Cincias Fsicas e Biomoleculares - IFSC/USP Biologia Molecular Aula Prtica 6 Transformao em bactrias competentes Introduo A tcnica conhecida como

o transformao de bactrias permite a introduo de um plasmdeo na clula bacteriana. Este DNA exgeno passa a fazer parte do material gentico bacteriano que ser herdado pelas novas clulas medida que a bactria se multiplica. As bactrias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma ou mais caractersticas novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibitico. As linhagens de Escherichia coli mais comumente empregadas para construo e propagao de plasmdeos em biologia molecular so DH5 e DH10B. O protocolo que permite a obteno de bactrias aptas a serem transformadas com DNA plasmidial chamado competncia. Basicamente, as bactrias podem ser tornadas competentes atravs de tratamentos qumicos (quimiocompetncia) ou descargas eltricas (eletrocompetncia). Ambos protocolos tm em comum a necessidade de obteno de culturas bacterianas em crescimento exponencial e, a partir desse ponto, diferem de acordo com o mtodo de competncia. O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda no plenamente conhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde as membranas interna e externa da clula bacteriana unem-se formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da membrana bacteriana e dos grupos fosfato da molcula do DNA. Um dos mtodos mais usados para transformao bacteriana o que utiliza cloreto de clcio. Neste mtodo as clulas bacterianas so previamente tratadas com soluo de cloreto de clcio para tornarem-se competentes, ou seja, aptas a receberem DNA exgeno. Todo o tratamento feito sob banho de gelo. O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0C a fluidez da membrana celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, o que dilata os poros da zona de adeso, auxiliando no bombeamento do DNA atravs desses canais. Protocolo de obteno de bactrias quimiocompetentes por cloreto de clcio Ateno: isso j foi feito! s para conhecimento! a) Inocula-se uma nica colnia da linhagem a ser utilizada na transformao em 10 ml de meio LB, incubando-a a 37oC, 250 rpm, 16 horas ou overnigth, se for conveniente;
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b) 1 ml dessa cultura crescida deve ser transferido para 100 ml de meio LB, num frasco estril com capacidade para 500 ml. Incube a 37 oC, 250 rpm, at que a D.O. 600nm atinja 0,375 (pode ser at 0,4); c) Distribua a cultura em 2 tubos de centrfuga estreis gelados, e centrifugue por 7 min. a 1600 x g, a 4 C; d) O precipitado resultante deve ser ressuspenso em 10 ml (em cada tubo) de uma soluo gelada e estril de CaCl2 [60 mM CaCl2; 15% (v/v) glicerina; 10mM Tris-HCl ou HEPES pH 7,0] e centrifugado novamente a 1100 x g, 4 oC por 5 min; e) Repita a ressuspenso do precipitado em 10 ml (em cada tubo) da soluo de CaCl2, e incube 30 minutos em banho de gelo. Centrifugue novamente a 1100 x g, 4 oC por 5 min; f) Cada precipitado deve ser ressuspenso em 2,0ml da soluo gelada de CaCl2 estril; g) Distribua a suspenso em frascos de polipropileno estreis, em alquotas de 100 ou 200l e imediatamente congele em nitrognio lquido, para guard-las a -80oC; h) 50 l devem ser utilizados em cada transformao. Protocolo de transformao bacteriana por choque trmico Obs: todo o procedimento deve ser realizado em um ambiente estril, no nosso caso usaremos o bico de Bunsen. 1) Coloque um microtubo contendo 50 L de clulas competentes de E. coli (linhagem DH5-) no gelo. 2) Com uma micropipeta, adicione toda a reao de ligao s clulas e deixe no gelo por 5 min. 3) Submeta as clulas ao choque trmico: retire rapidamente o microtubo do gelo e coloque por 2 minutos no banho-maria 42C e em seguida, recoloque-o no gelo. 4) Adicione s clulas 500 L de meio de cultura LB (Luria Broth) e incube por 30 min. a 37C, agitando suavemente (150 rpm). 5) Sedimente as clulas por centrifugao a 10.000 rpm por 1 minuto e descarte o sobrenadante. 6) Ressuspenda as clulas, por pitetagem suave, em 100 L de meio LB e plaquei-as: pipete as clulas sobre uma placa de Petri contendo meio LB-gar com 100 g/mL de ampicilina, 0,5 mM de IPTG, 0,1 mg/mL de X-Gal e, com o auxlio de uma ala de Drigalski, espalhe as clulas. 7) Incube a placa invertida em estufa a 37C por 12 a 14 horas. 8) Estoque as placas em cmara fria (4C). Questes I. Qual o resultado esperado deste experimento caso no seja colocado o agente de seleo (ampicilina) nas placas de petri? Porque isso ocorre? II. Qual a necessidade da incubao a 37 C antes de se adicionar a cultura s placas de Petri? III. Qual a funo do IPTG e X-Gal? Se essas substncias no fossem adicionadas, o que mudaria nos resultados?
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