Elaborado por: Ana Rita Costa N 30926 Joana Filipa Silva N 30940
A Gentica Forense a rea do conhecimento que trata da utilizao dos conhecimentos e das tcnicas de gentica e de biologia molecular no auxlio justia. O Teste de ADN para a justia como telescpio para as estrelas. No uma lio de bioqumica, no uma exibio das maravilhas reveladas por uma lente, mas um modo de ver as coisas como elas realmente so. (Barry Scheck e Peter Neufeld, Actual Innocence)
Palavras-chave: Gentica Forense, DNA, material biolgico, extraco de DNA, anlise de DNA.
ndice
Introduo___________________________________________ Pg. 4
Desenvolvimento_______________________________________ Pg. 5
o o o o o o o
Primeiro caso de aplicao da gentica forense___________ Pg. 6 Material biolgico de interesse biolgico________________ Pg. 7 Tcnicas de extraco de DNA_______________________ Pg. 9 Tcnicas de anlise da amostra de DNA________________ Pg. 10 Dificuldades encontradas e sua resoluo_______________ Pg. 12 Obteno do perfil de DNA_________________________ Pg. 12 Banco de dados criminais___________________________ Pg. 12
Concluso___________________________________________ Pg. 13
Bibliografia__________________________________________ Pg.14
Anexos_____________________________________________ Pg. 16
Introduo
As cincias forenses e criminais desempenham uma funo essencial no sistema de justia, ao fornecer informao cientfica fundamental para a investigao criminal e para os tribunais. O trabalho laboratorial em cincias forenses e criminais direcciona-se para o reconhecimento, identificao, individualizao e avaliao de vestgios fsicos em procedimentos legais, aplicando as cincias naturais. Na gentica forense os marcadores moleculares mais utilizados so os microssatlites autossmicos (tambm conhecidos pela sua sigla em ingls STRs - Short Tandem Repeats). Trata-se de uma rea de investigao cientfica que se dedica a trs tipos de exames criminalstica biolgica (anlise de manchas de sangue encontradas nos locais dos crimes, de smen deixado nas vtimas de crimes de natureza sexual, de plos ou cabelos suspeitos de pertencerem a criminosos); identificao biolgica de parentesco (identificaes de paternidade ou maternidade, entre outros); identificao gentica individual (identificao de um corpo ou de fragmentos de um corpo). A principal e nica responsabilidade dos tcnicos da gentica forense "limita-se a analisar factos, com base nos conhecimentos e rigor cientfico, e a elaborar relatrios para apreciao dos tribunais, que decidiro depois de confrontados outros meios de prova" (Francisco Moita Flores, vice-presidente do IMNL, in Jornal Pblico). Quanto s amostras biolgicas, nas cenas de crimes, as fontes escassas mais encontradas so fios de cabelo, amostras de saliva - no corpo da vtima ou em objectos e smen, restos de clulas de pele sob unhas, gotas de sangue e, em alguns casos, fragmentos de dentes. Dependendo do tipo de catstrofe ocorrida e dos danos causados ao material biolgico a ser colhido para a identificao, as fontes de DNA podem variar, desde sangue, ossos, dentes e tecidos moles, a fios de cabelo. Alm disso, os substratos para anlise podem ser materiais biolgicos decompostos, ou que exijam cuidados especiais nos mtodos de colecta e extraco (Hoff PO, 1999). Visto isto, a Gentica Forense uma rea do conhecimento das cincias forenses que utiliza o DNA para apoiar e auxiliar a Justia a deslindar casos sob investigao policial e/ou do Ministrio Pblico, utilizando conhecimentos e tcnicas de gentica e de biologia molecular, sendo essencial a extraco correcta e adequada de DNA para que a investigao criminal ocorra da melhor forma; estes mtodos sero posteriormente analisados neste trabalho de forma detalhada e individualizada.
De maneira geral, as tcnicas de extraco consistem em desnaturar as protenas que envolvem o ADN. Para isto, utiliza-se uma gama de espcies qumicas. Por exemplo, a mistura de clorofrmio, lcool isoamlico e fenol. Outra forma utilizando uma soluo de cloreto de sdio, que separa os sistemas em uma fase slida e uma fase lquida, onde nesta ltima se encontra o ADN. Existem diferentes mtodos de extraco de DNA, entre os quais: 1. Extraco com Chelex 100 Chelex-100 uma resina que utilizada nas cincias forenses para extrair, de um modo eficaz, DNA de amostras difceis, como por exemplo: de sangue, manchas, ossos, esfregao bucal, plos e cabelos com bulbos, entre outras. O protocolo para extraco de DNA com Chelex 100 foi baseado no mtodo descrito por Coombs: - Em cada tubo adicionado 1 l de proteinase K (20 mg/ml), sendo as amostras incubadas em banho-maria a 55C, durante trs horas, e agitadas gentilmente a cada hora. - Aps esse perodo, a cada tubo adiciona-se 100 l de Chelex 100 a 5% (diludo em soluo de Tris 10 mM e EDTA 1 mM), sendo os mesmos aquecidos a 99C durante 10 minutos sendo, posteriormente, suavemente agitados. - De seguida procede-se centrifugao a 10.600 rpm durante 15 minutos. - Os tubos so novamente aquecidos a 45C por cinco minutos e, posteriormente, foram adicionados 100 l de clorofrmio. - Para finalizar, coloca-se a centrifugar a 10.600 rpm durante 15 minutos.
Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 8
- Aps a centrifugao, retiramos o DNA e colocamo-lo em tubos limpos, que iro ser armazenados a 20C negativos.
2. Extrao com QIAamp DNA minikit
Este mtodo essencialmente utilizado na extraco de DNA a partir de tecidos biolgicos envoltos em parafina. O protocolo para extraco de DNA a partir de material parafinado com o sistema comercial QIAamp DNA minikit o seguinte: - Em cada tubo so adicionados 180 l de Buffer ATL (Tissue Lysis Buffer), juntamente com 20 l de proteinase K. - Aps homogeneizao, as amostras so incubadas em banho-maria a 55C, durante trs horas, e agitadas suavemente a cada hora. - Aps esse perodo, adiciona-se a cada tubo 200 l de Buffer AL, sendo posteriormente aquecidos a 70C durante 10 minutos para a inactivao da proteinase residual. - Em seguida, so adicionados 200 l de etanol, agitando durante 15 segundos e centrifugando durante um perodo reduzido de tempo. - A soluo resultante transferida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. - O dispositivo com a coluna removido do tubo e recolocado em um tubo limpo. - Posteriormente adiciona-se 500 l de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao novo tubo (com a coluna). - O procedimento de lavagem repetido com 500 l de Buffer AW2 (Wash Buffer 2), seguido de uma centrifugao a 14.000 rpm durante trs minutos. - O DNA extrado da coluna adiciona-se 100 l de Buffer AE: numa primeira fase so adicionados 50 l, aguardando-se um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto; em seguida, adiciona-se os restantes 50 l de Buffer AE, aguarda-se cinco minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por um minuto, aps as amostras terem sido transferidas do dispositivo para tubo de recuperao, sendo posteriormente armazenadas a uma temperatura de -20C.
3. Chelex-100, Chelex-100 combinado organicamente (do ingls: Chelex100 Organic Combined) e Chelex-100 combinado com pequenos fragmentos magnticos (do ingls: Chelex-100 magnetism pearl combined) So mtodos utilizados para a extraco de epitlio humano de acordo com cada caso.
PCR, reaco em cadeia polimerase (do ingls, Polymerase Chain Reaction) um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias) de DNA (cido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactria) ou leveduras. Existem sondas unilocais (SLP), que estudam cada locus individualmente, e sondas multilocais, que avaliam muitos loci ao mesmo tempo, conhecidos como impresso digital do DNA (JOBIM et al., 2006 a pud BALAZS, 1993).
Outro ponto importante a ser abordado sobre as limitaes do DNA, principalmente na rea criminal, diz respeito a peculiaridades da anlise. Muitas vezes, qualquer vestgio de roupas coloridas, que possa ser encontrado nas evidncias biolgicas, acaba por inibir a reaco de PCR (BONACCORSO, 2004). Quando a amostra levada a tribunal como prova jurdica, se a evidncia no for documentada, recolhida, embalada e preservada com muito cuidado, ela pode no preencher os requisitos legais e cientficos para ser admitida num tribunal, pois, se ela no for correctamente documentada antes da recolha, a sua origem pode ser questionada e se tiver sido mal recolhida ou embalada, a possibilidade de contaminao aumentar, levando a uma maior possibilidade de discordncia nos resultados da anlise do DNA (LEE e LAAD, 2001). Apesar de certas limitaes da anlise de DNA, deve-se acima de tudo enfatizar a sua importncia como prova extremamente poderosa, se esta for realizada segundo as recomendaes tcnicas exigidas (BONACCORSO, 2004).
Concluso
Os avanos nas tecnologias de DNA surtiram um enorme impacto no campo da cincia forense. Com uma incrvel sensibilidade e um alto poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido uma poderosa ferramenta para a identificao humana e investigaes criminais sendo um dos maiores progressos tcnicos da investigao criminal desde a descoberta das impresses digitais. Existem diferentes tipos de amostras biolgicas para extraco e posterior anlise de DNA sendo as mais utilizadas o sangue (liquido ou sob a forma de mancha seca), smen (colhido na vagina, peas ntimas ou manchas), plos (no qual o DNA est contido na raiz) e os objectos com saliva (a saliva no contm clulas mas nelas podem ser encontradas clulas epiteliais da cavidade bucal, as quais possuem DNA); restos de cadveres, amostras de msculos, ossos e polpa dentria. Devido a esta grande diversidade de amostras forenses existem tcnicas especficas de extraco de DNA dependendo da sua natureza. Assim, a tcnica Chelex-100 utilizada para amostras difceis, como o sangue, manchas, ossos, esfregao bucal, plos e cabelos com bulbos. A extrao com QIAamp DNA minikit essencialmente utilizada a partir de tecidos biolgicos envoltos em parafina; o mtodo Chelex-100 quando combinado com diferentes substncias serve para extrair DNA de outro tipo de amostras biolgicas. As amostras biolgicas merecem especial ateno devido sua susceptibilidade, degradao e contaminao merecendo cuidados especficos e tcnicas adequadas, como exemplo a PCR, sendo mtodos imediatos que requerem apenas uma pequena quantidade de material e podem fornecer identificao no-ambgua de alelos individuais. (DUARTE et al., 2001; GOES et al., 2002). A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise de DNA progrediram a ponto de no colocar em dvida a admissibilidade dos dados sobre o DNA quando adequadamente recolhidos e analisados (DUARTE et al., 2001). No futuro, espera-se que as tcnicas de biologia molecular existentes sejam aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam desenvolvidos, a fim de que a grande maioria dos casos de investigaes forenses cveis e criminais tenham um desfecho que no possa ser questionado nos tribunais.
Bibliografia
Wikipdia, a enciclopdia digital. Disponvel em: http://www.wikipedia.br (palavra-chave: gentica forense) FORTE, Isabel; Gentica Forense ao servio da justia, Jornal Pblico, 200509-07 HOFF PO, Mevag B, Staalstrom E, et al. Extraction of DNA from decomposed human tissue. Na avaliation of five methods for short tandem repeat typing. Forensic Sci. Int., v. 105, p.171, 1999. BEZZERRA, Carlos Csar. Exame de DNA: Tcnicas de colecta em locais de crime. Revista Percia Federal, Braslia-DF, n18. P. 7-14, Jun./Out. 2004. ZAHA, A. Biologia Molecular Bsica, 3 ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003. SILVA, Lus Antnio Ferreira; PASSOS, Nicolas Soares. DNA Forense Colecta de Amostras Biolgicas em locais de crime para Estudo de DNA. Macei: UFAL, 2006. 84p. LIMA, L. O. Direito Mdico Utilizao de Polimorfismo em Anlises Forenses. Edio: 2006. Disponvel em: http://www.geneticafffcmpa.fch.br. DUARTE, F.A.M. CONSELHO NACIONAL DE PESQUISA, Comite sobre tecnologia do DNA como prova forense. Funcep RP, 1999. DUARTE, F.A.M. CONSELHO NACIONAL DE PESQUISA, Comite sobre tecnologia do DNA como prova forense. Funcep RP, 2001. JOBIM, Luiz et al. Identificao Humana pelo DNA in: Identificao humana volume II, Tochetto. D.-coord., Campinas/SP: Millennium, 2006. Parte I p.7-97. CARRAPA, A e tal., Tcnicas de anlise de DNA aplicadas a diagnstico. Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Departamento de Biologia celular e Molecular. Porto, abr. 2005. Disponvel em: http://www.medicina.med.up.pt. BALAZS, I.; Population genetics of 14 ethnic groups using phenotypic data from VNTR loci. In DNA Fingerprinting State of tre Science. S. D. Pena, et all., 1993, p. 194-210. BONACCORSO, N. ANLISE FORENSE DE DNA. Monografia apresentada em 2000 no concurso de Ingresso para Professor da ACADEPOL e actualizada em 2004.
Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 15
CALABREZ, M.C.T. Influncia do calor na anlise de DNA extrado de sangue e tecidos humanos: importncia para a identificao de corpos carbonizados. Tese de doutorado, Universidade de So Paulo, 1999. AMABIS, J.M. & MARTHO, G. R. Identificando pessoas pelo DNA: Uma simulao. Folha de So Paulo. Disponvel em: http://www.fenixonline.com.br/ensino_medio/ivaneia/identificando_pessoas_D NA.pdf. BORM, Aluzio; FERRAZ, Daniel Amin; SANTOS, Fabrcio R. DNA e Direito. Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, Braslia-DF, n22 p.42-44, set/out. 2001. Forensic Science Institute of Public Security Ministry, Beijing 100038, China. The application of three methods combined for extracting DNA from human epithelium. DUARTE, Francisco.A.M.; PEREZ, Augusto.M.; PENA, Sergio.D.; DE BARROS, Margareth. P.M.; ROSSI, Elsie O. A avaliao do DNA como Prova Forense. Ribeiro Preto: FUNPEC. 2001. 283p. LEE, Henrry.C.; LADD, Carll. Preservation and Collection of Biological Evidence. Croatian Medical Journal, v. 42, n. 3, p. 225 - 228, 2001. BOROVIK, C.L.; TAJARA E.; ROCHA J.C.; FARAH L.M.S.; NACCACHE N.F.; NETTO R.C.M.; JOFFE R. Guia de boas prticas laboratoriais em citogentica e gentica molecular humana - comit de normatizao e recomendaes para procedimentos utilizados em laboratrios que prestam servios na rea de gentica humana sociedade brasileira de gentica. Disponvel em <www.sbg.org.br>. Acesso em: 13 nov. 2006. GES, Andra C. S.; SILVA, Dayse , A. DOMINGUES, Cristiane S.; SOBRINHO,Joo M.; CARVALHO, Elizeu F. C. Identification of a criminal by DNA typingin a rape case in Rio de Janeiro, Brazil. Sao Paulo Medical Journal, v. 120, n.3, p. 77 - 80, 2002. ENGER, E., ROSS, F., BAILEY, D. Concepts in Biology. Eleventh edition: McGraw-Hill, 2005.
Anexos
Procedimento de uma investigao forense
Fig. 2 Esquema geral para o teste de ADN para fins forenses. [adaptado de ENGER et al, 2005].
Na fig. 2 est representada os procedimentos adoptados para um caso de violao: Em (a) temos a recolha de smen na vtima e posterior exame. Tambm feita a anlise do ADN a partir de uma amostra de sangue do suspeito. Em (b) so representadas as enzimas de restrio que tm a capacidade de cortar o ADN em lugares especficos onde uma determinada sequncia de nucleotdeos ocorre (nota: tesoura simboliza as enzimas necessrias para a seleco de sequncias especficas). Em (c) esto ilustrados os pedaos de ADN separados pela electroforese. Em (d) mostra-se um padro conhecido como DNA fingerprint.
Licenciatura em Gentica e Biotecnologia Ana Costa e Joana Silva Pgina 18
Observao: os padres oriundos do smen recolhido e do sangue do suspeito coincidem, indicando que o smen do suspeito e que este est ligado ao crime.