Projeto de pesquisa apresentado disciplina de Bioqumica I, como um dos requisitos para aprovao na disciplina.
SUMRIO
SUMRIO.........................................................................................................................3 INTRODUO.................................................................................................................4 OBJETIVO GERAL..........................................................................................................5 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................................................6 DESENVOLVIMENTO....................................................................................................7 1. REVISO BIBLIOGRFICA..................................................................................7 1.1 Composio do leite............................................................................................7 1.2 Enzimas...............................................................................................................8 1.2.1 Enzimas presentes no leite............................................................................8 1.3 Pasteurizao do leite..........................................................................................8 1.3.1 Classificao da pasteurizao.....................................................................9 2. TESTE DE PEROXIDASE.....................................................................................10 2.1 Materiais e mtodos...........................................................................................10 3. TESTE DA REDUTASE.........................................................................................10 3.1 Materiais e mtodos...........................................................................................10 4. RESULTADOS E DISCUSSO.............................................................................11 CONCLUSO.................................................................................................................11 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................13
INTRODUO
O leite um alimento que caracteriza-se pela grande importncia na alimentao humana devido ao seu elevado valor nutritivo. Deve passar pelo processo de pasteurizao, o qual serve para garantir ao consumidor um leite de melhor qualidade, livre de microrganismos e aumentar a vida de prateleira, reduzindo alteraes enzimticas. As enzimas ou biocatalisadores so um grupo de protenas que tm a habilidade de acelerar os processos bioqumicos nos organismos vivos e em diferentes sistemas biolgicos. A ao das enzimas especifica, cada enzima catalisa somente um tipo de reao. As enzimas so fortemente influenciadas pela temperatura e pHe portanto, atuam bem em uma temperatura tima de atividade, a qual se encontra entre 25 e 50 C e o pH para a maioria das enzimas deve encontrar-se prximo neutralidade. A presena ou no de certas enzimas no leite utilizada nos testes de qualidade. A presena da peroxidase e da redutase, por exemplo, podem indicar a eficincia da pasteurizao, e classificar o leite baseado no grau de contaminao microbiana. Dentro deste contexto, objetivou-se avaliar a qualidade da pasteurizao e classificar o leite baseado na contaminao microbiana via testes enzimticos. as taxas de
OBJETIVO GERAL
OBJETIVOS ESPECFICOS
Verificar a presena da peroxidase e da redutase em diferentes tipos de leite. Verificar a presena de contaminao microbiana via testes enzimticos.
DESENVOLVIMENTO
1. REVISO BIBLIOGRFICA O leite um fluido biolgico muito complexo. Sua composio e caractersticas fsicas variam de espcie para espcie. O componente principal do leite a gua, mas dependendo da espcie o leite contm quantidades variadas de lipdios, protenas e carboidratos que so sintetizados dentro da glndula mamria. H tambm quantidades menores de minerais e outros componentes lipossolveis e hidrossolveis derivados diretamente do plasma sanguneo, de protenas especficas do sangue e intermedirios da sntese mamria.
1.1 Composio do leite A gua o principal componente do leite e o veculo dos demais, consiste em 87%. A gordura presente no leite representa 4.4% de um total de 100%. A gordura pesa menos que a gua e se encontra na forma de glbulos pequenos ou gotculas dispersas no soro do leite. As protenas so os nutrientes mais importantes do leite e compe uma parte essencial de nossa dieta. No leite encontram-se como forma de soluo, e as protenas que consumimos so quebradas em compostos mais simples no sistema digestivo e no fgado. As protenas do leite consistem de 80% de casena, que por sua vez composta de vrios componentes que juntos formam partculas complexas. As protenas do soro tm valores nutricionais muito altos e so largamente utilizadas na indstria alimentcia. O leite contm vrios minerais, com uma concentrao total menor que 1%. Os sais mais importantes so o clcio, sdio, potssio e magnsio. Eles se encontram na forma de fosfatos, cloretos, citratos e caseinatos. As vitaminas do sabor ao leite e so essenciais a determinados processos vitais. O leite contm muitas vitaminas e entre as mais conhecidas esto as vitaminas A, B1,B2, C e D. As vitaminas A e D so lipossolveis, enquanto as outras so hidrossolveis.
8 1.2 Enzimas
As enzimas so um grupo de protenas produzidas por organismos vivos. Elas tm a capacidade de provocar reaes qumicas e afetar o curso e a velocidade de tais reaes, fazendo isso sem serem consumidas. A ao das enzimas especfica: cada tipo de enzima catalisa somente um tipo de reao. Dois fatores que influenciam bastante a ao enzimtica so a temperatura e o pH. Vrias enzimas do leite so utilizadas em teste de controle de qualidade. 1.2.1 Enzimas presentes no leite Algumas das principais enzimas encontradas no leite so a lipase, a fosfatase, a peroxidase e a redutase. A lipase quebra a gordura em glicerol e cidos graxos livres. Muitos microrganismos produzem lipase. Quando o leite se deteriora, a lipase causa diferena no sabor. Por exemplo, excesso de cidos livres no leite e em produtos lcteos resulta no sabor ranoso. A fosfatase capaz de quebrar certos steres de cido fosfrico em cido fosfrico e lcool. Esta enzima destruda pelo processo de pasteurizao simples ( 72C por 15 segundos). O teste de fosfatase pode ser usado para determinar se foi atingido a temperatura de pasteurizao. A peroxidase desativada se o leite for aquecido a 75C (temperatura e tempo limites para a pasteurizao do leite). usada como parmetro para distinguir o leite cru do pasteurizado corretamente, superaquecido ou recontaminado com leite cru. A determinao da peroxidase presente no leite pasteurizado nos permite avaliar a qualidade do mesmo. Existe, ainda, uma enzima importante na determinao da qualidade higinico-sanitria do leite. A pesquisa da redutase utilizada para classificar o leite em tipo A, B ou C. Essa classificao baseia-se no grau de contaminao microbiana do produto.
1.3 Pasteurizao do leite A pasteurizao tem como objetivo principal a destruio de microrganismos patognicos associados ao alimento em questo. Um objetivo secundrio aumentar a
9 vida de prateleira do alimento, reduzindo as taxas de alteraes microbiolgicas e enzimticas. Os produtos pasteurizados podem conter, ainda, muitos organismos vivos capaz de crescer, o que limita sua vida de prateleira, por isso so combinadas outros mtodos de conservao e muitos produtos pasteurizados so conservados sob refrigerao. 1.3.1 Classificao da pasteurizao Existem trs tipos de pasteurizao:lenta (LHT), rpida (HTST) e muito rpida (UHT). A pasteurizao lenta, utiliza de temperaturas menores durante maior intervalo de tempo. Este tipo melhor para pequenas quantidades de leite. A temperatura utilizada de 65 C durante 30 minutos. A pasteurizao rpida utiliza de altas temperaturas durante curtos intervalos de tempo. mais utilizada em leites de saquinho, do tipo A, B e C. A temperatura utilizada de 75 C durante 15 a 20 minutos. Encontra-se como pasteurizao HTST(High Temperature and Short Time), alta temperatura e curto tempo. A pasteurizao muito rpida, na qual as temperaturas utilizadas vo de 130C a 150 C, durante 3 a 5 segundos. Este tipo conhecido como UHT (Ultra High Temperature) ou longa vida.
10 2. TESTE DE PEROXIDASE A qualidade da pasteurizao pode ser avaliada com o teste de peroxidase, que consiste em detectar a presena ou no da enzima no leite analisado.
2.1 Materiais e mtodos Para o teste de atividade de peroxidase, utilizou-se tubos de ensaio de 20 mL, pipetas graduadas de 2 e 10 mL, banho maria, capela de exausto, termmetro e suporte para tubos de ensaio. Os reagentes utilizados foram: soluo de alcolico guaiacol a 1 % v/v e gua oxigenada (H2O 2) de 10 a 20 volumes. Foram testados 4 diferentes tipos de amostra de leite, conforme apresentado na tabela 1: Tipo de leite In Natura P LHT (emb. plstica) UHT (emb. Tetra Pack) Validade ----------29/02/09 15/06/08 03/08/08
Transferiu-se 10 mL de cada amostra para tubos de ensaio de 20 mL e aqueceuse em banho-maria a (43 +/- 2) C por 5 minutos. Em seguida, passou-se para a capela onde adicionou-se 2 mL da soluo guaiacol pelas paredes dos tubos e 3 gotas de gua oxigenada. Esperou-se at que houvesse formao de cor em algumas amostras.
3. TESTE DA REDUTASE O teste da redutase permite classificar o leite baseado no grau de contaminao microbiana.
3.1 Materiais e mtodos Para o teste de atividade de redutase utilizou-se tubos de ensaio com tampas, uma pipeta volumtrica de 20 mL, banho-maria e soluo aquosa de azul de metileno 2,5 %. Em um tubo de ensaio adicionou-se 20 mL de leite, juntamente com 0,5 mL de uma soluo aquosa de azul de metilieno 2,5 %, fechou-se o tubo e deixou-se em
11 banho-maria a 37 C. Durante o banho-maria observou-se o tempo decorrido desde a mistura do leite com o corante at o descoramento completo.
4. RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados do teste de presena da enzima peroxidase seguem apresentados na Tabela 2: AMOSTRAS Leite in natura Leite em p Leite LHT Leite UHT PEROXIDASE Formao da colorao rseo salmo Formao de anel rseo salmo No houve desenvolvimento de colorao No houve desenvolvimento de colorao
Na Tabela 3, apresentada a seguir, verificam-se oe resultados do teste da enzima peroxidase: AMOSTRAS Leite in natura Leite em p Leite LHT Leite UHT REDUTASE A colorao azul permaneceu por mais de 7 horas A colorao azul permaneceu por mais de 7 horas A colorao azul permaneceu por mais de 7 horas A colorao azul permaneceu por mais de 7 horas
A avaliao do teste de peroxidase foi realizada mediante a colorao desenvolvida nas amostras, o desenvolvimento de uma colorao salmo indica peroxidase positiva, o que no seria favorvel, pois a peroxidase promove a fermentao do leite. Avaliou-se o teste de redutase com base nos resultados encontrados. O leite pde ser classificado em A, B ou C, de acordo com o tempo pelo qual manteve a colorao azul durante o banho-maria. No leite tipo A, a colorao se manteria por um mnimo de 5 horas. Tipo B, 3,5 horas, e tipo C, no mnimo 90 minutos. Todas as amostras mantiveram a cor por mais de 5 horas, classificando-as como leites do tipo A.
CONCLUSO
12 Os resultados esperados no teste de peroxidase eram que as amostras de leite in natura apontassem a presena da enzima, enquanto que as amostras que sofreram pasteurizao no. Como a colorao salmo desenvolveu-se apenas no leite in natura, e foi fracamente perceptvel nas outras amostras, pode-se dizer que os processos de pasteurizao realizados nas demais amostras foram suficientemente eficientes para a inativao da peroxidase. No teste de redutase classificou-se todos os tipos de leite como sendo do tipo A, pois em todas as amostras a colorao manteve-se por um mnimo de 5 horas. Com isso, sabe-se que em nenhuma das amostras foi encontrado alto grau de contaminao microbiana.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
LEITE, Disponvel em: http://www.delaval.com.br/leite.html. Acesso em:28 abril de 2008. ANLISES FSICO QUMICAS EM DERIVADOS DO LEITE: Disponvel em: http://cap-lab.com.br/2004/analises.htm. Acesso em 24 abril de 2008. ANALISE DO LEITE. Disponvel em: www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/analise_leite/analise_leite.htm.Acesso em: 23 maio de 2008. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas tcnicas do Instituto Adolfo Lutz. V.1: Mtodos qumicos e fsicos de alimentos, 3.ed.So Paulo: IMESP, 1985.p.223-224.