Escola Superior de Tecnologias da Sade do Porto 2ano do curso de Anatomia Patolgica Citolgica e Tanatolgica Citoqumica e Histoqumica Ano Lectivo

2011/2012

Docente: Dr Slvia Fernandes

Discente: Ana Nogueira n 10100092

Vila Nova de Gaia, 28 de Outubro de 2011

ndice
Introduo .......................................................................................................... 3 Objectivo ............................................................................................................ 4 Material e Mtodos ............................................................................................. 4 Resultados ......................................................................................................... 6 Discusso/Concluso ......................................................................................... 9 Referncias Bibliogrficas ................................................................................ 10

Introduo
O tecido conjuntivo tem origem na mesoderme embrionria e a sua principal funo de sustentao. constitudo por vrias clulas envolvidas por uma substncia extracelular constituda por uma matriz amorfa e fibras (colagnio, reticulares e elsticas).1,2 Dentro das fibras que existem no tecido conjuntivo as que podemos encontrar mais facilmente no nosso organismo so as fibras de colagnio, at porque estas so as que o constituem maioritariamente. Estas fibras so constitudas por fibrilas de colagnio de um dos cinco tipos que se encontram totalmente identificados (colagnio I,II,III,IV,V).1,2 Para que estas sejam visveis ao microscpio necessrio efectuar a colorao das mesmas por mtodos de colorao tricrmicos. Estes mtodos utilizam trs corantes no seu procedimento, um corante nuclear e dois corantes cidos que evidenciam respectivamente o ncleo e as fibras de colagnio e musculares. Os reagentes de colorao tricrmica destinam-se utilizao em diagnstico in vitro. O primeiro mtodo utilizado para demonstrar as fibras de colagnio foi o mtodo de Van Gieson que considerado eficaz sendo descartado pela inefectividade da colorao (no permanente). Este mtodo consiste primariamente na adio de dois corantes cidos (cido pcrico e fucsina cida) a baixo PH que vo corar diferencialmente o colagnio (fucsina cida) das restantes estruturas tecidulares (cido pcrico), e seguidamente a adio de um contrastante (hematoxilina frrica) pelo facto de a soluo corante apresentar um PH baixo. Outro mtodo o de Tricrmio de Masson (variante do Tricrmio de Mallory) que se baseia na permeabilidade das fibras de colagnio relativamente aos restantes componentes tecidulares. Numa primeira fase efectua-se uma colorao nuclear utilizando para tal uma hematoxilina resistente a solues cidas. Seguidamente pela aco da fucsina so coradas as estruturas acidfilas tecidulares, que em algumas estruturas, pela aco de um cido (cido fosfomlibdico) removida selectivamente. Posteriormente a utilizao de um corante de tamanho molecular superior ao da fucsina (azul de anilina) promove a colorao das fibras de colagnio. Existem diversos factores que podem influenciar a colorao tricrmica como por exemplo: PH (necessrio ser baixo para as fibras sofrerem colorao) Temperatura (calor implica maior difuso) Hematoxilina (utilizao da frrica pois resistente s solues cidas) Fixao (a colorao no ideal para tecidos previamente fixados).

Objectivo
Como principal objectivo esta actividade experimental tem a visualizao de fibras de colagnio ao microscpio para fins de diagnstico diferencial de sarcomas, estudo de patologias hepticas e pulmonares crnicas.

Material e Mtodos
Material Biolgico: Lmina com corte de tero Lmina com corte de Apndice Material de Laboratrio: Bata Luvas Estufa Tinas de Colorao Hotte Pipetas de Pasteur Gobls Pipetas Graduadas Pompete Esguicho Caixa de colorao de vidro alta com ranhura Lminas Lamelas

Reagentes/Preparao de Reagentes: Soluo lcool - cida Soluo Aquosa de Amnia Soluo cida de Fucsina Ponceau Soluo Aquosa de cido Fosfomolbdico Soluo de Azul de Anilina cido Actico lcoois (100% e 96%) Xilol Entellan Soluo de Bouin Hematoxilina Frrica de Weigert*

*Para a preparao desta soluo procede-se mistura de duas solues, a soluo A (sendo que existem duas, uma normal e uma teste para podermos inferir sobre a qualidade da teste) e a soluo B na proporo volumtrica de 1:1.

Mtodo: 1. Efectuou-se a desparafinao, hidratao, seguida da lavagem dos cortes em gua corrente durante aproximadamente 5 minutos. Seguiu-se uma lavagem com gua destilada. 2. Procedeu-se mordaagem dos cortes em soluo de Bouin durante 47 minutos na estufa a 56 C. 3. Prepararam-se as solues de Hematoxilina Frrica de Weigert A e Ateste. 4. Lavagem dos cortes em gua corrente durante cerca de 5 minutos (tempo necessrio para a cor amarelada dos cortes desaparecer). 5. Lavagem dos cortes em gua destilada. 6. Coraram-se os cortes com a soluo de Hematoxilina Frrica de Weigert, durante 10 minutos. 7. Lavagem dos cortes em gua corrente com passagem por gua destilada. 8. Adicionou-se uma soluo lcool cida com o intuito diferenciador (passo rpido). 9. Lavagem dos cortes durante 3 minutos em gua corrente. 10. Lavagem dos cortes em gua destilada. 11. Realizou-se o azulamento dos cortes com uma soluo aquosa de amnia a 0,5% ou 1% (2 mergulhos) 12. Lavagem dos cortes em gua corrente durante cerca de 3 minutos seguida de uma lavagem em gua destilada. 13. Efectuou-se a colorao dos cortes com a soluo cida de Fucsina Ponceau durante 5 minutos. 14. Lavagem dos cortes em gua destilada. 15. Diferenciaram-se os cortes com a soluo de cido fosfomolbdico a 1% durante 5 minutos. 16. Retirou-se o excesso de soluo nos cortes e coraram-se com a soluo de Azul de Anilina durante 5 minutos. 17. Lavagem em gua destilada. 18. Diferenciaram-se os cortes com a soluo de cido fosfomolbdico a 1% durante 5 minutos. 19. Retirou-se o excesso de soluo nos cortes e colocaram-se os mesmos numa soluo aquosa de cido actico a 1% durante 5 minutos. 20. Desidrataram-se os cortes com 3 a 4 passagens em lcool a 96% e lcool absoluto; Diafanizaram-se os cortes em 2 xilol; Seguiu-se a montagem em meio sinttico (entellan).

Resultados
Na figura 1 a amostra biolgica (tero) sofreu mordaagem com soluo de Bouin e utilizou-se na preparao da Hematoxilina frrica a soluo Ateste.Na figura 2 a amostra biolgica (tero) no sofreu mordaagem e utilizou-se na preparao da Hematoxilina frrica a soluo A. Na figura 3 est representado o apndice que sofreu mordaagem com soluo de Bouin e onde se utilizou na preparao da Hematoxilina frrica a soluo A. Na figura 4 visvel o apndice que no sofreu mordaagem e que na preparao da Hematoxilina frrica utilizou a soluo Ateste. Em todas as imagens possvel discernir eritrcitos e msculos corados de vermelho, ncleos pretos/azuis e fibras de colagnio e reticulina coradas a azul.

Figura 1 - Visualizao microscpica de tero, ampliao 100X

Figura 2 - Visualizao microscpica de tero, ampliao 100X

Figura 3 - Visualizao microscpica de Apndice

Figura 4 - Visualizao microscpica de Apndice

De referenciar que neste procedimento a hematoxilina frrica desempenhou o papel de contrastante tendo especial importncia na melhoria da visualizao das fibras de colagnio.

Discusso/Concluso
Aps a anlise dos resultados foi possvel verificar que a colorao dos cortes com Tricrmio de Masson foi efectuada correctamente, tendo sido cumpridos os objectivos da actividades laboratorial. Foi deste modo possvel visualizar em ambos os cortes histolgicos de tero e apndice as fibras de colagnio ainda que, nos cortes de tero a colorao esteja mais intensa. Esta diferena pode dever-se a uma falha nos tempos durante a colorao no permitindo a infiltrao do corante suficiente para dar a mesma intensidade aos cortes. Tambm pode dever-se perda de propriedades das substncias utilizadas bem como uma fixao excessiva do tecido o que implica uma diminuio da taxa de infiltrao dos corantes no tecido. Uma ltima explicao possvel a da soluo de fucsina ponceau no ser totalmente removida e por este facto aquando da adio da soluo de cido fosfomolbdico que promove a ligao do azul de anilina s fibras de colagnio nem todas vo corar ou ento coram menos intensamente. No decorrer deste procedimento utilizaram-se duas solues de Hematoxilina frrica de Weigert que foram preparadas extemporaneamente a partir de uma soluo A e de outra Ateste. Esta preparao extempornea efectuada para impedir o aparecimento de um composto cromforo que impediria a colorao nuclear efectiva. Quando comparados os cortes em que a colorao utilizou a Hematoxilina preparada a partir da soluo A e a partir da soluo Ateste no possvel visualizar quaisquer alteraes. Os quatro cortes apresentavam-se fixados em formol a 10% tamponado tendo-se procedido mordaagem de dois dos memos em soluo de Bouin. Quando comparando esta varivel na visualizao dos cortes as microscpio denotou-se que os que tinham sofrido mordaagem apresentavam uma imagem com cores mais intensas e brilhantes. Este tipo de procedimento pode ainda ser aplicado a diversos tecidos como por exemplo tecidos hepticos (fgado) ou tecidos pulmonares de modo a poder avaliar leses fibrosas que possam ocorrer nestes tecidos como por exemplo fibrose pulmonar intersticial, cirrose, etc. importante salientar que a utilizao de apndice e tero se deveu riqueza destes tecidos em fibras de colagnio.

Referncias Bibliogrficas
1. Gartner LP, Hiatt JL. Color Textbook of Histology. 3 Edio. Universidade de Michigan. Saunders Elsevier. 2007. p. 111,114. 2. Young B, Lowe JS, Stevens A, Heath JW. Weather Histologia Funcional. 5 Edio. Elsevier. 2007. p. 65,66.