UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES SARA LVIA DA SILVA FERNANDES DA MATTA

CARACTERIZAO MOLECULAR DE CICHLIDAE (ACANTHOPTERYGII; PERCIFORMES) DA BACIA DO ALTO RIO PARAN UTILIZANDO GENE MITOCONDRIAL CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I (COI)

Mogi das Cruzes, SP 2010

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES SARA LVIA DA SILVA FERNANDES DA MATTA

CARACTERIZAO MOLECULAR DE CICHLIDAE (ACANTHOPTERYGII; PERCIFORMES) DA BACIA DO ALTO RIO PARAN UTILIZANDO GENE MITOCONDRIAL CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I (COI)

Dissertao apresentada ao Curso de Psgraduao em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Mestre em Biotecnologia. rea de Concentrao: Taxonomia Molecular

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf Co-orientador: Prof. Dr. Alexandre Pires Marceniuk

Mogi das Cruzes, SP 2010

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DEDICATRIA

Gostaria de dedicar essa dissertao de mestrado aos meus pais Airton e Margarete pelo carinho e incentivo durante todos esses anos, alm de seus esforos para contribuir com minha educao. Dedico tambm a Paola Lumazini de Moraes por me fazer acreditar que tudo possvel e por estar sempre ao meu lado, comemorando cada conquista.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeo a Deus, pois sem Ele no haveriam mritos e conquistas. Agradeo ao meu orientador Prof Dr Alexandre Wagner Silva Hilsdorf pela oportunidade de crescimento profissional e ensinamentos durante esses anos. Aos professores da Ps- graduao em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes, em especial a Prof Dr Maria Santina de Castro Morini que desde o incio confiou em meu trabalho. Ao Prof Dr Cludio de Oliveira da UNESP de Botucatu pela ateno e por auxiliar em minha pesquisa durante esses dois anos. Agradeo tambm por ceder gentilmente s amostras de Cichlidae do Alto Paran. Ao Prof Dr Alexandre Pires Marceniuk por me ajudar na identificao morfolgica da nova espcie de Australoheros e correo da dissertao. Ao Prof Dr Vtor Fernandes Oliveira de Miranda pelos ensinamentos durante minha graduao e ps-graduao e por aceitar fazer parte da banca de defesa. A toda minha famlia, meus pais Airton e Margarete, minhas irms Mariana e Larissa por me ajudar nos dias difceis e estarem sempre ao meu lado. Aos meus avs Lourdes, Osvaldo, Irinia e Durval pelos carinhos e conselhos durante toda a minha vida. A Paola por todos esses anos de carinho e incentivo. Agradeo em especial a Ana Paula e Rogrio, pelos dias de alegria que me ajudaram a esquecer um pouco o mestrado..rs..Aos meus tios Ari, Flvia e Tia L. Agradeo aos meus primos, pelas brincadeiras e risadas. A todos os amigos do Laboratrio de Microbiologia do Ncleo Integrado de Biotecnologia coordenado pelo Prof Dr Wellington. As minhas eternas amigas Nathlia Urizzi, Nathlia Hoff, Lvia e Aline por todos esses anos de cumplicidade e carinho. Agradeo de corao as amigas que fiz para a vida toda, que me ajudaram, me fizeram rir e sempre estiveram ao meu lado: J, Fabi, Karlota, Taty, Corina (C uai), Carol, Tamara (Tat). Vocs so muito especiais. No esquecendo, ao Gustavo pelos grandes conselhos e por me ajudar nas coletas. Agradeo tambm a Lia, que conheci h pouco tempo, mas j me ajudou em vrias situaes.

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A Marisa e Clauber pela amizade e companheirismo, alm claro, das boas risadas. Agradeo tambm a Mrcia, por ter me ajudado financeiramente nos sequenciamentos. A Luisa Simbine pela amizade. A Marie (tcnica do Nib) por ser sempre gentil e prestativa. Enfim, agradeo a todos que de alguma maneira fizeram parte desses anos de luta e conquistas.

Muito Obrigado!!!

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A mente que se abre a uma nova idia jamais voltar ao seu tamanho original".
Albert Einstein

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RESUMO
A taxonomia e a sistemtica tm demonstrado um grande desenvolvimento nos ltimos anos, devido incorporao de tcnicas que utilizam marcas no DNA que diferenciam dois ou mais indivduos, denominados marcadores moleculares. Esses mtodos permitem avaliar as relaes entre os txons assim como a sua histria evolutiva. Recentemente foi proposto um curto segmento de 648 nucleotdeos da extremidade 5 do gene mitocondrial Citocromo c Oxidase I para distinguir e identificar grupos que possuem classificao incerta, alm de alocar as espcies em categorias taxonmicas corretas. Esse gene foi um dos principais componentes da padronizao da metodologia denominada DNA barcoding, cuja finalidade formar alianas internacionais de investigao da diversidade da vida eucaritica por meio da criao de um banco de dados de sequncias parciais de DNA do gene COI, promovendo assim, o processo de automao de identificao das espcies. Deste modo, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar molecularmente s espcies de peixes pertencentes famlia Cichlidae, provenientes da Bacia do Alto Rio Paran, utilizando o gene mitocondrial Citocromo c Oxidase subunidade I, bem como, apresentar evidncias de uma nova espcie de Australoheros para os rios de cabeceiras do Alto Rio Tiet. Foram coletadas de 5 a 10 amostras de tecido de cada espcie de Cichlidae para a extrao de DNA. Posteriormente, o gene COI foi amplificado, utilizando-se os primers Fish-F2 e Fish-R2. Aps a amplificao, as amostras foram sequenciadas, alinhadas com o aplicativo ClustalW e analisadas por meio do programa MEGA 4, utilizando o mtodo de Neighbor- Joining modelo Kimura-2-parameter com bootstrap de 3000 rplicas. Para verificar a existncia de uma nova espcie do gnero Australoheros, foi utilizada a comparao de sequncias do gene Citocromo b com a utilizao dos primers Fish-cytB-F e H15149, alm de estudos morfolgicos utilizando uma srie de medidas e contagens. Para o Alto Paran foram caracterizadas 15 espcies de Cichlidae distribudas em 9 gneros. A divergncia intraespecfica obtida foi de 0,5% com mnimo de 0% e mximo de 1%. J a divergncia mdia interespecfica foi de 19%, com mnimo de 3% e mximo de 30%. Na anlise do gene Citocromo b as divergncias interespecficas para o gnero Australoheros variaram de 3% a 7%. A espcie do Alto Tiet diferencia das demais descritas na literatura por meio de caracteres morfolgicos e moleculares. A menor divergncia foi encontrada entre as espcies Australoheros sp. e Australoheros ribeirae e maior divergncia entre Australoheros sp. e Australoheros scitulus. O caractere morfolgico que mais se destacou foi o comprimento do pednculo caudal em percentagem do comprimento padro, a espcie Australoheros sp. possui maior pednculo em comparao com as demais espcies descritas. Diante destes resultados, podemos inferir que o espcime encontrado no Alto Tiet trata-se de uma nova espcie. Entretanto, estudos complementares sero necessrios para compreender a biologia, comportamento e a morfologia da nova espcie de Australoheros encontrada no Alto Tiet. Palavras-chave: Taxonomia, DNA barcode, COI, Cichlidae, Australoheros.

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ABSTRACT
The taxonomy and systematic have been showing a great development in the last years due to the incorporation of techniques, which use marks on the DNA that differentiate two or more individuals, called molecular markers. These methods allow assess the relationships between the taxons as well as its evolutionary history. Recently, a short fragment of 648 nucleotides from near the 5 of mitochondrial gene cytochrome c oxidase I was proposed to distinguish and identify groups that have uncertain classification, also allocating the species under correct taxonomic categories. This gene was one of the main components of the methodology standardization called DNA barcoding, which aims to form international organizations of the eukaryotic life diversity investigation by creating a database containing partial sequences of gene cytochrome c oxidase subunit I (COI) of mitochondrial DNA, promoting the automation of species identification process. Therefore, the goal of the present study is to characterize fishes of the Cichlidae family sampled of the Upper Paran river watershed by using the mitochondrial gene COI, as well as, to present evidences of a new species of Australoheros genus for the Upper Tiet River. Five to ten tissue samples of each Cichlidae species were obtained for DNA isolation. Then, COI was amplified using the Fish-F2 and Fish-R2 primers. After the amplification, the samples were sequenced, aligned, with the ClustaIW application and analyzed by MEGA 4 program, using the Neighbor-Joining method, Kimura-2-parameter model with bootstrap of 3000 support. To ascertain the presence of a new species of Australoheros in the Upper Tiet River, molecular data by the amplification of cytochrome b sequences with the Fish-cytB-F and H15149 primers, and morphological studies using a series of measures and countings were used. To Upper Paran River, 15 species were characterized and distributed under 9 Cichlidae genus. The average of the intraspecific divergence was 0,5%, ranging from 0% the minimum to 1% the maximum. On the other hand, the average interspecific divergence was 19%, being 3% the minimum, and 30% the maximum. In the analysis of cytochcrome b, the interspecific divergences to Australoheros genus ranged from 3% to 7%. The Upper Tiet species is different from the others described in the published scientific literature because of morphological and molecular characters. The lowest divergence was found between the Australoheros sp. and Australoheros ribeirae species, and the highest, between Australoheros sp. and Australoheros scitulus. The main morphological character was the caudal peduncle length in usual length percentage, the Australoheros sp. species has a bigger peduncle than the other species ones. Based on the present data, we can infer that the species of Australoheros found in Upper Tiet river is a new one. However, additional studies shall be used to understand the new Australoheros new species biology, behavior and morphology, found on Upper Tiet river. Key-words: Taxonomy, DNA barcode, COI, Cichlidae, Australoheros.

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LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 Australoheros facetus: espcie tipo do gnero. Fonte: Fishbase (2009)...................................................................................................25 Figura 2 Mapa ilustrativo dos pontos de coleta dos espcimes de cicldeos da Bacia do Alto Paran............................................................................31 Figura 3 Amostras de DNA de cicldeos em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etdio .................................................................................38 Figura 4 Gel de agarose a 1,5% de amostras de DNA amplificadas com o primer Fish-F2, Fish-R2 para o gene do citocromo c oxidase subunidade 1 (COI) ....................................................................................................40 Figura 5 Divergncia mdia intraespecfica das espcies de cicldeos encontrados no Alto paran ................................................................43 Figura 6 Fenograma das relaes entre as espcies de Cichlidae coletadas no Alto Paran ..........................................................................................45 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Australoheros sp. nova espcie............................................................46 Nmero de espinhos da nadadeira anal ..............................................50 Nmero de raios da nadadeira anal .....................................................51 Nmero de espinhos da nadadeira dorsal............................................51 Nmero de raios da nadadeira peitoral ................................................52 Nmero de rastros no primeiro epibranquial ........................................52 Nmero de rastros no primeiro ceratobranquial ...................................53 Fenograma ilustrando as relaes entre as sequncias do gene mitocondrial citocromo b das espcies do gnero Australoheros .......................................................................................55

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Espcies includas no gnero Australoheros e suas distribuies geogrficas...........................................................................................26 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Amostras dos espcimes coletados na bacia do Alto Paran...............30 Sequncia de primers do gene COI testados nas reaes de PCR......33 Sequncia de primers do gene Citocromo b utilizados nas reaes de PCR. ....................................................................................................34 Tabela 5 Tabela 6 Reagentes utilizados nas reaes de sequenciamento .......................35 Frequncia mdia de bases ( ATCG) do gene Citocromo c oxidase subunidade I (COI)...............................................................................41 Tabela 7 Divergncia entre as espcies de cicldeos da bacia do Alto Rio Paran..................................................................................................43 Tabela 8 Tabela 9 Tabela 10 Dados morfomtricos de Australoheros sp. ..........................................47 Dados mersticos de Australoheros sp... ..............................................48 Divergncias genticas interespecficas do gene Citocromo b entre as espcies do gnero Australoheros.......................................................54

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LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

COI DNA dNTP EDTA MgCl2 L mM ng pb PBS PCR pmol RNA Taq TAE UV

Citocromo c oxidase subunidade I cido desoxirribonucleico Desoxiribonucleotdeo (A, G, C, ou T) cido Etilenoaminotetractico Cloreto de Magnsio Microlitro Milimolar Nanograma Pares de bases Tampo Fosfato de sdio dibsico - fosfato de sdio monobsico Reao em cadeia da polimerase, do ingls Polymerase Chain Reaction Picomol cido Ribonuclico Enzima termoestvel derivada da bactria Thermus aquaticus Tampo Tris-acetato e EDTA Luz ultravioleta

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SUMRIO
1 INTRODUO .......................................................................................................14 1.1 Marcadores Moleculares .....................................................................................14 1.2 DNA Barcoding....................................................................................................16 1.3 Bacia do Alto Rio Paran ....................................................................................19 1.3.1 Caractersticas da bacia do Alto Paran.......................................................19 1.3.2 Diversidade Ictiofaunstica . ..........................................................................21 1.4 Cichlidae..............................................................................................................22 1.4.1 Gnero Australoheros...................................................................................24 2 OBJETIVOS...........................................................................................................28 2.1 Geral....................................................................................................................28 2.2 Especficos ..........................................................................................................28 3 MTODO................................................................................................................29 3.1 Coleta das Amostras ...........................................................................................29 3.2 Extrao de DNA.................................................................................................32 3.3 Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) ...........................................................32 3.4 Purificao do Produto de PCR...........................................................................34 3.5 Sequenciamento..................................................................................................34 3.6 Anlise Estatstica dos Dados .............................................................................35 3.6.1 Anlises Moleculares ...................................................................................35 3.6.2 Estudo Morfolgico do gnero Australoheros ..............................................36 4 RESULTADOS.......................................................................................................38 4.1 Extrao de DNA.................................................................................................38 4.2 Teste para a escolha dos Primers .......................................................................39 4.3 Sequenciamento..................................................................................................40 4.4 Fenogramas e Divergncias Genticas dos Cichlidae do Alto Paran................41 4.5 Nova espcie de Australoheros para as cabeceiras do Alto Rio Tiet ................46 4.5.1 Dados Morfolgicos......................................................................................46 4.5.2 Dados Moleculares.......................................................................................53 5 DISCUSSO ..........................................................................................................56

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5.1 Relaes genticas entre as espcies de Cichildae do Alto Rio Paran.............56 5.2 Australoheros sp. espcie nova ..........................................................................60 6 CONCLUSES ......................................................................................................63 REFERNCIAS.........................................................................................................64

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1 INTRODUO

1.1 Marcadores Moleculares

O conhecimento da diversidade biolgica crucial em qualquer estudo relacionado s cincias da vida, no qual o reconhecimento das espcies assim como a atividade de nome-las fundamental para o estudo do comportamento, evoluo ou qualquer rea relacionada a organismos vivos (SAVAGE, 1995). Primeiramente foram utilizados dados morfolgicos para a identificao das espcies, pois naquele que momento incio eram aos as ferramentas de disponveis Com aos o pesquisadores deram estudos sistemtica.

desenvolvimento de novas tcnicas, o estudo da biodiversidade tornou-se mais amplo e conciso. Uma das primeiras tcnicas a serem utilizadas foi eletroforese de protenas em gis de amido (MANWELL e BAKER, 1963). Sequncias de genes de DNA ribossmico, assim como, de DNA mitocondrial dominaram a sistemtica molecular na dcada de 80 (AVISE, 1994). Desde o final da dcada de 70 muitos pesquisadores comearam a utilizar o DNA mitocondrial em estudos envolvendo estrutura populacional, relaes filogenticas e como ferramenta para compreender os vrios aspectos biolgicos e evolutivos de uma grande variedade de organismos (WILSON et al.1985; AVISE et al. 1987; MORITZ et al. 1987). John Avise reconheceu que divergncias na sequncia do DNA mitocondrial poderiam fornecer registros da histria evolutiva dentro de uma espcie, ligando os estudos da gentica populacional com a sistemtica podendo estabelecer investigaes, esses estudos foram chamados de filogeografia (AVISE et al., 1987). O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido amplamente utilizado nos estudos filogenticos de animais pois, sua taxa de evoluo superior quando comparado com genes nucleares, resultando no acmulo de diferenas entre espcies diretamente relacionadas. A transmisso do DNA mitocondrial garante que as variaes que possam vir a ocorrer sejam geradas apenas por mutaes, ao contrrio do genoma nuclear, em que a variao pode ser introduzida por meio de recombinao (BROWN et al., 1979; MOORE 1995; MINDELL et al., 1997). As

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diferenas que ocorrem nas sequncias so muito maiores entre espcies do que dentro da espcie, podendo deste modo, obter a distino entre grupos taxonmicos. A taxonomia e a sistemtica tm demonstrado um grande desenvolvimento nos ltimos anos, devido incorporao de tcnicas que utilizam marcas no DNA que diferenciam dois ou mais indivduos, denominados marcadores moleculares. Esses mtodos de anlise permitem avaliar as relaes entre os txons assim como a sua histria evolutiva (GRECHKO, 2002). O uso de marcadores genticos tem como objetivo revelar polimorfismos de DNA entre indivduos geneticamente relacionados. Atualmente existem inmeras tcnicas disponveis, sendo que cada uma utiliza uma estratgia particular para detectar tal polimorfismo (SUNNUCKS, 2000). A biologia molecular apresenta uma vasta rea de atuao. Na gentica da conservao tem possibilitado estimar nveis de heterozigose, anlise de estruturas populacionais, endemismo, biodiversidade, identificao e acompanhamento da disperso de espcies invasoras (SOL-CAVA, 2001). Os marcadores moleculares tm demonstrando ser uma ferramenta efetiva para o mapeamento e diagnsticos genticos, taxonomia molecular, anlises da integridade gentica e estudos evolutivos (CARNEIRO et al., 1996). Informaes moleculares so muitas vezes fontes de caracteres que permitem a resoluo das relaes filogenticas e taxonmicas em situaes em que a morfologia no pode resolver. Como exemplo, Sezaki et al. (2005) utilizaram tcnicas moleculares para distinguir duas espcies de enguia a fim de evitar a explorao demasiada e consequentemente o desaparecimento de uma nica espcie. Essas duas espcies so dificilmente distinguveis a partir de suas caractersticas externas, e, alm disso, possuem valores comerciais diferentes. As abordagens da taxonomia molecular podem ser definidas como mtodos baseados na comparao de sequncias de DNA que permitem a distino entre espcimes de acordo com suas variaes interespecficas. Esse mtodo tem apresentado muitas vantagens tais como: (1) os dados podem ser obtidos a partir de um nmero reduzido de exemplares; (2) txons morfologicamente indistinguveis podem ser separados; (3) uma nica tcnica molecular pode ser aplicada a diversos txons (BLAXTER e FLOYD, 2003).

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Revises taxonmicas recentes feitas em aves mostram que espcies reconhecidas s puderam ser definidas, em partes, com base em divergncias nucleotdicas em seu mtDNA (AVISE e ZINK, 1988; GILL e SLIKAS, 1992; MURRAY et al., 1994; BANKS et al., 2003).

1.2 DNA Barcoding

Os

genes

codificadores

de

protenas

mitocondriais

possuem

maior

variabilidade quando comparado com genes ribossomais, por isso, so melhores para distinguir espcies relativamente prximas. Ao mesmo tempo, a anlise entre sequncias de genes mitocondriais so mais simples, pois no apresentam inseres e delees, que so frequentes em genes ribossomais (FOLMER et al., 1994). Devido ao seu aparente melhor desempenho, recentemente foi proposto um segmento de 648 nucleotdeos da extremidade 5 do gene mitocondrial Citocromo c Oxidase I (COI ou Cox1). De acordo com Hebert et al. (2003a; 2003b) esse fragmento seria suficiente, em muitos metazorios, para distinguir e identificar grupos que possuem classificao incerta, alm de alocar os espcimes em categorias taxonmicas. Essa regio possui uma srie de caractersticas consideradas vantajosas para o seu uso como, por exemplo; (1) por ser uma regio curta pode ser obtida facilmente para um grande nmero de txons com uma pequena quantidade de primers; (2) uma sequncia facilmente alinhada; (3) informativa para distinguir espcies prximas, pois possui variabilidade semelhante a outros genes codificadores de protenas (HEBERT et al., 2003a). Esse gene foi um dos principais componentes da padronizao da metodologia, denominada DNA barcoding, que ganhou importncia em 2004 com a criao do Consortium for the BarCode of Life (CBOL), cujo objetivo formar alianas internacionais de investigao da diversidade da vida eucaritica (MARSHALL, 2005), por meio da criao de um banco de dados de sequncias

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parciais de DNA do gene COI, promovendo deste modo o processo de automao de identificao das espcies. Diversos consrcios foram formados para auxiliar no estabelecimento do CBOL, de modo a restringir os grupos de estudo. Por exemplo, The Lepidoptera Barcode of Life um banco de dados de sequncias de COI que auxilia na caracterizao das espcies de borboletas e mariposas; All Birds Barcoding Initiative difundido em 2005, visa reunir dados de aproximadamente 10.000 espcies conhecidas de pssaros de todo o mundo; The Fish Barcode of Life Initiative (Fish-Bol) uma biblioteca eletrnica de referncia que contm sequncias de COI de peixes, tanto de gua doce quanto marinhos. O mtodo de DNA Barcoding usa a divergncia entre sequncias do gene Citocromo c oxidase para facilitar a caracterizao das espcies. Esse estudo tem como objetivo a construo de bibliotecas de referncia para espcies conhecidas. Resultados anteriores mostram que o emprego desse mtodo eficaz para a identificao das espcies, a qual 95% mostraram sequncias de COI distintas (HEBERT et al., 2003b; 2004; WARD et al. 2005; HAJIBABAEI et al., 2007). Tm como vantagens a identificao de espcimes imaturos, espcies extintas, indivduos em diferentes estgios do ciclo de vida e possveis espcies crpticas. A metodologia tem aplicabilidade em grupos de animais como aves, lepidpteras, peixes, moscas entre outros (HEBERT et al., 2003a; HUBERT et al., 2008; WARD et al., 2005; IVANOVA et al., 2007). Em alguns peixes Neotropicais, complicado compreender os processos de especiao que originaram a diferenciao em espcies, devido reduzida variabilidade morfolgica associada a alguns grupos. Nestes casos, estudos moleculares tm um papel fundamental para esclarecer estes problemas de identificao, pois so capazes de mostrar a diversidade gentica presente nesses grupos (TURNER et al., 2004). Segundo Hajibabaei et al. (2007) o DNA Barcode pode auxiliar em outros estudos como na filogenia, taxonomia e na gentica de populaes. Na taxonomia pode ser rotineiramente utilizado para a identificao de espcimes e contribuir para a investigao de espcies sem definio taxonmica. Em estudos filogenticos pode ser um timo ponto de partida para a seleo de txons com ambiguidades filogenticas e a utilizao das sequncias depositadas no banco de dados do Barcode pode ser utilizada para construo de rvores filogenticas. J em Gentica

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de populaes pode oferecer o primeiro sinal de divergncias populacionais e facilitar o estudo comparativo da diversidade populacional de muitas espcies. Alguns grupos taxonmicos no puderam ser prontamente distinguidos at o nvel de espcie como alguns cnidrios bentnicos, grupos de anfbios e algumas espcies de gastrpodes, possivelmente porque esses grupos eram formados por espcies com tempo de divergncia bastante reduzido (WAUGH, 2007). De acordo com Kress et al. (2005) a metodologia de DNA barcode no foi eficiente para Angiospermas pois, a taxa mutacional do COI em plantas mais lenta comparado com animais. Com isso, esses pesquisadores propuseram a utilizao do espaador intergnico trnH-psbA para a identificao de plantas com flores. De acordo com Stoeckle et al. (2005) existe uma srie de obstculos para a aplicao do DNA Barcode entre eles: (1) grupos com baixa diversidade gnica em suas sequncias; (2) espcies que divergiram recentemente; (3) deteco de hbridos; (4) pseudogenes nucleares (Numts), que so cpias inativas semelhantes e at mesmo idnticas de genes em outros lugares do genoma. So identificados quando feita a traduo para sequncias de protenas, e segundo Mallet e Willmott (2003), o tamanho do gene no suficiente para permitir a discriminao entre espcies. Algumas crticas tambm so feitas em relao metodologia de DNA Barcode. De acordo com Lipscomb et al. (2003) DNA Barcoding uma caricatura da taxonomia real, pois reduz a identificao taxonmica a uma tarefa meramente tcnica ao invs de gerar cincia baseada em hipteses. Porm a proposta do DNA Barcoding unir pesquisas moleculares e morfolgicas para o aprimoramento do processo de identificao de espcies (DESALLE et al., 2005). Outras sequncias de DNA tambm foram sugeridas para esse mesmo fim, como dos genes mitocondriais 16S rRNA e Citocromo b, porm, por questes de padronizao e pelo aparente melhor desempenho, o CBOL adotou como sequncia padro o fragmento do gene COI (VENCES et al., 2005). No Brasil, vrios estudos envolvendo DNA barcoding so realizados para diferentes grupos animais, entre eles, estudos com tartarugas marinhas que ocorrem no litoral brasileiro (VARGAS et al., 2009), identificao de espcies de pssaros da famlia Thamnophilidae e Tyrannidae (VILAA et al., 2006; CHAVES et al., 2008), identificao de mamferos como quirpteros (REDONDO et al., 2008) e carnvoros

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(TRIGO et al., 2008) e identificao de espcies novas de peixes (BENINE et al., 2009). Os conjuntos de dados moleculares podem auxiliar em casos onde as caractersticas morfolgicas no conseguem esclarecer relaes a respeito da sistemtica, formando assim hipteses mais consistentes. Pesquisadores que utilizam DNA Barcoding pretendem tornar possvel o uso da metodologia molecular para alocar indivduos em grupos taxonmicos e facilitar a descoberta de novas espcies (MORITZ e CICERO, 2004).

1.3 Bacia do Alto Rio Paran

1.3.1 Caractersticas da bacia do Alto Paran

O Sistema do Alto Paran, uma das bacias hidrogrficas mais importantes do Brasil, possui aproximadamente 900.000 km2 e abrange o norte do Estado do Paran, sul do Mato Grosso do Sul, a maior parte do Estado de So Paulo, sul de Minas Gerais, sul de Gois e uma rea do Paraguai oriental adjacente ao Mato Grosso do Sul, que inclui o Reservatrio de Itaipu, antigamente Salto de Sete Quedas (BONETTO, 1986; BRITSKI e LANGEANI, 1988). A bacia do Alto Paran pertence regio ictiofaunstica do Paran, que inclui o sistema dos Rios da PrataUruguai-Paran- Paraguai representando o segundo maior sistema de drenagem da Amrica do Sul (LOWE-MCCONNELL, 1999). Essa bacia constituda por vrios tipos de fitofisionomias como, Florestas estacionais semideciduais, Cerrados, Florestas Ombrfilas Mistas, Campos Rupestres e Matas de Galeria (HUECK e SEIBERT, 1981). O nvel de conservao da plancie obedece a um gradiente, de acordo com a proximidade de centros urbanos. Quanto maior a aproximao das cidades, maior o nvel de antropizao (AGOSTINHO e ZAHWSKI, 1996), alm de centros urbanos, a bacia do Alto Paran drena regies industriais e agrcolas, constituindo uma regio

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excessivamente explorada. Esse quadro responsvel pelo empobrecimento da fauna, principalmente em relao s espcies de grande porte. Esse impacto assume propores alarmantes apenas em reas restritas da bacia, ou seja, naquelas com maiores concentraes populacionais e industriais na qual os recursos hdricos so imprprios para o consumo ou exigem elevados custos para seu tratamento (AGOSTINHO et al., 2002). Alm disso, mais de 70% da produo hidreltrica do pas gerada nessa regio, devido s inmeras represas presentes nesse local, transformando os principais afluentes do rio Paran (Grande, Tiet, Paranapanema e Iguau) em uma sucesso de lagos artificiais (LOWE-MCCONNELL, 1999). Esses ambientes muitas vezes so representados por reservatrios artificiais, o que aumenta consideravelmente a presena de espcies exticas. Procedimentos como construo de barragens, uso descontrolado de pesticidas e fertilizantes, destruio de florestas, principalmente da vegetao ripria, assoreamentos e introduo de espcies de outras bacias tm afetado fortemente as comunidades de peixes (BLHKE et al., 1978; MENEZES, 1996; CASTRO e MENEZES, 1998). Riachos e cabeceiras so ambientes que devem receber prioridade em estudos relacionados taxonomia, sistemtica, evoluo e biologia das espcies, pois frente ao processo de antropizao, so os primeiros a serem afetados, e como resultado, perdemos muita informao a respeito da real biodiversidade local (CASTRO e MENEZES, 1998; CASTRO, 1999). O Alto Paran uma rea que desde o incio do Tercirio vem sofrendo atividades tectnicas, o que pode explicar os diversos eventos de captura de cabeceiras, como ocorrido entre os rio Paraba do Sul e Tiet (ABSABER, 1998). Esses eventos tambm podem explicar a distribuio de algumas espcies do Alto Paran ocorrer em drenagens vizinhas como o rio Paraba do Sul, Ribeira do Iguape, Rio So Francisco e algumas drenagens litorneas (LANGEANI, 1989; WEITZMAN e MALABARBA, 1999; RIBEIRO, 2006; RIBEIRO et al., 2006; SERRA et al., 2007). De acordo com Malabarba (1998) houve no passado conexes entre o rio Tiet e drenagens costeiras devido a uma antiga adaptao do rio Paraba, essas conexes podem ter ocorrido em outras reas do Alto Paran, sendo necessrios estudos mais aprofundados, como filogeografia, para a melhor compreenso a respeito da diversidade aqutica deste local.

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Diversas espcies comuns so citadas para as pores do Alto Paran, Ribeira de Iguape, rios costeiros do sudeste brasileiro e rio So Francisco (LANGEANI, 1989; OLIVEIRA e BRITSKI, 2000; BRITTO e CASTRO, 2002; OYAKAWA et al., 2005) e de acordo com Serra et al. (2007) foi encontrada uma comunidade caracterstica de peixes do Alto Tiet em riachos litorneos do Estado de So Paulo.

1.3.2 Diversidade Ictiofaunstica

A Amrica do Sul possui a maior riqueza de espcies de peixes de gua doce do mundo, porm, a avaliao e compreenso dessa rica diversidade so afetadas pelo conhecimento incompleto da ecologia, biologia e sistemtica (MENEZES, 1996). Bhlke et al. (1978) estimaram que o nmero de espcies de gua doce neotropicais chegaria a 5000. Vinte anos depois, Schaefer (1998) estima um nmero de 8.000 espcies, representando um oitavo de toda a biodiversidade estimada de vertebrados viventes. Deste modo, devido carncia de informao da diversidade, esto sendo utilizadas metodologias como os marcadores genticos e moleculares para peixes Neotropicais visando o conhecimento de caractersticas de interesse econmico, bem como a preservao de unidades evolutivamente significativas (RYDER, 1986). De acordo com Castro e Menezes (1998) o sistema do Alto Paran, principalmente na regio do Estado de So Paulo possui os maiores rios do Estado. Estes canais so habitados por espcies de mdio a grande porte como curimbats (Prochilodus spp), piaparas (Leporinus sp.), pintados e cacharas (Pseudoplatystoma spp) e jas (Zungaro zungaro). Essas espcies normalmente possuem extensas distribuies geogrficas e importncia na pesca comercial e de subsistncia. Associados a estes rios, existe um grande nmero de riachos e cabeceiras, habitados por espcies de pequeno porte, com distribuio geogrfica restrita, com pouco ou nenhum valor comercial. Essas espcies so dependentes da vegetao

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ripria para sua alimentao, abrigo e reproduo e representam 50% do total de peixes de gua doce descritas para a Amrica do Sul mostrando um elevado grau de endemismo (BHLKE et al., 1978; LOWE-MCCONNELL, 1999). Em inventrio feitos por Langeani et al. (2007) foram encontrados para o Alto Paran 310 espcies de peixes distribudas em 11 ordens e 38 famlias, nmero superior a inventrio feito anteriormente por Bonetto (1986), no qual foram apontadas 130 espcies. Foi observada maior riqueza de peixes da ordem Siluriformes e Characiformes representando cerca de 80% das espcies. A Ictiofauna do Alto Paran constituda, em sua maioria, por espcies detritvoras (ilifagas e bentfagas) e piscvoras, que tambm ocorrerem em grande nmero de indivduos, correspondendo a uma considervel biomassa de peixes capturados (AGOSTINHO e JLIO JR., 1999).

1.4 Cichlidae

famlia

Cichlidae

um

grupo

monofiltico

que

compreende

aproximadamente 1600 espcies vlidas (ESCHMEYER e FONG, 2010). Possui ampla distribuio geogrfica, com representantes encontrados na Amrica do Sul, Central, Cuba, Espanha, em toda a frica, Madagascar, ndia, Sri Lanka, Sria, Israel e Ir (STIASSNY, 1991; CHAKRABARTY, 2006; SPARKS e SMITH, 2004; MARESCALCHI, 2005). A monofilia da famlia suportada por caracteres morfolgicos (ZIHLER, 1982; GAEMERS, 1984; STIASSNY, 1987) e moleculares (STREELMAN e KARL 1997; FARIAS et al., 1999; 2000). O grupo dos cicldeos rico em espcies com taxa de especiao extremamente rpida, formada por peixes altamente especializados (KORNFIELD, 1978; THOMPSON, 1979). So considerados peixes de gua doce secundrios, identificados como um grupo que derivou a partir de espcimes marinhos. Existem casos em que espcies so encontradas vivendo em guas salobras ou nadando em guas marinhas (MURRAY, 2001).

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Cicldeos possuem hbitos diurnos, formam ninhos, possuem cuidado parental dos ovos e larvas e so adaptados aos mais variados ambientes, apesar de ocorrerem com maior frequncia em guas calmas. Em relao ao nmero de espcies, os cicldeos africanos so mais expressivos quando comparados aos cicldeos Neotropicais, que por outro lado, apresentam comportamento, morfologia e ecologia variados (Nelson, 2006). Acredita-se que a diviso entre os cicldeos Sul Americanos e os Africanos aconteceu no cretceo, aps a fragmentao da Gondwanna h mais de 100 milhes de anos (STIASSNY, 1987; NELSON, 2006). Aps terem se instalado na Amrica do Sul, conseguiram atingir a Amrica Central e do Norte, principalmente no Mxico. So encontrados tambm na Europa, como fsseis, e nas Antilhas (MURRAY, 2001). De acordo com Kocher (2004), a partir de um nico ancestral, surgiram aproximadamente 2.000 espcies de cicldeos em pelo menos 10 milhes de anos nos lagos do leste da frica. Essa informao demonstra a rpida taxa de especiao que ocorre entre os cicldeos como um todo. De acordo com Nelson (2006), a famlia Cichlidae taxonomicamente classificada como:

Classe Osteichthyes Sub-Classe Actinopterygii Infra-Classe Teleostei Diviso Euteleostei Infra-Diviso Neoteleostei Super-Ordem Acanthopterygii Srie Percomorpha Ordem Perciformes Sub-Ordem Labroidei Famlia Cichlidae No sistema do Alto Rio Paran os cicldeos so representados pelos gneros Geophagus Heckel 1840, Crenicichla Heckel, 1840; Cichlasoma Swainson, 1839; Australoheros Rican e Kullander, 2006; Satanoperca Gnther, 1862; Cichla Bloch e

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Schneider, 180; Astronotus Swainson, 1839; Gymnogeophagus Miranda Ribeiro, 1918; Oreochromis Gnther, 1889 e Tilapia Smith, 1840 (Langeani et al., 2007).

1.4.1 Gnero Australoheros

O gnero Australoheros pertence subfamlia Cichlasomatinae (tribo Heroini) com espcies encontradas na bacia do Rio da Prata, nos tributrios do rio Paran, rio Paraguai e principalmente no sistema do rio Uruguai. Sua distribuio se estende a oeste na cordilheira dos Andes, na Argentina indo para o leste nas drenagens costeiras do Atlntico, Uruguai e no Brasil, incluindo a drenagem de So Francisco. Pode ocorrer tambm na bacia do rio Tocantins. Sua distribuio superior em comparao a outros cicldeos do grupo Heroini, estendendo-se por todo o continente Sul - americano. o nico gnero dessa tribo que ocorre fora da bacia Amaznica, e apesar de pertencer aos cicldeos Sul - americanos, mais relacionado com os Heroini da mesoamrica e das Antilhas (RICAN e KULLANDER, 2008). um grupo monofiltico suportado por sinapomorfias como o padro de colorao na fase reprodutiva onde se observa a interrupo das listras (5-7) em sua parte mediodorsal e presena de xantforos na base da nadadeira caudal em juvenis (RICAN e KULLANDER, 2006). A interrupo das listras, anteriormente considerada como caracterstica diagnstica para a espcie Cichlasoma facetum, hoje suporta a monofilia do gnero. Rican e Kullander (2006) recentemente descreveram o gnero Australoheros, e a princpio, foram reconhecidas quatro espcies: Australoheros facetus (JENYNS, 1842), Australoheros tembe (CASCIOTTA, GMEZ e TORESANI, 1995), Australoheros scitulus (RICAN e KULLANDER, 2003) e Australoheros kaaygua (CASCIOTTA, ALMIRN e GMEZ, 2006). A Tabela 1 apresenta as espcies que foram posteriormente descritas e suas distribuies geogrficas. De acordo com Rican e Kullander (2008) a biogeografia de Australoheros ao longo do baixo Paran, e na maioria da parte ocidental da Argentina, ainda pouco conhecida, porm

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estudos indicam que Australoheros facetus provavelmente o grupo-irmo de A. guarani. Australoheros facetus encontrado somente em drenagens costeiras do Rio da Prata, mas no ao longo do rio Uruguai (onde Australoheros minuano encontrado). Para as drenagens do Alto Paran, encontramos representantes de A. guarani, e para essa drenagem no so conhecidos os limites de distribuio de A. facetus. A complexidade e a diversidade de formas das espcies, alm da grande distribuio geogrfica, tornam o gnero Australoheros um dos mais diversificados dentro da tribo Heroini (RICAN e KULLANDER, 2008). Em levantamentos ictiofaunsticos at agora realizados para o Alto Paran, foram encontrados para o gnero Australoheros somente a espcie Australoheros facetus (LANGEANI et al., 2007) (Figura 1). Devido s inmeras espcies descritas nos ltimos anos, possvel ainda que existam espcies que no foram descritas, fazendo-se necessrios estudos a respeito da taxonomia utilizando ferramentas moleculares e morfolgicas para o reconhecimento do gnero e estimativa da biodiversidade.

Figura 1. Australoheros facetus: espcie tipo do gnero. Fonte: Fishbase (2009)

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Tabela 1. Espcies includas no gnero Australoheros e suas distribuies geogrficas. Fonte: Eschmeyer (2010).

Espcie
Australoheros forquilha Rican e Kullander, 2008 Australoheros charrua Rican e Kullander, 2008 Australoheros minuano Rican e Kullander, 2008 Australoheros guarani Rican e Kullander, 2008 Australoheros autrani Ottoni e Costa, 2008 Australoheros barbosae Ottoni e Costa, 2008 Australoheros ipatinguensis Ottoni e Costa, 2008 Australoheros macacuensis Ottoni e Costa, 2008 Australoheros macaensis Ottoni e Costa, 2008 Australoheros muriae Ottoni e Costa, 2008 Australoheros paraibae Ottoni e Costa, 2008 Australoheros ribeirae Ottoni, Oyakawa e Costa, 2008 Australoheros robustus Ottoni e Costa, 2008 Australoheros saquarema Ottoni e Costa, 2008 Australoheros taura Ottoni e Cheffe, 2009

Distribuio
Bacia do Alto Rio Uruguai (Argentina e Brasil) Drenagens do Rio Uruguai (Brasil) Mdio e Baixo Rio Uruguai (Brasil e Uruguai) Tributrios do Baixo Rio Paraguai (Paraguai) Bacia do Rio So Joo (Sudeste do Brasil) Bacia do Rio Paraba do Sul, Rio Preto (Minas Gerais) Bacia do Rio Doce (Minas Gerais) Bacia do Rio Macacu (Rio de Janeiro) Bacia do Rio Maca (Sudeste do Brasil) Rio Muria, Bacia do Rio Paraba do Sul (Sudeste do Brasil) Rio do Peixe, Rio Paraba do Sul (Brasil) Bacia do Rio Ribeira do Iguape (Brasil) Crrego da Areira, Bacia do Rio Paraba do Sul (Brasil) Bacia do Rio Mato Grosso, Sistema Lagoa de Saquarema. RJ Bacia do Alto Rio das Antas, Rio Grande do Sul (Brasil)

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Continuao da tabela 1.

Australoheros kaaygua Casciotta, Almirn e Gmez, Bacia do Rio Iguau (Brasil e 2006 Argentina) tributrios do Alto Rio Uruguai (Brasil) Australoheros tembe (Casciotta, Gmez e Toresanni, Bacia do Rio Paran e Rio 1995) Australoheros scitulus (Rican e Kullander, 2003) Australoheros facetus (Jenyns, 1842) Uruguai (Argentina) Tributrios do Baixo Rio Uruguai (Argentina, Uruguai e Brasil) Argentina, Brasil, Chile e Uruguai

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2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Caracterizar por meio de dados moleculares as espcies de Cichlidae da bacia do Alto Rio Paran utilizando gene mitocondrial Citocromo c Oxidase subunidade I; Apresentar evidncias de uma nova espcie de Australoheros para os rios de cabeceiras do Alto Rio Tiet.

2.2 Especficos

Realizar o sequenciamento de segmentos parciais do gene mitocondrial COI para as espcies da famlia Cichlidae encontradas no Alto Paran; Avaliar o desempenho das sequncias do gene COI para a caracterizao das espcies de peixes; Apresentar evidncias de uma nova espcie de Australoheros para a bacia do Alto Rio Tiet utilizando dados moleculares e morfolgicos.

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3 MTODO

3.1 Coleta das Amostras

Amostras de tecidos foram adquiridas em colaborao com o Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes do Prof Dr Cludio de Oliveira da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho campus Botucatu. Os mtodos de coleta utilizados na captura dos espcimes incluram a tcnica de pesca eltrica, redes de espera incluindo pus, vara e anzol. Aps a obteno dos indivduos, partes da nadadeira e msculo foram retirados e conservados em etanol 95%, e os indivduos posteriormente fixados em formol 10% para futuras anlises morfolgicas. Foram adquiridos de 5 a 10 amostras de tecido de cada espcie para posterior extrao de DNA. Os espcimes foram coletados na bacia do Alto Rio Paran em diversas localidades conforme apresentado na Tabela 2. A Figura 2 indica as localidades das coletas ao longo do Alto Rio Paran.

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Tabela 2. Amostras dos espcimes coletados na bacia do Alto Rio Paran

Espcie

Nmero do Lote/ n de acesso do tecido

LBP 6712 (31750)

Localidade

Data

Crenicichla haroldoi Crenicichla britskii Crenicichla sp. Crenicichla sp. Crenicichla sp. Cichla piquiti Cichla kelberi Cichla sp. Cichlasoma paranaense Australoheros riberae Australoheros sp.

Geophagus brasiliensis Geophagus brasiliensis Oreochromis niloticus Tilapia rendalli Astronotus crassipinnis Satanoperca pappaterra

Rio Paran/Bacia do 01/VII/2008 Prata LBP 5218 (26402, 26403, Rio Paran/ Rio do Prata 31/X/2007 26404, 26405, 26459, 26460, 26461) LBP 6421 (29973, 29974, Rio Tibagi/ Bacia do 05/VI/2008 29975, 29976, 29977) Prata LBP 2593 (17219, 17220, Rio Tiet/Miraluz- SP 17/II/2005 17221, 17222, 17223) LBP 2993 (19658, 19659, Rio Tiet/Rio Paran 23/IX/2004 19660) LBP 6720 (32030) Rio Paran/Bacia do 01/VII/2008 Prata LBP 5192 (26758, 26695, Rio da Prata/ Rio Paran 31/X/2007 26693, 26696, 26692) LBP 3492 (20147, 20148, Rio Tiet/Rio Paran 01/I/2006 20149, 20150, 20151, 20152, 20153, 20154.) LBP 5001 (32210, 32211, Rio Grande/Rio Paran 09/IV/2007 32212, 25905, 25906, 25907) LBP 4630 (34801, 34802, Jaguary/ Ribeira de 17/XI/2008 34803, 4630, 35523) Iguape (6b30, ID62, ID81, ID83, Cabeceiras do Alto Rio 2008/2009 ID94, ID96, ID102, ID109, Tiet ID112, ID116, ID117, ID120, ID157. LBP 5950 (28089, 28090, Rio Grande/ Bacia do 10/I/2008 28091, 27917, 27919) Prata 1B02, ID46, 5B36 Rio Tiet/ Rio Paraitinga/ 24/I/2008 Rio Jundia ID155(1), (2), (3), (4), (5) Rio Tiet/ Reservatrio X/2009 Jundia ID154 (1), (2), (3), (4), (5) Rio Tiet/ Reservatrio X/2009 Jundia LBP 5193 (26681, 26680, Rio da Prata/ Rio Paran 31/X/2007 26682, 26683, 26684, 26679.) LBP 5194 (26745, 26748, Rio da Prata/ Rio Paran 31/X/2007 26749, 26747, 26746, 26750)

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Figura 2. Mapa ilustrativo dos pontos de coleta dos espcimes de cicldeos da Bacia do Alto Paran. Nota: Cada ponto representa um local de coleta. Fonte: SpeciesLink (2001)

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3.2 Extrao de DNA

Para a extrao do DNA total foram utilizadas partes da nadadeira peitoral e rastros branquiais. Foi utilizado o kit de extrao IllustraTM Tissue&Cells genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com os procedimentos descritos pelo fabricante. O protocolo consiste basicamente na homogeneizao do tecido utilizando tampo PBS (Fosfato de sdio dibsico a 50mM, fosfato de sdio monobsico a 50mM, pH 7,4), lise do tecido para a liberao do contedo citoplasmtico, remoo do RNA, purificao da amostras para a remoo das protenas e posterior precipitao do DNA. Aps a extrao, as amostras foram avaliadas quanto a integridade e concentrao de DNA por meio de gel de agarose a 0,8% em tampo TAE 1X (0.04M Tris-acetato, 0.001M EDTA) corado com brometo de etdio (1mg/mL), digitalizados sob luz UV e por meio de espectrofotmetro (NanoDrop ND-1000).

3.3 Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

Para a amplificao da regio do gene Citocromo c oxidase subunidade I (COI) foram realizadas reaes de PCR contendo DNA template a 50ng/ L, 10pmol de primer, 2,5 mM de MgCl2, 1U de Taq DNA Polimerase, 2,5 mM de dNTP e gua esterilizada para um volume final de 50 L. O programa utilizado para as amplificaes consiste em: 94 por 3 minutos, 94 por 1 minuto, 55 por 1 C C C minuto, 72 por 1 minuto e 40 segundos em um total de 35 ciclos. As reaes C foram realizadas em termociclador (Peltier Thermal Cicler PTC 200-MJ Research). Gis de agarose a 1,2% (70V) foram feitos para verificar as amplificaes e posteriormente digitalizados em fotodocumentador ImageQuant 300 (GE Healthcare Life Sciences), utilizando-se luz UV. Para preparao das reaes de PCR um controle negativo foi usado como indicador da no contaminao das demais

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amostras, sendo que o mesmo preparado com todos os componentes, porm, sem o DNA. As amostras foram preparadas em fluxo laminar com esterilizao do material em raios UV. Foram testados 4 pares de primers do gene COI para a obteno de bandas consistentes. Dois pares foram cedidos gentilmente pelo Prof Dr Cludio de Oliveira da Universidade Estadual Paulista. Os primers testados foram: L6252, H 7271, e L5698, H5934. Outros dois pares foram sintetizados de acordo com Ward et al. (2005) Fish-F1, Fish-R1 e Fish-F2, Fish-R2 (Tabela 3).

Tabela 3. Sequncia de primers do gene COI testados nas reaes de PCR

Primers L6252 H7271 L5698 H5934 Fish-F1 Fish-R1 Fish-F2 Fish-R2

Sequncia 5 AAG GCG GGG AAA GCC CCG GCA G 3 5 TCC TAT GTA GCC GAA TGG TTC TTT T 3 5 AGG CCT CGA TCC TAC AAA GKT TTA GT 3 5 GGG TGC CAA TGT CTT TGT GGT T 3 5 TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3 5 TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3 5 TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC 3 5 ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 3

Para a caracterizao da possvel espcie nova de Australoheros sp. foram utilizados primers do gene Citocromo b (Tabela 4) de acordo com Kocher et al. (1989) Glu-DGL e H15149 e Irwin et al. (1991) Fish-cytB-F e H15915. As condies de amplificao do Citocromo b seguem o protocolo descrito para o gene COI.

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Tabela 4. Sequncia de primers do gene Citocromo b utilizados nas reaes de PCR.

Primers Glu-DGL H15149 H15915

Sequncia 5 TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG 3 5 AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3 5 AAC TGC CAG TCA TCT CCG GGT TAC AAG AC 3

Fish-cytB-F 5 ACC ACC GTT GTT ATT CAA CTA CAA GAA C 3

3.4 Purificao do produto de PCR

Aps a avaliao em gel de agarose, o produto amplificado da regio de interesse foi purificado para a utilizao na reao de sequenciamento. As amostras foram purificadas utilizado o kit GFXTM PCR DNA e Gel Band Purification (GE Healthcare), segundo recomendaes do fabricante. A verificao da qualidade das purificaes foi feita por meio de eletroforese em gel de agarose a 1,5% (65V) corado com brometo de etdio.

3.5 Sequenciamento

O sequenciamento foi realizado segundo o mtodo de interrupo de cadeia (SANGER et al., 1977) utilizando-se o kit DYEnamic ET Terminator premix (GE Healthcare). As reaes foram feitas no Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de So Paulo. O protocolo de preparao da reao de sequenciamento encontra-se na Tabela 5. As condies de temperatura para realizar as reaes foram: 95C por 20 segundos, 55C por 15 segundos, 60C por 1 minuto em um total de 30 ciclos.

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O material foi analisado no equipamento de sequenciamento automtico ABI Prism 3730 (Applied Biosystems). Foram feitas duplicatas de cada amostra para a obteno de sequncias consenso.

Tabela 5. Reagentes utilizados nas reaes de sequenciamento.

Reagentes Amostra de DNA purificado DYEnamic ET terminator Primer (5 pmol/ L) gua ultrapura

Quantidade 1L (Amostra de DNA a 20 ng) 4 L (2 l de buffer tampo e 2 l de prmix) 1 L Completar para 10 L de reao.

3.6 Anlise Estatstica dos Dados

3.6.1 Anlises Moleculares

As sequncias foram editadas utilizando o programa BIOEDIT Sequence Alignment Editor 7.0.9 (HALL, 1999) para a obteno de sequncias consenso. realizado esse procedimento para que a sequncia em estudo seja fidedigna ao representado no genoma, aumentando a confiabilidade dos resultados. As anlises taxonmicas dos dados moleculares para o gene COI foram realizadas com o programa MEGA 4 (TAMURA et al., 2007), utilizando o mtodo de Neighbor- Joining (SAITOU e NEI, 1987) modelo Kimura-2-parameter (KIMURA, 1980) com bootstrap de 3000 rplicas. As sequncias foram alinhadas utilizando o aplicativo ClustalW (THOMPSON et al., 1994).

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Kimura-2-parameter (K2P) o modelo que assume diferentes probabilidades de ocorrer substituies de bases nucleotdicas, ou seja, probabilidades diferentes de ocorrer transies e transverses. Diferentemente, o modelo Jukes Cantor assume que as mudanas de nucleotdeos podem ocorrer aleatoriamente, ou seja, igual probabilidade de ocorrer mudanas de bases. O modelo Kimura-2-parameter foi utilizado por questo de padronizao da tcnica de DNA Barcode. Esse o melhor modelo quando as distncias entre os txons so baixas (NEI e KUMAR 2000). Neighbor- Joining um mtodo para a reconstruo de rvores a partir de uma matriz de distncia e de acordo com o princpio da evoluo mnima (minimum evolution). A distncia entre cada par de espcies a soma dos comprimentos dos ramos que os unem na rvore, combinando os ns da rvore at encontrar uma combinao que fornece a menor soma de comprimento de ramos, resultando em rvores sem raiz denominadas fenogramas (SAITOU e NEI, 1987). J para a anlise das sequncias do gene Citocromo b foi utilizado o mtodo de Evoluo Mnima modelo Kimura-2-parameter com bootstrap de 3000 rplicas. Para o citocromo b foi utilizado esse mtodo, pois a topologia da rvore encontrada corroborou com a divergncia gentica par a par entre as espcies. Foi gerada, contudo, uma rvore de evoluo mnima sem raiz. O mtodo da evoluo mnima estima o comprimento total dos ramos de cada possvel topologia. Depois de avaliar todas as possveis topologias, o mtodo escolhe a topologia com o menor comprimento total de ramos.

3.6.2 Estudo Morfolgico do gnero Australoheros

A anlise morfolgica foi baseada em caracteres morfomtricos e mersticos descritos por Kullander (1987). Adicionalmente, a nova espcie foi diferenciada por meio de dados morfolgicos encontrados na literatura (Rican e Kullander, 2008; Ottoni e Costa, 2008; Ottoni, Oyakawa e Costa, 2008; Ottoni e Cheffe, 2009;

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Casciotta, Almirn e Gmez, 2006; Casciotta, Gmez e Toresanni, 1995; Rican e Kullander, 2003). Foram utilizados os valores mximos e mnimos para a comparao com os dados presentes na literatura. As medidas morfomtricas foram feitas com paqumetro utilizando preciso de dcimo de milmetro, e as contagens foram realizadas utilizando lupa estereoscpica. Aps a obteno dos dados morfomtricos e mersticos, estes foram inseridos em planilhas utilizando o programa Microsoft Office Excel 2003 para a anlise estatstica.

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4 RESULTADOS

4.1 Extrao de DNA

As extraes de DNA utilizando o kit IllustraTM Tissue&Cells genomicPrep Mini Spin Kit, apresentaram pouca degradao e DNA suficiente para a realizao da PCR (Figura 3).

M
23130 pb 9416 pb 6557 pb 4361 pb

Figura 3. Amostras de DNA de cicldeos em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etdio. Nota: M= Marcador -Hind III.

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4.2 Teste para escolha dos primers

Foram testados 4 pares de primers para o gene COI e 2 pares para o gene Citocromo b. Foram avaliados parmetros como reprodutibilidade, intensidade e uniformidade das bandas obtidas. Para o COI, os primers L6252 e H7271 (Oliveira, C. comunicao pessoal), resultaram em bandas de 1000 pb, porm no foi possvel amplificar todas as amostras do lote. J os primers L5698 e H5934 (Oliveira, C. comunicao pessoal.) obtiveram reprodutibilidade, porm as bandas possuam aproximadamente 300 pb, o que poderia representar um pseudogene. J os pares de primers Fish-F1, Fish-R1 e Fish-F2, Fish-R2 (Ward et al., 2005), obtiveram reprodutibilidade para todas as amostras e bandas consistentes de 700 pb. Foi escolhido para a amplificao de todas as amostras o par Fish-F2, FishR2, pois as bandas eram mais intensas no gel comparadas com as bandas utilizando os primers Fish-F1, Fish-R1 (Figura 4). O par de primer escolhido inicia o anelamento no comeo do gene COI, aproximadamente a partir de 40 pb. Para a amplificao do gene Citocromo b foi utilizado o par de primers FishcytB-F e H15149 devido uniformidade e reprodutibilidade das bandas que tiveram resultado superior as bandas amplificadas com o par Glu-DGL e H15915. As purificaes utilizando o kit GFXTM PCR DNA e Gel Band Purification foram satisfatrias, a qual foi possvel obter quantidade suficiente de DNA para posterior sequenciamento.

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600 pb

Figura 4. Gel de agarose 1,5% de amostras de DNA amplificadas com o primer Fish-F1, Fish-R1 para o gene do Citocromo c oxidase subunidade 1 (COI). Nota: M= Marcador 100 pb.

4.3 Sequenciamento

As sequncias aps serem obtidas, foram alinhadas e editadas para a construo dos fenogramas e anlise dos dados de similaridade. Os cromatogramas apresentaram picos definidos e sequncias concisas.

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4.4 Fenogramas e Divergncias Genticas dos Cichlidae do Alto Paran

Aps o sequenciamento e tratamento das sequncias consenso, estas foram analisadas para se obter rvores por meio dos dados moleculares. Foi obtido um total de 89 sequncias do gene COI com 544pb, incluindo 15 espcies dentro de 9 gneros. Dos 544 nucleotdeos foram observados: 304 stios conservados, 235 stios variados e 18 stios nicos. A composio nucleotdica indicou maior quantidade de bases C e T (Tabela 6).

Tabela 6. Frequncia mdia de bases (ATCG) do gene Citocromo c oxidase subunidade I (COI).

Gene COI

A 23,2%

T 29,8%

C 30,3%

G 16,6%

A mdia de divergncia intraespecfica no grupo dos cicldeos do Alto Paran foi de 0,5%, com o mnimo de 0% e mximo de 1%. J a divergncia mdia interespecfica foi de 19%, com mnimo de 3% e mximo de 30%. Para a espcie Crenicichla britskii a divergncia gentica intraespecfica foi de 0%. Espcimes que anteriormente no possuam classificao, representados como Crenicichla sp. tiveram divergncia de 1% a 3%. Para os demais grupos de cicldeos, Crenicichla britskii, obteve divergncia mdia interespecfica de aproximadamente 25%. Cichlasoma paranaense obteve divergncia intraespecfica variando de 0% a 1% com mdia interespecfica de 21,5%. A menor divergncia interespecfica foi para a espcie Cichla sp. (18%) e maior para Tilapia rendalli (25%).

42

Astronotus crassipinnis teve divergncia intraespecfca de 0% e mdia de divergncia interespecfica de 19,5% com menor divergncia para Cichla kelberi (15%) e maior para Tilapia rendalli (24%). As espcies Cichla piquiti e Cichla kelberi obtiveram divergncia mdia de 6%. A divergncia intraespecfica para os exemplares da espcie Satanoperca pappaterra foi de 0%, com mdia interespecfica de 21,5%. A menor divergncia foi observada em relao s espcies de Geophagus brasiliensis com 18% e divergncia mxima para as espcies de Oreochromis niloticus. Dentro da espcie Geophagus brasiliensis a divergncia foi de 0%, com mdia interespecfica de 22,5%. A menor divergncia (18%) foi observada para a espcie Satanoperca pappaterra e maior (27%) para a espcie Crenicichla sp. proveniente do rio Tibagi, Bacia do Prata. A espcie nova de Australoheros sp. comparada com a espcie Australoheros ribeirae tiveram divergncia nucleotdica de 4% e para a espcie Australoheros facetus de 3%. Entre os exemplares de Australoheros sp. a divergncia foi de 0%. A mdia interespecfica foi de 23%, com menor diferenciao para as espcies Cichla sp. e Tilapia rendalli e maior para Crenicichla haroldoi. J Australoheros ribeirae possui divergncia intraespecfica de 0% com mdia interespecfica de 23% com maior divergncia para a espcie Cichla sp. e menor para a espcie Crenicichla haroldoi. Entre os indivduos pertencentes espcie Tilapia rendalli a divergncia nucleotdica foi de 0% e mdia interespecfica de 23%, com menor divergncia para a espcie Australoheros ribeirae (18%) e maior para Crenicichla haroldoi (28%). Oreochromis niloticus tambm mostra divergncia intraespecfica de 0% porm a mdia interespecfica foi de 20,5%, com menor divergncia para Tilapia rendalli e maior para Crenicichla haroldoi. Os dados acima foram sumarizados e apresentados na Tabela 7, o qual mostrado divergncia entre as espcies de Cichlidae coletados no Alto Paran. A Figura 5 apresenta o padro das divergncias mdias interespecficas entre os cicldeos do Alto Paran.

43

Tabela 7. Divergncia entre as espcies de cicldeos da bacia do Alto Rio Paran

Divergncia Mdia Interespecfica dos Cicldeos do Alto Paran

30 Mdia interespecfica 25 20 15 10 5 0 Crenicihla britiskii Cichlasoma paranaense Astronotus crassipinnis Satanoperca pappaterra Geophagus brasiliensis Australoheros sp. Australoheros ribeirae Tilapia rendalli Oreochromis niloticus Cichla piquiti Cichla kelberi

Figura 5. Divergncia mdia intraespecfica entre de cicldeos encontrados no Alto Paran.

44

O fenograma na Figura 6 mostra as relaes entre os cicldeos da bacia do Alto Paran. Cada ramo representa um conjunto de indivduos, exceto os ramos que compreendem as espcies do gnero Crenicichla e Cichla, que esto representados todos os exemplares analisados. As espcies do gnero Australoheros compartilham um clado assim como as espcies Oreochromis niloticus e Tilapia rendalli. O conjunto de espcimes classificados como Cichla sp. podem ser caracterizadas parte como Cichla piquiti e parte como Cichla kelberi. O gnero Crenicichla formou um nico ramo suportado por 90% de bootstrap, havendo separao entre as espcies Crenicichla haroldoi e Crenicichla britskii. Os espcimes Crenicichla sp. de 1 a 11 podem ser classificados como Crenicichla britskii.

45
Crenicichla sp.(ex.17219) 19659 Crenicichla sp.(ex.17221) 19660 Crenicichla sp.(ex.17222) 19658 Crenicichla sp.(ex.17223) 17223 Crenicichla sp.(ex.19658) 17222 Crenicichla sp.(ex.19659) 17221 Crenicichla sp.(ex.19660) 17219 Crenicichla britskii Crenicichla britsk ii (ex.26459) Crenicichla britskii Crenicichla britsk ii(2) (ex.26460) 99 90 Crenicichla britskii Crenicichla britsk ii(3) (ex.26461) Crenicichla sp. (ex.29974) 29973 Crenicichla sp.(ex.29976) 29974 Crenicichla sp.(ex.29973) 29976 Crenicichla sp. Crenicichla sp. (ex.17220) Crenicichla haroldoi Satanoperca pappaterra Geophagus brasiliensis Cichlasoma paranaense Astronotus crassipinnis
20154 sp (ex.20154) Cichla

99

Cichla piquiti Cichla piquiti 20152 sp (ex.20152) Cichla 20151 sp (ex.20151) Cichla 20149 sp (ex.20149) Cichla Cichla k cf. kelberi (ex.26695) Cichla elberi(3)

70

98

Cichla 20147 sp.(ex.20147) Cichla 20150 sp. (ex.20150)

Cichla k elberi(5) Cichla cf. kelberi (ex.26758) Cichla k elberi Cichla cf. kelberi (ex.26692) Cichla k elberi(2) (ex.26693) Cichla cf. kelberi Cichla k elberi(4) (ex.26696) Cichla cf. kelberi

Australoheros ribeirae 100 Australoheros facetus Australoheros sp. Tiet 99 Oreochromis niloticus Tilapia rendalli Figura 6. Fenograma das relaes entre as espcies de Cichlidae coletadas no Alto Paran utilizando o mtodo de anlise Neighbor- Joining modelo Kimura-2parameter. Nota: Ex.= Exemplar. A espcie Australoheros ribeirae no pertence Bacia do Alto Paran. Cada ramo representa mais de um exemplar exceto para as espcies do gnero Crenicichla e Cichla.

0.02

46

4.5 Nova espcie de Australoheros para as cabeceiras do Alto Rio Tiet

4.5.1 Dados Morfolgicos

Nos rios de cabeceiras pertencentes Bacia do Rio Tiet foi reconhecida uma nova espcie pertencente ao gnero Australoheros, a qual foi diferenciada das demais espcies do gnero com base em caractersticas morfolgicas e moleculares. A espcie do Alto Tiet (Figura 7) popularmente chamada de Car-verde, por possuir uma colorao verde tpica. Possui listras interrompidas na poro mediodorsal (perto da cabea), e em juvenis, ocorre presena de xantforos na base da nadadeira caudal. Os dados morfomtricos e mersticos so apresentados nas Tabelas 8 e 9.

Figura 7. Australoheros sp. nova espcie. Fonte: Marceniuk (2009)

47

Tabela 8. Dados morfomtricos em porcentagem do comprimento padro de Australoheros sp. Nota: N = Nmero de indivduos examinados; Min = Medida mnima; Max =Medida mxima.

Medida
Comprimento Padro (mm) Altura do corpo Comprimento da nadadeira peitoral Comprimento da nadadeira plvica Comp. do ltimo espinho nadadeira dorsal Altura do pednculo caudal Comp. do pednculo caudal Comprimento da mandbula superior Comp. da mandbula inferior Comprimento da cabea Comprimento do focinho Dimetro orbital Largura pr-orbital Altura da Cabea Largura interorbital da

N
23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23

Min- Max
27,7 129,5 11,4 61,7 7,2 38,5 7,1 69,6 3,1 20,4 4,4 24,4 4,3 11,3 2,6 16,4 4,1 21,9 10 - 44 3,1 18,3 3,8 11,8 1,2 10,1 9,6 48,1 3 20,8

Mdia
78,5 35,4 23,1 40,3 11,7 7,2 7,2 9,2 12,4 27,6 10,6 8,3 5,3 28,1 10,8

48

Tabela 9. Dados mersticos de Australoheros sp. Nota: N = Nmero de indivduos examinados; Min = Medida mnima; Max =Medida mxima.

Contagens
Espinhos da nadadeira dorsal Raios da nadadeira dorsal Espinhos da nadadeira anal Raios da nadadeira anal Espinhos da nadadeira plvica Raios da nadadeira plvica Raios da nadadeira caudal Raios da nadadeira peitoral Epibranquial Ceratobranquial Total de Vrtebras Pares de costelas Vrtebras pr- caudais Escamas da linha lateral superior Escamas da linha lateral inferior

N
23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23

Min- Max
16 -17 8 - 11 7- 8 7- 8 1 5 22 13- 14 3- 4 9 -10 26 10 14 16- 17 7 -10

Morfologicamente, Australoheros sp. difere de Australoheros autrani por possuir menor nmero de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9), menor nmero de rastros no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 5-6; Figura 12) e menor nmero de rastros do primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs. 14-16; Figura 13). Australoheros sp. pode ser diferenciada da espcie Australoheros barbosae por possuir menor nmero de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9), menor nmero de rastros no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 6-8; Figura 12) e menor nmero de rastros do primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs.15-17; Figura13). A nova espcie difere de Australoheros charrua por possuir maior nmero de rastros no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior nmero de rastros do primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs. 6-8; Figura 13). Australoheros sp. difere das espcies Australoheros facetus e Australoheros forquilha por possuir menor nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7, Figura 12) e maior nmero de rastros do ceratobranquial (3-4 vs. 2; Figura 13). Difere da

49

espcie Australoheros guarani por ter maior nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 8, Figura 13). A nova espcie diferenciada de Australoheros ipatinguensis por possuir menor nmero de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9; Figura 9), maior nmero de espinhos da nadadeira dorsal (16-17 vs. 15; Figura 10) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 13-14; Figura 13). Australoheros sp. difere da espcie Australoheros kaaygua e Australoheros tembe por possuir maior nmero de espinhos da nadadeira anal (7-8 vs. 5-6; Figura 8) e para a espcie Australoheros kaaygua por possuir maior nmero do epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior nmero de rastros no ceratobranquial (910 vs. 6-8; Figura 13). Australoheros sp. diferenciada da espcie Australoheros macacuensis por possuir menor nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7; Figura 12) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 14-15; Figura 13). Difere tambm da espcie Australoheros macaensis por possuir menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 15-16; Figura 13). A nova espcie diferenciada de Australoheros minuano por possuir maior nmero de raios da nadadeira peitoral (13-14 vs. 12; Figura 11), maior nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 6-8; Figura 13). Difere tambm da espcie Australoheros miriae por possuir menor nmero de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9), maior nmero de espinhos da nadadeira dorsal (16-17 vs. 15; Figura 10) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 13-16; Figura 13). Australoheros sp. difere de Australoheros paraibae por possuir menor nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 7-8; Figura 12) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 13-16; Figura 13). Difere de Australoheros ribeirae por possui menor nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 5-7; Figura 12) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 15-16; Figura 13). Difere tambm da espcie Australoheros robustus por possuir menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 13-16; Figura 13). A nova espcie difere de Australoheros saquarema por possuir menor nmero de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9; Figura 9), e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 13-14; Figura 13). Difere da espcie Australoheros taura

50

por possuir menor nmero de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7; Figura 12) e menor nmero de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 15-16; Figura 13). E por fim, difere da espcie Australoheros tembe por possuir maior nmero de espinhos da nadadeira anal (7-8 v.s 5-6; Figura 8).

Nmero de espinhos da nadadeira anal

9 8 8 7 6 5 5 6 7 6 5 4 3 2 1 0

N de espinhos

Australoheros sp. Australoheros kaaygua Australoheros tembe

Espcies
Figura 8. Nmero de espinhos da nadadeira anal.

51

Nmero de raios da nadadeira anal

11 10
N de raios

10 9 8 7 9

10 9

10
Australoheros sp.

9 8 7 6

Australoheros autrani Australoheros barbosae Australoheros muriae Australoheros ipatinguensis Australoheros saquarema

Espcies
Figura 9. Nmero de raios da nadadeira anal

Nmero de espinhos da nadadeira dorsal

18

N de espinhos

17

17

Australoheros sp. Australoheros muriae Australoheros ipatinguensis

16

16

15

15

15

14

Espcies
Figura 10. Nmero de espinhos da nadadeira dorsal

52

Nmero de raios da nadadeira peitoral

15

14 N de raios

14 Australoheros sp. Australoheros minuano 12

13

13

12

11 Espcies
Figura 11. Nmero de raios da nadadeira peitoral

Nmero de rastros no primeiro epibranquial

9 Australoheros sp. 8 7 N de rastros 6 5 4 3 2 1 Espcies Australoheros autrani Australoheros barbosae Australoheros charrua Australoheros facetus Australoheros guarani Australoheros kaaygua Australoheros minuano Australoheros forquilha Australoheros macacuensis Australoheros taura Australoheros paraibae Australoheros ribeirae

1500 pb Nmero de rastros no primeiro epibranquial Figura 12.

53

Nmero de rastros do primeiro ceratobranquial

18 17 16 15 14 N de rastros 13 12 11 10 9 8 7 6 5 Espcies Australoheros sp. Australoheros autrani Australoheros barbosae Australoheros ipatinguensis Australoheros muriae Australoheros charrua Australoheros kaaygua Australoheros minuano Australoheros guarani Australoheros macacuensis Australoheros paraibae Australoheros robustus Australoheros ribeirae Australoheros taura Australoheros macaensis Australoheros saquarema

Figura 13. Nmero de rastros do primeiro ceratobranquial

4.5.2 Dados Moleculares

De acordo com os dados moleculares gerados, foram alinhadas 37 sequncias do gene Citocromo b de aproximadamente 368pb o qual foi encontrado 321 stios conservados, 45 stios variados e 8 stios nicos. As sequncias so compostas por 31,9% de timina, 27,7% de citosina, 24,7% de adenina e 15,7% de guanina. O fenograma ilustrado na Figura 14, mostra que a espcie Australoheros sp. forma uma clado distinto em relao as demais espcies representadas. As comparaes entre as sequncias das espcies foram feitas utilizando espcimes

54

sequenciados para o presente trabalho e espcimes depositados no banco de dados

GenBank.

A espcie do Tiet est mais relacionada com Australoheros ribeirae e distante de Australoheros scitulus, corroborando com a divergncia gentica de 3% para A. ribeirae e 7% para A. scitulus. A Tabela 10 reporta a divergncia gentica entre as espcies do gnero
Australoheros, demonstrando a divergncia intraespecfica da espcie Australoheros

sp. de 0% e divergncia interespecfica variando de 3% a 7%. Os ramos so sustentados com bootstrap acima de 76 indicando robustez dos grupos formados.

Tabela 10. Divergncias genticas interespecficas do gene Citocromo b entre as espcies do gnero Australoheros.

Amostra/Divergncia 1. Australoheros sp. 2. Australoheros ribeirae 3. Australoheros kaaygua 4. Australoheros minuano 5. Australoheros tembe 6. Australoheros facetus 7. Australoheros scitulus

1 0% 3% 4% 4% 5% 5% 7%

0% 3% 4% 4% 3% 6%

0% 4% 4% 4% 6%

0% 6% 4% 7%

0% 4% 6%

0% 5%

0%

55

Australoheros sp. Tiet Australoheros sp.

Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(2) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(3) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(4) 100 Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(5) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(6) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(7) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(8) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(9) Australoheros sp.

80

Australoheros sp. Tiet(10) Australoheros sp. Australoheros sp. Tiet(11) Australoheros sp. Australoheros ribeirae Australoheros ribeirae Australoheros ribeirae(2) Australoheros ribeirae Australoheros ribeirae(3) Australoheros ribeirae
Australoheros ribeirae Australoheros ribeirae(4) Australoheros ribeirae Australoheros ribeirae(5) Australoheros kaaygua (AY998658) k aaygua

76

96

79

Australoheros minuano Australoheros minuano (AY998659)

99

Australoheros tembe (AY998660) Australoheros tembe

Australoheros tembe (AY843373) Australoheros tembe(2) 100

Australoheros scitulus(2) Australoheros scitulus (AY998661) Australoheros scitulus(3) Australoheros scitulus (AY998662)
Australoheros scitulus Australoheros scitulus (AY998663)

Australoheros facetus (AY998667) Australoheros facetus

98

Australoheros facetus(2) Australoheros facetus (AY998666) Australoheros facetus(3) Australoheros facetus (AY998664) Australoheros facetus(4) Australoheros facetus (AY843387) Australoheros facetus(5)
Australoheros facetus (AY843386) Australoheros facetus(6)

0.005

Figura 14. Fenograma ilustrando as relaes entre as sequncias do gene mitocondrial Citocromo b das espcies do gnero Australoheros utilizando mtodo de evoluo mnima modelo K2P. Nota: Os cdigos entre parnteses indicam o nmero de acesso no Genbank. O grupo vermelho pertence a bacia do Alto Rio Tiet. O grupo azul pertence a bacia de Ribeira de Iguape. Verde pertence a bacia do Alto Rio Uruguai. Roxo pertence bacia do mdio e baixo Rio Uruguai. O grupo em laranja pertence a bacia do Rio Paran e Uruguai. O grupo em amarelo pertence a bacia do baixo Uruguai e por fim, o grupo em preto est distribudos em diversas bacias na Argentina, Brasil, Chile e Uruguai.

56

5 DISCUSSO

5.1 Relaes genticas entre as espcies de Cichlidae do Alto Rio Paran

Por meio da anlise do gene COI foram obtidos diversos agrupamentos especficos e supra-especficos dos cicldeos do Alto Paran. O primeiro agrupamento compreende as espcies Oreochromis niloticus e
Tilapia rendalli. Essas duas espcies foram usadas para o enraizamento do

fenograma por serem os nicos representantes do grupo dos cicldeos africanos. As tilpias foram introduzidas em vrias partes do mundo por possuir caractersticas propcias para o cultivo. Os principais objetivos para sua introduo foram o repovoamento de reservatrios e rios, controle da vegetao aqutica e cultivo em pesqueiros e pisciculturas (ATZ, 1954; RIEDEL, 1965). Em 1953 foi introduzido na regio sudeste do Brasil a primeira espcie de tilpia, Tilapia rendalli originria do antigo Congo Belga (AZEVEDO, 1955). Essa espcie foi inicialmente trazida para o Brasil para o controle da vegetao que obstrua as turbinas de hidreltricas, posteriormente foi levada para o nordeste para o repovoamento de audes e o desenvolvimento da piscicultura. Devido ao baixo rendimento da Tilpia rendali, em 1971 foi importada da Costa do Marfim a tilpia niltica (Oreochromis niloticus) e a tilpia de Zanzibar (Oreochromis urolepis
hornorum) (LOVSHIN, 1976).

Em estudos filogenticos realizados com o grupo dos cicldeos, comum as espcies Oreochromis niloticus e Tilapia rendalli compartilharem um mesmo ramo. Essa hiptese corroborada por resultados encontrados por Farias et al. (1999; 2000),o qual utilizando o gene 16S propuseram a filogenia de Cichlidae, separando em grupos como Cicldeos Neotropicais, Africanos, e o grupo basal compartilhado pelo cicldeos de Madagascar e ndia. Nesse trabalho, os gneros Oreochromis e
Tilapia dividiram um clado, com bootstrap de 97. Sparks (2004) prope para esses

57

dois gneros africanos a mesma hiptese, onde Oreochromis e Tilapia tambm compartilharam um clado com 96 de bootstrap. Outro agrupamento formado refere-se s espcies do gnero Australoheros. Includo nesse clado, esto as espcies de Australoheros facetus, encontrada em levantamentos ictiofaunsticos para a bacia do Alto Paran (LANGEANI et al., 2007),
Australoheros ribeirae, endmica da bacia do Ribeira de Iguape, no pertence ao

Alto Paran, foi includa na anlise para propor a hiptese de nova espcie para o grupo dos Australoheros do Alto Tiet. Esse grupo foi formado corroborando a existncia de uma nova espcie desse gnero de acordo com a diversidade interespecfica observada dentro do gnero, variando de 3% a 4% e bootstrap de 100. Outro clado pode ser observado entre os gneros Astronotus e Cichla. A espcie Astronotus crassipinnis encontrada recentemente na bacia do Alto Rio Paran, possivelmente depois da soltura de exemplares de aqurio (GRAA e PAVANELLI, 2007), e anteriormente identificada como Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (KULLANDER, 2003b). Para o Alto Paran so descritas somente duas espcies do gnero Cichla: Cichla kelberi e Cichla piquiti, as quais foram introduzidas na bacia. A espcie Cichla kelberi, popularmente conhecida como tucunar-amarelo e originria da bacia Amaznica, foi introduzida para a utilizao na pesca esportiva, e atualmente est entre as espcies mais abundantes da regio (JNIOR et al., 2003). Anteriormente era reconhecida na bacia do Alto Rio Paran como Cichla monoculus (Spix e Agassiz, 1831) (KULLANDER e FERREIRA, 2006). A espcie Cichla piquiti, popularmente conhecida como tucunar-azul, possui distribuio geogrfica entre a bacia dos rios Tocantins e Araguaia, e foi introduzida no Alto Paran com espcimes provenientes da bacia do rio Tocantins (OLIVEIRA, 2007). Essa espcie era identificada como Cichla sp. para o Alto Paran (GRAA e PAVANELLI, 2007). Os gneros
Astronotus

Cichla

esto

fortemente

relacionados

compartilham um clado o qual corrobora a hiptese sugerida por diversos autores. Essa hiptese foi observada utilizando os genes 16S, citocromo b, ATPase e sequncias nucleares (FARIAS et al., 1999; 2000; ZARDOYA et al. 1996), e como visto no presente trabalho, essa hiptese tambm corroborada utilizando-se o gene COI.

58

Os espcimes identificados como Cichla sp. foram reconhecidos como Cichla

piquiti (exemplares 20154, 20152, 20151 e 20149) por possuir divergncia

nucleotdica nula e compartilharem um clado com 99 de bootstrap. Os espcimes

Cichla sp (exemplar 20147). e Cichla sp. (exemplar 20150), foram identificados como Cichla cf. kelberi por compartilhar um clado nico e possuir divergncia nucleotdica

de 1%, com um ramo sustentado por bootstrap de 98, indicando robustez do grupo formado (HEBERT et al., 2003a). Os espcimes identificados a priori como Cichla kelberi foram classificados como Cichla cf. kelberi, pois os exemplares 26695, 26692, 26693 e 26696 no compartilham o mesmo clado, o qual no foi possvel confirmar o exemplar que representa a espcie Cichla kelberi verdadeira. O espcime identificado como Cichla aff. kelberi (26695) possivelmente pertence a uma outra espcie. Essa hiptese sustentada pela divergncia nucleotdica encontrada entre esse espcime e os demais identificados como Cichla cf. kelberi (exemplar 26758, 26692, 26693 e 26696), com divergncia de 3%. Como as espcies de Cichla foram introduzidas no Alto Paran, possvel que tenha ocorrido introduo de outras espcies desse gnero, provenientes de bacias hidrogrficas diferentes. Estudos envolvendo maior nmero de exemplares so necessrios para corroborar essa hiptese. Os indivduos pertencentes espcie
Cichlasoma paranaense

compartilharam um nico clado, com divergncia gentica de 0% entre eles, indicando que todos pertenam mesma espcie. Essa espcie possui distribuio excepcionalmente na Bacia do Alto Rio Paran (GRAA e PAVANELLI, 2007). Outro agrupamento observado compreende as espcies Satanoperca
pappaterra e Geophagus brasiliensis. Esse clado sustentado por duas hipteses. A

primeira refere-se espcie Satanoperca pappaterra. Para a bacia do Rio Paran, essa espcie era includa no gnero Geophagus Heckel, 1840, e identificada como
Geophagus jurupari Heckel, 1840. Atualmente sabe-se que a espcie Geophagus jurupari restrita a bacia do baixo Amazonas, ocorrendo para o Alto Paran

somente a espcie identificada como Satanoperca pappaterra, que possui distribuio nas Bacias dos rios Amazonas, Guapor e Paran-Paraguai (KULLANDER, 2003a) A outra hiptese refere-se filogenia do grupo dos cicldeos. De acordo com a hiptese filogentica da famlia Cichlidae, Satanoperca faz parte da subfamlia Geophaginae, assim como Geophagus brasiliensis (FARIAS 1999; 2000), sustentando a intrnseca relao entre essas duas espcies.

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Por fim, o agrupamento formado pelas espcies do gnero Crenicichla. As espcies de Crenicichla que no puderam ser identificadas por meio das caractersticas morfolgicas foram identificadas na anlise do gene COI.
Crenicichlas sp. (17219, 17221, 17222, 17223, 19658, 19659, 19660, 29974, 29976,

29973) foram reconhecidas como C. britskii por possuir divergncia de 1% e formar um clado com bootstrap de 90. Quando so observados ndices menores de 2% pode-se inferir que h divergncia intraespecfica, ou seja, diferena populacional que geralmente inferior 1% (AVISE, 2000). Diferentemente do espcime
Crenicichla sp. (17220), que possui divergncia de 3%, ficando separada das

demais por um clado distinto. Esse indivduo pode ser classificado como outra espcie de Crenicihla no representada na presente anlise. Para o Alto Paran so descritas cinco espcies pertencentes ao gnero
Crenicichla (LANGEANI et al., 2007). Contudo, de acordo com Graa e Pavanelli

(2007) foram identificadas somente quatro.

Para Langeani et al. (2007)

reconhecida a espcie Crenicichla jaguarensis (Haseman,1911). Essas espcies descritas possuem distribuio pela Bacia do Rio Paran, e possivelmente, o espcime Crenicihla sp. (17220), pode ser qualquer uma das espcies descritas para a Bacia do Rio Paran. As divergncias genticas encontradas entre as espcies de Cichlidae so superiores em comparao com Characidae. Astyanax e Bramocharax, os quais possuem valores de divergncia abaixo de 2% (VALDEZ - MORENO et al., 2009), indicando a recente formao do grupo (HEBERT et al., 2003a). A divergncia nucleotdica mxima encontrada entre gneros de Cichlidae apresentada no presente trabalho foi de 29%, a qual superior quando comparada com os peixes de gua doce da Guatemala e Mxico, que possuem divergncia de 16% entre gneros. Esse ndice ainda superior quando confrontado com os resultados de Ward et al. (2009) que compararam 273 gneros de peixes e obtiveram a divergncia mxima interespecfica de 24,18% . As espcies marinhas possuem menores divergncias em relao aos peixes de gua doce, o que pode ser observado comparando os cicldeos do Alto Paran com as espcies de peixes marinhos da Austrlia, 29% vs. 20% (Ward, 2005). A fragmentao dos rios e lagos de gua doce a partir das redes continentais levaram a maior estruturao gentica entre as populaes de peixes, acentuando as

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divergncias nucleotdicas em comparao as espcies marinhas (WARD et al., 1994). A composio nucleotdica obtida indica maior porcentagem de bases C e T como observado em grupos de telesteos (WARD et al., 2005, WARD e HOLMES, 2007). As relaes estabelecidas entre os taxa por meio da anlise do gene COI refletiram a filogenia do grupo proposta por Farias et al. (1999) e Sparks e Smith (2004) demonstrando que o COI pode ser um indicador na seleo de txons para estudos filogenticos e alm disso, as sequncias de DNA obtidas nos projetos de DNA barcoding podem ser adicionadas ao conjunto de sequncias utilizadas para elaborao de filogenias (HAJIBABAEI et al.,2007). O barcode foi eficiente para a caracterizao das espcies de cicldeos do Alto Paran.

5.2 Australoheros sp. nova espcie

O conjunto de dados morfolgicos e moleculares teve importncia fundamental para propor a hiptese de uma nova espcie de Australoheros para o Alto Rio Tiet. Historicamente as espcies do gnero Australoheros encontradas no sudeste do Brasil, incluindo a bacia do Alto Paran, bacia do rio Ribeira de Iguape e a bacia do rio Paraba do Sul foram designadas como Cichlasoma facetum (Jenyns 1842), ou Australoheros facetus (ARAJO e NUNAN, 2005; LANGEANI et al., 2007; PEREIRA e OYAKAWA, 2003 ). Castro et al. (2004), em levantamentos feitos para a bacia do Rio Grande no estado de So Paulo, identificaram os espcimes possivelmente de Australoheros
facetus como Cichlasoma facetum. Assim como para o Alto Paranapanema, Martins

e Barrella (2008) classificaram um cicldeo popularmente conhecido como caraverde e identificaram como pertencendo espcie Cichlasoma facetum. Estudos anteriores consideravam o gnero Australoheros como um pequeno grupo de espcies, o qual era identificado como Cichlasoma Swainson, 1839. Muitas

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espcies

foram

identificadas

como

Cichlasoma

facetum

(JENYNS,

1842),

especialmente para o Alto Paran. No Brasil, a espcie Australoheros facetus possui distribuio no Rio Grande do Sul e principalmente na Bacia do rio Paran. Para a bacia do rio Paraba do Sul, foram descritas recentemente quatro espcies pertencentes ao gnero
Australoheros e para a bacia do rio Ribeira de Iguape descrita at hoje uma espcie, Australoheros ribeirae (OTTONI e COSTA, 2008; OTTONI, OYAKAWA e COSTA,

2008). Para a bacia do rio Paran foi registrada at hoje somente trs espcies do gnero Australoheros: A. facetus, A. tembe e A. guarani (LANGEANI et al. 2007; RICAN e KULLANDER, 2008). De acordo com os resultados apresentados no presente trabalho, uma nova espcie do gnero Australoheros ocorre nas cabeceiras do Alto Tiet. Esta nova espcie se diferencia por dados morfolgicos e moleculares das espcies recentemente descritas para as bacias vizinhas como Ribeira de Iguape (OTTONI, OYAKAWA e COSTA, 2008) e Paraba do Sul (OTTONI e COSTA, 2008).
Australoheros sp. compartilha caractersticas morfolgicas nicas com as

demais espcies do gnero como, listras interrompidas na poro mediodorsal e juvenis com xantforos na base da nadadeira caudal (RICAN e KULLANDER, 2006). As divergncias nucleotdicas que separam as espcies de Autraloheros variaram de 3% a 7%, similares as encontradas por Rican e Kullander (2006) o qual obtiveram valores superiores a 4%. Vrias espcies da tribo Heroini esto separadas por divergncias de sequencias de Citocromo b menores, Astatheros alfari e A.
bussingi possuem 2,5% de divergncia, separando essas duas espcies

(LOISELLE, 1997; MARTIN e BERMINGHAM, 1998). A composio nucleotdica observada tpica do gene citocromo b encontrada em cicldeos, onde predominam bases T e C (FARIAS et al., 2001). Diante dos resultados apresentados no presente trabalho, vlido ressaltar a importncia da conservao de habitats, principalmente nas cabeceiras dos rios, onde h um elevado grau de endemismo. Espcies endmicas so importantes para estudos voltados a biodiversidade e qualidade ambiental, principalmente para espcies que ocorrem em margens de rios, pois se tornam mais suscetveis as aes antrpicas. Isso implica no desaparecimento de espcies de peixes que, muitas vezes, ainda no foram descritas na literatura cientfica. A taxonomia

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utilizando ferramentas moleculares e estudos morfolgicos nos leva a entender os processos relacionados sistemtica de um modo mais conciso, auxiliando deste modo nos levantamentos da biodiversidade. Alm disso, foi proposta a hiptese de uma nova espcie de Australoheros para as cabeceiras do Alto Rio Tiet por meio de dados moleculares e morfolgicos.

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6 CONCLUSES

O gene citocromo c oxidase subunidade I oferece novas informaes a respeito da identidade das espcies de Cichlidae coletadas na bacia do Alto Rio Paran; O gene COI foi efetivo para a identificao das espcies de cicldeos do Alto Paran; Foram identificadas para o Alto Paran 15 espcies distribudas em 9 gneros de Cichlidae de acordo com a anlise do gene COI; A espcie do gnero Australoheros encontrada no Alto Tiet trata-se de uma nova espcie; essa hiptese foi proposta por meio de caracteres morfolgicos e moleculares.

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