance de polimorfismos de las mismas y su importancia en la definicin del individuo como ser biolgicamente nico y su utilidad en el diagnstico de ciertas enfermedades, estudios de paternidad y de migraciones de poblaciones humanas.

Estructura y funcin molculas histocompatibilidad

Segn su estructura las molculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes grupos: molculas de histocompatibilidad clase I y clase II con estructuras y funciones diferentes. Entre las primeras se encentran las molculas clsicas de clase I que corresponde con los antgenos HLA-A, B C y las molculas no clsicas entre las que se encuentran HLA-E, F, G y CD1. Las molculas HLA clase II pueden ser HLA-DR, DQ y DP. (Tabla: Clases y formas de HLA) Estructura de las molculas HLA de clase I Las molculas HLA clase I se encuentran constituidas por 2 cadenas polipeptdicas: una cadena pesada, glicosilada, de mayor tamao, que se encuentra asociada, mediante interacciones no covalentes a una cadena ms pequea, cadena ligera, la -2-microglobulina. (Figura: HLA I y II). La cadena pesada, es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la responsable del polimorfismo antignico de las molculas de histocompatibilidad clase I, mientras que la cadena ligera es igual en todos los individuos (Figura: Variabilidad HLA).

En la cadena pesada, se distinguen tres zonas bien definidas, una zona extracelular de mayor tamao y otras ms pequeas que corresponde a la regin transmembrana, e intracitoplasmtica. La zona extracelular se halla organizada en tres dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados -1, -2 y -3 mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios. Los dominios -1 y -2 constituyen regiones de contenido variable en aminocidos mientras que el dominio -3 es bastante y pertenece a la superfamilia de las Igs y por tanto muestra una notable homologa con la regin constante de las inmunoglobulinas y con la -microglobulina -2

La cadena -2-microglobulina, es un polipptido idntico al encontrado en el componente srico y los genes que la codifican no se encuentran en el MHC, situndose en el cromosoma 16 en el hombre. El anlisis estructural de la -2-microglubulina revela que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, con una notoria homologa con el tercer dominio constante de la cadena pesada de las mismas. (Figura Estructura HLA-I) Estructura de las molculas HLA clase II. Las molculas de clase II son glicoprotenas que se encuentran en la superficie celular y estn formadas por dos cadenas, y unidas entre s mediante interacciones de naturaleza no covalente. Tanto la cadena como se encuentran codificadas por genes situados en el MHC. Estn constituidas por dos dominios extracelulares, -1 y -2 y -1 y -2 en cada una de ellas. Estructura tridimensional. El anlisis de la estructura tridimensional de los antgenos de histocompatibilidad de clase I y clase II, determinada mediante cristalografa, demuestra que los dominios estn estructurados de forma diferente. As, dentro de los antgenos clase I, el dominio -3 y la -2-microglobulina estn organizados en estructura de hoja plegada . Por el contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona formada por cuatro fragmentos en estructura de hoja plegada seguido de otro segmento organizado en forma de a-hlice. Esta organizacin delimita una hendidura denominada sitio de unin al pptido (peptide binding groove) en el que los residuos ms polimrficos se encuentran en el suelo y las paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un pptido que no pertenece a la molcula y de aproximadamente 8-10 aminocidos. Ese pptido procede de protenas endgenas, como veremos en el captulo siguiente e interacciona con las molculas de histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas estructuras. Un determinado antgeno de histocompatibilidad puede unirse a pptidos diferentes siempre que stos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la molcula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimrficos. La estructura tridimensional de los antgenos de clase II tambin ha sido determinada por cristalografa y es semejante a la de los antgenos de clase I. Los dos dominios proximales ( 2 y 2) son los equivalentes al dominio -3 y a la -2-microglobulina de los antgenos clase I, mientras que los dos dominios distales (-1 y -1) de los antgenos clase II se corresponden con los dominios -1 y -2 de la molcula clase I. La hendidura donde se ubica el pptido se forma entre los dominios y -1 de las molculas clase II. -1 Distribucin tisular de las molculas clase I y II. Las molculas de clase I se encuentran presentes en la mayora de las clulas nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresin es mnima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glndulas de Brunner duodenales, trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central. La expresin de las molculas de clase II se encuentra fundamentalmente restringida a

macrfagos, monocitos, linfocitos B y cuando estn activados tambin en linfocitos T y NK. Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras clulas que actan como presentadoras de antgenos, tales como clulas dendrticas del bazo, epidrmicas de Langerhans o clulas endoteliales. Tambin se encuentran en progenitores hematopoyticos, clulas leucmicas y clulas de diferentes tipos de tumores. Esta distribucin diferencial de las molculas de histocompatibilidad de clase I y II se encuentra directamente relacionada con la diferente funcin de cada tipo de molculas. En suma las molculas de histocompatibilidad estn presentes en la mayora de clulas del organismo actuando as para las clulas del sistema inmunitario "como marcadores lo propio" (el yo inmunolgico) en tanto que han intervenido en el proceso de seleccin de los linfocitos T en el proceso madurativo en el timo y en donde se han eliminado todos aquellos clonos que potencialmente son autorreactivos pero permanecen precisamente aquellos que reconocen a las molculas de histocompatibilidad propias (Tabla: distribucin HLA). Molculas de histocompatibilidad no clsicas Entre este grupo destacan de manera ms significativa, las molculas de histocompatibilidad HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homologa con las molculas clsicas clase I (HLA-A, -B y -C), aunque poseen funciones muy diferenciadas Molcula HLA-E: La estructura tridimensional de la molcula de HLA-E, es muy similar a la de las molculas clsicas HLA-A, B y C presentando sitios de unin conservados para la -2-microglobulina aunque tiene mucho pero no el polimorfismo de las anteriores. Esta molcula se encuentra en la mayora de las clulas del organismo y su importancia radica en que cuando es reconocida por los receptores CD94/NKG2A presentes en la mayora de las NK y ciertos linfocitos T, los inhiben. De esta manera parece que se protegen las clulas del organismo frente a su destruccin sobre todo de clulas NK. Recientemente se ha descubierto que la protena UL40 presente en los citomegalovirus, es capaz de unirse ella, Molcula HLA-F: Se sabe que esta molcula se expresa principalmente en clulas de amgdalas, bazo y timo. La localizacin de la protena es intracelular y est descrito que los tetrmeros de HLA-F se unen a los receptores ILTR2 (LIR1) y ILTR4 (LIR2) que son receptores inhibidores presentes en NK y otros leucocitos.

Molcula HLA-G: esta molcula se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribucin celular y tisular restringida al trofoblasto fetal y clulas del epitelio tmico. Esta molcula puede presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de ellas son protenas unidas a membrana (HLA-G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son protenas solubles (HLA-G5, G6 Y G7). Parece que juega un papel muy importante inhibiendo el sistema inmune de la madre para proteger al feto que en definitiva es un trasplante, debido a contenido paterno presente en el mismo. Familia de molculas CD1. Los antgenos CD1 son glicoprotenas no polimrficas constituidos por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la -2-microglobulina (-2-m). Se ha definido como una molcula presentadora de antgeno presente en la mayora de los mamferos encontrndose tanto en las clulas dendrticas como en timocitos. Mientras que en ratones las molculas CD1 pueden presentar pptidos y molculas no peptdicas como glicolpidos a clulas T, en

humanos slo hay evidencia de presentacin de antgenos no peptdicos de origen microbiano, generalmente a clulas T de TCR restringido Las clulas T implicadas en el reconocimiento de antgeno presentado por CD1 son denominadas NKT. En humanos la familia de los genes de CD1 contiene 5 miembros: CD1A, CD1B, CD1C, CD1D y CD1E, que se agrupan en dos grupos en base a la similitud de la secuencia de aminocidos entre ellas y entre especies. En general, las molculas de CD1 se expresan predominantemente en timocitos y en algunas APCs derivadas de mdula sea como las clulas dendrticas. Se ha descrito que las clulas del epitelio intestinal expresan las molculas de CD1d. GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Como ya se ha dicho, los genes que codifican las molculas de histocompatibilidad que se encuentran agrupados en el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad que se extiende aproximadamente 2-3 centimorgans (aproximadamente 4x106 pares de bases) y en el humano contiene al menos 50 genes distintos. Este grupo de genes se encuentra organizado de forma diferente en las distintas especies, conocindose con precisin la organizacin gentica del MHC en el hombre, sistema HLA. Recientemente se ha propuesto una nueva taxonoma para clasificar los distintos genes que codifican las molculas de histocompatibilidad. (Tabla: Funciones HLA) Complejo Mayor de Histocompatibilidad hombre.

en

el

El Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre est constituido por un grupo de genes situado en el brazo corto del cromosoma 6. El complejo mayor de histocompatibilidad humano es donde se codifican los loci que de los distintos antgenos HLA clase I y II. (Figura Complejo Mayor de Histocompatibilidad) Entre los de clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas a de los antgenos HLA-A, HLA-B y HLA-C y entre los de clase II se encuentran los pares de genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antgenos HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel, como caracteres codominantes simples. La regin gentica de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepcin de los que codifican la beta-2-microglobulina) se denomina haplotipo HLA (Figura Haplotipo HLA) As pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C y los genes clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA- DP. y otros loci que codifican molculas implicadas en el procesamiento de pptidos como son los genes TAP cuyos productos estn implicados en la transferencia de pptidos del citosol al retculo endoplsmico y los genes LMP que codifican componentes del proteosoma responsable de transformar protenas en pptidos que

posteriormente sern presentados en la superficie celular. Asimismo en esta regin se encuentran los genes que codifican algunos factores del complemento, la enzima 21-hidroxilasa, la citocina TNF-alfa y otros genes y pseudogenes con homologa estructural con los genes clase I y clase II con limitado polimorfismo y cuya funcin aun se encuentra insuficientemente aclarada (Figura MHC humano) La existencia de estos diferentes loci fue demostrada por la aparicin espontnea de recombinaciones entre los mismos o la existencia de lneas celulares mutantes, con prdidas de uno o varios loci y ha sido confirmada a lo largo de los ltimos aos por el empleo de tcnicas de biologa molecular que han permitido aislar y secuenciar estos genes. Gracias a estas tcnicas de biologa molecular se ha descubierto la existencia en esta regin de numerosos genes y pseudogenes pero solamente una minora tienen estructura clase I o clase II mientras que la mayora no estn relacionados estructuralmente. Cada clula del organismo, (excepto las clulas germinales), poseen un haplotipo procedente del padre y otro de la madre. La mayora de los genes del MHC son altamente polimrficos, es decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas, prcticamente idnticas en todos los individuos y zonas altamente variables. Cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a nivel genmico. Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos, el nmero de combinaciones tericas posibles en la poblacin considerada en su conjunto es muy alto. A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades subtpicas que aparecen por divisin de otras anteriores y a las antiguas especificidades supertpicas. As por ejemplo, las especificidades HLA-B51 y HLA-B52 se consideran como productos de la divisin del antgeno HLA-B5. De hecho la secuenciacin de los genes HLA ha demostrado que el polimorfismo que es detectado a nivel serolgico es slo una parte del que se encuentra a nivel genmico. As por ejemplo existen numerosos subtipos de HLA-A2 y numerosos subtipos de HLA-B27. Ello ha hecho que se establezca un nuevo sistema de nomenclatura para los diferentes alelos HLA que utiliza la letra del loci seguida de 4 dgitos tal como se muestra en el Apndice. Los dos primeros dgitos seran los de la especificidad serolgica y los otros dos indicaran la especificidad detectada por secuenciacin. Los haplotipos heredados de cada padre van a determinar el genotipo del hijo, es decir, el genotipo de ste ser la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de la madre (Figura Herencia haplotipos). Se ilustra grficamente todo lo anteriormente expuesto.

En una familia determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y (b) = A3, B7, Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, Cw2, DR2 y (d) = A11, B13, Cw3, DR5 los hijos podrn heredar cuatro combinaciones distintas de estos haplotipos, siendo (a, b), (b, c) y (b, d) los posibles genotipos resultantes. Tras la secuenciacin del Complejo Mayor de Histocompatibilidad se conoce que esta regin la forman ms de 200 loci, muchos de los cuales an son funcionalmente desconocidos, aunque posiblemente solo la mitad juegue un papel en la funcin del sistema inmune. Probablemente el estudio del polimorfismo de esta regin ayudar a comprender por qu unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance ser una importante herramienta para el estudio filogentico, la biologa y la evolucin de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad. Loci HLA-A, B, C. La regin que codifica las molculas de clase I est dividida en tres loci, conocidos como A (Tabla I) , B (Tabla II-III) y C, (Tabla IV) que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas molculas de clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados mediante tcnicas de hibridacin de DNA y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrndose una estructuracin homloga a los genes que codifican la b-2 microglobulina, las inmunoglobulinas y otros tipos de protenas. El prototipo de gen que codifica molculas de clase I, se encuentra dividido en 8 exones, cada uno de los cuales, se corresponde a cada dominio estructural de la molcula. Si bien se conoce con precisin la funcin de estas tres familias de antgenos de histocompatibilidad de clase I expresados en la superficie celular, se ha demostrado la existencia de otros genes que tambin codifican otros antgenos HLA de clase I con menor polimorfismo y cuya expresin es variable, tanto en su distribucin tisular como en la densidad de la membrana celular. Entre estos genes se incluyen: HLA-E, HLA-F y HLA-G. Gen HLA-E: Este gen presenta una secuencia parecida a la molcula Qa1 murina, que une pptidos hidroflicos de la secuencia leader de las molculas MHC clsicas. Se expresa en pequeas cantidades en la superficie de la clula, y su expresin est regulada por la presencia de las otras molculas de histocompatibilidad presentadas en la superficie celular y es TAP dependiente. Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes de las molculas clsicas. Se transcribe en una gran variedad de clulas y tejidos presentando un polimorfismo limitado. Gen HLA-G: Este gen presenta la estructura tpica de la HLA clase I y su expresin parece estar restringida a la placenta y se asocia con funciones de carcter tolerognico. Regin HLA-D En la regin D se localizan los genes que codifican las molculas HLA-DR (Tabla V-VI ), HLA-DQ (Tabla V ) y HLA-DP. Su anlisis bioqumico demuestra que se trata de molculas de clase II compuestas, como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b. Las molculas HLA-DR y HLA-DQ se estudiaron por serologa y los antgenos HLA-DP fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulacin secundaria de linfocitos previamente sensibilizados (PLT). El empleo de tcnicas de biologa molecular ha permitido el aislamiento y secuenciacin de los genes de esta regin, de manera que hoy se conoce con precisin que la regin D posee un elevado nmero de genes. Los genes de la familia DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena DRalfa y posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que codifican cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo. Se han descrito otra serie de pseudogenes DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse an su funcin y expresin. La cadena proteica DR puede combinarse (Figura Recombinacin genes clase II) Con las diferentes

cadenas codificadas por los genes DRB dando origen a las mol culas de clase II portadoras de las especificidades HLA-DR (la unin de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1 y las especificidades HLA-DRw51, 52 y 53 (la unin de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB5, DRB3 o DRB4, respectivamente). Tanto las familias DQ como DP contienen dos pares de genes, es decir dos genes a y dos genes b, prximos entre s y todos poli- mrficos. Slo uno de estos pares, DQA1 y DQB1 y DPA1 y DPB1, codifican las cadenas a y b de las molculas de clase II HLA-DQ y HLA-DP respectivamente. Los otros 2 pares de genes DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y DPB2 poseen un limitado polimorfismo y no se encuentran expresados en la superficie celular. Adems existe otra subregin que contiene un gen a, denominado DNA, y un gen beta, DOB, que podran codificar un nuevo tipo de molculas clase II. Por otra parte tambin se han localizado una nueva pareja de genes, HLA-DM, no polimrficos, que se encuentran implicados en el proceso de procesamiento y presentacin de antgeno como se expone en el prximo captulo. Cada uno de estos genes est estructurado en secuencias de intrones y exones relacionados con los dominios estructurales de la protena codificada por ellos.

FUNCIN MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Las molculas de histocompatibilidad estn presentes en la mayora de clulas del organismo actuando as para las clulas del sistema inmunitario "como marcadores lo propio" (el yo inmunolgico) en tanto que han intervenido en el proceso de seleccin de los linfocitos T en el proceso madurativo en el timo y en donde se han eliminado todos aquellos clonos que potencialmente son autorreactivos pero permanecen precisamente aquellos que reconocen a las molculas de histocompatibilidad propias. Complementariamente a lo indicado anteriormente, la funcin biolgica ms relevante de las molculas de histocompatibilidad propias presentes en las clulas del organismo es la de presentar pptidos antignicos para la activacin de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen molculas HLA clase I y su pptido, pertenecen a la subpoblacin de linfocitos citotxicos mientras que las clulas T que reconocen molculas HLA clase II en su la mayora tienen la funcin de producir citocinas (Tabla funciones HLA). Polimorfismo HLA. El complejo mayor de histocompatibilidad posee un nmero extraordinariamente grande de alelos diferentes en cada locus y es uno de los complejos genticos ms polimrficos que se conocen en vertebrados superiores. Estos alelos difieren en sus secuencias de DNA de una persona a otra y en el nmero de aminocidos entre los alelos. El anlisis de genes de ha revelado mas de mil alelos para HLA clase I y ms de 500 para clase II. Este enorme polimorfismo da como resultado una gran diversidad de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad dentro de una especie.

Todo ello permite calcular una enorme cantidad de diferentes haplotipos clase I y clase II posibles en la poblacin humana, pero como cada haplotipo contiene genes tanto de clase I como de clase II, las cifras se multiplican para obtener un total superior a 5 x 10" posibles combinaciones de estos alelos. Las variaciones de un alelo a otro no estn distribuidas al azar, sino que se concentran en las regiones de la molcula que estn ms relacionadas en la interaccin de estas molculas con los pptidos antignicos. (Tabla Polimorfismo HLA) Desequilibrio de ligamento El clculo del nivel de polimorfismo calculado segn el nmero de alelos es inferior al que realmente se presenta en a poblacin. Este fenmeno se conoce como desequilibrio de ligamento que corresponde, pues, a la diferencia entre la frecuencia observada para una combinacin particular de alelos y la esperada con base en las frecuencias de los mismos en los distintos individuales. Para explicar este fenmeno, se han propuesto la intervencin de varios procesos que no seran excluyentes los unos de los otros. Uno de ellos es que los haplotipos con representacin mayor en la poblacin actual reflejaran las combinaciones de alelos presentes en los fundadores (esto es por ejemplo lo que ocurrira en la poblacin india de americana). Otra es que se presente como consecuencia de los efectos del proceso evolutivo; por ejemplo, algunas combinaciones de alelos proporcionaran resistencia a ciertas enfermedades y haran que se seleccionaran y estuvieran representadas en mayor frecuencia mientras que otros que podran generar efectos perjudiciales, como mayor susceptibilidad enfermedades autoinmunes, y se expresasen con menor frecuencia debido a un proceso de seleccin negativo. Por ltimo es necesario resalta tambin que en ello puede intervenir el hecho de que unas zonas del DNA sean ms propensas a al entrecruzamiento entre los alelos que otras. Cmo se genera la diversidad de las molculas HLA? Las molculas HLA que una persona expresa estn fijadas en los genes y no cambian con el tiempo como hemos visto parta las inmunoglobulinas en los RCTs que se pueden ir generando de manera dinmica mediante procesos somticos, que incluyen reorganizacin gnica y mutacin somtica de los genes. La diversidad de molculas HLA de una especie proviene del polimorfismo que implica la presencia de mltiples alelos en un locus gentico dentro de la especie humana. La diversidad de molculas HLA en un individuo se debe no solo a la presencia de diferentes genes sino tambin a los diferentes alelos que cada uno de ellos se pueden presentar en cada individuo y muy excepcionalmente a mutaciones acaecidas en los genes del complejo mayor de histocompatibilidad acaecida en el momento de conformarse los genes de la descendencia (Tabla: generacin diversidad HLA). Todo hace indicar que el polimorfismo del CMH evolucion con el objeto de contrarrestar la evolucin de los microorganismos hacia variantes cuyos pptidos no son presentados por las molculas del CMH y evitar de esa manera su patogenicidad una el que infectan al organismo. La lucha entre el individuo y

microorganismos, existen desde molcula mismo origen del mismo dado que los microorganismos existen desde antes que el propio individuo, Obviamente si se evade la presentacin antignica de los microorganismos, stos adquieren la capacidad de establecer una infeccin sin ser detectados por el sistema inmune. Por lo tanto, el sistema inmune ha ido mutando los genes del CMH para generar una alta variabilidad en el sitio de unin al pptido de manera de anular la posibilidad de los microorganismos de generar variantes cuyos pptidos no son presentados por las molculas del CMH. Esta presin de seleccin hizo que la frecuencia de sustituciones de secuencias en diferentes alelos del CMH sea muy superior a lo esperado si el proceso fuera una simple introduccin de mutaciones al azar. Sin embargo muchos virus han desarrollado mecanismos de escape del sistema inhibiendo la expresin de molculas HLA y que hay que tratar con IFN por su capacidad de aumentar la expresin de las mismas y as combatir ele efectos potencialmente deletreos de los mismos. Factores inductores de la Generacin de polimorfismo La diversidad en las molculas HLA se va generando de manera permanente aunque lenta han influido mltiples factores y circunstancias. Entre ellas destacona grmenes frente a los cuales tiene que defenderse el individuo y tambin parecen ser decisivos otras fuerzas naturales como son el hecho de la reproduccin sexual y la eleccin de pareja que ello conlleva y que la implantacin embrionaria en el tero es ms factibles en embriones mas heterocigticos as como la progresin del embarazo presentan menos complicaciones feto heterocigticos que homocigticos. Efectivamente, a mayor cantidad de alelos, mayor ser la variabilidad y posibilidades de unin de los distintos pptidos a las molculas HLA. Esto trae como consecuencia que la respuesta inmune mediada por linfocitos T contra cualquier agente patgeno ser ms amplia y eficiente y en consecuencia ms ventajosa la capacidad de defensa a mayor polimorfismo lo que les da a las personas ms poliformas ms posibilidades de sobrevivir ante plagas o infecciones concretas y de la evolucin. Todo ello justifica que al correr del tiempo desaparecen de las poblaciones con menos capacidad de defensa (por ejemplo en una plaga en la antigedad) y slo sobreviven los ms aptos. Por ejemplo al paludismo, sobre todo a la forma grave o el mayor grado de progresin a SIDA de las personas infectadas por el virus HIV que son homocigticas en relacin a las heterocigticas.

Tipaje HLA. Se denomina tipaje HLA, al anlisis que se realiza en el laboratorio para conocer las molculas de histocompatibilidad o los alelos HLA de un determinado individuo mediante mtodos serolgicos o de sus genes por biologa molecular (Figura Tipaje HLA) El tipaje HLA tiene especial inters en las siguientes situaciones:

Estudio de la asociacin con distintas formas clnicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente est asociada a DR3 y DR4 En trasplantes de rganos y medula sea y en Estudios de filiacin familiar. La mayora de los genes del HLA son altamente polimrficos, como ya se explic en el apartado anterior, y cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a nivel genmico. As se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA.

Mtodo Serolgico. El mtodo serolgico ms comnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una poblacin de linfocitos a una batera de sueros o anticuerpos monoclonales que son especficos para cada uno de los antgenos posibles. Posteriormente se aade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero especfico para los antgenos de un individuo determinado, se producir la lisis celular que podr ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una tcnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etdio. El bromuro de etdio se fija al ADN de las clulas muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que tie a las clulas vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular (Figura Tipaje serolgico) Para llevar a cabo la tipificacin de los antgenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas clulas los antgenos de clase II se expresan ms abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las clulas T expresan cantidades significativas de molculas MHC de clase II slo cuando estn activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de linfocitos totales a travs de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las clulas B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulacin mecnica de la columna de la que previamente se han eliminado, por lavado, las clulas no adherentes. Existe a su vez, otro mtodo ms utilizado y menos perjudicial para la separacin de las clulas B que consiste en el uso de microesferas magnticas acopladas a anticuerpos contra antgenos especficos de estas clulas (el antgeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego stas se separan en un campo magntico (con un imn) y se lavan para proceder a su tipificacin por serologa. Mtodos de Biologa Molecular Las tcnicas de biologa molecular ms usadas (no las nicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los mtodos de: a. Secuenciacin directa del ADN. b. Anlisis del tamao de los fragmentos de restriccin del ADN (RFLP restriction fragment lenght polymorphism). c. Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). La secuenciacin directa del ADN no es prctica para

su uso rutinario. Actualmente son utilizadas tcnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR. La tcnica de RFLP incluye la fragmentacin del ADN con enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibridacin con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con istopos radiactivos o con enzimas y la deteccin del producto por autoradiografa, quimioluminiscencia o colorimetra. La tcnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas horas (ver captulo sobre mtodos inmunolgicos). Las tcnicas que actualmente ms se utilizan para realizar tipaje HLA son PCRSSO y PCR-SSP. La PCR-SSO (Figura Tipaje por biologa molecular) se basa en la amplificacin de la zona polimrfica del ADN por PCR, hibridacin con oligonucletidos especficos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la tcnica de PCR-SSP (Primers especficos de secuencia) slo se consigue amplificacin en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son especficos por lo tanto lo nico que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. Regulacin de la expresin de los genes del MHC En la parte 5' no traducida de los genes se encuentran las reas reguladoras (llamadas elementos cis) constituidas por el promotor (rea estrictamente necesaria) y los aumentadores e inhibidores que modulan la expresin basal de los genes. El promotor suele estar situado a una distancia de unas 300 bases desde el inicio de la transcripcin, mientras que los aumentadores o inhibidores se encuentran a distancias variables. Sobre estas reas cis se fijan unas protenas llamadas factores de transcripcin (elementos trans) que son necesarios para que se active la polimerasa II, enzima que inicia la transcripcin. En muchos casos, la induccin de la expresin de los genes se debe a modificaciones posttranstraducionales de estas protenas como son la fosforilacin o la glicosilacin. Hasta ahora no se conoce el mecanismo exacto de la expresin de los genes de clase I y II aunque se han descrito algunos de sus elementos cis y trans. Los genes de clase I y -2-microglobulina tienen regiones cis muy parecidas y su expresin est coordinada. Se han detectado tres regiones cis en el promotor a las que se unen factores de transcripcin y que se llaman aumentadores A y B y entre ellos el IRE (elemento de respuesta al interfern) (Figura Regulacin genes). Adems, existen dos inhibidores en dos regiones a unas -700 y -400 bases. Sobre las reas cis se unen factores de transcripcin que no son especficos del promotor de clase I, sino que regulan muchos genes. En la regin I del aumentador A se une RXRb que es un elemento de la familia de los receptores de la hormona tiroidea y del cido retinoico y que se une a AP-1 (Protena Activadora 1) que es un complejo de los oncogenes jun y fos originando un heterodmero

que aumenta su afinidad por el DNA. En la regin II del aumentador A se une el NF-kB (Nuclear FactorkB). En la regin IRF se unen protenas que se inducen por efecto del interfern y que se fosforilan por una tirosina qui- nasa. Por ltimo, en el aumentador B parece que se unen protenas del grupo AP-1 que responde a la induccin con AMP cclico. En el promotor de todos los genes de clase II y de todas la especies descritas, existen tres reas con secuencias que tienen una gran homologa entre los genes y que se denomina X, Y y W separadas entre s por unas 20 bases. Estas reas son esenciales para la transcripcin (elementos cis) y sobre ellas se unen una serie de factores de transcripcin. La caja Y contiene una secuencia CCAAT sobre la que se une el NFY (Nuclear Factor Y) compuesto por dos protenas A y B, ambas se requieren para una unin eficiente al DNA. Sobre la caja W se une un factor no caracterizado hasta ahora y sobre la caja X, dependiendo del extremo 5'(X 1 ) se han descrito protenas RF-X y NF-X y sobre el extremo 3'(X 2 ) se unen hXBP y el complejo AP-1 (fos-jun) aunque estas interacciones con el DNA no estn muy claras. La distancia crtica que separa estas cajas sugiere que los factores de transcripcin que se unen a ellas interaccionan dando lugar a que se inicie la transcripcin. Sin embargo, no sabemos que es lo que hace que se induzca clase II por efecto del gamma-interfern o porque en algunos casos la induccin de clase II sea constitutiva. Otros genes del sistema HLA. Situados en el complejo HLA se encuentran un grupo de genes que codifican tanto el componente Bf de la cascada alternativa del complemento, como los componentes de la va clsica C2 y C4 que se estudian en el captulo dedicado al complemento. Otros genes de esta regin y de inters en la respuesta inmune son los genes que codifican Las formas y del factor de necrosis tumoral (TNF-) HSP (Heat Shock Protein) lmp que codifican los componentes del proteosoma y TAP1 y 2 que son protenas transportadoras. Estas estructuras como veremos en el captulo 6, poseen una gran importancia en la funcin de procesamiento antignico asociada a las molculas del MHC. Tambin dentro del sistema HLA e ntimamente relacionado con los genes anteriores, se encuentran los genes que codifican la enzima 21-hidroxilasa, que participa en el metabolismo de ciertas hormonas sexuales. Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el ratn. El complejo mayor de histocompatibilidad en el ratn se ha llegado a conocer despus de diversos procesos de recombinacin gentica de ratones hasta la obtencin de cepas recombinantes (Figura Ratones recombinantes). Incluye varios loci, entre ellos los K, IA, IE, S y D y como en el humano, cada locus contiene uno de varios genes alternativos.

Como en el humano, los genes H-2 se heredan en bloque (como haplotipos), son codominantes y se segregan siguiendo las leyes de Mendel (Figura ratones recombinantes). En la (Tabla Haplotipos H-2) se muestran los distintos haplotipos H-2 de las cepas murinas ms comunes y en la Figura 5.16 se compara la organizacin del complejo de histocompatibilidad murino con los de otras especies. Mecanismo de polimorfismo generacin de

El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolucin a lo largo de miles de millones de aos como consecuencia de la presin evolutiva ejercida por los agentes infecciosos. Para la generacin de este elevado polimorfismo el MHC ha utilizado diferentes mecanismos que han contribuido de diferente forma a la creacin de nuevos alelos. As, algunos son el resultado de mutaciones puntuales mientras que otros proceden de la combinacin de secuencias completas entre diferentes alelos, bien mediante un proceso de recombinacin gnica o bien mediante el proceso denominado conversin gnica, segn el cual una secuencia es reemplazada por otra semejante de un gen homlogo. La recombinacin entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo ms frecuentemente utilizado para la creacin del polimorfismo y as muchos alelos diferentes pueden proceder de procesos de recombinacin repetidos a partir de un pequeo nmero de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la funcin de los antgenos de histocompatibilidad. Ventajas y desventajas aportadas por polimorfismo HLA Para un individuo, la ventaja de tener mltiples genes del CMH de clase I y de clase II es que estos genes aportan diferentes especificidades de unin a los pptidos, lo que permite que se pueda presentar un mayor nmero de pptidos derivados del patgeno durante cualquier infeccin determinada. Esto

mejora la potencia de la respuesta inmunitaria contra el patgeno al aumentar el nmero de linfocitos T especficos del patgeno activados. El mismo argumento es vlido para el polimorfismo de cualquier locus determinado del CMH; la ventaja de ser heterocigoto es que pueden ponerse en juego dos especificidades diferentes de HLA, en comparacin con una sola en el caso del homocigoto. Adems, el alto grado de polimorfismo de los isotipos presentadores de antgeno del HLA asegura que la mayora de los miembros de la poblacin sean heterocigotos. Sin embargo, la magnitud de la ventaja de ser heterocigoto variar de acuerdo con la diferencia de especificidades de unin a los pptidos de los dos alotipos. Puede suponerse que este tipo de ventaja surge de una seleccin compensadora porque acta para mantener una variedad de isoformas del CMH en la poblacin al tener ms posibilidades de sobrevivir. Ejemplos de este fenmeno de distribucin selectiva de un determinado alelo que confiere ventajas evolutivas al antgeno en una poblacin son frecuentes. Veamos por ejemplo lo que ocurre en oeste de frica don del el paludismo es endmico y mortal en algunos casos. Pues bien se ha visto que los individuos de dichas zonas suelen enfermarse desarrollando un cuadro leve de la enfermedad lo que no ocurre con los individuos de otras zonas o endmicas para el paludismo de frica. Hoy sabemos cmo esta resistencia est ligada antgeno la presencia de una molcula HLa clase I, HLA-Bw52, que se encuentra en muy alta proporcin en las regiones arriba indicados y por el contrario en muy baja proporcin en otras regiones en donde el paludismo no es endmico. (Tabla Ventajas y desventajas del polimorfismo) As los individuos que no tiene este antgeno moriran ms fcilmente antes de procrear, con lo que al pasar el tiempo solo sobreviviran los ms aptos, que son los que posen la molcula HLA-Bw53 que como decimos confiere la capacidad de defensa frente al paludismo. En suma se ha efectuada una seleccin positiva del antgeno HLQA-Bw53 que ha hecho que se mantengan en la poblacin debido antgeno que proporciona una clara ventaja evolutiva en las regiones donde el paludismo es endmico. Una cuestin interesante es lo que ocurre con las enfermedades reumtica tan ampliamente ligas a genes de del CMH y es que no estn influyendo en un proceso de seleccin negativa de la poblacin que los porta. Una explicacin a ello deriva del hecho de que la manifestacin de estas enfermedades es tarda (habitualmente pasados los 35-40 aos) fecha ya en donde se ha realizado la seleccin de pareja y esta ha procreado. En este mismo sentido es de destacar que incluso se observa una seleccin favorecedora de procesos autoinmunes (reumticos sobre todo) y ello tiene su explicacin en el hecho de que el haplotipo mas autoinmuntiario es a la vez el haplotipo con mayores potencialidades defensivas frente a la infeccin como es en la actualidad la epidemia actual de infeccin por VIH proporciona una oportunidad nica para estudiar los efectos del polimorfismo del HLA sobre una enfermedad infecciosa. As se sabe que el carcter de heterocigoto para el HLA proporciona grande ventajas (Figura: Sida y HLA). Como desventajas del polimorfismo HLA cabe destacar el mayor nmero de enfermedades autoinmunes presentadas en estos individuos, los inconvenientes de la realizacin de trasplantes por incompatibilidad entre donante y receptor y la dificultad en el generacin de vacunas de tipo celular (Tabla: ventajas y desventajas polimorfismos HLA). Asociacin entre HLA y enfermedad

Desde hace varias dcadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociacin cuando tiene un valor estadsticamente significativo, se viene considerando como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer una determinada enfermedad. Esto puede cifrarse estadsticamente como riesgo relativo (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen. Efectivamente, a pesar del alto polimorfismo de las molculas HLA y de la ampliacin del nmero de subtipos allicos de clase I y de clase II, hoy se conocen diversas enfermedades que estn asociadas a clase I y otras a clase II. El nmero de enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II (Tabla Enfermedades asociadas) Las causas de esta asociacin HLA y enfermedad no son conocidas completamente. Por ejemplo en espondilitis anquilopoytica (EA), enfermedad invalidante y que afecta a las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociacin con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos pptidos antignicos de origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 especficamente que inducira fenmenos de autoinmunidad, bien por generar en la molcula B27 modificaciones conformacionales que la haran no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-pptido con cierta similitud con antgenos bacterianos que provocaran reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLA-B27, previamente sensibilizados a tales antgenos bacterianos. En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destruccin selectiva de los islotes de Langerhans del pncreas, con infiltracin linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antgenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.

Procesamiento y presentacin de antgenos

Los linfocitos, las nicas clulas con receptores especficos para antgenos, son responsables de iniciar y llevar a cabo la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos B interaccionan con el antgeno mediante su receptor (BCR), una inmunoglobulina de membrana (mIg) que reconoce determinantes antignicos tridimensionales en protenas y otras molculas antignicas, solubles o particuladas, en estado nativo. En cambio, el receptor clonotpico de los linfocitos T (TCR) reconoce complejos moleculares en la membrana de las clulas presentadoras de antgeno (APC), formados por molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I (MHC-I) o de clase II (MHC-II) y pptidos antignicos resultantes de la degradacin intracelular del antgeno. Las clulas T, por tanto, a diferencia de los linfocitos B, necesitan de clulas presentadoras de antgeno (APC) accesorias que captan el antgeno, lo procesan y lo presentan en la membrana. El TCR interacciona molecularmente con el pptido contenido en la cavidad de las molculas del MHC y con las propias molculas presentadoras, de forma que

el reconocimiento del antgeno por el linfocito T, tal como se ha visto en captulos anteriores, queda restringido por el MHC (Figura 6.1). El fenmeno de la restriccin por el MHC del reconocimiento de antgeno fue originalmente descrito por Zinkernagel y Doherty (1974) en la respuesta de los linfocitos T al virus de la linfocoriomeningitis (LCV). Estos investigadores demostraron que las clulas T citotxicas especficas de virus slo reconocen las clulas infectadas si stas expresan determinadas molculas de histocompatibilidad en su superficie. Este trabajo mereci el Premio Nobel de Medicina en 1996. CLULAS PRESENTADORAS DE ANTGENO Y SU FUNCIN Los requerimientos para la presentacin de antgeno de las clulas son: capacidad de captacin de antgenos del medio externo, maquinaria proteoltica eficiente que permita la degradacin del antgeno en pptidos capaces de ser presentados, expresin de molculas de MHC-II y expresin de molculas coestimuladoras y de adhesin. Los tres tipos celulares que cumplen en diferentes grados estos requisitos, llamadas APC profesionales, son las clulas dendrticas, los macrfagos y los linfocitos B. Existen otras estirpes celulares que, an no siendo APCs profesionales, son capaces de expresar molculas de MHC-II bajo determinadas condiciones, tales como clulas endoteliales y fibroblastos. Clulas dendrticas como presentadoras de antgeno. Mientras estn en estado inmaduro, las clulas dendrticas tienen gran capacidad de captacin de antgeno del medio y una maquinaria proteoltica eficiente, expresan bajos niveles de MHC y de molculas coestimulatorias; expresan receptores Fc (CD32), de manosa y de complemento, implicados en captacin de antgeno por endocitosis, fagocitosis y, sobre todo, macropinocitosis. Al activarse su maduracin en presencia de citocinas inflamatorias, aumenta considerablemente su capacidad de macropinocitosis y la expresin de receptores que permiten la captacin de antgeno; tambin se activa la sntesis de molculas de MHC-I y II que unirn con gran eficiencia tanto pptidos originados en la propia clula dendrtica como pptidos externos que se hallan en el lugar de inflamacin. Desde el sitio de la herida, las clulas dendrticas maduras expresan un alto nmero de complejos MHC/pptido de alta estabilidad en su membrana, paran la sntesis de novo de MHC, pierden la capacidad de captacin de antgeno y la expresin de algunos receptores iniciando su migracin los rganos linfoides secundarios (ganglios linfticos, bazo o mucosas). Durante el transporte de los tejidos perifricos a los rganos linfoides por los vasos linfticos, las clulas cambian de morfologa y reciben el nombre de clulas veladas (veiled cells). A su llegada a los rganos linfoides secundarios, las clulas dendrticas maduras se emplazan en las zonas ricas en clulas T (recibiendo el nombre de clulas dendrticas interdigitantes) donde realizan su funcin de presentar pptidos a clulas T especficas que all se encuentren, inicindose as la respuesta inmune contra el agente agresor. Las clulas dendrticas son especialmente eficientes en la activacin y estimulacin de clulas T pre-inmunes, tanto CD8 como CD4. Mediante la unin de pptidos exgenos o endgenos a sus molculas de MHC-I, altamente expresadas, pueden iniciar una respuesta de clulas T CD8+, incluso simultnea a la activacin de clulas T CD4+. Por otra parte, se las ha propuesto como responsables en gran parte del mantenimiento de la memoria T ya que los complejos MHC-II/pptido formados permanecen expuestos en su membrana durante un perodo de tiempo largo proporcionando a las clulas T de memoria un contacto continuado con el antgeno que las ha estimulado en la respuesta primaria. Macrfagos como clulas presentadoras de antgeno Los macrfagos activados en el lugar de infeccin inician un proceso de fagocitosis muy activo mediante receptores especficos, receptores tipo toll (TLR) y receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en los patgenos. Los macrfagos tambin

pueden endocitar antgenos opsonizados con molculas del complemento o anticuerpos, va receptores del complemento o receptores Fc (CD64, CD32, CD23). Los monocitos y macrfagos no activados expresan niveles bajos de MHC-II, en cambio en los macrfagos activados se induce la expresin de molculas de clase II y las molculas accesorias en su superficie que aumentan su capacidad de presentacin de antgeno. Consecuencia de la activacin, los macrfagos secretan quimiocinas que reclutan clulas inflamatorias y citocinas implicadas en la activacin de las clulas T como IL-12 dirigiendo la respuesta adaptativa en las fases iniciales. Linfocitos B como clulas presentadoras de antgeno. Los linfocitos B pueden actuar como clulas presentadoras de antgeno ya que expresan MHC-II constitutivamente, expresin que aumenta cuando se activan, aunque su capacidad de captacin de antgeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son clulas presentadoras muy eficientes si expresan una inmunoglobulina de superficie (BCR) especfica del antgeno. La eficiencia de la presentacin de un antgeno por clulas B aumenta 100-1000 veces cuando el antgeno se internaliza tras su unin con el BCR, permitiendo que un antgeno se presente con gran eficiencia incluso en bajas concentraciones. La presentacin de antgeno a linfocitos T especficos es parte esencial de la completa activacin y diferenciacin de la clula B en clula plasmtica productora de anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la colaboracin de los linfocitos T. La presentacin de antgeno es su forma de obtener esta colaboracin. La interaccin entre clulas T y B especficas del mismo antgeno requiere segundas seales producidas a partir de la interaccin entre CD40 en la clula B y CD40L en la clula T y por la interaccin entre la IL-4 producida por los linfocitos T y su receptor en la clula B. El papel de las clulas B como APC se refuerza en la respuesta secundaria contra el antgeno, ya que existen un mayor nmero de clulas B especficas expandidas durante la respuesta primaria. Clulas presentadoras de antgeno no profesionales. En humanos, las clulas endoteliales expresan molculas del MHC-II y molculas accesorias que aumentan en condiciones de inflamacin y se las ha implicado en la presentacin de antgeno en reacciones de hipersensibilidad retardada en tejidos perifricos. Adems existen otras clulas, como las epiteliales o los fibroblastos que en presencia de citocinas, especialmente IFN-gamma, expresan MHC-II y como consecuencia podran presentar antgeno en determinadas situaciones. Por otra parte, todas las clulas nucleadas que expresan MHC-I pueden presentar antgeno a clulas T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta inmune. CAPTACIN Y PROCESAMIENTO DE ANTGENO Los antgenos deben de ser captados y despus procesados por las APCs. El procesamiento de antgeno es el conjunto de mecanismos de degradacin de antgenos tanto exgenos como endgenos para su presentacin a clulas T una vez unidos a las molculas de MHC de clase II. Captacin de antgenos exgenos Las clulas captan antgeno exgeno por endocitosis, mediada o no por receptor, proceso por el que la clula incorpora en su citoplasma materiales del medio externo. Se distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. Pinocitosis es la captacin de lquido extracelular en el que se hallan los antgenos en forma soluble, llamada macropinocitosis cuando la clula es capaz de captar grandes volmenes de fluido que despus concentra, mecanismo clsico de las clulas dendrticas.

La fagocitosis es un proceso utilizado por fagocitos mononucleares, neutrfilos y otras clulas para ingerir y eliminar partculas de gran tamao, incluidos agentes infecciosos, clulas seniles y restos celulares. La internalizacin de la partcula se inicia por la interaccin de receptores en la superficie de la clula con ligandos de la superficie de la partcula o por simple invaginacin mecnica de la membrana. Procesamiento de antgenos Despus de la internalizacin, la vescula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusin con compartimentos de la va endoctica en varios pasos, que culminan en la formacin de lisosomas. La va endoctica est constituida por distintos tipos de vesculas cuyo contenido se va modificando a medida que van madurando en el interior de la clula. El pH del interior de estas vesculas es bajo y va acidificndose a medida que stas van evolucionando haca lisosomas. Las primeras vesculas de la va endoctica son los endosomas tempranos que evolucionan a endosomas tardos, pasan a prelisosomas y finalmente se transforman en lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los caracterizan. El procesamiento de antgeno consiste en la desnaturalizacin y protelisis de las protenas captadas en las vesculas acdicas. Las proteasas son activas a pH bajo de forma que si tratamos las APCs con agentes lisosomotrpicos que alcalinizan las vesculas endocticas, como la cloroquina o el cloruro amnico, se bloquea el procesamiento, la generacin de pptidos y, por tanto, la presentacin del antgeno. BIOSNTESIS MOLCULAS DEL MHC Las molculas del MHC son glicoprotenas de membrana cuya funcin es presentar el antgeno en forma de pptidos a los linfocitos T en la respuesta inmune. Las molculas del MHC se dividen en dos clases: de clase I y de clase II y, aunque ambas son protenas de membrana, la va biosinttica y de exocitosis que utilizan es distinta e influye en el tipo y origen de los pptidos que presentan. Va biosinttica de MHC-I Las molculas de clase I estn formadas por una cadena pesada (cadena alfa) y la beta-2microglobulina (beta-2-m) cuya asociacin se lleva a cabo en el retculo endoplasmtico (RE) con la ayuda de diversas chaperonas, desde donde siguen la ruta constitutiva de exocitosis hacia la membrana celular. Esto es, las molculas del MHC-I generadas en el RE pasan al aparato de Golgi, despus pasan a travs del trasGolgi y por va vesicular, llegan a la membrana celular (Figura 6.2). Sin embargo, el heterodmero alfa-beta-2-m formado en el RE es inestable en condiciones fisiolgicas y requiere de la unin de un pptido para alcanzar una conformacin estable que le permita la salida del retculo endoplsmico. La cadena pesada a se une a una molcula de 88 kDa llamada calnexina, chaperona de MHC-I por excelencia, que funciona unindose a protenas de nueva sntesis que an no se han plegado o ensamblado correc-

tamente, retenindolas en el RE. Cuando la beta-2-m se une a la cadena a, la calnexina se des- plaza para que MHC-I se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya funcin es parecida a la calnexina. El complejo calreticulina-alfa-beta-2-m se une a una tercera chaperona llamada tapasina que a su vez se une a la subunidad TAP-1 del transportador de pptidos asociado a la membrana TAP (ver ms adelante). Esta asociacin estabiliza a los heterodmeros alfa-beta-2-m parcialmente plegados hasta que se asocian a un pptido (ver fig. va de clase I). Los dmeros TAP, formados por las subunidades TAP-1 y TAP-2 se encargan de transportar pptidos de degradacin citoslica al interior del RE. Cuando TAP proporciona un pptido con afinidad adecuada para poderse unir a la molcula de clase I, se forma el complejo estable MHC-I/pptido, que se separa de las chaperonas e inicia la va de exocitosis hacia la superficie celular, donde queda expuesto el pptido para su posterior reconocimiento por un linfocito T CD8+ especfico. Entrada pptidos al retculo endoplasmtico La mayora de pptidos presentados por MHC-I derivan de protenas citoslicas. Para transportar pptidos al interior del RE, las clulas han adaptado una molcula transportadora de una familia de molculas conocida con el nombre de transportadores-ABC (ATP-binding cassette (ABC)-transporters) encargados del transporte de iones, azcares, aminocidos e incluso protenas. El transportador de pptidos, conocido con el nombre de TAP (Transporter Associated with antigen Processing) est compuesto por dos protenas homlogas, TAP1 y TAP2. El heterodmero TAP1/TAP2 conserva las caractersticas esenciales de los transportadores-ABC: cada cadena contiene 6 dominios transmembrana, es decir, atraviesa 6 veces la membrana del RE, y dos dominios hidroflicos de unin a ATP. Estas dos cadenas se disponen en la membrana con la posibilidad de generar un poro por el que accede el sustrato al interior del RE. El mecanismo de transporte propuesto de los pptidos generados en el citoplasma, es el siguiente: el pptido interacciona con la parte citoplasmtica de TAP provocando la hidrlisis del ATP que induce un cambio conformacional del transportador permitiendo el paso del sustrato al lumen del RE. Las molculas TAP se han descrito en humanos, ratones y ratas. Se ha demostrado una preferencia en el tamao, de 8-12 aa, y de secuencia del pptido transportado, por lo que se ha involucrado a TAP en la seleccin de pptidos que se van a unir al MHC-I. La mayora de los pptidos no se unen a MHC-I y son rpidamente transportados de nuevo al citosol donde son degradados por mecanismos an desconocidos. Los genes que codifican las subunidades TAP-1 y TAP-2 estn dentro del MHC. Protelisis de antgenos en el citosol Los pptidos transportados por TAP se generan por degradacin de protenas en el citosol celular. Existen varios sistemas de degradacin de protenas en el citosol de los cuales el complejo multicataltico llamado proteosoma es el ms directamente involucrado en la generacin de pptidos para clase I. El proteosoma es un complejo proteico multienzimtico de alto peso molecular resultado de la asociacin de distintas subunidades con capacidad cataltica, muy abundante y ubicuo, que se encuentra en arqueobacterias, eubacterias y eucariotas, y en estos ltimos se localiza en el citosol y en el ncleo. Estructuras de este tipo se hallan muy conservadas entre especies: en eucariotas superiores se han descrito proteosoma

formados por ms de 25 subunidades distintas, en levaduras presentan hasta 14 subunidades y en bacterias se ha descrito el proteosoma de Thermophlasma acidophilum, formado por slo 2 subunidades distintas (Figura 6.3). La gran estabilidad de los enzimas en estos microorganismos termoflicos ha permitido la cristalizacin del proteasoma, revelando una estructura en forma de cilindro formado por las subunidades que encaran su centro cataltico hacia el interior. Los dos extremos estn compuestos por subunidades estructurales denominadas alfa. Los dos anillos internos estn constituidos por subunidades denominadas beta y forman una cmara donde se produce la proteolisis. Las protenas citoslicas semidesnaturalizadas se introducen dentro del cilindro quedando a merced de las actividades catalticas de las subunidades del proteasoma. En vertebrados, las subunidades beta-1, beta-2 y beta-5 son substituidas por otras tres: beta-1 i , (LMP2) beta-2 i (MECL-1) y beta-5 i (LMP-7), cuya expresin se modula en presencia de IFN-gamma (inmunoproteasoma). Las subunidades inducibles se sustituyen de forma cooperativa en la estructura del proteasoma dando lugar al inmunoproteasoma. Los genes que codifican para LMP-2 y LMP-7 se localizan en la regin del MHC-II por lo que, igual que en el caso de TAP, se ha sugerido un papel selectivo del inmunoproteasoma en la generacin de pptidos capaces de unirse a MHC-I.

Va biosinttica de MHC-II Las molculas del MHC de clase II estn formadas por dos cadenas alfa y beta que se sintetizan en el RE, a las que posteriormente se une una cadena llamada invariable (Ii), no polimrfica. Los heterodmeros aparecen como agregados transitorios de elevado peso molecular, puesto que una vez se han ensamblado las dos cadenas se forman trmeros de dmeros alfa/beta. Por su parte la Ii una vez sintetizada tambin se dispone en forma de trmero generndose finalmente un nonmero formado por tres molculas alfa/beta/Ii, (alfa/beta/Ii) 3 . La calnexina tambin se une a la Ii en el RE despus de generarse, en cambio los dmeros alfa/beta se unen a otra chaperona llamada BiP (binding protein), miembro de la familia de las protenas de estrs trmico o heat shock proteins (hsp). La cadena invariante se une al dmero disponindose de tal manera que bloquea el sitio de unin de pptido de la molcula MHC-II, impidindose as la asociacin entre pptidos y molculas de clase II en el retculo citoplasmtico. Una vez se ha generado el nonmero (alfa/beta/Ii) 3 , se inicia una va de exocitosis no constitutiva pasando del complejo de Golgi al transGolgi desde donde, (alfa/beta/Ii) 3 se desva a un compartimento de la va endoctica denominado MIIC. La desviacin de los heterodmeros alfa/beta a la va endoctica responde principalmente a una secuencia seal de la cadena invariante, aunque existen evidencias de que tambin las propias cadenas beta de MHC-II tienen secuencias adicionales de desvo hacia los endosomas. En este compartimento (MIIC), correspondiente a la zona intermedia de la va endoctica, entre los endosomas tardos y los lisosomas (Figura 6.4) , se inicia la proteolisis parcial de la cadena Ii quedndose slo unido a alfa/beta la porcin de Ii que ocupa la hendidura de

unin a pptidos, llamada CLIP (class II-associated invariant chain peptide). CLIP se separa de (alfa/beta/Ii) 3 naturalmente, pero el dmero se mantiene estable gracias a la intervencin de una nueva chaperona residente del MIIC, el dmero codificado en el MHC, HLA-DM (o DM, en otras especies). El dmero se separa de DM si se asocia a un pptido capaz de conferirle suficiente estabilidad. El complejo estable MHC-II/pptido viaja a la superficie celular de la APC por va vesicular, aunque los mecanismos precisos no son conocidos (Figura 6.5). Cadena invariante La cadena invariable es una protena de membrana que se une a los dmeros alfa/beta, ocupando el lugar de unin a pptido, impidiendo as la formacin de complejos MHCII/pptido en el RE. Adems, la cadena invariante es la responsable de la desviacin a la va endoctica del complejo nonamrico (al- fa/beta/Ii) 3 y de la retencin en la va endoctica de los agregados inestables que se forman. La Ii se ha descrito en humanos, ratones y rata. En humanos se han descrito 4 isoformas de Ii, resultantes del procesamiento alternativo del RNA, aunque la forma predominante es la denominada p33. La cadena invariante tiene estructura lineal, lo que permite que el fragmento de Ii que se une a la cavidad bloquee perfectamente el acceso del pptido. El fragmento de la cadena invariante que queda unido a la molcula de MHC-II se denomina con el nombre genrico de CLIP (class II-associated invariant chain peptide, ver pargrafo anterior) y ocupa la regin correspondiente a los aminocidos 80 al 104, con variaciones de tamao (Figura 6.6) HLA-DM y HLA-DO El estudio de la regin gnica de clase II en busca de nuevas molculas homlogas a las molculas clsicas MHC-II, condujo al aislamiento de HLA-DMA y HLA-DMB, en humanos, y de H-2 Ma-lfa, H2Mbeta1 y H-2Mbeta2, en ratones. La molcula de DM es un heterodmero integrado en la membrana, formado por una molcula DM-alfa y un Dm-beta. DM se sintetiza en el RE, viaja por el aparato de Golgi y transGolgi desde donde se desva a la va endoctica, donde permanece por un tiempo. A diferencia de las molculas de clase II, HLA-DM no se expresa en la superficie celular, lo que sugiere que dicha molcula acta preferentemente en la va endoctica. En 1994, dos estudios independientes

demostraron que, en ausencia de HLA-DM, las molculas de clase II no podan generar el complejo MHC-II/pptido, sugiriendo un papel esencial en el intercambio entre CLIP y los pptidos ubicados en la va endoctica. HLA-DM se ha definido como catalizador del intercambio de pptidos en la cavidad del MHC-II, aunque parece ser que su principal funcin es de chaperona, mediando la retencin en el MIIC de complejos alfa/beta vacos o asociados a CLIP, hasta que se asocien con un pptido capaz de conferirles alta estabilidad. HLA-DO es otra molcula codificada en la regin de clase II que interviene en la formacin del complejo MHC-II/pptido. HLA-DO es un heterodmero formado por la unin de las cadenas DOalfa y DObeta al que se le ha atribuido un papel regulador de la funcin de DM en algunas clulas, incluyendo el epitelio tmico y las clulas B. Las vas de procesamiento y presentacin de antgeno endgeno y exgeno no son excluyentes. En la clula presentadora de antgeno profesional que expresa tanto molculas de clase I como de clase II, en un estado de infeccin donde existe alta expresin de molculas de MHC y una gran produccin de antgeno extrao, todas las vas de presentacin de antgeno coexistirn en la misma clula para cubrir todas las posibilidades de presentacin de antgeno y combatir ms efectivamente al patgeno. LAS MOLCULAS DEL RECEPTORES DE PPTIDOS MHC COMO

Las molculas del MHC son receptores de pptido que unen pptido por defecto, es decir, necesitan formar complejo con un pptido para convertirse en molculas estables y maduras. En estado de reposo celular, las molculas del MHC estn ocupadas por pptidos propios, endgenos o exgenos. Cuando el organismo es atacado por un agente extrao, como por ejemplo un virus, estos pptidos naturales son desplazados por los pptidos vricos que durante la infeccin sern mayoritarios en el interior de la clula presentadora. Debido al polimorfismo de las molculas del MHC, cada molcula de histocompatibilidad presenta una secuencia distinta en el lugar de unin al pptido lo cual implica que existan preferencias en cuanto al patrn de pptidos que se unirn a cada molcula de MHC. Por otra parte, los pptidos que se unen a las molculas de MHC-I y MHC-II presentan caractersticas peculiares que describen a continuacin (Figura 6.7). Pptidos unidos por MHC-I Las molculas de clase I unen pptidos cortos, de 8-10 aa. En general, cada molcula de clase I puede unir de 2.000 a 10.000 pptidos distintos, pero dichos pptidos presentan restricciones en su secuencia, motivos estructurales especficos de cada alelo. Estas restricciones se limitan principalmente a los aminocidos en posicin 2 y 9 del pptido que son los "puntos de anclaje" a determinados

residuos de la hendidura en la molcula de clase I (Tabla 6.1) Los aminocidos de anclaje se unen en sus cadenas laterales a bolsillos especficos de los sitios de unin de cada alelo. El resto del pptido, los aminocidos del 3 al 8, queda en medio de la cavidad de unin sobre una base de molculas de agua, lo cual da gran plasticidad al complejo. Estos residuos estn involucrados en la interaccin con el TCR. Pptidos unidos por MHC-II Las molculas de clase II, a diferencia que las de clase I, unen pptidos de mayor tamao que oscilan entre 12 y 34 aa, aunque el tamao preferido para todos los alelos estudiados es de 12 a 17 aa. La forma de unin del pptido a la cavidad de unin es tambin distinta. En la hendidura de MHC-II el pptido queda unido por su secuencia central (core), quedando libres los extremos del pptido a cada lado de la hendidura. La variabilidad observada en la secuencia de dichos pptidos tambin se halla sujeta a una cierta restriccin que depende del alelo del MHC-II. Aunque las posiciones de anclaje del pptido a la hendidura no son tan constantes como para MHC-I, los aminocidos en dos o tres posiciones extremas (generalmente, 2 o 4 y 9) de la secuencia central del pptido son las posiciones principales de anclaje al MHC y por lo tanto las que definen el motivo estructural especfico de alelo (Tabla 6.2) Los pptidos que se unen a las molculas MHC-II son mayores que los de MHC-I y varan en longitud. Debido diferencia de tamao de los pptidos aislados, los residuos de anclaje se hallan en distintas posiciones. No obstante, la secuencia interna del pptido se une a la cavidad presenta rasgos comunes: por ejemplo, en el alelo HLA-DR3, los residuos que ocupan la posicin 4 (P4) estn cargados negativamente como el cido asprtico (D) o el cido glutmico (E) y en la posicin 9 (P9) son residuos hidrofbicos como tirosina (Y), leucina (L), prolina (P) o fenilalanina (F).