Tratamiento de Aguas Residuales

Bioadsorcin de metales pesados de aguas cidas de minas (I)

Sobre residuos de levaduras cerveceras
M. Garca Roig, F. I. Ramrez Paredes y T. Manzano Muoz
Dpto. de Qumica Fsica. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad de Salamanca 1. Introduccin La contaminacin por aguas de drenaje cidas que contienen metales pesados es un problema comn en muchas zonas metalognicas y particularmente importante en explotaciones mineras de carbn o de metales [1]. En las minas a cielo abierto tiene lugar un proceso natural aerobio de biolixiviacin debido a la existencia en el terreno de determinados microorganismos y de agua (de escorrentas que circulan a travs de cortas, filones pirticos y escombreras). Las reacciones redox de tipo bioqumico que constituyen este proceso de biolixiviacin [2-5] provocan la formacin de cido sulfrico a partir de los sulfuros metlicos presentes en los residuos minerales [2], con la consecuente disminucin del pH del agua y la solubilizacin de los metales pesados que pueden llegar a difundirse en forma de contaminacin metalogentica a masas de agua prximas ms extensas (ros, embalses). Si bien las minas son fenmenos locales y sus mayores impactos sobre los ecosistemas terrestres y acuticos son fundamentalmente de carcter local, no siempre es as y la dispersin de los metales pesados puede llegar a ser regional e incluso ms global. Las minas generan grandes cantidades de rocas y escombreras que deben depositarse sobre la tierra o en los ecosistemas acuticos. Los resultados principales en trminos de contaminacin por metales pesados son reas de tierras contaminadas baldas, aguas cidas ricas en metales surgidas a partir de residuos y escombreras depositadas sobre el terreno y la consecuente contaminacin de tierras, lagos, ros y reas costeras. En este sentido, y como triste ejemplo, en Espaa, la dispersin de la contaminacin por metales pesados y sus nocivos efectos a lo largo de la cuenca del ro Guadiamar y del coto de Doana tuvo su causa en la rotura del embalse de las aguas cidas de la mina de Aznalcllar (Sevilla). Un primer objetivo de este trabajo ha sido la identificacin y evaluacin de problemas de contaminacin metalognica en aguas superficiales de diferentes zonas mineras de las provincias de Salamanca y Zamora, donde existen menas de W, U, Sn, Bi, etc., que en la actualidad han dejado de explotarse y que mantienen cortas a cielo abierto desde hace bastantes aos, con volmenes ms o menos importantes de agua retenida, y escombreras, en algunos casos, de notable magnitud. Dada la creciente percepcin de los riesgos que conlleva la contaminacin ambiental por metales pesados, en los casos evaluados positivamente (drenajes cidos de las minas Merladet y F en la provincia de Salamanca), nuestro segundo objetivo sera investigar la capacidad de biorremediacin de dichas aguas cidas de mina mediante procesos de bioadsorcin por biopolmeros abundantes y baratos.
1.1. Bioadsorcin de metales

Se ha caracterizado la composicin qumica y los estados fisicoqumico y ecolgico de las aguas cidas de dos minas a cielo abierto de la cuenca del ro Duero. Asimismo, se han establecido las condiciones para la obtencin y manipulacin adecuadas de diferentes residuos biolgicos, abundantes y baratos, que se muestren tiles para la descontaminacin de metales pesados de dichas aguas cidas. Se ha ensayado, a escala de laboratorio (<100 l), una tecnologa innovadora para la depuracin de estas aguas cidas contaminadas con metales pesados, basada en las caractersticas fisicoqumicas de adsorcin, intercambio inico y complejacin de iones metlicos (bioadsorcin) que poseen biopolmeros, tales como la queratina, la quitina y otros constituyentes mayoritarios de distintos tipos de residuos biolgicos industriales, como son las levaduras cerveceras exhaustas, objeto de detalle en el presente artculo, y otros como pelos de cerdo, plumas de ave y caparazones de cangrejos de ro que sern objeto de un artculo posterior.

Existen en la naturaleza biomasas muertas e inactivas con capaci-

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Tabla I. Grupos ionizables en polmeros biolgicos susceptibles de participar en la unin de metales Grupo Carboxilo Carboxilo Carboxilo Carboxilo Carboxilo Carboxilo Sulfato Acido sulfnico Fosfato Fosfato Fosfato Hidroxilo Hidroxilo Localizacin Protena c-terminal Beta aspartato Gamma glutamato Acido urnico Acido silico Lactato (Acido murmico) Carbohidrato como ster. Tirosina Acido cisteico Serina como ster Azcar o poliol mono ster Acido teicoico y otro polisacrido dister Tirosina fenlica Serina, treonina-alcohol, sacarido-alcohol (p.ej. Ribosil 2 en ARN) Cistena HexosaminaManNH2,GalNH,GlcNH2 Protena N- terminal Lysina Histidina (pirimidina) Adenosina (purina) Guanosina (purina) Uridina (piramidina) Timidina (pirimidina) Adenosina (purina) Guanosina (purina) Guanosina (purina) Una base de cido nucleico -NH, o un imidazol incluido en la unin con la ribosa Histidina Arginina Pptido pKa 3,5-4 4-5 4-5 3-4,4 2,6 3,8(3,9) Sin datos (probablemente <-0,5) 1,3 6,8 Pk1 0,94-2,10 Pk2 6,11-6,75 Probablemente similar al cido nucleico 12,3-13,0 >13

grupos estn sujetos a posibles cambios post- traduccin por metilacin in vivo y esto afectar a todas sus caractersticas de carga. Existirn centros de carga positiva en los cidos nucleicos en los grupos amino de los anillos protonados de la purina o de la pirimidina o en el nitrgeno heterocclico tambin protonado. Los polisacridos considerados como grupo son macromolculas cidas o neutras con escasos grupos funcionales bsicos, apareciendo como aminoazcares no acetilados. La quitina es un ejemplo notable en la que una proporcin de los residuos de glucosamina estn no acetilados, lo que facilita la formacin de quitosano deacetilado, con una alta proporcin de centros de carga positiva protonable. Algunas de las constantes de ionizacin representativas para algunos de estos grupos se pueden observar en la Tabla I. La formacin de complejos entre grupos funcionales orgnicos de biopolmeros adsorbentes y tomos metlicos implica la presencia en los restos orgnicos de uno o varios tomos que tengan un par de electrones solitarios para donar. Entre ellos, los ms probables sern tomos neutros trivalentes de nitrgeno y tomos de oxgeno y de azufre neutros y divalentes que existen en una amplia diversidad de grupos amino, imino y nitrgenos heterocclicos de las protenas y los cidos nucleicos, en los grupos carbonilo y en los oxgenos hidroxilados distribuidos en protenas, cidos nucleicos, polisacridos, polifenoles y poliheterociclos y, finalmente, en el azufre del grupo tiol y del grupo tioter de los aminocidos cistena y metionina, respectivamente.
1.2. Biopolmeros de residuos industriales para la bioadsorcin de metales

Sulfhidrilo Amino Amino Amino Amino Amino Amino Lactam-NH Lactam-NH Lactam-NH Lactam-NH Imidazol- NH

10 7,3/7,7/7,85 7,5-8 10 4,11 3,45 1,6 9,17 9,8 3,6 9,2 2,3

Imidazol Guanidino-NH2 Imino

6-7 12 13

dad para acumular metales por procesos de bioadsorcin, ya que poseen biopolmeros con grupos funcionales con afinidad para unir metales presentes en las aguas. Dada la complejidad de la mayor parte de los biopolmeros, en la unin entre los iones metlicos y los biopolmeros pueden intervenir simultneamente diferentes tipos de procesos fisicoqumicos: intercambio inico, formacin de complejos de coordinacin, adsorcin fsica, procesos de microprecipitacin, reacciones redox. En cuanto concierne al intercambio de cationes metlicos en disolucin acuosa, los principales grupos ionizables de

unin catinica en los biopolmeros son carboxilo, fosfato y sulfato orgnicos. As, a modo de ejemplo, el grupo carboxilo est distribuido ampliamente en los biopolmeros y se encuentra casi siempre como constituyente de las cadenas laterales de las protenas, as como en los cidos urnico, neuramnico, murmico y monosacridos sustituidos relacionados de los polisacridos. El intercambio de aniones metlicos puede tener lugar por medio de una amplia variedad de compuestos orgnicos basados en nitrgeno. En las protenas, los grupos amino, imidazol y guanidina son sitios comunes de carga positiva. Todos estos

Los biopolmeros naturales han existido siempre; estas macromolculas producidas por el metabolismo de seres vivos datan de ms de 3.000 millones de aos. El uso de estos polmeros para el intercambio inico no es en absoluto

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nuevo. Baste decir que aparece ya una cita en el Exodo (15:23-25), en la que se comenta cmo Moiss, tras ser aconsejado por Jehov, arroj un tronco de rbol seco a las aguas saladas del ro Marah convirtindolas en aguas dulces. Durante mucho tiempo a lo largo de la historia se us la arena y la turba como material de intercambio inico, pero no fue hasta el ao 1912 cuando se pens que esta capacidad para remover iones se deba a los grupos cidos. El estudio de los polmeros sintticos es muy reciente; tan slo abarca el siglo XX. Aunque el poliestireno se sintetiz en 1839, el polietilnglicol en 1860 y el polimetilmetacrilato en 1880, la percepcin generalizada de las macromolculas no se dio hasta los aos 20 [3]. De hecho, el primer material de intercambio inico sinttico no se produce hasta el ao 1903 por Harm y Rumpler [4], pero el uso de fragmentos de discos de gramfono rotos como intercambiadores inicos, por Adams y Holmes [5], no se produce hasta el ao 1935, arrancando as la sntesis de intercambiadores sintticos propiamente dichos. Aunque la mayora de los biopolmeros presentan propiedades de intercambio inico, lo cierto es que no se han utilizado mucho con este fin hasta que salieron al mercado los materiales semisintticos para el intercambio inico. Los biopolmeros son en la actualidad muy usados en las separaciones bioqumicas, por ejemplo para el fraccionamiento de protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Y la mayora, por no decir todos, de estos materiales de intercambio inico son polisacridos. En 1931 Kullgren [6] fue posiblemente el primero en aplicar para fines analticos las propiedades como intercambiador inico de la celulosa modificada al comprobar que la celulosa tratada con sulfito era capaz de eliminar los iones de cobre que existieran en el agua y que adems estos iones de cobre podan recuperarse despus mediante un tratamiento cido. As, desde los aos 50, celulosas tanto de intercambio aninico

como catinico, dextranos y otros polisacridos marinos se han comercializado con una gran variedad de grupos de intercambio. Mucho ms recientemente ha comenzado a existir cierto inters por la quitina y su derivado el quitosano como agentes de unin inica [7] aplicables para gran variedad de usos en la industria. Alginatos Existen varios estudios acerca de la capacidad de adsorcin de los alginatos o de otros componentes de las algas [7]. De hecho, los alginatos funcionan como una mezcla de resinas de intercambio inico, producindose en ellos procesos de intercambio aninico-catinico y de adsorcin. En muchos casos, la unin a ciertos metales es funcin directa del pH, la presencia de ligandos competidores o de iones [8]. Aderhold y col. [9] estudiaron la capacidad de eliminacin de metales como el cobre, plomo, nquel, zinc y cadmio por algas fefitas como Ecklonia mxima, Lessonia flavicans y Durvillea potatorum. En estos experimentos, se constata la necesidad de encontrar una relacin entre los porcentajes de adsorcin para aguas sintticas (con un solo metal) y aguas residuales fuertemente contaminadas con varios metales y, por tanto, susceptibles de sufrir fenmenos de competencia. Se han establecido unos valores de pH en torno a 4 para la adsorcin de la mayora de los iones catinicos. Sin embargo, tambin se ha visto que, para la eliminacin de ciertos metales como el Au III, Ag I y el Hg II, el pH es muy poco influyente [10]. Carvalho y col. [11] demuestran que en algas los alginatos no son los absolutos responsables de los procesos de adsorcin, tras haber estudiado comparativamente la capacidad de adsorcin de Cu, Cd y Zn por clulas de Ascophyllum nodosum. Celulosa y derivados Shukla y Sakhardande [12] llevaron a cabo estudios sobre la adsorcin de diferentes cationes

metlicos (Fe2+, Fe3+, Pb2+, Hg2+) sobre materiales celulsicos tales como fibras de algodn, pulpa de bamb blanqueada, fibras de yute y serrn, comprobndose niveles de bioadsorcin de hasta el 96% en algunos casos. Otros materiales celulsicos abundantes, baratos y de origen agrcola, pueden eliminar cantidades considerables de iones metlicos de las disoluciones acuosas. En este sentido, Eromosele y Otitolaye [13] utilizaron las cscaras de las semillas de la planta silvestre Butyrospermun Parkii, disponibles en grandes cantidades como subproducto que se desechaba, comprobando su capacidad para bioadsorber iones hierro, cinc y plomo de disoluciones acuosas. Asimismo, las pieles de las almendras, subproducto de las industrias de repelado de almendras, debido a su elevado contenido en celulosa, podran encontrar aplicacin en la eliminacin de metales txicos de aguas residuales industriales. La celulosa es insoluble en la mayora de los disolventes, pero puede disolverse si se bloquean los grupos hidroxilos como aductos de sulfuro de carbono, el anlogo con azufre del CO2. El grupo funcional restante se denomina xantato, y stos tambin han sido estudiados como productos fcilmente obtenibles a partir de residuos industriales como el serrn, pulpa de maz, paja y cartuchos de filtros de celulosa. En este sentido, Holland [14] observ que la capacidad de eliminacin de metales variaba en funcin del nmero de grupos hidroxilo bloqueados, y que adems existan complicaciones como el fuerte olor producido por la descomposicin de los xantatos, la gran cantidad de agua de lavado que era necesario utilizar, etc. Concluy que exista una imposibilidad prctica de desarrollar estos procesos a gran escala. Pectinas Las pectinas son heteropolisacridos que se encuentran como sustancias cementadoras en las paredes celulares y en las capas intercelulares de todas las plantas terrestres,

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entre ellas la remolacha azucarera. Qumicamente estn formadas por polmeros del cido galacturnico, parcial o totalmente esterificado con metanol. El polmero totalmente desmetilado se denomina cido pctico y sus sales pectatos. La pulpa de la remolacha azucarera es un residuo abundante y barato de las industrias azucareras y es capaz, gracias a su contenido en pectinas y mediante procesos de intercambio inico, adsorcin y quelacin, de atrapar metales pesados de las aguas (Cu2+ eficacia similar que para el Pb2+, ambos ms eficaces que para el Cd2+ que es similar al Zn2+, Ni2+ y al Ca2+) [15]. Asimismo, la pectina extrada de dicha pulpa, despus de procesos de acilacin por simple hidrlisis alcalina, acumula Cd2+ tan eficazmente como el alginato, eluyndose con cloruro clcico 0,3 M [16]. Levaduras Los residuos de levaduras como subproductos de las industrias de fermentacin (cerveza, antibiticos, etc.) presentan una afinidad notable por los iones metlicos en disolucin (Zn, Cd, Ni, Pb, Cr, Ag.), afinidad que es funcin del pH, y se pueden utilizar, por tanto, en procesos de bioadsorcin para la descontaminacin de aguas con metales [17]. La utilizacin de biomasa fngica para los estudios de biorremediacin se basa en la capacidad de las paredes de estos microorganismos (cuyos componentes ms significativos son los polisacridos quitina y (1, 3) -D-glucano) para bioadsorbedor los metales pesados independientemente de los procesos internos que estn sucediendo en la clula, es decir, que se puede partir de biomasa muerta sin alterar las propiedades y beneficiarse as de su mayor facilidad de uso. Los procesos comunes son de intercambio inico y la capacidad de adsorcin puede ser manipulada por una serie de mecanismos fsicos y qumicos que tienen lugar a nivel de la superficie celular. Esta biomasa puede ser utilizada en biorreactores de lecho empaquetado o de flujo continuo [18].

Estudios llevados a cabo por Guibal y col. [19] mediante espectroscopia IR han demostrado la unin del catin uranilo a los grupos amino del quitosano de la pared celular de varias biomasas tpicas de algunas fermentaciones industriales, como son Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum y Mucor miehei. Esta unin del uranilo a los sitios amino les confiere una estructura similar a la de los grupos amida, por lo que la unin del metal provoca cambios en las intensidades relativas de las bandas amina o amida. La complejacin del uranilo por los ligandos amino estn gobernados por el pH. Asimismo, Tsezos y Volesky [20] ya citaron algunas de las propiedades de unin del uranio a Rhizopus arrhizus, sealando que los procesos de adsorcin a las paredes de quitina de dicho hongo por parte del uranilo ocurren de forma muy rpida, mientras que la precipitacin de hidrxido de uranilo dentro de la estructura de la pared celular se da en ms baja proporcin. Asimismo sealaron que se daban procesos de interferencia con otros iones como hierro y zinc. En el ao 1995, Simmons y col. [21] realizaron estudios referentes a las capacidades de unir metales de la levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae), que ser uno de nuestros materiales de estudio, y de Candida albicans, obtenidas como residuos industriales. En dicho estudio, ya se encontraron notables diferencias entre diferentes cepas de Saccharomyces (con diferentes estructuras en su pared celular) y entre sta y Candida en la eliminacin de metales (cobre, plata) de las aguas. As, la adsorcin de Cu II est fuertemente influida por el pH [22]. Mediante el uso de electrodos selectivos de iones, se observ la liberacin de gran cantidad de agentes complejantes de cobre (posiblemente protenas y carbohidratos). En contraste con esto, estos agentes no presentaron actividad complejante con la plata. Incidiendo ms en Saccharomyces, Brady y col. [23] estudiaron

sus propiedades ms particularmente llegando a la conclusin de que se trataba de un buen agente bioadsorbente a pH entre 5-9. Simmons y col. [24] han estudiado la respuesta de Saccharomyces frente a la adsorcin de plata en funcin de la edad de la biomasa. Llegaron a la conclusin de que aquellas cepas ms viejas presentaban valores ms bajos de eliminacin de metales que las ms jvenes, y esto debido fundamentalmente a un descenso en el nmero de complejos de plata en el interior de la clula. De esta manera, queda claro que en estos procesos interviene no slo la pared externa del hongo sino tambin su interior, presentando agentes que aumentan la eficacia del proceso de eliminacin. De ah tambin que se haya observado una mayor eliminacin usando biomasa formada por clulas completas que aquella formada slo por pared celular. 2. Materiales y mtodos Materiales Los reactivos cido sulfrico, cido clorhdrico 35% (Panreac, Barcelona, Espaa), hidrxido sdico, nitrato de uranilo hexahidratado (UO2(NO3)2.6H2O) (Merck, Darmstadt, Alemania), arsenazo III, plomo en polvo (Fluka Chemie Gmbh, Buchs, Suiza), Tritn X100 (Sigma Chem. Co.), Hypol 2002 (Grace Service Chemicals Gmbh, Heilderberg, Alemania), agua de calidad ultrapura Milli-Q (Millipore) se obtuvieron de las mencionadas fuentes. Varias muestras hmedas de Saccharomyces cerevisiae fueron donadas por el grupo Cruz Campo S.A. (Sevilla). Estas levaduras exhaustas se recogieron de los fermentadores industriales de la empresa y se conservaron en cmara frigorfica a 4C. Aguas de minas Las tomas de muestra de las aguas de corta de las minas se llevaron a cabo en la primavera de 1999 transportndose y almacenndose a

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temperatura ambiente en bidones de PVC previamente lavados con cido clorhdrico 2N. Estas muestras de agua procedan de las cortas de las siguientes minas: 1) Mina Feli o Alabancos en el distrito minero de Barruecopardo-La Fregeneda (La Fregeneda, Salamanca), con los minerales casiterita (Sn02), wolframita [(Fe,Mn)W04], arsenopirita (FeAsS), pirita (FeS2), lepidolita [K2Li3A14Si7021(OH,F)3]. 2) Mina Merladet en el distrito minero de Barruecopardo-La Fregeneda (Barruecopardo, Salamanca) con los minerales scheelita (CaW04), wolframita, arsenopirita y pirita. 3) Mina Terrubias en el distrito minero de Morille Martinamor (San Pedro de Rozados, Salamanca), con los minerales scheelita, wolframita y casiterita. 4) Mina Alegra en el distrito minero de Morille Martinamor (Morille, Salamanca), con los minerales scheelita, wolframita, casiterita. 5) Mina Dorinda en el distrito minero del Granito de Ricobayo (Villalcampo, Zamora), con el mineral casiterita. 6) Mina Fe de ENUSA en el distrito minero de Ciudad Rodrigo (Saelices el chico, Salamanca), con los minerales pechblenda [Complejo], pirita y marcasita (S2Fe). Instrumentacin Los instrumentos y equipos utilizados en este trabajo han sido: agitadores magnticos BUNSEN MC-8, pHmetro CRISON micro 2001, equipo de ultrasonidos Granzn 2200, centrfugas Centrolit "Selecta P" y Centromix, pipetas automticas Biohit Proline, filtros Millipore, Millex-Gs Sterile 0,22 mm, picadora Moulinex, balanzas Mettler Toledo AB204 y Precisa 600C, horno de secado WTB Binder, reactores de vidrio y metacrilato de tanque y columna, bombas peristlticas GILSON Miniplus 2 e Ismatec, conductmetro, salinmetro, turbidmetro y termmetro (sonda multiparamtrica WTW Profilab), equipo de ecotoxicidad GEM Biochemical Inc. Bacterial Systems "BG-1", espectrofotmetro UV-Visible Hitachi 150-20, equipo de anlisis cuantitativo de metales y otros elementos qumicos por ICP Plasma (Servicio Central de Anlisis de la Universidad de Salamanca), espectrofotmetro de absorcin atmica (amablemente cedido por el Dpto. de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa de la Universidad de Salamanca). Preparacin de la biomasa de Saccharomyces cerevisiae En los experimentos de bioadsorcin, esta biomasa se utiliz: a) En forma libre, sin ninguna modificacin, es decir suspendindola directamente en las aguas contaminadas con metales y despus separndolas por centrifugacin. b) Inmovilizada fsicamente en el polmero sinttico espuma reticulada de poliuretano. Inmovilizacin de las levaduras La inmovilizacin de las clulas de Saccharomyces cerevisiae se llev a cabo por atrapamiento fsico de las mismas en espuma reticulada de poliuretano, quedando el microorganismo fsicamente incluido dentro de la matriz del polmero fuertemente entrecruzado. Esta matriz se sintetiza a partir de un poliisocianato hidrfilo (Hypol 2002) suministrado por Grace Service Chemicals Gmbh (Heidelberg, Alemania). El procedimiento experimental de inmovilizacin de clulas consisti en: 1) Disolver 1,00 g de levadura liofilizada en 40,0 cm3 de disolucin de NaCl (8,5 g/1), determinando su contenido en protena (mg protena/cm3) mediante el mtodo de Lowry. 2) Mezclar lentamente, sin dejar de agitar, los 40,0 cm3 de Saccharomyces con 20,0 g del prepolmero Hypol 2002. 3) Dejar reposar durante 10 min. 4) Cortar la espuma reticulada de poliuretano con clulas atrapadas en pequeas lminas o cubos, conservndose en la disolucin de NaCl (8,5 g/1) a 4C. Sntesis de la espuma reticulada de poliuretano La sntesis de la espuma reticulada de poliuretano se llev a cabo en las mismas condiciones y siguiendo el mismo procedimiento experimental antes visto, con la excepcin de que en este caso la mezcla se hacia con 40,0 cm3 de NaCl (8,5 g/1) ms 20,0 g de Hypol 2002. Esta matriz plstica, vaca del microorganismo, servir de control en todos los experimentos a fin de evaluar la posible adsorcin de los metales sobre la matriz polimrica de poliuretano. Anlisis fisicoqumico, qumico y radiolgico de las aguas Los parmetros fisicoqumicos que se determinaron (unos in situ y otros en el laboratorio) en las aguas de mina fueron la temperatura, el pH, la conductividad especfica, el oxgeno disuelto, la turbidez, la demanda qumica (DQO) y demanda bioqumica de oxgeno (DBO) siguiendo los mtodos habituales (Standard Methods) para el anlisis de aguas y aguas residuales [3]. El anlisis qumico cualitativo de las aguas se llev a cabo obteniendo de las muestras su residuo seco por calentamiento en estufa a 98 C y efectuando, asimismo, una precipitacin qumica selectiva, variando progresivamente el pH. Sobre los residuos secos y los precipitados obtenidos se proceda a un anlisis qumico por Barrido Energtico de Dispersin de Rayos X (EDAX). El anlisis qumico cuantitativo de las muestras de aguas se llev a cabo por Espectroscopia de Emisin de Inductividad Acoplada de Plasma (ICP plasma) en el Servicio Central de Anlisis de la Universidad de Salamanca. Con el fin de confirmar la posible radiactividad de algunas muestras de agua, por el Laboratorio de Radiactividad Medioambiental de la Universidad de Salamanca se determinaron (con rplicas) las radiactividades y de muestras de aguas cidas de la corta 1 de la mina Fe de ENUSA para extraccin de uranio. Se siguieron mtodos estndar [3], mejorados por Morn y col. [25-27].

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Anlisis ecotoxicolgico de las aguas Segn el test de bioluminiscencia de Photobacterium phosphoreum (test de Ames), se considera que una muestra lquida es txica cuando se produce una inhibicin de la luminiscencia de dichas bacterias superior a un 20% (umbral de toxicidad) en el anlisis llevado a cabo a 15C y en 15 min. La cuantificacin de la toxicidad de las muestras se realiza de acuerdo al EC50 (concentracin efectiva mxima: valor de dilucin de la muestra para la cual se produce una inhibicin del 50% de la luminiscencia) y segn la norma ANFORT T-90-320. Anlisis qumico del catin UO22+ Se utiliz un sistema de inyeccin en flujo (FIA) de dos canales con un punto de confluencia. El portador era una corriente de 3,6 M HCl, mientras que por el canal del reactivo circulaba una corriente de 2.0.10-4 M Arsenazo en 3,6 M HCl y en presencia de Tritn X-100 al 1%. El caudal de las corrientes de portador y reactivo era de 2.0 cm3/min. El anlisis del catin uranilo en las aguas se realiza mediante un mtodo rpido y sensible [28], que evita una manipulacin para conseguir la reduccin de U(VI) a U(IV) al insertar una minicolumna reductora de plomo dentro del sistema FIA [29]. Las disoluciones patrn y las muestras se introducan en el sistema FIA mediante una vlvula de inyeccin (100 l) para pasar, a continuacin, esta disolucin de uranio (VI) a travs de la columna reductora de plomo insertada en el canal de entrada de muestra (CR, 2 mm de dimetro interno y 5,5 cm de longitud), producindose la reduccin a uranio (IV), evitando as el contacto con el oxgeno del aire. Posteriormente, el bolo de muestra conflua con la corriente de reactivo y en su paso por el reactor helicoidal (1 m) se formaba el complejo U(IV) - Arsenazo III cuya absorbancia se registraba a la longitud de onda de 665 nm. La medida de la altura de los picos obtenidos para cada una de las disoluciones inyectadas est directamente rela-

Cu residual/mg/l

Tiempo/min
Figura 1. Cintica de bioadsorcin del Cu de la disolucin acuosa cida en contacto con Saccharomyces sp. a distintas concentraciones iniciales del metal

cionada con la cantidad de muestra inyectada y con la concentracin de uranio en la misma. Procedimiento experimental para las cinticas y las isotermas de bioadsorcin Los experimentos cinticos de bioadsorcin se llevaron a cabo a 20C mediante incubacin con la biomasa (25 g) en reactor de tanque agitado (120 r.p.m.) de 5 disoluciones acuosas de 10 l de volumen cada una y de concentraciones diferentes en un nico metal (entre 114 y 0,6 mg/1). La toma de muestras de agua (alcuotas de 10 cm3) se efectu a tiempos prefijados entre 0 y 24 h, separando la levadura por centrifugacin y estabilizando cada disolucin del metal sobrenadante aadiendo otros 10 cm3 de 0,01 M H2SO4. Los experimentos de equilibrio (isotermas de bioadsorcin) se efectuaron en lotes en presencia de una concentracin constante de biomasa. El equilibrio se consider alcanzado a 20C en un periodo de una hora de incubacin, tras el cual se extraa una muestra de la disolucin acuosa en la que medir la concentracin del metal. El anlisis de los metales en estas disoluciones cidas sobrenadantes se realizaba mediante espectrofotometra de absorcin atmica a la llama, a excepcin hecha del Al que se analizaba por espectrofotometra

UV-Visible, siguiendo el mtodo de la eriocromocianina-R y realizndolo en continuo mediante anlisis por inyeccin en flujo (FIA). Ajuste estadstico de los datos El ajuste de los datos cinticos y de equilibrio de bioadsorcin a diferentes ecuaciones y modelos se ha llevado a cabo con el paquete de software cientfico SIMFIT, cuyo autor es el Prof. W.G. Bardsley de la Universidad de Manchester (Reino Unido). 3. Resultados y discusin
3.1. Caracterizacin fisicoqumica, ecotoxicolgica y qumica de las aguas de mina

Dado que el objetivo inicial del estudio era identificar y caracterizar aguas cidas de minas en la cuenca del ro Duero y ms concretamente en las provincias de Salamanca y Zamora, tras la toma de muestra de agua de cada una de las seis minas, se comprob que las aguas de las cortas de las minas Merladet y F eran las nicas aguas cidas y ecotxicas con las que contar para nuestros estudios posteriores de biorremediacin de las mismas (Tabla II). Con el propsito

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Tabla II. Parmetros fisicoqumicos de las diferentes aguas de minas evaluadas Aguas de mina T C pH O2 Conductividad soluble mg/l mS/cm 12,2 100 12,5 8,8 0.91 6.4 349 60,2 11,3 Turbidez Acidez Ecotox u.nefelom. mgCaC03/l equitox/m3 Radioactividad Bq/1

de conocer la composicin qumica de tales aguas cidas, se efectuaron anlisis qumicos cuantitativos por espectroscopia de emisin de inductividad acoplada de plasma (ICP), con los resultados que se recogen en la Tabla III. Como principales conclusiones de este primer estudio cabe comentar que se demuestra una estrecha correlacin entre el pH cido y la concentracin de metales en las aguas. As, las aguas de corta de pH cidos (mina Merladet y F) son las

Merladet F Feli Terrubias Alegria Dorinda

12,9 9,0 20,6 11,6 11,8 11,2

3.16 3.10 6.8 6.45 6.45 6.9

0,91 15

96,0 100

14.6 69.2 (-) (-) (-) (-)

0 978 11 0 0 0 0

DQO y DBO5 fueron nulos para todas las aguas, es decir, no contaminacin orgnica.

Tabla III. Anlisis cuantitativo de los elementos qumicos componentes de las aguas de corta de las minas F y Merladet (concentraciones expresadas en ppm) AGUA S Mg 781,7 38,56 Ca 267,9 119,0 Na 34,89 25,24 K 6,36 3,97 Li 0,63 0,19 Si 12,13 28,58 Mn 114,1 3,1 Al 89,43 8,76 Fe 6,26 2,39 Zn 7,12 3,6 Cu 0,54 0,50 Ni 4,68 0,50

F 1501,8 Merladet 176,80

Concentracin de catin uranilo en las aguas de la mina F: 40 mg/l.

Tabla IV. Porcentajes mximos de metal bioadsorbido de disoluciones acuosas cidas de un nico metal en incubacin en discontinuo (batch) con Saccharomyces sp. y a diferentes concentraciones iniciales del metal. Cu Co mg/l 84 17 7 2 0,8 % 53 45 47 70 42 Co mg/l 111 19 5 2 0,6 Mn % 43 61 48 62 61 Co mg/l 114 15 6 1,5 0,6 Ni % 40 44 48 43 36 Co mg/l 107 24 6 2 0,8 Zn % 76 71 66 64 58 Co mg/l 84 17 7 1,3 0,7 Al % 100* 100* 30 100* 26

que presentan mayores niveles de metales y de sulfatos en disolucin (datos no mostrados), siendo, adems, las nicas aguas de las minas analizadas que dan positivo el test de ecotoxicidad de Ames. Los principales metales existentes en estas aguas son aluminio, manganeso, hierro, nquel, cinc y cobre, estando el agua cida de la mina F significativamente ms contaminada (2870 mg/l de carga qumica inorgnica) que el agua de la mina Merladet (411 mg/l carga qumica) y poseyendo aqulla, adems, una caracterstica diferenciadora, que es la presencia de catin uranilo UO22+ (40 mg/1). Adems, se puede observar que las aguas examinadas muestran un cierto grado de mineralizacin (conductividad especfica ms bien baja), escasa turbidez y elevado grado de oxigenacin.
3.2. Bioadsorcin de metales de aguas cidas sintticas

*Muestras contaminadas con Cladosporium sp.

Tabla V. Porcentajes mximos de metal bioadsorbido de las aguas cidas de la mina Merladet (Barruecopardo, Salamanca) por Saccharomyces cerevisiae en suspensin libre Cu Co 94 55 30 7 1,8 0,9 0,5 % 12 5 16 39 47 77 >80 Co 110 67 33 11 5 4 3 Mn % 2,4 38 37 3,5 0,2 2,7 3,2 Co 87 61 36 9 2,6 1,0 0,5 Ni % 42 15,8 44 9 11 16 40 Co 118 70 45 12 5,4 4 3,6 Zn % 12 7 0 0 0 0

Co: concentraciones expresadas en p.p.m.

Considerando la abundancia y el bajo coste del residuo de levaduras cerveceras, se eligi esta biomasa de

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Saccharomyces cerevisiae como primer candidato con el que estudiar la biorremediacin de estas aguas cidas de minas. Dado que Al, Cu, Mn, Ni y Zn eran los metales mayoritarios, el primer experimento consisti en estudiar la selectividad, la cintica y el equilibrio de bioadsorcin de cada uno de estos cinco metales disueltos en agua destilada de pH cido (3.3-4.5) por las levaduras exhaustas de cerveza. Los resultados de este estudio se recogen en las figuras 1 (para el caso del Cu a modo de ejemplo) y 2 y en la Tabla IV y de ellos se pueden deducir las siguientes conclusiones: 1) En cuanto a la selectividad de la biomasa por los distintos metales y su capacidad de bioadsorcin (Tabla IV), se comprueba que los mayores porcentajes de eliminacin corresponden al Zn (76%) seguido de Cu (70%), Mn (62%), Ni (48%) y Al (30%). 2) Las cinticas de eliminacin de cada metal disuelto en el agua sinttica por bioadsorcin sobre Saccharomyces sp. son de primer orden respecto de la concentracin del metal ([Metal]disolucin = Ae-kt + C), alcanzndose el equilibrio en los primeros 15-20 minutos, lo que apunta a un proceso rpido de adsorcin superficial del metal sobre la biomasa. Para el caso de la bioadsorcin del Cu, k = 0,139 min-1, es decir que el 50% de bioadsorcin del metal sobre la levadura se consigue a los 5 min de proceso (t1/2). 3) Las isotermas de bioadsorcin de los metales sobre la biomasa (Fig. 2) parecen ajustarse al comportamiento de Langmuir [Metaladsorbido/masa adsorb e n t e = K b [ M e t a l ] equilibrio/ (1+K[Metal]equilibrio)]. Las constantes de afinidad para la unin metal-bioadsorbente son: K=7,29 (Zn), 3,65 (Cu), 3,31 (Mn) y 3,20 (Ni) dm3/mmol, y las constantes de capacidad de unin: b = 0,076 (Zn), 0,069 (Cu), 0,060 (Mn) y 0,059 (Ni) mmol/g. Se propone que en el proceso de bioadsorcin participan mayoritariamente interacciones fisicoqumicas especficas (de tipo intercambio inico, coordinacin, complejacin de metales), si bien interacciones ms fsicas y lbiles y menos espeFigura 2. Isotermas de bioadsorcin de los metales de la disolucin acuosa cida por la accin de Saccharomyces sp. en suspensin libre

cficas (efecto hidrofbico, polares, van der Waals) entre el catin metlico y los distintos grupos funcionales sobre la superficie del microorganismo pueden tener un menor grado de participacin. 4) Durante los experimentos de bioadsorcin de los metales disueltos por las levaduras, el pH de las aguas aumentaba de manera espontnea desde sus valores iniciales (pH 3.3-4.5) hasta alcanzar valores en torno a 5.5-6.0 (datos no mostrados). Es decir, el proceso de bioadsorcin del metal sobre las levaduras neutralizaba parcialmente dichas disoluciones acuosas cidas.

De la curva de valoracin (pH frente a NaOH aadido) de la biomasa disuelta en agua (datos no mostrados), se ha deducido la existencia en ella de al menos cuatro grupos qumicos cido-base, con pK aparentes 3,7, 4,5, 6,8 y 9,5. Conviene citar como de especial inters el hecho de que al realizar el experimento de bioadsorcin del aluminio sobre las levaduras, los sobrenadantes de algunas muestras alcuotas separadas del biorreactor y una vez filtradas y aciduladas con 0,01 M H2SO4 se contaminaron con un microorganismo, que posteriormente se iden-

Cu elim/ mmol/g

Cu residual/ mM
Figura 3. Isoterma de adsorcin tipo Langmuir del Cu del agua cida de la mina Merladet por Saccharomyces cerevisiae en suspensin libre

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Tratamiento de Aguas Residuales

tticas, se propone que en el proceso de bioadsorcin participan mayoritariamente interacciones fisicoqumicas especficas (de tipo intercambio inico, coordinacin, complejacin de metales), si bien interacciones ms fsicas y lbiles y menos especficas (efecto hidrofbico, polares, van der Waals) entre el catin metlico y los distintos grupos funcionales sobre la superficie del microorganismo puedan tener un menor grado de participacin. 4) Durante los experimentos de incubacin de las aguas cidas de corta con las levaduras, el pH de las aguas aumenta de manera espontnea desde sus valores iniciales (pH 3.3) hasta alcanzar valores en torno a 4.0-4.6 (datos no mostrados). Es decir, el proceso de bioadsorcin del metal sobre las levaduras neutraliza parcialmente dichas aguas cidas de mina. 5) Comparando los procesos de bioadsorcin de metales por Saccharomyces sp en aguas sintticas y en aguas de la mina Merladet (aunque dopadas) se observan valores muy similares en cuanto a la eliminacin de los metales Cu y Ni, siendo, sin embargo, sensiblemente menor la eficacia del proceso con aguas reales para el caso del Mn y nula para los dems metales. Se postula una interferencia antagonista sobre la bioadsorcin de un metal por la presencia simultnea de otros metales.
3.4. Eliminacin de la ecotoxicidad del agua de mina por levaduras inmovilizadas

Tabla VI. Evolucin de la ecotoxicidad de las aguas cidas por incubacin con la matriz soporte vaca y cargada de clulas de Saccharomyces cerevisiae.

Muestra 200 cm3 agua cida 200 cm3 agua cida 200 cm3 lixiviado 200 cm3 lixiviado

Poliuretano ( levadura) 11,5 g (- Saccharomyces) 13,7 g (+ Saccharomyces) 11,3 g (- Saccharomyces) 13,6 g (+ Saccharomyces)

EC 50% Equitox/m3 14,63 8,20 -

tific como el hongo filamentoso Cladosporium sp. En consecuencia, los correspondientes resultados de eliminacin de Al por Saccharomyces cerevisiae fueron artefactos pero sorprendentes, ya que Cladosporium sp. elimin porcentajes del orden del 70% del Al presente en las aguas. Este hallazgo novedoso (no descrito en bibliografa) podra servir de base para futuros estudios de biorremediacin de aguas cidas con metales pesados por la accin de este microorganismo que, por otra parte, creci espontnea y notablemente en aguas de pH 2.0-3.5.
3.3. Bioadsorcin de metales de aguas cidas de mina

tes entre 118 y 0,5 mg/1. Aunque el anlisis y seguimiento se hace de un solo metal cada vez, en el agua de corta estn presentes los otros metales, adems de otras especies qumicas que pueden interferir o competir con el propio proceso de bioadsorcin por levadura (Tabla III). Los resultados de este estudio se recogen en la figura 3 (para el caso del Cu a modo ilustrativo) y en la Tabla V, y de ellos se pueden deducir las siguientes conclusiones: 1) En cuanto a la selectividad y capacidad de bioadsorcin de los distintos metales por la biomasa, se comprueba que los mayores porcentajes de eliminacin corresponden al Cu (80% eliminacin, es decir 0,19 mgCu/g bioadsorbente) seguido de Ni (25 %, 0,24 mgNi/g bioadsorbente) y Mn (3%, 0,026 mgMn/g bioadsorbente). 2) La cintica de bioadsorcin de los metales disueltos en el agua cida de mina por Saccharomyces sp. es rpida, siendo de primer orden respecto de la concentracin del metal ([Metal]disolucin = Ae-kt + C) y alcanzndose el equilibrio en los primeros 10-15 minutos (datos no mostrados), lo que apunta a un proceso rpido de adsorcin superficial del metal sobre la biomasa. 3) Las isotermas de bioadsorcin del Cu (Fig. 3) y los dems metales (datos no mostrados) sobre la biomasa parecen ajustarse al comportamiento de Langmuir [Metaladsorbido/masa adsorbente=Kb[Metal]equilibrio/(1+ K[Metal]equilibrio)]. La constante de afinidad para la unin Cubioadsorbente es K = 2,46 dm3/mmol y la constante de capacidad de unin b = 0,1 mmol/g. Al igual que con aguas cidas sin-

Conocida la selectividad, cintica y capacidad de bioadsorcin de cada metal disuelto en agua cida sinttica por la accin de Saccharomyces cerevisiae, en el siguiente estudio se pretenda comprobar dichos parmetros para los procesos de bioadsorcin de los metales que contaminan las aguas cidas reales de la mina Merladet (Barruecopardo, Salamanca) por la accin de las levaduras cerveceras. Los experimentos son anlogos a los realizados en el estudio anterior manteniendo las mismas condiciones y el mismo tipo de anlisis de las muestras. Dada la baja contaminacin metalognica de las aguas cidas de la corta principal de la mina Merladet (3,6 mg./l Zn, 3,1 mg/1 Mn, 0,5 mg/1 Cu, 0,5 mg/1 Ni segn Tabla III), las muestras de agua fueron dopadas cada una por separado con cada metal a estudiar su bioadsorcin hasta conseguir siete concentraciones diferen-

Los experimentos se llevaron a cabo en reactor discontinuo de tanque agitado a 120 r.p.m. y a temperatura de 20C con el agua cida de la mina Merladet (Barruecopardo, Salamanca) (0,06 mg/1 Al, 0,06 mg/1 Ni, 0,56 mg/1 Cu, 1,91 mg/1 Zn, 2,91 mg/1 Mn) y con un lixiviado de lodo de la mina (0,04 mg/1 Cu, 0,20 mg/1 Zn, 0,19 mg/1 Mn), tratados segn el mtodo oficial B.O.E. 10/ 11/89 de anlisis de ecotoxicidad. Los resultados del estudio de la evolucin de la ecotoxicidad del agua y del lixiviado

abril 03

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de la mina de Barruecopardo tras su incubacin con el soporte de poliuretano sin y con clulas de Saccharomyces se recogen en la Tabla VI. Como consecuencia de este estudio se pudo extraer la conclusin de que dicha agua cida ecotxica por el hecho de incubarla con levaduras cerveceras atrapadas en espuma de poliuretano dejaba de serlo. 4. Conclusiones 1. Tras evaluar la composicin qumica y los estados fisicoqumico y ecolgico de las aguas superficiales de las cortas de una serie de minas a cielo abierto de las provincias de Salamanca y Zamora, se ha podido concluir que nicamente son aguas cidas contaminadas con metales pesados txicos las aguas de las minas F (Saelices el Chico, Salamanca) (con U, Al, Cu, Mn, etc.) y Merladet (Barruecopardo, Salamanca) (con Al, Mn, Zn, Cu). 2. Tras investigar la cintica y el equilibrio de eliminacin de metales de las aguas cidas de la mina Merladet mediante procesos de bioadsorcin sobre residuos industriales de levaduras de cerveza (Saccharomyces cerevisiae), se puede proponer, en principio, a estos residuos, abundantes y baratos, como agentes activos eficaces para la biorremediacin de este tipo de aguas contaminadas con metales. Adems, estos biorresiduos se han demostrado eficaces a la hora de rebajar o anular los niveles de ecotoxicidad y radioactividad de estas aguas cidas de mina. 5. Bibliografa
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Agradecimientos A Iberdrola Instituto Tecnolgico y al Centro de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico del Agua (CIDTA) de la Universidad de Salamanca por la concesin de una beca. Al Director y personal del CIDTA por su eficaz colaboracin, asesoramiento y cesin temporal de sus equipos e instalaciones para el desarrollo de algunas de las tareas del programa de trabajo. Al Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa de la Universidad de Salamanca por la cesin de sus espectrofotmetros de Absorcin Atmica. A las empresas donantes de las aguas cidas y de los residuos biolgicos utilizados en este proyecto: Empresa Nacional del Uranio S.A. (ENUSA) (Saelices el Chico, Salamanca), Merladet S.A. (Barruecopardo, Salamanca), Grupo Cruz Campo S.A. (Sevilla), por su excelente colaboracin. Al Prof. William G. Bardsley por la cesin gratuita de la ltima versin del paquete SIMFIT.

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