A. JUDUL PERCOBAAN : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) B. TUJUAN PERCOBAAN : 1.

Menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi. 2. Menentukan nilai Rf dari zat warna pada tanaman dengan menggunakan pelat KLT. C. DASAR TEORI Kromatografi lapis tipis (KLT) atau Thin Layer Chromatography (TLC) dalah salah satu jenis kromatografi cair-cair dan berdasarkan mekanisme pemisahannya termasuk kromatografi adsorpsi serta jika ditinjau dari konfigurasinya termasuk kromatografi planar. Dasar pemisahan pada KLT adalah perbedaan kecepatan migrasi di antara fasa diam yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solvent (eluen) yang juga dikenal dengan istilah pelarut pengembang campur. Kromatografi lapis tipis atau KLT pada prinsipnya sama dengan kromatografi kertas, hanya saja sebagai fasa diam digunakan lapisan tipis absorben yang disalutkan pada sebuah pelat dari kaca atau aluminium foil tebal atau plastik. Pelat KLT perlu dipanaskan dalam oven pada suhu 110o sebelum digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang terikat dan mengaktifkan absorben. Karena air yang terikat kuat pada absorben dapat menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul analit. Analisis dengan KLT diawali dengan pemilihan pelarut pengembang (eluen) yang digunakan. Pemilihan pelarut pengembang tergantung pada jenis analit yang akan dipisahkan. Untuk hidrokarbon digunakan campuran heksana atau petroleum eter dengan toluena atau eter pada berbagai perbandingan. Campuran pelarut ini memiliki kepolaran sedang dan untuk sampel polar dapat digunakan campuran pelarut etil asetat, aseton, atau metanol. Pelarut yang menyebabkan semua noda merambat naik berarti terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak, berarti pelarut tersebut kurang polar. Cara termudah untuk memilih jenis eluen yang tepat adalah dengan menggunakan metode cincin terkonsentrasi. Pada sebuah pelat ditotolkan beberapa

noda dari sampel yang sama. Kemudian untuk setiap noda ditotolkan pelarut yang berbeda. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan gambar berikut : Noda sampel Lapisan luar pelarut (solvent front)

Kurang Polar

Cukup Polar

Terlalu Polar

Analit yang dipisahkan ditotolkan pada pelat yang kemudian digantungkan pada sebuah bejana gelas berisi pelarut (eluen) sedemikian sehingga bagian bawah pelat terendam sekitar 0,5 cm. Eluen akan merambat naik sepanjang pelat dengan efek kapiler dan membawa komponen analit sehingga mencapai batas atas pelat kromatografi tersebut.

Persiapan Chamber Chamber yang digunakan dapat berupa bejana, gelas, atau botol dari kaca dengan dasar rata. Bagian dalam chamber dilapisi dengan kertas saring sampai seluruh dinding chamber tertutup oleh kertas saring tetapi bagian atas chamber

tidak tertutup kertas saring sekitar 2 3 cm. Kemudian eluenyang digunkan dimasukkan kedalam chamber sebanyak 5 mL untuk menjenuhi kertas saring dengan uap eluen tersebut dan selama proses penjenuhan chamber harus ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya. Kertas saring tidak boleh melebihi tinggi gelas karena uapnya dapat keluar melalui kertas saring yang berada di luar gelas sehingga chamber tidak jenuh lagi dan noda tidak naik. Jika kertas saring terlalu kecil maka chamber tidak akan jenuh semuanya sehingga noda sulit naik atau berkembang. Komponen-komponen analit akan terpisah dan membentuk noda sepanjang pelat.

Tahap penotolan dan tahap pengembangan Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda sampel yang sama kemudian setiap noda ditotolkan eluen yang berbeda. Sedangkan untuk penentuan Rf, pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda yang sama di batas bawah pelat. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan. Penempatan pelat dilakukan dengan hati-hati sehingga lapisan tipis fasa diam pelat tidak bersentuhan dengan kertas saring di dalam chamber dan noda yang ditotolkan tidak terkena pelarut. Setelah pelat diletakkan dengan benar, chamber ditutup dan dibiarkan eluen merambat naik secara kapiler. Setelah eluen mencapai batasatas pelat, maka pelat segera diangkat dan noda yang terbentuk ditandai dengan pensil, kemudian diukur Rfnya. Jika tidak ada noda yang terlihat maka pelat disemprot dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, amonium sulfida, dan

sebagainya. Atau dengan cara menyinari pelat dengan lampu ultra violet atau menjenuhkan pelat dengan uap iodium. Cara menghitung Rf adalah
Rf = jarak noda dengan batas bawah pelat jarak eluen

Cara menentukan simpangan baku adalah

S
2

x x
n

Setiap komponen memiliki harga Rf yang tertentu, yang kemudian dibandingkan dengan Rf senyawa standar. Jika noda tidak tampak, maka dapat disemprot dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, ammonium sulfida dan sebagainya. Cara lain adalah dengan menyinari pelat tersebut dengan lampu ultraviolet atau menjenuhkan kertas tersebut dengan uap iodium. D. ALAT DAN BAHAN ALAT 1. Pelat KLT berukuran 5x2 cm 2 lembar dan 3x5 cm 2 lembar 2. Pipa kapiler untuk menotolkan noda 3. Gelas yang memiliki dasar rata, lurus, diameter 10 cm, tinggi 7 cm 4. Corong pemisah 5. Kertas saring whatman selebar bagian dalam gelas 6. Gelas ukur 10 ml 7. Gelas kimia 50 ml 8. Pelat kaca untuk menutup gelas 9. Pelat tetes 10. Pinset panjang 11. Cawan Petri BAHAN 1. Daun pandan betawi, kunyit dan daun pacar masing-masing 15 gram 2. Metanol 3. Etanol 4. Kloroform

E. CARA/ALUR KERJA 1. Persiapan Sampel Sampel: pandan betawi

Beberapa gram pandan betawi yang sudah dihaluskan 25 mL metanol Direndam Diambil filtratnya (diperas dengan tangan yang sudah memakai sarung tangan) setelah larutan berwarna cukup tua. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pemisah. + 25 mL diklorometan Campuran dikocok baik-baik dengan arah sama sambil sekali-sekali dibuka tutupnya. Campuran didiamkan sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah diambil dan digunakan sebagai pigmen sampel. Sampel berwarna hijau tua

Sampel: kunyit Beberapa gram kunyit yang sudah dihaluskan/diparut 25 mL metanol Direndam Diambil filtratnya (diperas dengan tangan yang sudah memakai sarung tangan) setelah larutan berwarna cukup tua. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pemisah. + 25 mL diklorometan Campuran dikocok baik-baik dengan arah sama sambil sekali-sekali dibuka tutupnya. Campuran didiamkan sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah diambil dan digunakan sebagai pigmen sampel. Sampel berwarna kuning tua 2. Persiapan pelat Pelat 3 X 5 cm Dioven Diberi beri titik-titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda dengan jarak 1 cm dan sehingga dapat memuat 6 titik

Pelat 2 X 5 cm Diberi batas dengan pensil. Batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm

3. Persiapan Eluena dan Tahap Penotolan dan Pengembangan Sampel a. untuk cincin terkonsentrasi Metanol diklorometana Dicampur ke dalam vial-vial dengan perbandingan metanol : diklorometan sebagai berikut: A. 3 : 7 B. 4 : 6 C. 5 : 5 D. 6 : 4 E. 7 : 3 F 8:2

b. untuk penentuan Rf

Kertas saring Dimasukkan ke dalam gelas hingga menutupi seluruh dinding gelas tetapi tidak melebihi bagian atas gelas. + 5 mL campuran metanol dan diklorometana Ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya.

4. Tahap penotolan dan pengembangan sampel a. untuk cincin terkonsentrasi Pelat 3 X 5 cm Sampel ditotolkan 2-3 kali dengan pipa kapiler pada enam titik yang telah diberi tanda dengan pensil tadi sampai warnanya cukup jelas. Noda yang ditotolkan harus pada tempat yang sama. Diberi kode A-F untuk setiap noda Campuran pada vial A-F ditotolkan pada noda Dibandingkan eluen mana yang cocok untuk sampel.

Eluen C b. untuk penentuan Rf Pelat 2 X 5 cm Sampel ditotolkan pada batas bawah pelat KLT 2-3 kali hingga noda cukup jelas. Pelat kaca dibuka. Pelat KLT dimasukkan ke dalam gelas dengan hati-hati dengan menggunakan pinset sampai posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas (tidak boleh miring). Noda jangan sampai terkena eluen. Segera ditutup kembali gelas tersebut dan dibiarkan mengembang sampai eluen tersebut menyentuh batas atas pelat. Saat eluen menyentuh batas atas pelat, pelat KLT diambil dengan hati-hati. Noda diamati dan diberi tanda pensil, dikeringkan. Ditutup denga selotip agar noda tidak memudar warnanya. Harga Rf setiap komponen yang dihasilkan oleh pemisahan dihitung.

Penentuan Rf

F. DATA DAN PENGAMATAN Tabel 1. Data untuk cincin terkonsentrasi Sampel Pandan Kunyit Eluen A Kurang polar Polar Eluen B Non polar Non polar Eluen C Cukup polar Cukup polar Eluen D Non polar Kurang polar Eluen E Cukup polar Kurang polar Eluen F Cukup polar Kurang polar

Tabel 2 Data untuk menentukan Rf Sampel 1 Pandan Kunyit 0,39 0,08 Rf1 2 0,37 0,07 Rf4 1 Pandan Kunyit 0,80 0,47 2 0,79 0,54 x 0,79 0,50 1 0,87 x 0,38 0,07 1 0,56 0,30 Rf2 2 0,54 0,30 Rf5 2 0,87 0,84 x 0,87 0,84 1 0,94 x 0,55 0,30 1 0,68 0,33 Rf3 2 0,67 0,33 Rf6 2 0,95 X 0,95 X 0,67 0,33

Sampel

G. PEMBAHASAN 1. PERSIAPAN SAMPEL Untuk persiapan sampel ada 2 macam yaitu kunyit dan daun pandan. Untuk kunyit, kunyit diparut tanpa ditambah air dan untuk daun pandan betawi yang berwarna hijau tua diblender hingga cukup halus. Masing- masing diambil beberapa gram. Kemudian untuk kunyit direndam dalam 10 ml etanol (larutan tidak berwarna) sampai filtrat berwarna kuning keruh. Sedangkan untuk daun pandan filtrate berwarna hijau tua. Setelah itu masing-masing diambil filtratnya (tapi jangan langsung diperas dengan tangan karena metanol dan etanol bersifat karsinogen yang dapat membahayakan tubuh) sehingga didapatkan filtratnya sebanyak 15 ml. Masing-masing filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam corong pemisah dan ditambah dengan 5 ml kloroform kemudian dikocok searah dan sesekali dibuka tutupnya agar gas yang terbentuk dapat keluar. Selanjutnya campuran tersebut didiamkan sampai terbentuk dua lapisan. Untuk sampel kunyit, lapisan bawah berwarna kuning keruh dan lapisan atas berwarna kuning kecoklatan, sedangkan sampel daun pandan lapisan bawah berwarna hijau tua dan lapisan atas berwarna kuning kecoklatan. lapisan bawah. 2. PERSIAPAN PELAT Pelat dimasukkan ke dalam oven dahulu sekitar 10 menit agar molekulmolekul air yang terikat hilang dan absorben menjadi aktif. Setelah itu pelat diberi tanda dengan pensil (jika dengan bolpoin maka noda bolpoin akan ikut terelusi atau mengembang). Untuk cincin terkonsentrasi pelat yang berukuran 3x5 cm diberi titik sebanyak 6 titik. Sedangkan untuk penentuan Rf, 2 pelat berukuran 2x5 cm masingmasing diberi batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm. Pemberian titik dimaksudkan untuk lebih memperjelas pemisahan dalam cincin terkonsentrasi. 3. PERSIAPAN ELUEN Untuk cincin terkonsentrasi, kami tidak melakukan/membuatnya karena eluen sudah disiapkan oleh laboran. Sedangkan untuk penentuan Rf, kertas saring dimasukkan ke dalam gelas sehingga kertas tersebut menutupi seluruh dinding gelas namun tidak sampai melebihi bagian atas gelas. Kemudian dimasukkan campuran (eluen) heksan, kloroform dan etanol (larutan tidak berwarna) dengan perbandingan Untuk pigmen sampel digunakan

4:3:3 sebanyak 5 ml dan segera tutup dengan pelat kaca karena campuran mudah menguap. Selanjutnya didiamkan agar kertas saring basah seluruhnya yang bertujuan agar atmosfer dalam gelas (chamber) terjenuhkan dengan uap pelarut. 4. TAHAP PENOTOLAN DAN PENGEMBANGAN SAMPEL a). Untuk cincin terkonsentrasi Masing-masing sampel ditotolkan pada pelat KLT di enam titik dengan menggunakan pipa kapiler sehingga warnanya cukup jelas. Beri kode A-F untuk setiap noda. Selanjutnya mengambil eluen pada pelat tetes A dengan pipa kapiler dan ditotolkan pada noda A. Untuk noda B-F dilakukan hal yang sama dengan eluen pada pelat tetes B-F juga. Dari noda yang telah diberi kode A-F, noda yang memberikan cincin paling bagus (cukup polar) adalah noda-noda pada kode D dengan perbandingan heksan:kloroform:etanol adalah 4:3:3. b) Untuk penentuan Rf Masing-masing sampel ditotolkan pada batas bawah pelat KLT yang pertama di tiga tempat sehingga masing-masing titik terdapat noda-noda. Untuk noda pertama adalah sampel kunyit, noda kedua adalah sampel daun pandan dan noda ketiga adalah sampel daun pacar. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam gelas (chamber) dengan hati-hati menggunakan pinset sehingga posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas dan segera ditutup dengan pelat kaca. Noda dibiarkan mengembang sampai eluen mencapai batas atas pelat, kemudian pelat segera diangkat. Tiap-tiap noda sampel terelusi sehingga terbentuk beberapa noda. Lalu noda-noda yang terbentuk tersebut diberi tanda dengan pensil, kemudian dikeringkan dan ditutup dengan selotip agar noda tidak memudar warnanya. Langkah-langkah tersebut diulangi pada pelat KLT yang kedua. Setelah itu diukur Rf-nya dan sehingga didapatkan nilai Rf untuk: 1). Sampel kunyit Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Rf5 Rf1 = 0,07 = 0,30 = 0,33 = 0,50 = 0,84 = 0,38

2). Sampel daun pandan betawi

Rf2 Rf3 Rf4 Rf5 Rf6 H. DISKUSI

=0,55 =0,67 = 0,79 = 0,87 = 0,95

Pada saat kami melakukan praktikum, ada beberapa kendala yang kami hadapi. Yakni pandan yang kami dapatkan tercampur dengan pandan wangi, seharusnya paandan yang digunakan adalah pandan betawi, sehingga tidak mendapatkan hasil Rf yang maksimal dan cincin terkonsentrasi hasil penotolan menjadi sulit untuk cukup polar.Dikarenakan pandan wangi mempunyai struktur molekul yang berbeda dengan pandan betawi. I. KESIMPULAN Dari percobaan KLT dengan sampel kunyit dan daun pandan betawi yang telah kami lakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. Komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi adalah campuran antara heksan, kloroform dan etanol dengan perbandingan 4:3:3. 2. Nilai Rf dari zat warna pada tanaman kunyit, daun pandan betawi dan daun pacar dengan menggunakan pelat KLT adalah sebagai berikut : 1). Sampel kunyit Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Rf5 = 0,07 = 0,30 = 0,33 = 0,50 = 0,84

2). Sampel daun pandan betawi Rf1 = 0,38 Rf2 =0,55 Rf3 =0,67 Rf4 = 0,79 Rf5 = 0,87 Rf6 = 0,95

J. PERTANYAAN 1. Apakah yang terjadi jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar atau kurang polar? Mengapa? Jawab : Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar maka seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat (solvent front) tanpa mengalami pemisahan. Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT kurang polar maka noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak. 2. Apa fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf? Jawab : Fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf digunakan agar atmosfer dalam gelas (chamber) terjenuhkan dengan uap pelarut (menjenuhkan chamber). 3. Mengapa permukaan pelat KLT tidak boleh rusak? Jawab : Permukaan pelat KLT tidak boleh rusak karena dapat mempengaruhi hasil pemisahan noda atau pengembangan noda. 4. Mengapa pelat KLT yang harus digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven? Jawab : Pelat KLT yang digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven pada suhu 110o sebelum digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang terikat dan mengaktifkan absorben. Karena air yang terikat kuat pada absorben dapat menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul analit. 5. Mengapa batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pensil? Jawab : Batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pensil karena jika menggunakan bolpoin maka noda bolpoin akan ikut terelusi atau mengembang.

DAFTAR PUSTAKA

Azizah, Utiya. 2007. Panduan Praktikum Mata Kuliah Kimia Analitik II: Dasar-Dasar Pemisahan Kimia. Surabaya: Unipress Unesa. Clark, Jim. 2007. Kromatografi Kertas. (www.chem-is-try.org, diakses 8 April 2009) Day, R. A., Underwood, A. L. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif. New York: PrenticeHall. Sianita B, Maria Monica. 2006.Buku Ajar Mahasiswa Kromatografi. Surabaya: Unipress Unesa.

LAMPIRAN
I. Perhitungan Rf
Rf = jarak noda dengan batas bawah pelat jarak eluen

A.1 Rf untuk pandan ke-1 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Rf 1 = Rf 2 = Rf 3 = Rf 4 = Rf 5 = Rf 6 = 1,39 = 0,39 3,5 1,98 = 0,56 3,5 2,40 = 0,68 3,5 2,80 = 0,80 3,5 3,05 = 0,87 3,5 3,30 = 0,94 3,5

A.2 Rf untuk pandan ke-2 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Rf 1 = Rf 2 = Rf 3 = Rf 4 = Rf 5 = Rf 6 = 1,30 = 0,37 3,5 1,90 = 0,54 3,5 2,35 = 0,67 3,5 2,78 = 0,79 3,5 3,05 = 0,87 3,5 3,35 = 0,95 3,5

A.3 Menentukan x untuk Rf1 dan Rf2

xRf = Rfke 1 + Rfke 2 2

Untuk x ke-1
xRf 1 = 0,39 + 0,37 = 0,38 2

Untuk x ke-4
xRf 4 = 0,80 + 0,79 = 0,79 2

Untuk x ke-2
xRf 2 = 0,56 + 0,54 = 0,55 2

Untuk x ke-5
xRf 5 = 0,87 + 0,87 = 0,87 2

Untuk x ke-3
xRf 3 = 0,68 + 0,67 = 0,67 2

Untuk x ke-6
xRf 6 = 0,94 + 0,95 = 0,95 2

B.1 Rf untuk kunyit ke-1

B.2 Rf untuk kunyit ke-2

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Rf 1 = Rf 2 = Rf 3 = Rf 4 =

0,30 = 0,08 3,5 1,05 = 0,30 3,5

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Rf 1 = Rf 2 = Rf 3 = Rf 4 = Rf 5 =

0,27 = 0,07 3,5 1,05 = 0,30 3,5 1,15 = 0,33 3,5 1,90 = 0,54 3,5 3,05 = 0,87 3,5

1,15 = 0,33 3,5 1,65 = 0,47 3,5

tidak ditemukan tidak ditemukan

Tidak ditemukan

B.3 Menentukan x untuk Rf1 dan Rf2

xRf = Rfke 1 + Rfke 2 2

Untuk x ke-1
xRf 1 = 0,08 + 0,07 = 0,07 2

Untuk x ke-4
xRf 4 = 0,47 + 0,54 = 0,50 2

Untuk x ke-2
xRf 2 = 0,30 + 0,30 = 0,30 2

Untuk x ke-5 tidak ada Untuk x ke-6 tidak ada

Untuk x ke-3
xRf 3 = 0,33 + 0,33 = 0,33 2