Apostila

Bioqumica dos Sistemas Cardiovascular e Respiratrio

Professores: Russolina Zingali Robson Monteiro

SUMRIO

UNIDADE 1. Metabolismo do Miocrdio ........................................... UNIDADE 2. Sistema Hemosttico .................................................... UNIDADE 3. Regulao do Processo Hemosttico ......................... UNIDADE 4. Testes de Hemostasia ................................................... UNIDADE 5. Hemcias e Grupos Sanguneos .................................. UNIDADE 6. Metabolismo da Hemcia .............................................. UNIDADE 7. Hemoglobina e Mioglobina ...........................................

pg. 03 pg. 19 pg. 47 pg. 67 pg. 75 pg. 87 pg. 104

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................

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ANEXOS I. Anemia e ndices Hematimtricos .................................................. II. Aula Prtica 1 Testes de Hemostasia ........................................ III. Aula Prtica 2 ndices Hematimtricos e Determinao de Grupo Sanguneo ................................................................................ pg. 143 pg. 125 pg. 140

UNIDADE 1

1. METABOLISMO DO MIOCRDIO
1.1. INTRODUO O corao necessita de energia diariamente para poder exercer a sua funo de bombear o sangue por todo o corpo humano e, assim, perfundir os tecidos. Para que isso ocorra em harmonia, necessrio que haja uma oferta contnua de oxignio e substratos energticos, o que obtido atravs da circulao coronariana. A utilizao de cada substrato pelo corao definida tanto pela concentrao arterial de cada um deles, quanto pela demanda energtica do miocrdio em determinado momento. 1.2. COMBUSTVEIS DO CORAO HUMANO As principais fontes de energia do corao so carboidratos e cidos graxos, os quais so utilizados em maior proporo nos estados ps-prandial e de jejum, respectivamente. Em jejum, ou no perodo entre as refeies, o nvel de cidos graxos livres no sangue alto, e estes so preferencialmente utilizados para o metabolismo oxidativo (Figura 1), tornando-se ento a principal fonte de energia. Quando os cidos graxos so oxidados, a oxidao da glicose inibida, e a mesma altamente convertida a glicognio. Este fenmeno conhecido como o efeito econmico da oxidao do cido graxo. Inversamente, quando os nveis de glicose e insulina circulantes esto elevados, os nveis de cidos graxos circulantes so suprimidos; logo, o corao diminui a captao dos mesmos e, com isso, a inibio da gliclise pelos cidos graxos removida, e a oxidao da glicose aumentada. Alm disso, o prprio metabolismo da glicose suprime diretamente a oxidao de cidos graxos (Figura 2). Refeies ricas em gorduras levam a um aumento acentuado de triglicerdeos no sangue durante a lipemia ps-prandial. Nestes casos, a enzima lipase lipoprotica converte o triglicerdeo a cidos graxos, que ento entra nas vias de oxidao dos mesmos. Nestas circunstncias excepcionais, os triglicerdeos circulantes tornam-se o principal combustvel do miocrdio. Durante exerccios fsicos intensos, o nvel de lactato sanguneo eleva-se e este se torna o principal combustvel do corao, enquanto a oxidao da glicose e a captao de cidos graxos passam a contribuir para a obteno de apenas 15-20% da energia necessria ao corao durante o exerccio. Os corpos cetnicos contribuem significativamente para o metabolismo energtico do corao somente em estado de jejum ou em cetose diabtica severa, pois, assim como os cidos graxos e o lactato, sua utilizao dependente de sua concentrao. Finalmente, na isquemia, vale ressaltar que o padro de captao de substratos modifica-se de uma predominncia da utilizao de lipdeos para a de carboidratos.

Figura 1. Metabolismo Oxidativo dos cidos Graxos. Quando o nvel sanguneo de cidos graxos livres (FFA) alto, estes so utilizados como a principal fonte de energia do corao. Alm disso, enquanto os cidos graxos so oxidados, a oxidao da glicose encontra-se reduzida, e a mesma altamente convertida a glicognio. GS = glicognio sintase; PFK = fosfofrutoquinase; PDC = complexo piruvato desidrogenase.

Figura 2. Controle da Insulina sobre a Absoro da Glicose pelo Corao. Quando os nveis de glicose e insulina circulantes esto elevados, o corao diminui a absoro dos cidos graxos, e a oxidao da glicose aumentada.

6 1.2.1. Ciclo Glicose-cido Graxo O ciclo glicose-cido graxo, primeiramente descrito por Randle e colaboradores (1963), baseado na variao dos papis relativos da glicose e do cido graxo como principais fontes de energia entre os estados abastecidos e em jejum (Figura 3). A produo cclica (liga/desliga) de cido graxo pelo tecido adiposo o evento bsico no ciclo. Durante o jejum, o tecido adiposo quebrado para liberar cidos graxos, inibindo o metabolismo da glicose pelo corao. Aps as refeies, a presena de glicose estimula a produo de insulina e a primeira torna-se o principal combustvel. A contribuio de determinado combustvel para o metabolismo oxidativo do corao varia no decorrer do dia de acordo com seus nveis circulantes, assim como com o tipo de alimento ingerido e com a prtica de exerccio fsico.

Figura 3. Metabolismo Cardaco da Glicose e dos cidos Graxos. Os micitos cardacos transportam a glicose para o seu interior atravs dos transportadores especficos GLUT 1 e GLUT 4. A glicose metabolizada na via glicoltica e produz piruvato, que pode ser ento oxidado na mitocndria a acetil CoA pela enzima piruvato desidrogenase (PDH). A acetil CoA entra no ciclo do cido ctrico e gera equivalentes redutores para a produo de ATP na cadeia transportadora de eltrons. J os cidos graxos entram nos micitos por difuso passiva ou mediada por translocases especficas. Estes so ento esterificados pela acil CoA sintase e subsequentemente transportados mitocndria pela via da carnitina acil transferase 1 (CAT-1 ou CPT-1, no esquema), onde so oxidados e geram acetil CoA.

7 1.2.2. Metabolismo Oxidativo da Glicose A captao da glicose pelas clulas cardacas controlada pelos transportadores de glicose GLUT 4 e GLUT 1 (Figura 2). Como a concentrao de glicose no meio extracelular maior do que no intracelular, este transporte no requer energia. A absoro da glicose aumenta sempre que os transportadores so estimulados, como durante o trabalho cardaco aumentado, no perodo psprandial, ou em situaes de hipxia ou isquemia, condies estas que aumentam tambm a gliclise. Por outro lado, a absoro da glicose reduzida pelos fatores que inibem a gliclise, como um baixo trabalho cardaco, o jejum, ou em casos de diabetes mellitus severa. Nas ltimas duas condies, o nvel de cidos graxos no sangue encontra-se elevado. No perodo ps-prandial com consumo de carboidratos, os nveis circulatrios de glicose elevam-se e a liberao de insulina, um hormnio circulante, estimulada. Esta aumenta o nmero dos transportadores de glicose GLUT 4 e GLUT 1 no sarcolema (Figura 2), translocando-os de stios internos no disponveis para stios externos. Logo, a insulina estimula a taxa de reciclagem desses transportadores entre stios internos e externos. A insulina se liga a receptores especficos, os quais consistem de uma sub-unidade externa e uma sub-unidade interna. A ligao da insulina na sub-unidade leva a uma autofosforilao da sub-unidade , a qual amplifica fortemente o efeito da insulina e promove a ativao de tirosina cinases, desencadeando vias de sinalizao celulares que iro culminar, por exemplo, em um aumento da atividade de enzimas como a glicognio sintase e a piruvato desidrogenase. Em diversas doenas, tais como a diabete tardia, falha cardaca congestiva e alguns tipos de hipertenso, o transporte de glicose encontra-se prejudicado mesmo com nveis de insulina aparentemente normais ou at elevados. Estes so casos de resistncia insulina.

1.2.3. Via Glicoltica A gliclise a via metablica que converte a glicose a piruvato (Figura 4a). Durante o metabolismo oxidativo normal, a glicose gera piruvato, que ento oxidado no ciclo do cido ctrico (ou Ciclo de Krebs). Ao entrar na clula cardaca, a glicose rapidamente convertida pela enzima unidirecional hexoquinase a glicose 6-fosfato. Esta ento dirigida para a sntese de glicognio ou para a gliclise. Na gliclise, a glicose-6-fosfato convertida a frutose 1,6-bisfosfato pela fosfofrutoquinase (PFK), uma das enzimas que regulam o fluxo desta via. Quando sua atividade aumentada, como em hipxia, a converso da glicose 6-fosfato a frutose 1,6-bisfosfato, via frutose 6-fosfato, ocorre em uma taxa aumentada (Figura 4a). glicose + ATP glicose 6-fosfato
hexoquinase

glicose 6-fosfato + ADP

frutose 6-fosfato

frutose 6-fosfato + ATP

PFK

frutose 1,6-bisfosfato + ADP

Depois disso, cada frutose 1,6-bisfosfato convertida a duas molculas de trioses fosfato (Figura 4a). Nas etapas seguintes, duas molculas de piruvato e quatro de ATP so formadas independentemente da presena de oxignio, alm de 2 (NADH + H+) (Figura 4a). frutose 1,6-difosfato + 2 Pi + 4 ADP + 2 NAD+ NADH + + 2 H+ + 2 H2O 2 x piruvato + 4 ATP + 2

Logo, no balano geral, uma molcula de glicose gera duas de ATP, duas de piruvato, duas de H2O, e dois (NADH + H+).

a.

b.

LDH

PDH

Figura 4. Metabolismo Aerbio e Anaerbio da Glicose. a) Via glicoltica: a via metablica da converso da glicose a piruvato. b) Destinos do piruvato dependendo das condies de oxignio: anaerbia formao de lactato; aerbia descarboxilao oxidativa. LDH = lactato desidrogenase; PDH = piruvato desidrogenase.

9 Cabe ressaltar que existe um controle intracelular coordenado da gliclise, de tal modo que a absoro e fosforilao da glicose, a atividade da PFK e a da piruvato desidrogenase podem aumentar ou diminuir simultaneamente em resposta a um trabalho aumentado do corao, assim como a outros estmulos. Esses so, portanto, pontos-chave no controle da gliclise.

1.2.4. Metabolismo Aerbico dos cidos Graxos (AGs) O metabolismo miocrdico dos AGs comea em funo de seus nveis circulantes. Ou seja, quanto maior o seu nvel, maior ser a relao molar AG/albumina, e maior ser a captao dos AGs pelo miocardio. Uma vez captados, os AGs passam por uma srie de mudanas at a formao de molculas de acetil CoA. O primeiro passo desta via a ativao dos AGs intracelulares pela coenzima A (CoA) para formar derivados de acil CoA. A membrana mitocondrial no permevel a essas molculas, que necessitam, portanto, serem transformadas e transportadas para o interior da mitocndria. Inicialmente, as molculas de acil CoA combinam-se com a carnitina, formando acil carnitina, que transportada pelo sistema carreador de carnitina para o espao mitocondrial interno. Depois disso, as longas cadeias de acil CoA, j livres de carnitina, sofrem -oxidao e progressivamente so formadas molculas de acetil CoA, as quais so oxidadas no ciclo do cido ctrico e finalmente levam gerao de ATP. Qualquer AG intracelular no oxidado pode ser estocado como triglicrides ou transformado em lipdeos estruturais por alteraes no grau de saturao. Os triglicrides (ou triacilgliceris) teciduais podem ser fontes de cidos graxos quando os nveis destes esto baixos na circulao (Figura 5). Sumrio das etapas do metabolismo dos AGs: 1. AG intracelular reage com CoA e forma acil CoA extramitocondrial:
Acil CoA sintetase

AG + CoA + ATP

acil CoA + AMP + PPi

2. Acil CoA extramitocondrial reage com a carnitina e forma acil cartinina, reao essa catalisada pela enzima carnitina acil transferase 1 (CAT-1); 3. A enzima carnitina acil translocase transloca a acil carnitina extramitocondrial para o espao intramitocondrial; 4. A enzima carnitina acil transferase 2 (CAT-2) permite acil carnitina intramitocondrial reagir com a CoA, e ocorre a liberao de acil CoA intramitocondrial e carnitina. Esta ltima exportada de volta ao citoplasma; 5. A acil CoA intramitocondrial sofre -oxidao e forma unidades de dois carbonos de acetil CoA, que entram no ciclo do cido ctrico; 6. Quando os nveis de captao de AGs so bem elevados, ocorre mais formao de acetil CoA do que o ciclo do cido ctrico capaz de consumir. Nestes casos, o excesso de acetil CoA pode tambm reagir com carnitina intramitocondrial, formando acetil carnitina, que transportada ao espao extramitocondrial pela enzima carnitina-acetil translocase, onde ocorre formao de acetil CoA citoplasmtico. Este pode ento sofre transformao a malonil CoA, que prov um feedback inibitrio.

10 O malonil CoA produzido sempre que elevados nveis de acetil CoA citosslico esto presentes devido ao alto metabolismo de AGs, ou s altas taxas de oxidao da glicose. 1.2.5. -Oxidao A -oxidao converte a longa cadeia de acil CoA em fragmentos de dois carbonos de acetil CoA. A oxidao do AG continuamente remove uma molcula de acetil CoA da terminao carboxi da cadeia. Durante o esforo cardaco aumentado, a mitocndria torna-se mais oxidada. Os nveis intramitocondriais de NADH2 e FADH2 diminuem, e ocorre um aumento na taxa de oxidao dos cidos graxos. Por outro lado, na anaerobiose, os nveis de NADH2 e FADH2 aumentam, como resultado de uma reduo da taxa de -oxidao devido ao diminudo transporte de eltrons.

Figura 5. Descrio detalhada da absoro e degradao dos cidos graxos pela mitocndria. Os nmeros correspondem s enzimas acil CoA sintase (1), carnitina acil transferase 1 (2), carnitina acil translocase (3), carnitina acil transferase 2 (4) e 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase (5). Fp = flavoprotena, NAD+ = nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada, NADH = nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida.

11 Um resumo do metabolismo energtico das clulas cardacas est representado na Figura 6.

Figura 6. Representao esquemtica da absoro e metabolismo dos substratos nas clulas musculares cardacas. FAT, fatty acid translocase; FABP, sarcoplasmic fatty acid-binding protein; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, reduced niconamide adenine dinucleotide.

1.2.6. Piruvato e Lactato O piruvato formado a partir do lactato absorvido pelo corao e pela degradao da glicose, e situa-se na interseco da gliclise e do metabolismo oxidativo no ciclo do cido ctrico. No corao anaerbico, o piruvato forma lactato; no aerbico, sofre descarboxilao oxidativa e entra no ciclo do cido ctrico. Esta reao ocorre pela atividade do complexo enzimtico da piruvato desidrogenase (PDH) (Figura 4b), encontrado na membrana interna da mitocndria. Os produtos desta reao de mltiplas etapas incluem a acetil Coa e NADH2. A primeira entra diretamente no ciclo de Krebs e totalmente oxidada a CO2 e H2O, e a segunda forma ATP pela fosforilao oxidativa. A piruvato desidrogenase encontrada tanto na forma ativa como na inativa. Normalmente, encontra-se na forma inativa, mas pode ser ativada pelo aumento do esforo cardaco, pelas catecolaminas ou pelas altas taxas de gliclise do estado ps-prandial. Por outro lado, a enzima inibida pela formao

12 de NADH2 na isquemia ou na hipxia, ou pela oxidao dos cidos graxos. A inibio desta enzima o evento-chave na inibio da gliclise durante a oxidao dos cidos graxos. O lactato absorvido pelo corao aerbico e produzido durante a anaerobiose; ento, a sua liberao no seio coronrio pode ser usada como um sinal de isquemia do miocrdio. A contribuio do lactato para as necessidades de energia de um miocrdio bem oxigenado pode aumentar a at 60% quando o seu nvel em circulao encontra-se elevado, como por exemplo durante e logo aps exerccio fsico. Durante infuso de lactato, a contribuio do mesmo pode subir a at 90%. O lactato um combustvel muito menos importante quando seu nvel est baixo, ou quando os nveis dos cidos graxos esto elevados. A absoro do lactato pelo corao depende de um sistema de transporte especfico, pois o sarcolema no livremente permevel ao mesmo. Uma vez absorvido, o lactato convertido a piruvato pela lactato desidrogenase (LDH), sendo que esta reao reversvel:
LDH

lactato + NAD

piruvato + NADH + H+

Existem cinco isoformas de LDH, nomeadas de acordo com suas migraes eletroforticas. Cada enzima composta de quatro subunidades do tipo H ou M. A isoforma cardaca constituda predominantemente de subunidade H, e conhecida como LDH-1. Pode-se estimar o tamanho de um infarto do miocrdio dosando-se a taxa de aparecimento e desaparecimento de LDH-1 no sangue perifrico, com picos entre 35-43 horas aps o aparecimento dos sintomas. 1.2.7. Corpos Cetnicos Os corpos cetnicos (CC) so formados no fgado em decorrncia do metabolismo excessivo de cidos graxos atravs da -oxidao. Esse processo, como j mencionado anteriormente, consiste na degradao dos cidos graxos nas mitocndrias atravs da liberao progressiva de fragmentos de dois carbonos, na forma de acetil Coenzima A (acetil CoA). Durante um jejum prolongado, quando a glicemia encontra-se muito baixa, os nveis de cidos graxos elevados, os nveis de insulina baixos e os de glucagon altos, h estmulo para a gliconeognese, que ocorre principalmente no fgado, e desvia o oxaloacetato do ciclo do cido ctrico. A gliconeognese aumentada necessria porque alguns rgos nobres, como o crebro, utilizam principalmente a glicose como fonte energtica. Desta forma, ocorre o acmulo de acetil CoA pelo metabolismo excessivo de cidos graxos, e diminuio da via do cido ctrico devido ao desvio do oxaloacetato para a gliconeognese. Com esse acmulo, ocorre aumento na produo de corpos cetnicos pelo fgado que se formam pela unio de duas molculas de acetil CoA. Inicialmente, formado acetoacetato, que transportado pelo sangue do fgado para diversos rgos que podem utiliz-lo como fonte energtica. O acetoacetato ainda convertido a -

13 hidroxibutirato ou acetona. Esses trs compostos so denominados corpos cetnicos (Figura 7).

Figura 7. Sntese dos Corpos Cetnicos. Duas molculas de acetil CoA se juntam e formam o acetoacetato, que pode se transformar em -hidroxibutirato ou acetona. Corpos cetnicos: acetoacetato, -hidroxibutirato e acetona.

Portanto, quando grande parte da energia do organismo provm do metabolismo das gorduras, como na inanio, nas dietas ricas em gorduras e no diabetes no tratado, aumenta a produo de corpos cetnicos. A utilizao desses compostos pelas clulas cardacas mediada pela enzima tiolase, que realiza a reao inversa e converte corpos cetnicos em duas molculas de acetil CoA. Como no miocrdio no ocorre gliconeognese e, nessas clulas, o oxalacetato no desviado do ciclo do cido ctrico, o acetil CoA formado segue nesta via, gerando energia para o corao. Nos diabticos descompensados, mesmo que a glicemia esteja elevada, a glicose no consegue ser absorvida pelas clulas insulino-dependentes, uma vez que o estmulo para a exposio dos transportadores GLUT 1 e GLUT 4 dado pela insulina no encontra-se ativo, por falta de ou resistncia a esse hormnio. Logo, observa-se uma intensa produo heptica de corpos cetnicos nesses pacientes, assim como uma grande utilizao desses substratos como fonte de energia pelos micitos cardacos, mesmo em situaes ps-prandiais. Vale ressaltar que o acmulo de corpos cetnicos na corrente sangunea (cetose), observado na diabetes no tratada, pode levar a um quadro de acidose metablica severa (cetoacidose) nesses indivduos.

14 1.3. PRINCIPAIS RESERVAS DE ENERGIA O corao possui reservas de energia que so poupadas para momentos de carncia energtica, como por exemplo, durante a isquemia. A isquemia a interrupo do fluxo sangneo para determinado rgo, diferente da hipxia, que a interrupo apenas da chegada de oxignio, podendo ou no haver fluxo sangneo. Durante uma isquemia, portanto, o corao fica privado tanto dos substratos energticos, como cidos graxos, glicose, lactato e corpos cetnicos, quanto de hormnios como glucagon e adrenalina. Para continuar funcionando, ento, os micitos cardacos utilizam suas principais reservas energticas: creatina-fosfato e glicognio.

1.3.1. Creatina-Fosfato O miocrdio utiliza as reservas de creatina fosfato, principalmente, para a manuteno da integridade da membrana plasmtica (mantm os canais dependentes de ATP). A creatina fosfato transfere fosfato ao ADP, formando creatina e restaurando os nveis de ATP, cuja produo est muito reduzida durante a isquemia. Essa reao catalisada pela enzima creatina fosfoquinase cardaca (CPK-MB). Essa mesma enzima tambm se localiza prximo membrana mitocondrial, e, nessa regio, quando as ofertas de oxignio e ATP so normalizadas, a CPK-MB restaura os nveis de creatina fosfato atravs da reao inversa. Assim, a creatina fosfato uma fonte energtica de curtssima durao.

1.3.2. Glicognio O glicognio um polissacardeo constitudo de vrias molculas de glicose, que forma grandes grnulos no citoplasma da clula cardaca. As molculas de glicognio esto em constante estado de turnover, como resultado das taxas variveis de sntese e degradao das mesmas. As vias de sntese e degradao do glicognio so realizadas por dois sistemas de enzimas diferentes. A sntese ocorre em altas taxas nos perodos ps-prandiais sob influncia da insulina, que aumenta a absoro da glicose e estimula a atividade da enzima glicognio sintase (Figura 1). A sntese do glicognio parece tambm acontecer aps intenso esforo cardaco ou aps isquemia, quando o glicognio depletado, sugerindo que a prpria diminuio dos nveis de glicognio capaz de estimular sua produo. No estado de jejum, embora haja falta de insulina, a sntese do glicognio ainda pode ocorrer, mesmo que em menor taxa, porque a glicognio sintase estimulada por altos nveis miocrdicos de glicose 6-fosfato, que resultam do bloqueio da via glicoltica. A energia requerida para a sntese do glicognio derivada de um composto fosfato de alta energia, uridina trifosfato (UTP), que formado a partir do ATP. J os dois principais mecanismos que levam glicogenlise so: (1) ativao da glicognio fosforilase pela adenosina monofosfato cclica (cAMP); ou

15 (2) na isquemia, por uma diminuio nos nveis de fosfato de alta energia. Um aumento em cAMP promove uma cascata de eventos que no final converte a enzima fosforilase b inativa fosforilase a altamente ativa:
estmulo de catecolaminas -receptor adenilato ciclase cAMP * * ativao de protena quinase ativao da fosforilase b quinase * * mudana da fosforilase b fosforilase a degradao do glicognio

A glicognio fosforilase cataliza a reao em que uma ligao glicosdica, reunindo dois resduos de glicose no glicognio, sofre o ataque por fosfato inorgnico (Pi), removendo o resduo terminal no-redutor de glicose como glicose 1-fosfato. A fosforilase age repetitivamente nas extremidades noredutoras das ramificaes do glicognio, controlando assim o incio da glicogenlise durante hipxia ou isquemia. A continuao da degradao pode ocorrer apenas depois da ao de uma enzima de desramificao, que cataliza as reaes sucessivas que removem as ramificaes.

Funo do Glicognio Cardaco O glicognio cardaco uma fonte potencial de energia miocrdica, produzindo trs molculas de ATP durante a gliclise e a quantidade padro de ATP atravs do ciclo do cido ctrico em condies aerbicas. O glicognio tem o papel estabelecido como fonte de energia durante hipxia ou isquemia miocrdica. Alm dessas condies de curta durao, o turnover do glicognio pode contribuir substancialmente para a gliclise aerbica em um corao em trabalho normal, e pode ser oxidado preferencialmente glicose externa, especialmente logo depois de um estmulo -adrenrgico aumentado. Como o glicognio est situado nas proximidades do retculo sarcoplasmtico, seu turnover pode fornecer ATP no local para a bomba de captao de Ca 2+. 1.4. DOENA CARDACA DA ESTOCAGEM DE GLICOGNIO A degradao do glicognio pode ocorrer em lisossomos das clulas cardacas atravs de uma outra via, dependente de -1,4 glicosidase. Quando esta enzima inativa, ocorre um acmulo muito grande de glicognio que pode levar a uma condio de glicogenlise cardiomeglica ou doena de Pompe (Figura 8). As membranas lisossomais se rompem devido ao acmulo de glicognio, com risco de destruio do msculo cardaco. A glicogenlise citoplasmtica, dependente de fosforilase e da enzima desramificadora, ocorrem normalmente.

16

Figura 8. Eletromicrografia de Tecido Cardaco de Paciente com Doena de Pompe. (aumento de 6.500 X) A clula superior consiste de muitos elementos contrcteis intactos, com as terminaes e a lateral da fibra esfiapadas, e glicognio ligado membrana (seta descontnua). O citoplasma da clula inferior foi totalmente substitudo pelo glicognio (seta contnua). Verifica-se que os elementos contrteis ou mitocndrias no foram mantidos, e as membranas lisossomais rompidas flutuam livremente no glicognio.

1.5. REPERFUSO O corao irrigado pelas artrias coronarianas que, normalmente, adaptam-se ao aumento de demanda energtica. Caso isso no acontea, pode ocorrer hipxia por reduo do fluxo sanguneo no corao, causando leses reversveis ou irreversveis, dependendo do tempo de hipxia. Se as leses forem irreversveis, mesmo aps a reperfuso, no h restaurao das estruturas celulares, gerando reas de necrose. Por outro lado, quando as leses so reversveis, a velocidade de reperfuso deve ser definida pelo tempo de hipxia sofrido. Quanto maior o tempo de hipxia, menor deve ser a velocidade de reperfuso, pois a rpida restaurao do fluxo sangneo aps um longo perodo de hipxia gera aumento paradoxal da leso. Em situaes fisiolgicas, o metabolismo das bases nitrogenadas leva a formao de pequena quantidade de hipoxantina, que atravs da enzima xantina oxidase, na presena de O2, leva a formao de xantina e perxido de hidrognio (H2O2), que so rapidamente degradados. A isquemia, ao longo do tempo, leva ao esgotamento de fontes energticas como cidos graxos, glicose, fosfocreatina e glicognio, e ao acmulo de metablitos do ATP, como ADP, AMP, adenosina e inosina (Figura 9). Como o ATP nessas ocasies no pode ser regenerado, as ligaes fosfato de menor energia (ADP e AMP) tendem a ser utilizadas como fonte energtica para a tentativa de manuteno da maquinaria celular, gerando, portanto, o acmulo dessas substncias. O aumento da concentrao desses metablitos estimula a

17 formao de hipoxantina a partir de adenosina e inosina, atravs de reaes catalisadas por enzimas presentes no citoplasma das clulas cardacas. Quando o fluxo sangneo restabelecido, atravs do uso de trombolticos, por exemplo, o oxignio que chega ao miocrdio ativa a enzima xantina oxidase. Essa enzima utiliza a hipoxantina como substrato para gerar xantina e H 2O2, que se acumula. Essa mesma enzima ainda pode utilizar a xantina como substrato para gerar cido rico. J o perxido de hidrognio formado pode dissociar-se em dois radicais livres hidroxila (OH). Essas espcies reativas peroxidam lipdios (os lipdios peroxidados tornam-se instveis e reativos, iniciando uma reao autocataltica em cadeia), reagem com protenas da membrana celular (aumentam a sua degradao) e provocam danos ao DNA (ruptura dos seus filamentos), agravando as alteraes em reas com leses ainda reversveis. O miocrdio possui mecanismos protetores antioxidativos contra esses radicais livres, mas como estes radicais esto sendo formados em alta velocidade, h discrepncia entre a sntese dos mecanismos protetores e dos radicais livres.

O2
Gliclise Anaerbia Ciclo do cido Ctrico

Cadeia Respiratria

NADH FADH 2

Lactato

Acidose Ltica

ADP/AMP Adenosina/Inosina

Reperfuso

Estoque de Glicognio

O2
Hipoxantina
Xantina Oxidase

Xantina
Xantina Oxidase

cido rico

H2 O2

Peroxidao de Lipdeos

HO

Modificao Oxidativa de Protenas

Danos ao DNA

Figura 9. Efeito da Reperfuso sobre o Metabolismo de Produtos de Degradao da Adenosina. Durante a hipxia, o metabolismo de adenosina e inosina leva ao acmulo de hipoxantina. A reperfuso, aumento repentino de O2, leva a uma ativao da enzima xantina oxidase, que transforma a hipoxantina em xantina e liberao de H2O2. A xantina posteriormente transformada em cido rico. O acmulo de espcies reativas de O2 leva a danos nos tecidos.

18 Quando a reperfuso ocorre gradualmente, apesar de haver muito substrato (hipoxantina) para a enzima xantina oxidase, o estmulo lento do oxignio permite que haja sincronia entre a produo de radicais livres e mecanismos antioxidantes de defesa celular. Durante a perfuso normal do miocrdio, com aporte de oxignio e nutrientes, a enzima xantina oxidase tambm est ativa. No entanto, nessas ocasies, os nveis de metablitos de ATP no esto elevados, pois o ATP est sendo sempre renovado. Portanto, no h formao em excesso de hipoxantina, o substrato da xantina oxidase. Assim, a formao de radicais livres no significante, pois os mecanismos celulares de proteo a esses radicais conseguem dar conta da pequena quantidade produzida. 1.6. MARCADORES BIOQUMICOS DE ISQUEMIA MIOCRDICA O dano celular provoca a ruptura da membrana plasmtica, com conseqente extravasamento do contedo intracelular para o interstcio. Atravs da drenagem venosa, essas substncias caem na corrente sangnea, permitindo que se estime ocorrncia de infarto atravs das suas dosagens. Os principais marcadores bioqumicos utilizados so as isoformas cardacas das troponinas T e I, mioglobina, CK-MB, e a enzima LDH-1. A troponina I o marcador mais especfico, mas demora um pouco para ter sua concentrao sangnea elevada; no entanto, seus nveis mantm-se altos entre 7 a 10 dias aps o episdio de infarto. A mioglobina o primeiro marcador a apresentar seus nveis elevados, mas apesar de ser muito sensvel, pouco especfica, pois sua concentrao aumenta aps qualquer injria muscular, no s do miocrdio. A CK-MB, uma isoforma cardaca da creatina fosfoquinase, e a LDH-1, isoforma cardaca da lactato desidrogenase, tambm apresentam alteraes mais tardias na corrente sangnea, mas as suas dosagens so realizadas de rotina, pois apresentam baixo custo e resultado satisfatrio. Todas essas enzimas devem ser dosadas periodicamente, e seus resultados anotados em um grfico, formando uma curva enzimtica e permitindo, assim, a confirmao do diagnstico, a monitorao da leso e a estimativa do tamanho do infarto do miocrdio.

Autor(es):
Catarina A. Miyamoto Eduarda Pascarella Redenschi Luize Gonalves Lima Russolina Zingali

19

UNIDADE 2

20

2. SISTEMA HEMOSTTICO

2.1. PRINCPIOS GERAIS Hemostasia o processo fisiolgico responsvel pela manuteno da fluidez do sangue e pela conteno da perda de sangue aps algum dano vascular, evitando perturbaes no fluxo sanguneo, alm de estar envolvido no incio do processo de reparo tecidual. O sistema hemosttico contribui ainda para o sistema de defesa, uma vez que previne ataques de microorganismos por formar uma rede de plaquetas e fibrina, que dissolvida mais tarde com o restabelecimento do fluxo sangneo normal. Simultaneamente hemostase, inicia-se um processo um pouco mais lento de formao de um novo tecido e revascularizao. Mas quais so os agentes participantes do processo de hemostasia? De maneira geral, podemos citar: Plaquetas; Parede vascular (especialmente endotlio e subendotlio); Fatores de coagulao e seus inibidores; Protenas plasmticas (fator de von willebrand, outras protenas de adeso, imunoglobulinas); ons Ca2+; Substncias orgnicas de baixo peso molecular (fosfolipdeos, prostaglandinas, etc); Citocinas e hormnios.

As interaes desses agentes podem ser estimuladas principalmente aps uma leso vascular, mas tambm em condies patolgicas como doenas autoimunes, aterosclerose ou cncer.

21 Mas por que, em condies fisiolgicas, essas interaes no ocorrem o tempo todo, se grande parte dos fatores envolvidos encontra-se circulante ou presente nos vasos sanguneos? A resposta que os fatores de coagulao, em sua maioria consistindo de protenas plasmticas, circulam na forma de zimognios, isto , pr-enzimas que requerem processamento por protelise para que se tornem ativas. Alm disso, a camada interna dos vasos, formada pelas clulas endoteliais, possui um papel preponderantemente anti-hemosttico. As clulas endoteliais so capazes de: Separar fisicamente o sangue do subendotlio (que a camada que possui substncias pro-hemostticas); Sintetizar e liberar prostaglandina do tipo PGI2 (prostaciclina) e xido ntrico, substncias que reduzem a resposta plaquetria a estmulos ativadores da hemostasia primria; Alm disso, possuem em sua membrana externa, em contato com o sangue, duas substncia anti-hemostticas: a protena trombomodulina e o glicosaminoglicano heparan sulfato (que ser discutido futuramente).

A figura abaixo demonstra como est o endotlio na hora em que a leso ocorre, ou seja, o endotlio intacto e, portanto, inibidor da hemostasia. Alm disso, o esquema direita demonstra o endotlio lesionado e sua ao trombognica.

Figura 10. Aes Endoteliais Opostas (Antirombtica Vs. Pr-Trombtica) em Diferentes Situaes. Repouso ( esquerda); ou frente uma leso ( direita).

Para o melhor entendimento do processo hemosttico, este dividido em fases: Hemostasia primria consiste na formao de tampo ou agregado plaquetrio; Hemostasia secundria ou coagulao consiste na formao de uma rede de fibrina (cogulo) encarregada de estabilizar a agregao plaquetria.

22 Aps a hemostasia secundria, ocorre a dissoluo do cogulo de fibrina. A essa fase denominamos fibrinlise. Cada captulo dessa unidade destinado a elucidar cada uma dessas fases, que esto esquematizadas com suas respectivas duraes na figura abaixo:

LESO

HEMOSTASIA PRIMRIA (1-5 min) Vasoconstrico (3-10 seg) Adeso plaquetria (segundos) Agregao plaquetria (minutos)

HEMOSTASIA SECUNDRIA (3-15 min) Ativao dos fatores de coagulao Formao de fibrina (minutos)

FIBRINLISE Ativao da fibrinlise (minutos) Lise do cogulo (horas)

Figura 11. Resumo das Fases do Processo Hemosttico.

23 2.2. HEMOSTASIA PRIMRIA Hemostase primria consiste em uma srie de eventos, os quais incluem vasoconstrico e adeso, ativao e agregao plaquetrias, como apresentado na figura abaixo.

Figura 12. Participao das Plaquetas no Processo de Hemostasia durante a Formao do Tampo. A) Processo de injria com exposio de agonistas plaquetrios; B) Adeso das plaquetas ao subendotlio; C) Mudana de forma da plaqueta com secreo de grnulos; D) Ligao plaqueta-plaqueta; E) Depsito de fibrina sobre o tampo plaquetrio.

2.2.1. Vasoconstrico Eficiente forma de prevenir perdas sanguneas, em especial na microcirculao. um processo mediado por uma interao do sistema nervoso autnomo, clulas musculares e diversos mediadores como serotonina, adrenalina e noradrenalina. Para modular a vasoconstrico e impedir que essa seja extrema e cause isquemia, a prostaciclina I2 e a liberao de xido ntrico pelo endotlio possuem ao vasodilatadora. A vasoconstrico extremamente rpida e eficiente para conter pequenos sangramentos. Para sangramentos maiores, so recrutadas as plaquetas. 2.2.2. Plaquetas: Sua Estrutura e Funes As plaquetas constituem o grupo celular mais importante da hemostasia. So fragmentos de clulas com formato discoidal, sintetizados na medula ssea, e representam uma forma especializada e madura dos megacaricitos. Sua

24 sntese estimulada pelo hormnio trombopoietina, que encontrado em baixas concentraes no plasma. O citoesqueleto da plaqueta contribui significativamente para a manuteno da sua forma discide e para a sua alterao de forma, que ocorre durante a fase de ativao plaquetria. Metabolicamente, as plaquetas perderam a capacidade de sintetizar protenas. Sua energia gerada essencialmente pela degradao da glicose e fosforilao oxidativa. Em geral, as plaquetas tornam-se ativadas e, portanto, pr-hemostticas, ao serem estimuladas por diferentes fatores. Por sua vez, as plaquetas ativadas secretam diversas citocinas, fatores de crescimento e outras protenas por meio de grnulos. A plaqueta contm dois sistemas internos de membrana: Sistema canalicular aberto, que formado por mltiplas invaginaes, semelhantes a uma esponja, que so visualizadas na superfcie da plaqueta. Durante a ativao plaquetria, a plaqueta secreta seus grnulos atravs desses canais. O sistema canalicular tambm fornece pseudpodes que so emitidos com a mudana de forma que a plaqueta sofre aps sua ativao. Sistema tubular denso, que constitudo por restos de reticuloendoplasmtico. Este sistema membranoso, que no se comunica com o exterior, serve como um local de depsito de clcio intracelular.

A forma como as plaquetas atuam na hemostase discutida abaixo e, didaticamente, dividimos essa participao plaquetria nas trs fases a seguir:

Adeso Plaquetria Essa etapa se inicia quando a plaqueta entra em contato com uma superfcie no fisiolgica, gerada por uma leso do endotlio. Tal leso faz com que o colgeno subendotelial seja exposto s plaquetas circulantes. A adeso inicia-se com a interao entre o colgeno e as plaquetas, que ocorre pela ligao direta do receptor plaquetrio glicoprotena Ia/IIa (GPIa/IIa) s fibrilas de colgeno. Outro receptor presente na superfcie das plaquetas, a glicoprotena Ib/IX/V (GP Ib/IX/V), tambm participa da interao plaqueta-colgeno, porm de maneira indireta. Este receptor se liga a uma protena plasmtica denominada fator de von WIllebrand (FwV), a qual, por sua vez, est ligada ao colgeno. O FvW age, portanto, produzindo uma espcie de gancho entre a plaqueta (mais especificamente o receptor plaquetrio GP Ib/IX/V) e o colgeno subendotelial. Cabe ressaltar que este ltimo exemplo de interao (GP Ib/IX/V-FvWcolgeno) determinante para a estabilizao da adeso plaquetria inicial ao espao subendotelial, especialmente sob alta fora de fluxo da corrente sangunea, permitindo a continuidade do processo de hemostasia primria. Assim, ambas as deficincias genticas de FvW (Doena de von Willebrand) ou

25 do seu receptor GPIb/IX/V (Sndrome de Bernard-Soulier) resultam em adeso plaquetria defeituosa e distrbios hemorrgicos, como demonstrado na figura abaixo.

Figura 13. Doenas Relacionadas Hemostasia Primria.

Fator de von Willebrand O FvW sintetizado nos megacaricitos e nas clulas endoteliais, e armazenado, respectivamente, em grnulos e em organelas especficas, denominadas corpos de Weibel-Palade. O FvW uma protena de alto peso molecular que forma multmeros extensos, sendo encontrado tanto no plasma (associado ao fator VIII) como em plaquetas, e, ainda, na regio subendotelial. Sua concentrao plasmtica aproximadamente 30% menor em indivduos do grupo sanguneo O. Este fator apresenta stios de ligao especfica aos receptores plaquetrios GPIb/IX/V, ao fator VIII, ao colgeno, e protena botrocetina, derivada de veneno de cobra. A funo de carregar o fator VIII de extrema importncia. A concentrao plasmtica do FvW de 50 nmol/L excedendo em quase 50 vezes a de FVIII (1 nmol/L). Ambas as protenas possuem grande afinidade uma pela outra e, portanto, praticamente todo o FVIII encontra-se ligado ao FvW. Este estabiliza e protege o FVIII da inativao proteoltica, transportandoo at o local da leso e aumentando, assim, sua concentrao local. Depois da ativao do FVIII, este se desliga do FvW, podendo ser inativado pela protena C.

26 Ativao Plaquetria Uma vez aderida, atravs da interao plaqueta-subendotlio eficientemente estabilizada pelo FvW, a plaqueta sofre um estmulo de ativao pela prpria ligao ao colgeno, alm da ao de outras substncias ativadoras os agonistas plaquetrios. O colgeno, a trombina, o ADP e a adrenalina, entre outros, so exemplos de agentes responsveis pelo processo de ativao plaquetria. Na tabela abaixo, esto os principais agonistas e seus respectivos receptores plaquetrios:

Agonista ADP Colgeno Epinefrina PAF -trombina Tromboxana A2

Receptor P2Y1 P2Y12 GP IV GP VI Receptor de Epinefrina Receptor de PAF GP Ib PAR 1 PAR 4 Receptor de tromboxana A2

Tipo de receptor Acoplados Protena G Canal de clcio Tirosina fosfatase Acoplado Protena G Acoplado Protena G Acoplados Protena G Acoplado Protena G

A ativao plaquetria induz vrios eventos, dentre os principais: Secreo dos grnulos e grnulos densos; Mudana de forma da clula o formato original da clula (discide) alterado para um formato esfrico com emisso de pseudpodes; Aumento nos nveis intracelulares de clcio; Alterao da composio lipdica da membrana externa; Exposio da GP IIb/IIIa.

Secreo de grnulos A ativao plaquetria iniciada pela ligao dos agonistas supracitados aos receptores da superfcie plaquetria, seguida pelo desencadeamento de uma cascata de fosforilao de protenas intracelulares que culmina, entre outras coisas, na liberao dos grnulos plaquetrios, os quais podem ser de trs tipos: grnulos densos, contendo clcio, serotonina, epinefrina e ADP; grnulos alfa, contendo FvW, fibronectina, trombomodulina, fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e uma enzima inativadora da heparina (fator plaquetrio 4);

27 lisossomas com endoglicosidases e heparinases.

Em especial, as liberaes de tromboxano A2 (TXA2) um derivado do cido araquidnico e ADP so de extrema importncia, por serem capazes de ativar ainda mais plaquetas, desencadeando finalmente a agregao plaquetria.

Mudana de forma da clula e aumento nos nveis intracelulares de clcio Os agonistas plaquetrios se ligam a seus receptores e estimulam a fosfolipase C, uma enzima que hidrolisa o fosfatidilinositol (PIP2) em dois componentes: o inositol trifosfato (IP3) e o diacilglicerol (DAG). O IP3 induz a liberao de clcio no citoplasma, proveniente do sistema tubular denso, alm de fosforilar a miosina, uma protena contrtil do citoesqueleto plaquetrio. Como resultado, a plaqueta muda a sua forma e torna-se capaz de degranular (liberar os seus grnulos, como explicado anteriormente). Com o aumento de clcio, a assimetria da membrana presena de fosfatidilserina exclusivamente na camada interna das clulas alterada, devido a mudanas na atividade das seguintes enzimas: Aminofosfolipdeo translocase ATP-dependente (ou flipase) transporta especificamente os lipdeos fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina da camada externa para a camada interna da membrana da clula. Ativada em baixos nveis de clcio e inativa em altos nveis de clcio intracelular. Flopase ATP-dependente transporta inespecificamente fosfolipdeos da camada interna para a camada externa da membrana. Ao lenta. Escramblase transporta inespecificamente fosfolipdeos da camada interna para a externa e vice-versa. Ao rpida. Inativa em baixos nveis de clcio e ativa em altos nveis de clcio intracelular.

Alm disso, a alta concentrao de clcio tambm ativa as chamadas fosfolipases A2, que liberam cido araquidnico a partir de fosfolipdeos de membrana, como a fosfatidilcolina para a produo de tromboxano A2, um potente ativador de plaquetas. O cido araquidnico sofre a ao da enzima ciclooxigenase, produzindo compostos como PGG2 e PGH2. A partir destes, a enzima tromboxano sintetase produz tromboxano A2 (TXA2), o qual, por sua vez, age na prpria plaqueta, estimulando fosfolipases de membrana um mecanismo de retroalimentao positiva.

Alterao da composio lipdica da membrana externa O aumento nos nveis de fosfatidilserina na membrana externa da plaqueta ativada fundamental para a montagem de alguns complexos da coagulao

28 sangunea, como demonstrado abaixo e melhor aprofundado no captulo de coagulao sangunea.

Figura 14. Perda de Assimetria Fosfolipdica da Membrana Plasmtica na Presena de Clcio. Efeito regulatrio do clcio sobre a atividade de enzimas transportadoras de fosfolipdios e exemplo do papel da exposio de fosfatidilserina na montagem do complexo pr-coagulante protrombinase.

DAG O DAG, produzido na via ativada por fosfolipase C, estimula ainda a protena quinase C (PKC), que fosforila a miosina e conduz as plaquetas profunda mudana na forma plaquetria.

Agregao Plaquetria A agregao plaquetria estritamente dependente da ativao plaquetria, especialmente devido induo da maior exposio da GP IIb/IIIa, presente na membrana da plaqueta, ao seu ligante fibrinognio (decorrente de mudanas conformacionais dessa glicoprotena), e secreo de ativadores plaquetrios contidos nos grnulos. Este fenmeno de agregao consiste em uma interao fsica entre as plaquetas, mediada pela protena plasmtica fibrinognio, que possui uma seqncia especfica de aminocidos que reconhecida pela GP IIb/IIIa. O resultado final desta fase a formao do agregado plaquetrio, capaz de impedir o sangramento at que a hemostase secundria (coagulao) esteja concluda.

29 2.2.3. Distrbios na Hemostasia Primria Quando h deficincia em algum dos fatores envolvidos na hemostasia, h um prejuzo em todo o processo descrito, que o que caracteriza os distrbios hemostticos. Os distrbios hemostticos congnitos mais importantes esto descritos na tabela abaixo. Alm dos congnitos, tambm h distrbios adquiridos, como pelo uso excessivo de antiinflamatrios, de cido acetilsalislico, anti-histamnicos ou de psicotrpicos. H tambm distrbios numricos, de alterao na produo de plaquetas, como a aplasia medular, leucemia e produo reduzida por deficincia de folato ou vitamina B12, ou de destruio excessiva: coagulao intravascular disseminada (CID), envenenamento botrpico e esplenomegalia.

Distrbio

Freqncia ocorrncia Relativamente comum

da

Descrio

Gravidade do sangramento

Doena de von Willebrand

Fator de von Willebrand defeituoso ou ausente, a protena que mantm as plaquetas unidas parede vascular lesada, ou deficincia do fator VIII da coagulao

Leve a moderado na maioria dos casos. Pode ser severo nas pessoas que apresentam nveis muito baixos do fator de von Willebrand

Doena da reserva de armazenamento Sndromes de Chdiak-Higashi e de HermanskyPudiak Disfuno do tromboxano A2

Relativamente incomum

Grnulos das plaquetas defeituosos que impedem a aglomerao das plaquetas

Leve

Raras

Formas especiais de doena do fundo de armazenamento

Varivel

Muito rara

Resposta plaquetria comprometida aos estmulos de aglomerao

Leve

Trombastenia de glazman

Rara

Ausncia de GP IIb/IIIa na superfcie da plaqueta que so necessrias para a aglomerao plaquetria

Varivel

Sndrome de Bernard-Soulier

Rara

Ausncia de protenas na superfcie da plaqueta e plaquetas anormalmente grandes que no aderem s paredes vasculares lesadas

Varivel

30 2.2.4. Importante Observao Farmacolgica O cido acetilsalislico, comercialmente conhecido como aspririna, capaz de interferir no processo de hemostasia primria. A aspirina, que inativa a enzima ciclooxigenase, evita a sntese de PGH2 plaquetrio e, consequentemente, de tromboxano A2, o que dificulta uma eficiente ativao plaquetria. Alm disso, discute-se seu efeito limitador sobre a capacidade do colgeno de ativar as plaquetas, uma vez que o colgeno , por si s, indutor fraco da ativao plaquetria, mas se torna um indutor poderoso na presena de PGH2. Dessa forma, percebemos que a aspirina possui um papel antitrombtico, ou seja, de inibir a hemostase, mas que no ocorre to intensamente em indivduos normais pela compensao da ativao plaquetria por outros agonistas, tais como a trombina. Por outro lado, no endotlio, a aspirina tambm atuar inibindo a ciclooxigenase endotelial. Esta produz PGG2 que passa a PGH2, o qual, no endotlio, se converte em PGI2 um inibidor da hemostasia primria. Logo, no endotlio, a aspirina agiria como um agente pr-hemosttico. Mas porque ser que a sua ao predominante continua sendo antitrombtica? Porque apesar de a aspirina agir na mesma enzima, tanto na plaqueta quanto no endotlio, este ltimo possui a capacidade de sintetizar novas protenas e, dessa forma, rapidamente repe seus nveis de ciclooxigenase. J nas plaquetas, a sntese protica no ocorre, e a enzima no reposta, inibindo, portanto, a produo de PGH2 e consequentemente de tromboxano A2, o que dificulta a ativao plaquetria. O esquema abaixo busca resumir toda essa produo dos derivados do cido araquidnico.

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CIDO ARACDNICO
Inibida por

ciclooxigenase PGG2

aspirina

Tromboxana sintetase (nas plaquetas) PGH2 TROMBOXANA A2

Prostaciclina sintetase (no endotlio)

PGI2

Assim, concluem-se os conceitos relacionados hemostasia primria, cujos pontos mais importantes so: As fases desse processo; A participao das plaquetas e de seus receptores; A ao da aspirina.

A partir de agora, passaremos prxima etapa, hemostasia secundria, mas tendo em mente que a hemostasia primria no uma fase separada da secundria. Os processos de ativao ocorrem todos juntos, somente com diferena temporal para os efeitos apresentados que fazem com que sejam agrupados em fases. Na verdade, essa diviso meramente didtica, e essas fases interligam-se, estimulam-se e inibem-se, como ser explicado a seguir.

32 2.3. HEMOSTASIA SECUNDRIA: COAGULAO SANGNEA A coagulao sangnea constitui a segunda etapa do processo hemosttico. Apesar da diviso didtica e conceitual desta fase, como veremos mais adiante, esta etapa est naturalmente relacionada hemostase primria. O sangue contm diversas protenas plasmticas, dentre as quais os fatores de coagulao, que esto envolvidos em uma seqncia rigorosamente controlada de reaes de ativao, as quais resultam, em ltima instncia, na formao de trombina e, subsequentemente, fibrina. Esta srie de eventos leva ativao parcial dos fatores de coagulao, que circulam em um estado precursor inativo chamado de zimognio (zimo= enzima, gnio= que d origem). O processo de ativao primariamente uma seqncia de clivagens proteolticas em locais especficos tambm conhecida como protelise limitada , um mecanismo muito comum a vrios outros sistemas do organismo, tais como o sistema complemento, sistema de regulao da presso sangunea via angiotensina/renina ou sistema de cininas, ativao de metaloproteases de matriz, etc. A enzima, nesta constelao, um fator de coagulao ativado, e o substrato (em muitos casos tambm ligados a superfcie), um zimognio de um fator de coagulao diferente que se torna ativado depois de uma parte da molcula ter sido clivada (o peptdio de ativao). Em alguns casos, vrias clivagens proteolticas podem ser requeridas, porm nem sempre o peptdeo de ativao liberado, e isto se deve ao fato de o mesmo estar ligado molcula residual via pontes dissulfeto ou por ligao no covalente. No caso dos fatores homlogos VIII e V, vrias clivagens proteolticas ocorrem, mas as cadeias de protenas individuais finais ainda formam uma molcula ligadora de clcio relativamente estvel (ver figura 15 para stio de clivagem nos fatores de coagulao). A clivagem das ligaes do peptdio de ativao induz mudanas conformacionais considerveis que expem o stio ativo da enzima recm gerado, geralmente escondido dentro da pr-enzima. Na maioria dos casos, os passos de ativao proteoltica so mais ou menos restritos a superfcie, porque muitos dos fatores de coagulao ou de seus precursores tm locais de ligao especfica a fosfolipdios, ons metlicos, receptores especficos ou co-fatores localizados na superfcie de diferentes tipos de clulas. Todos os fatores de coagulao com atividade proteoltica pertencem classe de serino-proteases (que contm o resduo de aminocido serina no stio cataltico), as quais compartilham significativa seqncia de homologia. Em certas doenas, uma ativao inespecfica de fatores de coagulao pode ser mediada por uma variedade de outras proteases de microorganismos, liberadas por clulas tumorais, leuccitos ativados ou tecidos danificados. Um caso especial so as proteases de animais venenosos, tais como certas espcies de serpentes que contm poderosos ativadores da coagulao (e inibidores) nos seus venenos, e podem induzir mudanas macias associadas hemostase, com severas complicaes tromboemblicas ou hemorrgicas.

33 2.3.1. Fatores da Coagulao Os fatores de coagulao representam uma famlia de protenas plasmticas altamente glicosiladas. A maioria deles (exceto Fator II protrombina e Fator I fibrinognio) encontrada em concentraes muito baixas. exceo do fator tecidual (TF) que est ligado membrana de clulas do subendotlio, todos os fatores da coagulao so protenas plasmticas que requerem uma etapa de ativao proteoltica. A pr-calicrena e o cininognio de alto peso molecular HMWK , e tambm o Fator XII esto envolvidos na ento chamada fase de contato da coagulao sangunea ou via extrnseca, que parece ser de mnima importncia para a hemostase fisiolgica.

Fator Fibrinognio *Protrombina Fator V *Fator VII Fator VIII *Fator IX *Fator X Fator XI Fator XIII Fator XII Pr-calicrena HMWK

Peso Molecular (Da) 330.000 72.000 300.000 50.000 300.000 56.000 56.000 160.000 320.000 76.000 82.000 108.000

Concentrao Plasmtica (g/mL) 3.000 100 10 0,5 0,1 5 10 5 30 30 40 100

Concentrao Necessria para Hemostase (% concentrao normal) 30 40 10-15 5-10 10-40 10-40 10-15 20-30 1-5 0 0 0

*Fatores dependentes de vitamina K

Alguns dos fatores da coagulao so dependentes de vitamina K, isto , uma srie de reaes enzimticas que resultam na modificao (gamacarboxilao) de cadeias laterais de cido glutmico presentes no chamado domnio-Gla dessas protenas dependem de vitamina K. Gla o acrnimo para cido gama-carboxiglutmico (do ingls gamma-carboxyglutamic acid). Resduos Gla- so requeridos para ligao de ons clcio, co-fatores pivs da maioria das reaes da cascata de coagulao. Entretanto, a ligao do clcio no est restrita a apenas o cido gama-carboxiglutmico. importante observar que mais de um resduo de cido glutmico modificado por esta reao, somente no domnio Gla. Antagonistas da vitamina K (coumadim / Warfarin, phenprocoumon / Marcumar / Falithrom, acenocoumarol / Sintrom) so drogas que so ministradas para profilaxia e tratamento de doena tromboemblica. Sua funo inibio de gama-carboxilao, o que leva a formao de fatores de coagulao em parte inativos. Estes anticoagulantes orais inibem o sistema de reciclagem

34 (reduo) enzimtica de uma forma oxidada e inativa de vitamina K (vitamina K epxido) que gerada nas reaes de gama carboxilao.

Figura 15. Representao Esquemtica da Seqncia de Alguns Fatores da Coagulao.

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Figura 16. Formao do Domnio Gla. A reao de gama carboxilao dos fatores da coagulao ocorre no fgado, e pode ser bloqueada por antagonistas da vitamina K como a varfarina. Em (A) est representada a reao de gama carboxilao em resduos de cido glutmico, catalisada pela enzima gama-glutamil carboxilase. Esta converte uma forma reduzida de vitamina K em vitamina K epxido (oxidada), que por sua vez reciclada a sua forma reduzida pela enzima vitamina K epxido redutase (em B), a qual alvo de inibio pela varfarina e outros cumarnicos relacionados.

2.3.2. Vias de Ativao da Coagulao Sangunea A ativao do sistema de coagulao pode ser separada em duas vias: a via extrnseca ou via do fator VII, cuja ativao se d pelo fator tecidual; e a ativao por contato com superfcies no-fisiolgicas, tambm chamada de ativao intrnseca ou via de contato, onde h participao das protenas prcalicrena (PK) e cininognio de alto peso molecular (HMWK), e dos fatores XII, XI e IX (FXII, FXI, FIX). Estas duas vias no esto diretamente separadas; elas interagem em diversas etapas. As duas vias se encontram no fator X. Etapas restantes so comuns a ambas as vias. Por razes prticas, uma vez que os dois principais ensaios de coagulao (TAP e PTTa) separaram estas vias, comum trat-las individualmente.

Via Extrnseca A ativao fisiolgica da coagulao sangunea mediada quase exclusivamente por meio da via do fator tecidual. Fator tecidual (TF) uma protena de membrana que usualmente no encontrada em quantidade suficiente na superfcie do endotlio, clulas brancas do sangue ou no plasma. Entretanto, o subendotlio constitutivamente rico em TF, o qual tambm tem sido localizado em quase todos os tecidos. Placas aterosclerticas e moncitos estimulados com lipopolissacardeos (endotoxina LPS) ou a citocina prinflamatria interleucina 1 (IL-1) tambm podem gerar TF.

36 ou estmulos de ativao celular, ou sintetizado de novo por leuccitos/clulas sanguneas, respectivamente. Os indutores fisiolgicos da biossntese do fator tecidual so diversas citocinas, tais como IL-1, fator de necrose tumoral (TNF), trombina, protena C 5a (do sistema complemento), a anaflatoxina gerada do complemento C5, e provavelmente vrios outros. O fator tecidual consiste de um domnio intracelular, uma poro transmembrana e um domnio extracelular, que homlogo ao de receptores de citocinas. Aps injria vascular, TF exposto no subendotlio, e o contato do fator tecidual com o fator VIIa leva formao de um complexo ativo, chamado de complexo tenase extrnseco, o qual pode ativar o fator X, ainda mais eficientemente na presena de fosfolipdios (PL) e ons clcio. De acordo com outros resultados, concentraes muito baixas de fator VIIa parecem estar sempre presentes no sangue (meia vida 2,5 h) e so responsveis pela ativao inicial de tal complexo nos locais onde h TF exposto. O sistema, simplificadamente, pode ser ilustrado como uma srie de etapas subseqentes: TF/FVIIa + FX (+ Ca2+ + PL) FXa FXa + FII (protrombina) FIIa (Trombina) FIIa + Fibrinognio Fibrina Na realidade, entretanto, o sistema muito mais complexo. Um elemento muito importante da hemostase o envolvimento de reaes de feedback positivo, caracterizadas pela participao de um produto da reao em sua prpria formao, levando a uma amplificao macia. Na hemostase, o feedback positivo provido pela ativao de uma prenzima pelo produto de sua reao, a enzima resultante, (p.ex., a ativao de FVII pelo prprio FVIIa na presena de TF e ons clcio), e pela ativao de cofatores que aceleram as reaes enzimticas. As reaes de feedback positivo esto envolvidas em muitas etapas na cascata de coagulao. Na via extrnseca, provavelmente o feedback mais importante alcanado depois que o fator V ativado pelos primeiros traos de trombina. Junto com Ca ++ e PL, FVa acelera a ativao de protrombina pelo FXa significativamente, enquanto a forma no ativada no efetiva. O complexo FXa, FVa, PL e clcio (complexo protrombinase) muito mais efetivo na gerao de trombina que o FXa sozinho, e parcialmente protegido contra inibio por inibidores tais como a antitrombina.

A contribuio do FVIII, FIX e FXI para a formao de trombina Pacientes com deficincias de FVIII ou FIX (hemoflicos A e B, respectivamente) so muito mais comuns que pacientes com uma deficincia em um dos fatores extrnsecos tpicos. Isso ilustra que a deficincia completa ou muito severa de FVII, FX, FV e protrombina provavelmente letal. Mas uma grave deficincia de FVIII e IX tambm associada com hemorragia macia, especialmente no tecido conjuntivo das articulaes. No caso de deficincia de FXI (hemofilia C), a tendncia ao sangramento relativamente fraca em alguns

37 pacientes. Outros sofrem de uma ditese hemorrgica severa, similar queles das clssicas hemofilias A e B. Os achados clnicos provam que todos os fatores devem estar envolvidos na ativao da coagulao. O FVIII circulante est ligado ao FvW e ativado pela trombina:

Figura 17. Esquema de Ativao do FVIII pela trombina.

O envolvimento de FVIII, FIX e FXI na formao de trombina foi reinvestigado atravs dos ltimos anos e isso levou a uma descrio revisada da coagulao sangunea, na qual a ento chamada via intrnseca no representa mais um papel importante a respeito da formao de trombina fisiolgica. J h um longo perodo, sabia-se que, na presena de baixas concentraes de TF, no apenas fator X, mas tambm fator IX era ativado por FVIIa. Sob essas condies, a taxa de formao de trombina tornou-se tambm dependente deste FIXa e de FVIIIa (co-fator do FIXa, juntos formam o complexo tenase intrnseco, na presena de Ca++ e PL). Usando um ensaio imune para o peptdio de ativao do fator IX, que liberado por ativao, foi demonstrado que FVIIa in vivo de longe o ativador mais relevante de FIX. Sob as condies do ensaio de tempo de protrombina (TAP), entretanto, no qual um grande excesso de TF usado, a ativao da coagulao independente dos fatores IX e VIII. Mais recentemente, descobriu-se que a

38 trombina capaz de ativar tambm o FXI, ativador conhecido do FIX. Essa etapa provavelmente dependente da presena de superfcies negativas ou compostas. De acordo com dados mais recentes, FXI ativado quando altos nveis de trombina so gerados, que um processo em andamento at mesmo quando fibrina j est formada. Isto explica por que a deficincia do FXI no detectada em ensaios de coagulao para a via extrnseca, nos quais a taxa para formao de fibrina (usualmente os primeiros filamentos de fibrina detectados) determinvel.

A Fase de Contato da Coagulao Sangunea e a Via Intrnseca A interao do sangue com superfcies artificiais, especialmente superfcies que so negativamente carregadas tais como vidro ou plsticos (em dispositivos mdicos), aciona uma complexa interao de vrias protenas que requerem uma superfcie negativamente carregada para uma mudana conformacional que as ativa. Superfcies biolgicas negativamente carregadas tambm podem ser representadas por certos componentes de membrana, tal como sulfatdeos. Eles so expostos ao sangue em casos de injrias. Este processo chamado de fase de contato da coagulao sangunea. A fase de contato tambm caracterizada por reaes de feedback positivo. Na presena de cininognio de alto peso molecular (HMWK ou HK), prcalicrena ativada pelo FXIIa a calicrena, que por sua vez ativa mais FXII e assim por diante. O FXIIa, por sua vez, pode tambm ativar FXI a FXIa. O nico fator envolvido que parece ser um fator fisiolgico de coagulao o FXI. Uma deficincia desta protena (hemofilia C) pode levar a problemas hemorrgicos leves e, s vezes, at mesmo severos, enquanto que a deficincia de FXII e HMWK ou pr-calicrena no determinam quadros hemorrgicos. O FXIa ativa FIX a FIXa. Todas as etapas subseqentes requerem ons clcio e so fosfolipdeos dependentes. FIXa livre ativa FX, mas esta reao no muito efetiva. To logo alguma trombina formada, entretanto, FIXa forma um complexo com FVIIIa (que ativado pela trombina). Junto com PL (na superfcie de plaquetas) e ons clcio, este complexo (tenase intrnseco) ativa FX com eficcia muito maior. A via intrnseca, especialmente a fase de contato, parece ser um tanto menos importante que a via extrnseca. Existe crescente consenso de que o gatilho fisiolgico tpico da coagulao, em sade e doena, o fator tecidual. Cabe ressaltar, entretanto, que a ativao por contato desempenha um papel importante quando o sangue exposto a superfcies no biolgicas, tal como durante cirurgia de by-pass cardiopulmonar, na qual a inibio da ativao por contato rotineiramente realizada com aprotinina, um inibidor de protease polivalente. Aparentemente, o benefcio teraputico alcanado com aprotinina, entretanto, preferencialmente a inibio da fibrinlise induzida pela ativao por contato (discutido em mais detalhes na parte de fibrinlise).

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Figura 18. Resumo das Vias Extrnseca e Intrnseca da Coagulao. Observe a ligao comum entre ambas as vias no nvel de ativao do fator IX. PL=fosfolipdios; HMWK=cininognio de alto peso molecular.

40 Um Modelo Recente na Coagulao Sangunea Fisiolgica Resultados mais recentes proveram evidncias para um modelo baseado em superfcies celulares hemostticas que enfatiza a importncia de receptores celulares especficos para as protenas da coagulao. J h algum tempo foi reconhecido que plaquetas fornecem fatores que apiam a ativao de protrombina, uma vez que FXa ligado superfcie da plaqueta pode levar gerao de trombina. De acordo com este novo modelo, a coagulao no ocorre simplesmente como uma cascata, mas em trs estgios sobrepostos: Fase 1: Iniciao Ocorre na superfcie de uma clula que expe fator tecidual, p.ex. em clulas subendoteliais ou moncitos ativados. A formao do complexo tenase extrnseco (TF/FVIIa) resulta na formao de FXa e FIXa, e na gerao de pequenas quantidades de trombina. Essa fase de iniciao facilmente desligada pelo inibidor da via do fator tecidual (TFPI), como veremos mais adiante. Fase 2: Amplificao A trombina formada na fase inicial essencial para ativao das plaquetas e dos co-fatores das enzimas FXa e FIXa, respectivamente FV e FVIII, de modo a permitir uma amplificao da gerao de trombina em larga escala. Dessa forma, o FXa, agora constituinte do complexo protrombinase, est protegido da inibio por antitrombina. Fase 3: Propagao Grandes quantidades de trombina so geradas na superfcie da plaqueta ativada, onde a exposio de fosfolipdios aninicos, especialmente fosfatidilserina, essencial para a montagem dos complexos tenase intrnseco (FIXa/FVIIIa/FX) e protrombinase (FXa/FVa/protrombina). Nveis mais elevados de trombina levam tambm ativao de FXI, que est disponvel no plasma, mas tambm liberado de plaquetas (atravs dos grnulos alfa). A superfcie da plaqueta ativada protege ainda o FXIa de inibio por inibidores plasmticos. FXIa pode induzir a formao de trombina de forma explosiva, por ativao mais eficiente de FIX na superfcie da plaqueta ativada. Obviamente, uma formao adicional macia de trombina atravs dessa via ocorre quando a fibrina j estiver formada.

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Figura 19. Reaes da Coagulao Dependentes de Superfcies de Membrana. Representao esquemtica dos principais complexos enzimticos da coagulao, onde cada serino-protease est associada ao seu co-fator protico e substrato apropriados, em uma superfcie de membrana expondo Fator Tecidual (no caso do complexo tenase extrnseco) ou fosfatidilserina, representada em azul (no caso dos complexos tenase intrnseco e protrombinase).

Formao de Polmero de Fibrina Solvel e Fibrina Estabilizada A fase final da cascata de coagulao leva formao de fibrina insolvel por converso da protena solvel no plasma, o fibrinognio, pela trombina em uma srie de reaes proteolticas. Fibrinognio uma grande protena plasmtica multimrica que formada de duas cadeias alfa, beta, gama. As cadeias de protenas individuais do fibrinognio so conectadas por diversas ligaes dissulfeto. A molcula forma uma estrutura nodular que pode ser depois segmentada em um domnio-E central e dois domnios-D (Figura 20).

Figura 20. Desenho Esquemtico aa Clivagem de Fibrinognio pela Trombina. Este esquema mostra os fibrinopeptdios A (FPA) e B (FPB), expostos no domnio-E central, sendo cortados pela trombina. O produto da reao chamado des-AB-fibrina, monmeros de fibrina, ou, depois da formao de oligmeros, fibrina solvel.

42 A liberao de fibrinopeptdios FPA e FPB (um processo gradual levando primeiro a des-A-fibrina e um tanto depois a des-AB-fibrina) gera mudanas significativas na estrutura geral da molcula e induz polimerizao. Aps certo tamanho molecular ter sido atingido, a solubilidade da fibrina reduzida significativamente. Isso leva formao de um polmero insolvel, que forma uma rede de cadeias ramificadas, o cogulo. A trombina permanece ligada ao cogulo e ainda ativa. Em adio trombina, existem diversas enzimas de cobras venenosas que tambm podem gerar fibrina (Reptilase , uma protease semelhante trombina proveniente de Bothrops atrox, Ancrod e vrias outras). Algumas enzimas de cobras venenosas cortam apenas FPA ou FPB. Defibrinao teraputica com enzimas de cobras venenosas parecem ser benficas no acidente vascular cerebral (AVC) e outras doenas tromboemblicas arteriais. Em contraste com a trombina, batroxobin e enzimas de cobras venenosas altamente purificadas similares no so inibidas por antitrombina ou inibidores de ao rpida similar, e no ativam plaquetas ou FV, FVIII, FXI ou FXIII. Portanto, estas enzimas so ferramentas valiosas na investigao da formao de fibrina e retrao do cogulo.

Fator XIII A formao de des-A-fibrina por trombina leva quase simultnea ativao de outro fator da coagulao, FXIII, em uma reao dependente de clcio. FXIIIa age como uma transglutaminase e faz uma ligao cruzada entre as molculas de fibrina. De acordo com dados recentes, o substrato de FXIIIa j a des-Afibrina. FXIIIa tambm promove a ligao cruzada entre diversas outras protenas e o cogulo de fibrina. Dentre estas protenas, esto a alfa2-antiplasmina, inibidor central do sistema de fibrinlise, e o inibidor da fibrinlise ativado por trombina (TAFI). Esses inibidores previnem o cogulo de ser dissolvido precocemente.

Figura 21. Converso de Fibrinognio em Fibrina (1) e Estabilizao do Cogulo de Fibrina pelo Fator XIIIa (2).

43 A ligao cruzada mediada pelo FXIIIa a formao de uma ligao isopeptdeo entre cadeias laterais de lisina e glutamina especficas no substrato. Essa reao libera uma molcula de amnia/ligao cruzada (Figura 22).

Figura 22. Ligao Cruzada Isopeptdeo Catalisada pelo Fator XIIIa.

A fibrina forma uma rede tridimensional. In vivo, um cogulo de fibrina contm clulas aprisionadas tais como plaquetas, eritrcitos e clulas brancas do sangue. Devido baixa atividade fibrinoltica inicial, o cogulo relativamente estvel por algum tempo. Desde de que o cogulo ainda tenha trombina ativa, pedaos dissolvidos do cogulo (embolia) podem transportar um material altamente trombognico para outros segmentos de vasos sanguneos, que podem ento ser o incio de um novo evento tromboemblico (p.ex., um infarto do miocrdio ou um AVC). A fixao direta de filamentos de fibrina a diferentes clulas tais como plaquetas, fibroblastos, clulas do msculo liso e a protenas adesivas garante que a rea afetada esteja mecanicamente (impacto do fluxo) e quimicamente (impacto de enzimas fibrinolticas ou proteases de leuccitos) bem protegida. Isto limita a perda de sangue no caso da injria de um vaso, protege contra invaso por agentes infecciosos em feridas abertas, e previne os filamentos de fibrina e clulas aprisionadas de formar mbolos, que podem ocluir vasos sanguneos em outras reas.

2.3.3. Deficincia dos Fatores da Coagulao

44 Deficincias Hereditrias As deficincias congnitas da maioria dos fatores da coagulao so relativamente raras. Deficincias leves de fatores da coagulao (usualmente abaixo de 30% da atividade normal ou at mesmo mais baixo), no levam a ditese hemorrgica espontnea. Entretanto, a combinao com um fator de risco diferente, tal como trombocitopenia, uso de AAS (cido acetilsaliclico) e outros, pode ser perigoso, especialmente quando requerida uma cirurgia. Portanto, uma anamnese cuidadosa obrigatria, e testes de coagulao que investiguem a funo das vias de coagulao devem sempre ser efetuados, incluindo uma investigao da funo plaquetria, que provavelmente mais importante que o sistema plasmtico. As deficincias hereditrias que levam a ditese hemorrgica so mais conhecidas como hemofilias, e trs tipos diferentes so descritos: a Hemofilia A, conhecida tambm como hemofilia clssica e que se caracteriza pela ausncia do fator VIII da coagulao; a Hemofilia B, tambm conhecida como doena de Christmas, e que se caracteriza pela ausncia do fator IX; e a Hemofilia C, que determinada por gene autossmico dominante no relacionado com o sexo e caracteriza-se pela ausncia de fator XI.

Terapia Deficincias de fatores da coagulao so usualmente tratadas com fatores purificados e concentrados de plasma agregado de diferentes doadores, ou de origem recombinante, especialmente para a maioria das formas de hemofilia, as deficincias de FVIII (hemofilia A) e FIX (hemofilia B). Deficincias de alguns dos outros fatores da coagulao so usualmente tratadas com plasma fresco congelado (ou liofilisado) ou com PPSB, uma frao do plasma que rica em fatores da coagulao dependentes de vitamina K. PPSB tem sido utilizado cuidadosamente porque algumas marcas podem conter fatores da coagulao ativados tal como FIXa. Apenas para alguns subtipos de deficincia do fator de Von Willebrand, a peptdio hormnio desmopressina (que libera FvW de clulas endoteliais) pode ser usada como uma alternativa menos cara, mas muito efetiva. Terapia concentrada requer monitorao cuidadosa.

Inibidores Uma complicao perigosa da terapia concentrada o desenvolvimento de inibidores, autoanticorpos, que agem diretamente contra o respectivo fator da coagulao. O desenvolvimento de inibidores pode ter tambm causas genticas. No caso de deficincia do FVIII, a formao do inibidor afeta aproximadamente 1/3 dos pacientes. Inibidores podem tambm ser formados espontaneamente ou depois do parto. Alguns inibidores desaparecem espontaneamente, outros requerem tratamento com frmacos imunossupressores e/ou altas concentraes de fatores da coagulao que esto associados com altos custos. Ademais,

45 concentrados de FVIII de porcos e concentrados de fatores da coagulao ativados (FEIBA = atividade desviadora do inbidor do fator FVIII), e tambm FVIIa recombinante so usados.

Deficincia adquirida Deficincias adquiridas dos fatores da coagulao (e seus inibidores fisiolgicos) so achadas freqentemente em pacientes com doena heptica (a maioria dos fatores da coagulao so sintetizados no fgado), durante septicemia, no cncer, depois de trauma, queimaduras e vrias outras doenas ou alguns tratamentos especficos, tal como a terapia com L-asparginase no cncer. Uma situao muito perigosa o quadro clnico de coagulao intravascular disseminada (CID), tambm conhecido como coagulopatia de consumo. Essa doena ameaadora da vida no incomum em pacientes com doena heptica, cncer e especificamente durante septicemia. O quadro clnico caracterizado pela ocorrncia simultnea de sintomas de hemorragia severa e trombose, induzida por desequilbrio na hemostasia. O consumo de fatores da coagulao e da fibrinlise e seus inibidores, diminuio da contagem de plaquetas e fibrinognio, e a ocorrncia de marcadores de ativao do sistema hemosttico (p.ex., um aumento da fibrina solvel, produtos de degradao de fibrina e fibrinognio e outros marcadores) so tpicos.

Deficincia de fibrinognio e desfibrinogenemia Uma deficincia de fibrinognio pode levar a complicaes hemorrgicas. Em adio s deficincias, vrias formas mutantes so conhecidas. Usualmente elas mostram o quadro clnico de uma leve a moderada ditase hemorrgica. Algumas desfibrinogenemias, entretanto, mostram tambm uma tendncia em direo a freqncias aumentadas de doenas tromboemblicas, que podem estar associadas com aumento da fora do cogulo ou fibrinlise prejudicada (devido a uma funo co-fator prejudicada da respectiva fibrina na ativao catalisada por ativadores do plasminognio) do cogulo.

Deficincia do FXIII Uma deficincia de FXIII pode levar a uma prejudicada cicatrizao de feridas e problemas hemorrgicos severos. A deficincia congnita de FXIII muito rara, mas deficincias adquiridas so achadas em diversas situaes clnicas, nas quais o sistema de coagulao sistematicamente ativado, tal como durante a coagulopatia de consumo, septicemia, em certas doenas de tumores, em doena heptica, em doenas gastrointestinais inflamatrias e na prpura Henoch-Schoenlein. De acordo com os resultados de um estudo da European Thrombosis Research Organization, pacientes com nveis muito baixos de FXIII e pacientes com atividade <5% podem desenvolver hemorragia severa. Terapia com substituio possvel. Existe tambm crescente evidncia de que uma deficincia de FXIII tratada com concentrados pode ser benfica em certas doenas inflamatrias, tal como morbus Crohn ou colite ulcerosa.

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O FXIII uma protena altamente polimrfica. A presena da mutao Val34Leu leva atividade alterada de FXIII e parece estar associada com um risco aumentado para hemorragia cerebral, mas protetor a respeito do infarto do miocrdio ou tromboembolismo venoso.

Autor(es):
Rodrigo Maciel Bruna Gouveia Luize Gonalves Lima

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UNIDADE 3

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3. REGULAO DO PROCESSO HEMOSTTICO

3.1. INIBIDORES DA COAGULAO Os principais sistemas inibidores da coagulao sangunea so:

inibidores de protease inibio de fatores de coagulao ativados; a via da protena C responsvel pela inativao de co-fatores ativados.

3.1.1. Inibidores de Protease Os inibidores de proteases so achados em muitos fluidos corpreos. Sua funo a ligao e a neutralizao de enzimas proteolticas que esto envolvidas em diversas vias regulatrias. Os inibidores de protease tm estrutura homloga uns com os outros. As serino-proteases, tais como fatores da coagulao e da fibrinlise, so inibidas por protenas inibidoras pertencentes famlia das serpinas (do ingls serpin, Serine-Protease Inhibitor). A vasta maioria de inibidores de proteases funciona como um tipo de pseudo-substrato de enzimas. Os inibidores formam um complexo com a enzima alvo similar ao complexo transitrio enzima/substrato. Em contraste reao enzimtica tpica, entretanto, o inibidor no clivado rapidamente e, assim, a protease permanece ligada enzima. Na prtica, isso significa que uma molcula de inibidor consumida por molcula de enzima.

Antitrombina e a Importncia da Heparina Antitrombina (AT, previamente conhecida como antitrombina III ou AT III) o inibidor plasmtico mais importante para os fatores da coagulao ativados. Seus principais alvos so a trombina, o FXa e o FIXa. A importncia de AT na inibio do FVIIa ainda no completamente entendida. O produto de reao da AT com a enzima um complexo inativo (AT-enzima), na qual a enzima perde permanentemente a sua atividade. Este complexo AT-enzima retirado da circulao em poucos minutos pelo fgado. Interessantemente, a concentrao aumentada de trombina-AT pode ser utlizada como marcador de um estado hipercoagulante, em que h gerao aumentada de trombina. O efeito inibitrio da AT enormemente potencializado na presena de glicosaminoglicanos (GAG) negativamente carregados, tal como o heparan sulfato, que achado na superfcie de clulas endoteliais. Este fenmeno tambm produzido pela heparina no-fracionada (UFH) ou pela heparina de baixo peso molecular (LMWH), uma forma de heparina degradada enzimtica ou quimicamente. A heparina no fracionada liga-se tanto enzima quanto AT, enquanto a LMWH liga-se apenas AT, induzindo uma mudana conformacional no inibidor. Por esta razo, a LMWH inibe o FXa muito efetivamente, sendo menos efetivos na inibio de trombina.

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Figura 23. Papel de Glicosaminoglicanos na Inibio de Trombina por Antitrombina.

O local de ligao para AT nas molculas de heparina uma seqncia curta composta por um pentassacardeo com um padro distinto de grupos carboxi e sulfato ligados ao esqueleto glicosdico. Uma forma sinttica deste pentassacardeo (Fondaparinux) agora disponvel como um frmaco, e amplamente utilizado para profilaxia de doena tromboemblica. O mecanismo de ao do pentassacardeo similar ao da LMWH. A atividade da heparina requer a presena de uma concentrao mnima de AT no sangue, em torno de pelo menos 40%. Por esta razo, a deficincia de AT um fator de risco para doena tromboemblica. Ambas deficincias hereditrias, qualitativa ou quantitativa, so conhecidas, mas so relativamente raras (em torno de 1:10.000). Entretanto, deficincias adquiridas no so incomuns. Uma atividade de AT reduzida pode enfraquecer a eficcia da terapia com heparina e LMWH. Portanto, determinaes de AT devem ser realizadas antes e durante a terapia com heparina. A AT parcialmente consumida durante a terapia com heparina. Em casos graves, a substituio com AT purificada ou com plasma congelado fresco requerida. Uma sria complicao do uso clnico de heparina o desenvolvimento de trombocitopenia induzida por heparina (HIT), que ocorre em 1-5% dos pacientes tratados com heparina. A HIT tipo I, provavelmente induzida por um efeito direto pr-agregatrio de heparina, relativamente leve (usualmente contagem de plaquetas >100/nL). A HIT tipo II, entretanto, pode ser extremamente sria. Ela se desenvolve de 4 a 14 dias depois da administrao de heparina e pode levar a uma diminuio macia da contagem de plaquetas (muitas vezes <100/nL) e ao desenvolvimento de trombose. Sabe-se que a HIT II tem uma patognese imune

50 mediada pela produo de auto-anticorpos, contudo o mecanismo trombognico desses auto-anticorpos no est completamente elucidado. Ele pode incluir, por exemplo, ativao plaquetria e leso de clulas endoteliais com exposio de fator tecidual e colgeno. Pacientes com HIT I no requerem tratamento especfico, contanto que a HIT II no se desenvolva durante a terapia. Em pacientes com HIT II, a heparina deve ser interrompida imediatamente e a anticoagulao com outro frmaco requerida.

Co-fator II da Heparina O co-fator II da heparina (HCII) um inibidor homlogo AT, mas apresenta uma atividade inibitria especfica contra a trombina. Assim como a AT, sua ao dependente de GAGs como o dermatan sulfato, um GAG distinto do heparan sulfato, e tambm pode ser potencializada por heparina. Diferentemente da AT, a ligao do HCII com heparina ou dermatan induz uma alterao alostrica que facilita a sua interao com uma regio especfica da trombina denominada exostio I, o que explica a especificidade deste inibidor pela enzima. Cerca de 1% dos pacientes com trombose apresentam deficincia de HCII, mas esta no necessariamente a causa da trombose.

Figura 24. Papel de Glicosaminoglicanos na Inibio de Trombina pelo Co-fator II da Heparina.

51 Inibidor da Via do Fator Tecidual O inibidor da via do fator tecidual (TFPI) inibe o FXa e o complexo formado pelo fator tecidual e o FVIIa. Interessantemente, o TFPI s capaz de inativar o complexo FVIIa/fator tecidual depois de uma reao prvia com o FXa. Inicialmente, com o incio da coagulao, ocorre a formao de certa quantidade de FXa. Parte deste ser ligado ao TFPI, e isso levar inibio do complexo FVIIa/fator tecidual, responsvel pela iniciao da coagulao sangunea, constituindo um feedback negativo. O TFPI encontrado no plasma, mas pode ser liberado da vasculatura durante a terapia com heparina ou LMWH. Assim, sua concentrao vrias vezes maior na terapia com heparina. No plasma, TFPI est parcialmente associada com lipoprotenas (LDL e VLDL). O TFPI liberado durante tratamento com heparina parece ser uma forma presente nas clulas endoteliais. Existe evidncia recente de que a gerao de trombina induz uma liberao de TFPI, o que seria outro exemplo de uma reao de feedback negativo: a trombina interrompe sua prpria produo.

Figura 25. Mecanismo de Ao do TFPI. TFPI inativa FVIIa de maneira dependente de FXa. TFPI Primeiramente se complexa ao FXa, e o complexo TFPI/FXa ento inibe FVIIa inserido no complexo FVIIa/TF.

52 3.1.2. A Via da Protena C Junto com a ativao de AT e TFPI, a via da protena C o sistema de defesa mais importante e efetivo contra a trombose. Deficincias no sistema da protena C (PC), especialmente resistncia protena C ativada (APC), so as desordens congnitas mais freqentemente associadas com a trombofilia.

A protena C A protena C uma protena plasmtica dependente de vitamina K que compartilha seqncias de homologia com a protrombina e outros fatores dependentes da vitamina K, o que inclui o seu prprio co-fator protico, a protena S.

Figura 26. Representao Esquemtica da Seqncia das Protenas C e S.

A protena C o precursor de uma serino-protease que ativado por trombina. A protena C ativada uma protease que inativa especificamente os cofatores FVa e FVIIIa da coagulao, de um modo dependente de clcio, fosfolipdeos carregados negativamente e de um co-fator protico, a protena S livre. Visto que um alto fator de amplificao atingido por estes co-fatores ativados, a neutralizao deles muito efetiva para interromper a formao de

53 trombina. Existe evidncia de que o FV no ativado pode tambm representar um papel de co-fator na inativao de FVa e FVIIIa por APC. A clivagem em Arg 506 no FV por APC enfraquece esta funo de co-fator. Vale ainda ressaltar a importncia de duas protenas transmembrana presentes na superfcie das clulas endoteliais: o receptor de protena C endotelial (EPCR) e a trombomodulina. A PC intacta interage com o EPCR com uma afinidade muito alta na presena de Ca2+ e pode ser ativada por trombina. Para fazer isso, a trombina precisa ligar-se a outro receptor na clula endotelial, a trombomodulina. Esta acelera a ativao da protena C pela trombina em torno de 1000 vezes em relao enzima sozinha. Quando a trombina est ligada trombomodulina, ela perde todas as suas funes de coagulao, incluindo a ativao de FV, FVIII e FXIII, alm da capacidade de clivar o fibrinognio e ativar plaquetas.

Ca++

Figura 27. Mecanismo de Ao da Protena C Ativada. A PC inativa (PC) interage com seu receptor (EPCR) na superfcie da clula endotelial, e ativada por trombina ligada trombomodulina (TM). A protena C ativada (APC) inativa ento, por protelise, os co-fatores FVa e FVIIIa (normalmente associados superfcie de plaquetas), de um modo dependente de clcio, fosfolipdeos carregados negativamente e de um co-fator protico, a protena S livre (PS).

Resistncia APC A resistncia a APC (APCR) descreve uma funo prejudicada da via da protena C. Na APCR, a APC adicionada ao plasma no mostra o prolongamento esperado do tempo de coagulao do plasma. A APCR pode ser herdada ou adquirida. A forma hereditria uma mutao no fator V, que chamado FV Leiden. Uma mutao no xon 10 do FV (1691 GA), que determina uma troca de arginina para glutamina na posio 506 da protena, muda um dos stios de clivagem para APC no FVa. A conseqncia biolgica desta mutao um atraso na inativao por APC na forma Leiden de FVa quando comparado com o tipo selvagem.

54 O FVa mutado permanece ativo por muito mais tempo que o tipo selvagem e pode produzir mais trombina. Ademais, o variante 506 Gln do FV parece ter uma atividade de co-fator mais baixa para protena C ativada na inativao de FVIIIa e FVa. Portanto, os pacientes afetados por esta mutao podem desenvolver doena tromboemblica, especialmente quando outros fatores de risco esto presentes p.ex., o uso de frmacos contraceptivos orais e a ocorrncia de patologias tais como lupus anticoagulante (produo de autoanticorpos que so direcionados contra fosfolipdios ou contra protenas ligadoras de fosfolipdios, como por exemplo, protenas C ou S, protrombina, beta 2glicoprotena I e anexina V), ou deficincias de um dos inibidores da coagulao, como protena C, protena S ou antitrombina. Vale ressaltar que a mutao do FV de Leiden tem uma alta prevalncia em caucasianos (5-10%), mas est ausente ou muito rara nas populaes nativas americana e australiana, no Japo e em alguns outros pases da sia Oriental. A forma homozigota relativamente rara, mas ainda muito mais comum que a deficincia de antitrombina, protena S ou protena C. Pacientes homozigotos para FV Leiden tem um risco maior para trombose que heterozigotos, nos quais 50% das molculas de fator V so normais. J a resistncia APC adquirida freqentemente achada em:

Pacientes com inflamao ou em gravidez (provavelmente parcialmente induzida pelo aumento da protena C4b-BP, cuja ligao protena S leva a uma perda de funcionalidade dessa protena regulatria); Pacientes com FVIII elevado (protena de fase aguda, algumas vezes seu aumento pode tambm ocorrer espontaneamente); Pacientes com sndrome antifosfolipdica; Pacientes com mutao G20210A de protrombrina; Pacientes com deficincias de antitrombina, protena C ou protena S.

Deficincia de Protena C e Protena S Uma deficincia de protena C e/ou S pode levar trombose. Aproximadamente metade dos pacientes com deficincia de protena C desenvolve trombose at a idade de 40 anos. A deficincia de protena C est associada com risco aumentado de at 7 vezes para o tromboembolismo venoso. Tambm a deficincia de protena S parece predispor trombose venosa, provavelmente com um risco de 5 a 10 vezes acima do normal. Formas qualitativa (tipo I) e quantitativa (tipo II) de deficincia de protena C e protena S so conhecidas.

55 3.2. FIBRINLISE Mais que apenas dissolver cogulos. O Sistema Fibrinoltico responsvel pela lise de cogulos de fibrina, mas tambm est envolvido na degradao do colgeno, angiognese, metstase tumoral e nas cascatas proteolticas das metaloproteases da matriz. No entanto, apenas seu envolvimento direto na hemostase ser discutido. 3.3.1. Mecanismos Bsicos na Fibrinlise A fibrinlise compartilha vrias similaridades com o sistema de coagulao. Os fatores e inibidores so homlogos s suas contrapartes e so obviamente produtos de precursores comuns durante a evoluo molecular. Alm disso, o sistema fibrinoltico requer etapas de ativao de pr-enzimas. As funes de cofator tambm representam um papel importante. A enzima central da fibrinlise a protena plasmtica plasminognio, o precursor da serino-protease plasmina. Os dois ativadores mais importantes do plasminognio so o ativador de plasminognio tecidual (t-PA), e a uroquinase (u-PA). Ambos ativadores de plasminognio so precursores de serino-proteases e requerem uma etapa de ativao proteoltica. A principal via de ativao do sistema fibrinoltico dependente de fibrina, e iniciada com a formao do cogulo, embora, inicialmente, a resposta fibrinoltica no seja favorecida.

Ativao da Fibrinlise por t-PA: Fibrinlise Dependente de Fibrina O plasminognio tem afinidade fibrina e se liga firmemente a esta molcula. Clulas endoteliais sintetizam e liberam o ativador de plasminognio tecidual (t-PA) na corrente sangunea. Aparentemente, certos estmulos tal como estase ou formao de fibrina podem aumentar a secreo e a nova sntese de tPA. O t-PA tambm tem forte afinidade fibrina. A fibrina serve como um co-fator para a ativao de plasminognio por uma clivagem proteoltica mediada por tPA. A fibrina, e especialmente a fibrina parcialmente degradada, aumentam a ativao de plasminognio mediada por t-PA. Alm disso, o plasminognio que se liga fibrina tambm suscetvel ativao auto-proteoltica pela plasmina (reao de feedback positivo). A plasmina uma enzima relativamente inespecfica, mas muito poderosa que cliva a rede de fibrina e libera produtos de degrao da fibrina (FDP) de diferentes tamanhos moleculares, sendo os menores deles o fragmento D e o fragmento E. Um produto de degradao importante diagnosticamente o Ddmero, o menor de uma srie de FDPs com ligaes cruzadas. Concentraes aumentadas de D-dmero indicam formao de fibrina e subseqente lise. A plasmina, entretanto, tambm cliva fibrinognio, o que gera produtos de degradao do fibrinognio tais como fragmento X e Y e produtos menores. Alguns desses produtos de degradao prejudicam a agregao plaquetria e a

56 polimerizao de fibrina, funcionando como anticoagulantes. Portanto, em algumas situaes clnicas com baixa concentrao de fibrinognio devido atividade fibrinoltica aumentada, o sangramento pode ser preferencialmente causada pela presena de FDPs do que pelo nvel de fibrinognio diminudo. Ativao de plasminognio por u-PA Uma via diferente para ativar a fibrinlise mediada pelo ativador de plasminognio do tipo uroquinase (u-PA), a forma ativada de seu precursor plasmtico pr-uroquinase. A pr-uroquinase encontrada em baixas concentraes como uma molcula de cadeia nica (scu-PA) no plasma. A ativao deste precursor em uma forma de dupla-cadeia (tcu-PA) mediada por FXIIa, calicrena e por plasmina (reao de feedback positivo) e aumentada pela ligao ao receptor de uroquinase. A dependncia de calicrena pode explicar porque pacientes com uma deficincia de pr-calicrena, FXII ou HMWK, que foram historicamente sendo considerados como parte da cascata de coagulao, no tm problemas hemorrgicos, mas em vez disso sofrem de trombose. Entretanto, a importncia da via dependente de u-PA da fibrinlise no est completamente entendida. A uroquinase pode, em vez disso, ser importante para remodelamento tecidual e migrao celular.

Figura 28. Representao Esquemtica da Converso de Plasminognio em Plasmina. Ativao por protelise catalisada pelos ativadores de plasminognio tecidual (t-PA) e uroquinase, ou ainda pela estreptoquinase, uma protena bacteriana e, portanto, exgena, bastante utilzada na clnica como um tromboltico.

3.3.2. Inibidores da Fibrinlise

Alfa2-antiplasmina Sob condies fisiolgicas, a plasmina rapidamente inativada por alfa 2antiplasmina. Esta uma serpina que possui afinidade fibrina e ligada

57 covalentemente fibrina pelo FXIIIa durante a formao do cogulo. A reao entre alfa2-antiplasmina e plasmina muito rpida. A meia vida da plasmina livre no sangue de apenas 0,1 segundos. Na superfcie de fibrina, na qual a plasmina muito menos acessvel alfa2-antiplasmina, a inibio provavelmente cerca de 50 vezes mais lenta que no plasma. A deficincia de alfa 2-antiplasmina est associada com complicaes hemorrgicas. Formas adquiridas da deficincia so muito mais comuns que a deficincia hereditria.

Inibidor do Ativador de Plasminognio tipo 1 (PAI-1) Ambos t-PA e u-PA tm um inibidor especfico, PAI-1. Esta serpina estabilizada pela ligao vitronectina, uma protena de matriz extracelular. O PAI-1 encontrado no plasma e nas plaquetas. O PAI-1 tambm sintetizado por clulas endoteliais, especialmente quando elas so estimuladas por lipopolissacardeos (LPS, endotoxinas) durante a sepse, por citocinas prinflamatrias tais como IL-1 ou TNF, e tambm por trombina. O PAI-1 considerado uma protena de fase aguda e pode aumentar significativamente durante a inflamao, mas tambm durante a trombose. A rara deficincia de PAI1 hereditria est associada com hemorragia.

Inibidor da Fibrinlise Ativado por Trombina (TAFI) O inibidor da fibrinlise ativado por trombina (TAFI) uma protena plasmtica que, quando convertida a uma enzima ativa, atenua a fibrinlise. O TAFI uma metaloendopeptidase dependente de zinco, e esta enzima retira aminocidos bsicos C-terminais tais como lisina ou arginina. O TAFI existe na forma precursora (pr-TAFI) e a sua ativao realizada pela trombina associada trombomodulina (ver a via da protena C) e dessa maneira ligada a clulas endoteliais. O TAFI ativado protege o cogulo de fibrina contra a lise por clivar os stios de ligao lisina requeridos para a ligao de plasminognio, o que significativamente retarda o tempo de fibrinlise induzido por t-PA. Existe uma correlao direta entre o tempo de lise do cogulo e a concentrao de TAFI. O fator XIIIa entrecruza TAFI fibrina, desse modo ajudando a proteger o cogulo recm formado da degradao prematura por plasmina. O entrecruzamento pode facilitar a ativao de TAFI, estabilizar a atividade enzimtica, e proteger a enzima ativa de degradao mais adiante. A regulao positiva da produo de TAFI durante a resposta inflamatria pode exacerbar a trombose, contribuindo para o desenvolvimento de coagulao intravascular disseminada, bem como de outras condies envolvendo trombose. A lise do cogulo por concentraes farmacolgicas de t-PA no influenciada pelo TAFI. Em estudos animais, antagonistas contra o TAFI promoveram tromblise. Dados recentes sugerem que a aspirina pode inativar o TAFI.

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Figura 29. Resumo dos principais mecanismos de controle da fibrinlise.

3.3.3. Fisiopatologia da Fibrinlise

Hiperfibrinlise A produo excessiva de plasmina (hiperfibrinlise) uma situao clnica potencialmente perigosa que est associada com um forte risco hemorrgico. Visto que muitos testes de laboratrio no so sensveis para deteco de hiperfibrinlise, o aumento excessivo da formao de plasmina e a gerao de FDPs anticoagulatrios freqentemente no so reconhecidos cedo o bastante. Os ensaios globais tpicos realizados no plasma no so muito sensveis para hiperfibrinlise. O nico ensaio global que prontamente disponvel e sensvel para deteco imediata da hiperfibrinlise so a tromboelastografia, ou a sua verso mais sofisticada, a tromboelastometria. Devido a sua especificidade limitada, a plasmina no pode degradar muitos substratos no sangue. Ademais, a plasmina pode ativar metaloproteases da matriz que esto associadas com destruio tecidual e apoptose. Hiperfibrinlise pode desenvolver-se em pacientes politraumatizados, durante sepse, coagulao intravascular disseminada ou em outras situaes. Tambm uma deficincia congnita ou adquirida em um dos inibidores da prpria plasmina (deficincia de alfa2-antiplasmina) ou de seus ativadores (deficincia de PAI-1) pode induzir hiperfibrinlise. A hiperfibrinlise um crculo vicioso que dispe a sangramento, mas parcialmente tambm a trombose. Um diagnstico associado a tratamento subseqente necessrio. O frmaco de escolha a aprotinina, um inibidor de baixo peso molecular relativamente inespecfico isolado do parnquima do pulmo. A aprotinina utilizada com sucesso em circuitos cardiopulmonares, p.ex. em cirurgias de corao aberto, para reduzir a hemorragia induzida por hiperfibrinlise. Outros frmacos antifibrinolticos so o cido tranexmico ou o

59 cido epslon-amino caprico, que interferem com a interao de plasminognio/tPA e fibrina. Assim, esses frmacos previnem a formao de plasmina.

Fibrinlise Prejudicada (Hipofibrinlise) A hipofibrinlise pode ser esperada a partir de:

Deficincia de t-PA, u-PA ou plasminognio; Liberao defeituosa de t-PA do endotlio (sntese e armazenamento); Concentrao elevada de PAI-1 (muito comum) ou alfa2-antiplasmina.

Em casos raros, a hipofibrinlise tambm o resultado de uma forma rara de disfibrinogenemia, na qual a fibrina (fibrinognio) mutante perdeu a habilidade de estimular a fibrinlise. Deficincias dos fatores de contato FXII, pr-calicrena e HMWK resultando em ativao prejudicada de pr-uroquinase por calicrena tambm podem levar a uma fibrinlise defeituosa. A hipofibrinlise est associada com o desenvolvimento de doena tromboemblica, mas certamente no ao mesmo grau como na resistncia APC, deficincias da via da protena C ou deficincia de antotrombina. Testes clnicos amplos, tal como o estudo da trombofilia de Leiden, no necessariamente suportam o conceito de que a hipofibrinlise um forte fator de risco no desenvolvimento da trombofilia. 3.3.4. Terapia Tromboltica A terapia tromboltica empregada em milhes de pacientes com doena tromboemblica, especialmente com acidente vascular cerebral e infarto agudo do miocrdio. O benefcio clnico foi mostrado em testes multicntricos amplos durante a ltima dcada. A terapia tromboltica dissolve os cogulos, especialmente quando iniciada muito cedo aps o evento agudo. Frmacos trombolticos que so amplamente utilizados para o tratamento do infarto do miocrdio, trombose venosa profunda, acidente vascular cerebral isqumico e desordens relacionadas so:

Estreptoquinase (SK), uma protena bacteriana capaz de ativar o plasminognio j citada acima; Ativador de plasminognio tecidual (t-PA), um ativador especfico de fibrina produzido por tcnicas recombinantes (alteplase) e derivados de t-PA construdos geneticamente, p.ex. com meia vida plasmtica prolongada (reteplase, lanoteplase) ou inibio prejudicada por PAI-1 (tenecteplase); Uroquinase (da urina humana ou recombinante) ou rscu-PA (saruplase); Estreptoquinase anisolitada (APSAC), um complexo de plasminognio e estreptoquinase que est bloqueado no stio ativo por um agente bloqueador lbil.

60 O t-PA utilizado com sucesso para tratamento de acidente vascular cerebral (AVC), se um AVC hemorrgico puder ser excludo. A terapia tromboltica freqentemente combinada com heparina. Como resultado, uma resposta hiperfibrinoltica macia gerada, ou sistematicamente (SK), ou mais localizada a reas ricas em fibrinas (t-PA). Isto pode levar lise parcial ou completa do trombo de fibrina e recanilizao de vasos ocludos. Tambm o fibrinognio parcialmente degradado. Isto poderia ser outro efeito colateral positivo, porque a viscosidade do sangue e a adeso e agregao plaquetrias so diminudas. Alm disso, os produtos de degradao do fibrinognio possuem um efeito anticoagulante poderoso porque eles prejudicam a polimerizao da fibrina. O grau de degradao de fibrinognio fortemente dependente do frmaco e da dose. Obviamente, a terapia com t-PA induz uma reduo relativamente leve de fibrinognio. Um efeito colateral da terapia tromboltica o sangramento, embora esquemas teraputicos modernos e o aperfeioamento de frmacos trombolticos tenham reduzido este risco significativamente.

61 Resumo de alguns dos principais reguladores do processo hemosttico

Equilbrio entre os mecanismos pr- e anticoagulantes

PAI-1 antiplasmina Fator Tecidual Fatores da coagulao

PTN C / PTN S TFPI AT / HC II Sistema fibrinoltico

Fatores Pr-coagulantes

Fatores Anticoagulantes

62 3.3. TROMBOSE Tendo discutido os componentes da hemostasia normal, voltamos agora nossa ateno desregulao que se submete formao patolgica do trombo. 3.3.1. Patognese Trs influncias principais predispem formao do trombo, conhecida como a trade de Virchow: (1) leso endotelial; (2) estase ou turbulncia do fluxo sanguneo; e (3) hipercoagulabilidade sangunea.

Leso Endotelial Essa a influncia dominante; a leso endotelial por si s pode levar trombose. particularmente importante para a formao do trombo que ocorre no corao ou na circulao arterial, em que as freqncias do fluxo, normalmente altas, poderiam de qualquer forma atrasar a coagulao pela preveno da adeso plaquetria ou fatores da coagulao diludos. Assim, a formao trombtica dentro das cmaras cardacas (p.ex., seguida leso endocrdica devido ao infarto miocrdico), sobre as placas ulceradas nas artrias aterosclerticas ou em locais de leso vascular traumtica ou inflamatria (vasculite) devido, em grande parte, leso endotelial. Claramente, a perda fsica do endotlio levar a exposio da matriz extracelular subendotelial, adeso plaquetria (presena de colgeno), liberao do Fator Tecidual, e depleo local de prostaciclina e ativadores de plasminognio. Todavia, importante observar que o endotlio no necessita estar fisicamente rompido para contribuir para o desenvolvimento da trombose; qualquer perturbao no equilbrio dinmico dos efeitos pr e antitrombticos do endotlio pode influenciar os eventos de coagulao local. Assim, o endotlio disfuncional pode passar a expressar quantidades maiores de fatores pr-coagulantes (p.ex., molculas de adeso plaquetria, Fator Tecidual, e o inibidor do ativador de plasminognio) ou pode sintetizar menos efetores anticoagulantes (p.ex., trombomodulina, PGI 2, e o ativador de plasminognio tecidual). Uma disfuno endotelial significativa (na ausncia de perda celular endotelial) pode ocorrer, p.ex., devido aos estresses hemodinmicos da hipertenso ou presena de endotoxinas bacterianas. Mesmo influncias relativamente sutis, como a hemocistinria, a hipercolesterolemia, a radiao, ou os produtos absorvidos da fumaa do cigarro, podem iniciar a leso endotelial.

Alteraes do Fluxo Sanguneo Normal A turbulncia contribui para a trombose arterial e cardaca por causar leso ou disfuno endotelial, bem como pela formao de bolsas contracorrentes e focais de estase: a estase um fator principal para o desenvolvimento do trombo venoso. O fluxo sanguneo laminar, com as plaquetas fluindo centralmente no lmen do vaso, separado do endotlio por uma zona clara do plasma de movimento mais lento. A estase e a turbulncia, portanto, (1) rompem o fluxo

63 laminar e trazem as plaquetas em contato com o endotlio; (2) impedem a diluio dos fatores coagulantes ativados pelo fluxo de sangue fresco; (3) retardam o fluxo interno dos inibidores dos fatores coagulantes e permitem a formao do trombo; e (4) promovem a ativao celular endotelial, predispondo trombose local, adeso leucocitria e uma variedade de outros efeitos celulares endoteliais. A turbulncia e a estase contribuem claramente para a trombose em um nmero de cenrios clnicos. As placas aterosclerticas ulceradas no somente expem a matriz extracelular subendotelial, mas tambm so fontes de turbulncia. As dilataes artica e arterial anormais, denominadas aneurismas, causam estase local e so locais favorveis de trombose. Os infartos miocrdicos no somente tm leso endotelial associada, mas tambm tm regies de miocrdio no-contrtil, adicionando um elemento de estase na formao dos trombos murais. A estenose da valva mitral (p.ex., aps doena cardaca reumtica) resulta em dilatao atrial esquerda. Em conjunto com a fibrilao atrial, um trio dilatado um local de estase profunda e uma localizao principal ao desenvolvimento do trombo. As sndromes de hiperviscosidade (como a policitemia) causam estase de pequenos vasos. E finalmente, os eritrcitos deformados na anemia de clulas falciformes causam ocluses vasculares, com a estase resultante predispondo trombose.

Hipercoagulabilidade A hipercoagulabilidade outro componente importante na equao que contribui para os estados trombticos. imprecisamente definida como qualquer alterao das vias de coagulao que predisponha trombose. As causas de hipercoagulabilidade podem ser disfunes primrias (genticas) e secundrias (adquiridas). Das causas herdadas de hipercoagulabilidade, as mutaes nos genes do fator V e da protrombina so as mais comuns. Aproximadamente 2 a 15% dos caucasianos carregam uma mutao especfica no fator V (denominada mutao Leiden, uma cidade na Holanda, onde ela foi descoberta), substituindo o resduo da arginina normal na posio 506 por uma glutamina e tornando a protena resistente clivagem pela protena C. O fator V de Leiden mutante no pode ser inativado por clivagem no resduo de arginina normal e, portanto, resistente ao efeito anticoagulante da protena C ativada. Tal resistncia inativao mediada pela fator Va promove coagulao incontrolada. Entre os pacientes com trombose venosa profunda recorrente, a freqncia no portador consideravelmente maior, em torno de 60% em algumas sries. Finalmente, uma nica alterao nucleotdea (transio de G para A) na regio no-traduzida 3 do gene da protrombina um alelo bastante comum (1 a 2% da populao), que est associado a nveis elevados de protrombina e um risco aumentado de quase trs vezes de tromboses venosas. Outros exemplos podem ser ainda citados, como a elevao dos nveis de homocistena, que contribui para trombose arterial e venosa e, realmente, para o desenvolvimento da aterosclerose. Provavelmente, esse efeito devido inibio

64 da antitrombina III e trombomodulina endotelial. A hiperomocistenemia pode ser herdada ou adquirida. Uma mutao homozigota no gene da metiltetraidrofolato redutase causa homocistenemia branda em 5 a 15% das populaes branca e da sia Ocidental, correspondendo, assim, freqncia do fator V de Leiden. Todavia, a relao entre esta mutao e a trombose bem menos estabelecida. Alm dessas mutaes pontuais bem caracterizadas, os polimorfismos nos genes dos fatores coagulantes tambm parecem fornecer o risco aumentado de trombose venosa. Demais estados hipercoagulveis primrios, menos comuns, incluem deficincias herdadas de anticoagulantes, como a antitrombina III, protena C, ou protena S; indivduos afetados apresentam-se, tipicamente, com trombose venosa e tromboembolismo recorrente na adolescncia ou no incio da vida adulta. Ainda que individualmente estas disfunes herdadas sejam incomuns, de maneira coletiva elas so significativas por duas razes. Primeiro, as mutaes subjacentes dessas trombofilias herdadas podem ser co-herdadas e o efeito de ter duas mutaes em risco de trombose muito mais que suplementar. Segundo, indivduos com tais mutaes tm um risco maior que os indivduos normais de desenvolver trombose venosa quando as causas adquiridas de hipercoagulabilidade, como na gravidez, tambm esto presentes. As causas herdadas da hipercoagulabilidade devem ser consideradas em pacientes abaixo dos 50 anos de idade que se apresentam com trombose na ausncia de qualquer predisposio adquirida. Diferente destas disfunes hereditrias incomuns, a patognese da ditese trombtica adquirida em um nmero de cenrios clnicos comuns mais complicada e multifatorial. Em algumas situaes (p.ex., insuficincia cardaca ou trauma) certos fatores, como estase ou leso vascular, podem ser mais importantes. Em outros casos (p.ex., o uso de contraceptivos orais e o estado hiperestrognico da gravidez), a hipercoagulabilidade pode ser causada, parcialmente, pela sntese heptica aumentada de muitos fatores da coagulao e sntese reduzida da antitrombina III; a heterozigoticidade pelo fator V de Leiden tambm pode ser um componente contribuidor de base. A hipercoagulabilidade vista com o avano da idade pode ser devido suscetibilidade aumentada de agregao plaquetria e liberao de PGI 2 reduzida pelo endotlio. O tabagismo e a obesidade promovem a hipercoagulabilidade por mecanismos desconhecidos. Entre as causas adquiridas de ditese trombtica, a supostamente conhecida sndrome da trombocitopenia induzida pela heparina e a sndrome do anticorpo antifosfolipdico (previamente denominada sndrome anticoagulante de lupus) merecem ateno especial.

Destino do Trombo Se um paciente sobrevive aos efeitos imediatos de uma obstruo vascular trombtica, os trombos so submetidos a uma combinao dos quatro eventos seguintes, nos dias-semanas que se seguiro:

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Propagao o trombo pode acumular mais plaquetas e fibrina (propagao), levando eventualmente obstruo do vaso; Embolizao os trombos podem deslocar-se e viajar para outros locais da vasculatura; Dissoluo os trombos podem ser removidos pela atividade fibrinoltica; Organizao e recanalizao os trombos podem induzir a inflamao em fibrose (organizao) e podem tornar-se eventualmente recanalizados, isto , podem restabelecer o fluxo vascular, ou podem ser incorporados na parede vascular espessada.

Quanto dissoluo, a ativao das vias fibrinolticas pode levar reduo rpida e mesmo lise total dos trombos recentes. Com os trombos mais velhos, a polimerizao extensiva de fibrina d ao trombo uma resistncia mais substancial protelise, tornando a lise ineficiente. Isso importante devido s infuses teraputicas de agentes fibrinolticos, como o t-PA (p.ex., no tromboembolismo pulmonar ou trombose coronria), que provavelmente so efetivos somente por um curto perodo de tempo aps a formao dos trombos. Os trombos mais velhos tendem a tornar-se organizados. Isso se refere ao crescimento interno de clulas endoteliais, clulas musculares lisas, e fibroblastos no trombo rico em fibrina. A tempo, os canais capilares so formados, que podem se anastomosar para criar condutos de uma terminao do trombo a outra, restabelecendo, numa extenso limitada, a continuidade do lmen original. Ainda que os canais no possam restaurar com sucesso um fluxo significativo a muitos vasos obstrudos, tal recanalizao pode converter, em potencial, o trombo numa massa vascularizada de tecido conjuntivo. Com o tempo e a contrao das clulas mesenquimais (particularmente em trombos menores), o tecido conjuntivo pode ser incorporado como tumefao subendotelial da parede do vaso; eventualmente, somente um bloco fibroso permanece para marcar o local original do trombo. Ocasionalmente, em vez de se organizar, o centro de um trombo submete-se digesto enzimtica, presumivelmente como um resultado da liberao das enzimas lisossomais dos leuccitos e plaquetas nele contidos. Isso particularmente provvel nos trombos maiores dentro das dilataes aneurismticas ou das cmaras cardacas. Se ocorrer a semeadura bacteriana, tal trombo degradado ser um meio ideal de cultura, resultando, por exemplo, num aneurisma mictico.

Correlaes Clnicas Os trombos so significativos, pois eles causam obstruo das artrias e veias, e so fontes possveis de mbolos. A importncia de cada um depende de onde ocorre o trombo. Assim, enquanto o trombo venoso pode causar congesto e edema nos leitos vasculares distal a uma obstruo, uma conseqncia sria distante que eles podem embolizar-se nos pulmes, causando morte. Reciprocamente, ainda que os trombos arteriais possam embolizar-se, seus papis na obstruo vascular em locais crticos (p.ex., artrias coronrias, resultantes no infarto miocrdico) muito mais importante.

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Autor(es):
Luize Gonalves Lima

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UNIDADE 4

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4. TESTES DE HEMOSTASIA
Os testes hemostticos ou provas da hemostasia so de extrema importncia na avaliao de uma suposta desordem hemosttica. As duas provas a seguir - tempo de sangramento e prova do lao so indicadas para a avaliao da hemostasia primria. As outras duas tempo de ativao de protrombina (T.A.P.) e tempo de tromboplastina parcial ativado (P.T.T.a.) avaliam a coagulao sangunea (formao do cogulo de fibrina).

4.1. TEMPO DE SANGRAMENTO O tempo de sangramento ou TS um exame sugestivo de desordens da hemostasia primria, considerado um parmetro de atividade plaquetria. Consiste em avaliar o tempo necessrio para cessar o sangramento de uma pequena leso de tamanho e profundidade padronizados. Os valores de TS considerados normais esto entre 1 e 4 minutos. Inicialmente, a tcnica para avaliao do tempo de sangramento consistia em mensurar o tempo necessrio para cessar o sangramento de uma pequena leso feita com uma lanceta ou estilete, no lbulo da orelha ou polpa digital (Mtodo de Duke). No entanto, surgiu para fins comparativos, a necessidade de se padronizar as condies da realizao do teste. Isto porque alguns outros parmetros, que no a capacidade hemosttica, podem influir no tempo de sangramento. Dentre estes podemos destacar, por exemplo, alteraes de presso arterial, irrigao da regio, e profundidade e tamanho da leso. Desta forma, Ivy introduziu modificaes do mtodo para padronizar as condies de realizao do teste para melhor avaliar a hemostasia (Mtodo de Ivy). No mtodo de Ivy, o tamanho e profundidade da leso so padronizados pelo uso de um equipamento apropriado. O local da leso uma rea do antebrao que seja pouco coberta de pelos e sem vasos visveis e a presso sangunea mantida dentro de uma faixa controlada pelo inflamento de um cuff no brao para a manuteno da presso em torno de 40mmHg. O teste do tempo de sangramento, feito nestas condies, avalia a capacidade de formao do plug plaquetrio, fase inicial da hemostasia, e, portanto um mtodo de avaliao da hemostasia primria e de funcionalidade plaquetria. Alteraes do tempo de sangramento so indicativos de alteraes qualitativas ou quantitativas das plaquetas. Qualidade das plaquetas: Na trombastenia de Glanzmann, a plaqueta perde sua capacidade de agregao, desse modo a formao do tampo fica dificultada e o TS fica prolongado. Nmero de plaquetas: Pode estar elevado (trombocitose) ou diminudo (trombocitopenia). Dentre as tromboses, destaca-se a trombocitemia hemorrgica, em geral TS elevado e o nmero de plaquetas pode chegar a 2 ou 3 milhes por mm3.

69 As trombocitopenias so a causa mais comum, na clnica, de TS alongado. Distrbios da coagulao e deficincias dos componentes da cascata de coagulao tm pouca ou nenhuma influncia sobre o tempo de coagulao. Resumindo, o TS depende da hemostase primria (plaquetas, fator de von Willebrand, integridade vascular cutnea). Portanto, um TS alargado diante de uma plaquetometria normal, sugere: doena de von Willebrand ou distrbio de funo plaquetria hereditrio (trombastenia de Glazmann, sndrome de BernardSoulier) ou adquirido (uremia, circulao extracorprea). 4.2. PROVA DO LAO Esse exame tambm chamado de prova de fragilidade capilar ou teste da resistncia de Hess. Esta prova feita colocando-se torniquete de borracha (garrote) ou manguito de presso no antebrao e insuflando ar at manter a presso mdia entre a sistlica e a diastlica por 5 minutos. Aps esse tempo, verifica-se na parte anterior do antebrao e na dobra do cotovelo o nmero de petquias que aparecem. Petquias so pontos avermelhados indolores que surgem na pele devido ao extravasamento de sangue que ocorre quando h fragilidade capilar. As petquias devem ser contadas quando afastadas pelo menos 5 cm da posio do garrote ou manguito. O nmero de petquias depende da fragilidade capilar. Normalmente h 4 ou 5 petquias numa rea de 1 cm2. Quando h fragilidade capilar, o nmero de petquias maior, ou seja, 6 ou mais petquias. Com essa prova, promove-se aumento da presso nos capilares e obstruo do retorno venoso, o que favorece o extravasamento de sangue para o meio intersticial. Portanto, o impedimento de formao petequial depende da resistncia da parede capilar e tambm em funo da quantidade e qualidade das plaquetas. No h, porm, uma relao perfeita entre fragilidade capilar e nmero de plaquetas, mas em geral a trombocitopenia (nmero de plaquetas diminudo) acompanhada de fragilidade capilar. O aumento da fragilidade capilar pode ser observado na trombocitopenia, trombastenia de Glanzmann, trombocitopatias, doena de von Willebrand, prpura Henoch-Schonlein, disproteinemias, prpura senil, diabetes mellitus, hipertenso, artrite reumatide. importante ressaltar, porm, que em mulheres esse teste de difcil interpretao devido ao fcil desenvolvimento de petquias.

4.3. TEMPO DE ATIVAO DE PROTROMBINA (TAP) E TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPa) Os dois testes a seguir avaliam a coagulao sangunea, sendo o primeiro dedicado avaliao da via extrnseca e o segundo dedicado via intrnseca.

70 4.3.1. Tempo de Ativao de Protrombina (TAP) Tempo de protrombina (TAP) o tempo que o plasma leva para coagular quando a ele se adiciona Cloreto de Clcio e excesso de um preparado denominado tromboplastina tecidual (trata-se de um preparado contendo altos nveis de Fator Tecidual). Para a realizao desse teste, necessrio que o sangue seja coletado com quelantes de clcio fracos como o oxalato ou citrato de sdio. Assim, ao se adicionar o Clcio ionizado, a coagulao prontamente iniciada pela via extrnseca, uma vez que a tromboplastina adicionada nesse teste contm fosfolipdio de membrana e o prprio Fator Tecidual, o que garante que a coagulao ocorra preferencialmente pela via extrnseca, que mais rpida que a via intrnseca. Na via extrnseca atuam, alm do Fator Tecidual, os fatores V, VII, X e protrombina. Portanto, a deficincia de um ou mais destes fatores ou presena de inibidores da coagulao levaro a um TAP prolongado. Clinicamente, o resultado do TAP pode ser dado da seguinte forma: Em segundos - o TAP de um plasma humano normal de 11,5 s a 12,5 s (segundo mtodo de Quick); Uma relao entre tempo do paciente e o tempo controle - o normal uma relao de 1,0 a 1,4; Pela Atividade de Protrombina - o normal acima de 70-80%.

A deficincia de um dos fatores citados provocar um aumento em segundos do TAP, por exemplo: tempo do paciente = 24s. Este valor comparado com o controle, que se for, por exemplo, de 12s a relao ser 2. Neste mesmo exemplo a Atividade de Protrombina ser 50%, logo o TAP em segundos aumenta e a Atividade de Protrombina diminui. Uma utilizao clinica importante deste exame est em testes pr-cirrgicos para avaliao do sistema de coagulao do paciente, uma vez que a cirurgia predispe a hemorragias. Outra utilizao clnica est na avaliao de insuficincia heptica, uma vez que os fatores da via extrnseca (exceto o Fator Tecidual) so sintetizados no fgado e estaro em quantidades menores no plasma em pacientes com este quadro. Segundo o critrio de Child-Pugh temos: 1 ponto TAP (segundos prolongados) 1-3 s 2 pontos 4-6 s 3 pontos >6 s

O TAP est elevado nas coagulopatias extrnsecas ou comuns, geralmente quando a deficincia moderada ou grave (< 10% da atividade). As condies

71 que mais elevam este tempo so: uso de cumarnicos (warfarim), deficincia de vitamina K, insuficincia heptica, deficincia dos fatores da via extrnseca ou da via comum.

4.3.2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (PTTa) Este exame tambm denominado tempo de formao de tromboplastina do sangue ou tempo de cefalina, nesta prova se adiciona ao plasma citratado o reagente denominado de tromboplastina parcial ou cefalina, a qual eventualmente contm uma suspenso de caulim (partculas de vidro). A adio de cloreto de clcio inicia a coagulao pela via intrnseca. O PTTa para um plasma humano normal ativado por caulim de 32 s a 46 s. Como este teste realizado na ausncia de Fator Tecidual, o processo de coagulao obrigatoriamente iniciado pela via intrnseca, ou seja, pelo contato com as partculas de vidro, que garantem a superfcie negativa capazes de ativar os fatores XI e XII. Desse modo, se o teste for anormal, porque deve haver deficincia em um dos fatores plasmticos da via intrnseca. Clinicamente, o resultado do PTTa deve ser dado: Em segundos - normal em torno de 32 s a 46 s; Atividade normal; Relao entre o tempo do paciente e o tempo de controle.

O PTTa estar alargado nas coagulopatias da via intrnseca ou via comum, geralmente quando a deficincia leve, moderada ou grave (<15 30% da atividade normal). As condies que mais elevam este tempo so: deficincia do fator VIII (hemofilia A), deficincia do fator XI (hemofilia B), CID, insuficincia heptica, deficincia grave de vitamina K e intoxicao grave por cumarnicos. Vale lembrar que na Doena de von Willebrand pode haver uma deficincia leve do fator VIII, mas capaz de alargar o PTTa. A deficincia mais comum na prtica diria clnica a do fator VIII. Quando o teste for anormal deve-se logo pesquisar este fator. Devemos ressaltar tambm que na obteno do sangue para a realizao deste exame, deve-se tomar cuidado para puncionar e pegar a veia na primeira tentativa, caso contrrio poder haver contaminao com Fator Tecidual, o que poderia gerar um resultado impreciso. 4.4. PROVAS DE HEMOSTASIA COMO UTILIZ-LAS? Agora, estamos diante de um paciente que apresenta uma hemorragia sugestiva de uma desordem hemosttica. Por onde comeamos? Como interpretar o resultado dos exames e qual o prximo passo?

72 Para comear utilizamos as quatro Provas da Hemostasia mais importantes: 1) 2) 3) 4) Contagem de plaquetas; Tempo de Sangramento; PTTa; TAP.

As duas primeiras medem a hemostasia primria e as duas ltimas, a hemostasia secundria. Nos pacientes que apresentam o sangramento clssico dos distrbios da hemostasia primria (sangramento imediato aps procedimento odontolgico ou cirrgico, sangramento muco-cutneo), os primeiros testes a serem pedidos devem ser a contagem plaquetria e o Tempo de Sangramento. Se a suspeita inicial for de distrbio da hemostasia secundria (hemartrose, hematoma profundo), o PTTa e o TAP so os exames mais importantes. Nas hemorragias no caractersticas, todos estes testes devem ser prontamente analisados. 1) Se houver trombocitopenia significativa (<50.000 plaquetas/mm3), com PTTa e TAP normais (sem coagulopatia), o diagnstico est claro. Devemos procurar as causas de trombocitopenia - prpura trombocitopnica idioptica, prpura trombocitopnica trombtica, sndrome hemoltico-urmica, anemia aplsica, leucemia, hipersplenismo etc. S para lembrar: a trombocitopenia justifica o prolongamento do Tempo de Sangramento e do tempo de retrao do cogulo. 2) Se houver trombocitopenia e coagulopatia (alargamento do PTTa e/ou do TAP), devemos pensar na insuficincia heptica com hiperesplenismo, na CID (coagulao intravascular disseminada) e no uso de heparina. Devemos solicitar o tempo de trombina, a dosagem do fibrinognio plasmtico e dos produtos de degradao de fibrina. Se anormais, confirma CID. 3) Se a plaquetometria for normal, mas o Tempo de Sangramento for anormal (>7-10 min), a suspeita recai sobre a doena de von Willebrand ou outros distrbios da funo plaquetria (hereditrios, mais raros ou adquiridos, como uremia). A presena da combinao Tempo de Sangramento alargado e PTTa alargado, com os restantes das provas normais indica doena de von Willebrand. Neste distrbio hereditrio relativamente comum, a deficincia parcial do fator VIII explica o alargamento de PTTa. 4) Se as provas da hemostasia primria forem normais, mas da hemostasia secundria (PTTa e TAP) estiverem alteradas. Veja as combinaes abaixo:

4.4.1. PTTa Alto e TAP Normal (o Problema Est na Via Intrnseca): POSSVEIS CAUSAS: uso de heparina, deficincias hereditrias da via intrnseca, como fator VIII (hemofilia A), fator IX (hemofilia B), fator XI, doena de

73 von Willebrand, anticorpos anti-fator VIII, IX ou XI. A deficincia do fator XII, prcalicrena ou cininognio de alto peso molecular no se associa a sangramento. Desordem provavelmente adquirida pensar em uso de heparina ou anticorpo anti-fator VIII. Desordem provavelmente hereditria teste para os fatores da via intrnseca cuja deficincia pode levar ao sangramento (VIII, IX e XI). 4.4.2. PTTa Normal e TAP Alto (o Problema Est na Via Extrnseca): POSSVEIS CAUSAS: insuficincia heptica inicial, deficincia de vitamina K inicial, uso de cumarnicos, alguns casos de CID, anticorpo anti-fator VII, deficincia hereditria da via extrnseca (fator VII). Desordem provavelmente adquirida: pensar em insuficincia heptica (fase inicial) ou uso de cumarnico. Desordem provavelmente hereditria: teste para fator da via extrnseca (fator VII).

4.4.3. PTTa e TAP Altos (o Problema Est na Via Comum): POSSVEIS CAUSAS: insuficincia heptica, deficincia de vitamina K, uso de cumarnicos, uso de heparina, CID e deficincias hereditrias da via comum (fibrinognio, protrombina, fator X ou fator V). Desordem provavelmente adquirida: tempo de trombina e dosagem de fibrinognio plasmtico anormais, confirmam CID; se forem normais, pensar em insuficincia heptica, deficincia de vitamina K ou uso de cumarnicos. Desordem provavelmente hereditria: testes para fatores da via comum (fibrinognio, protrombina, fator X ou fator V). O Tempo de Trombina est alterado nos distrbios do fibrinognio (pedir testes especiais para disfibrinogenemia). 4.4.4. PTTa e TAP Normais: Se todos os testes estiverem normais, incluindo aqueles da hemostasia primria, as hipteses passam a ser: 1- hiperfibrinlise; 2- deficincia de fator XIII e 3- disfibrinogenemia. Desordem provavelmente adquirida: pensar em distrbios relacionados hiperfibrinlise. O teste da lise da euglobulina e o aumento dos PDF confirmam o diagnstico. Desordem provavelmente hereditria: considerar deficincia de fator XIII e disfibrinogenemia. O exame mais importante nesse momento o Teste da

74 Solubilidade do Cogulo a Uria 5M. Este teste feito adicionando-se uria na concentrao 5M ao cogulo formado. Normalmente no h dissoluo se houver, h forte suspeita da deficincia do fator XIII.

Autor(es):
Ana Carolina Menezes

Revisor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto

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UNIDADE 5

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5. HEMCIAS E GRUPOS SANGUNEOS

5.1. INTRODUO O Sangue um tecido conjuntivo especializado constitudo de clulas e plasma. O plasma o componente lquido do sangue e constitudo por sais e componentes orgnicos (incluindo aminocidos, lipdios, vitaminas, protenas e hormnios). Os elementos celulares do sangue compreendem as hemcias, os leuccitos, e as plaquetas. Os eritrcitos sedimentados constituem cerca de 45% do volume de sangue. H dois tipos de leuccitos: os granulcitos (neutrfilos, eosinfilos e basfilos), os agranulcitos (linfcitos e moncitos) Nos captulos anteriores, estudamos o plasma e os fatores de coagulao que nele circulam; alm da funo das plaquetas na manuteno da hemostasia. Neste captulo vamos nos deter especificamente no estudo das hemcias, tambm chamadas de eritrcitos (Gk. erythros, vermelho; kitos, clula). 5.2. HEMATOPOIESE E ERITROPOIESE A hematopoiese o processo pelo qual os elementos celulares do sangue so formados. As clulas sanguneas aparecem primeiramente na terceira semana do desenvolvimento embrionrio fetal, a partir do saco vitelino. Estas clulas so geradas por meio de uma populao de clulas-tronco restrita produo de clulas mielides. No terceiro ms da embriognese, as clulastronco hematopoiticas definitivas (originadas do mesoderma intra-embrionrio na regio artica/gonadal/mesonfrica e/ou do saco vitelnico) migram em direo ao fgado, o rgo principal de formao das clulas sanguneas at pouco tempo antes do nascimento. No incio do quarto ms de desenvolvimento embrionrio, clulas-tronco migram em direo medula ssea para iniciar a hematopoiese neste local. Durante o stimo ms de vida intra-uterina, a medula ssea torna-se o local principal de hematopoiese e permanece durante a vida adulta. Ao nascimento, a medula presente em todo o esqueleto ativa na hematopoiese e praticamente a fonte exclusiva de clulas sanguneas. At a poca da puberdade, a medula de todo o esqueleto permanece vermelha e hematopoieticamente ativa. Aproximadamente aos 18 anos apenas as vrtebras, costelas, crnio, plvis, e regies prximas s epfises de mero e fmur conservam a medula vermelha, e a medula restante se torna amarela, gordurosa e inativa. Os elementos celulares formadores do sangue tm uma origem comum a partir de clulas-tronco pluripotentes hematopoiticas, situada no pice de uma hierarquia complexa de progenitores. As clulas-tronco pluripotentes do origem a dois tipos de progenitores multipotentes, as clulas-tronco mielides comuns e linfides comuns. A clula-tronco linfide comum pode originar precursores de clulas T, clulas B e clulas natural killer. A partir da clula-tronco mielide comum surgem pelo menos trs tipos de clulas-tronco comprometidas, capazes de diferenciao ao longo dos caminhos eritride/megacarioctico, eosinoflico, e granuloctico/macrofgico. As clulas-tronco comprometidas so chamadas de

77 unidades formadoras de colnia (CFU), pois in vitro do origem a colnias de prognies diferenciadas. Seguindo o processo de comprometimento de linhagens, o progenitor hematopoitico e as clulas precursoras proliferam diante da influncia reguladora de fatores de crescimento e hormnios, como a eritropoietina (EPO).

A eritropoiese o processo no qual os glbulos vermelhos so originados. Para que ela ocorra de maneira completa e eficiente, alguns pr-requisitos bsicos so necessrios: uma medula ssea ntegra (tecido hematopoitico quantitativa e qualitativamente normal), fatores estimulantes para a formao de colnias eritrides (EPO, entre outros), alm dos fatores nutrientes para a proliferao, diferenciao e amadurecimento dos precursores de eritrcitos e formao de todos os seus constituintes, principalmente a hemoglobina. Entre os fatores nutricionais podem-se citar o ferro, o cido flico, a vitamina B12, protenas (aminocidos) e a piridoxina como os principais. A EPO uma glicoprotena produzida principalmente no rim (clulas intersticiais peritubulares localizadas na regio cortical interna e medular externa do rim). Sua produo estimulada em duas situaes: 1) elevadas altitudes e 2) anemia, como veremos no captulo de Anemia e ndices Hematimtricos. A EPO necessria para manter o comprometimento das clulas progenitoras eritrides. Na ausncia deste hormnio, as clulas sofrem apoptose. A eritropoiese inclui a seguinte seqncia: pr-eritroblasto, eritroblasto basfilo, eritroblasto policromtico, eritroblasto ortocromtico, reticulcito e eritrcito. A hemoglobina formada ainda na fase de pr-eritroblasto, completando sua formao apenas na fase de reticulcitos. medida que este processo se desenvolve, a clula vai perdendo a basofilia e adquirindo um carter cido. A extruso nuclear ocorre durante o processo de diferenciao do

78 eritroblasto ortocromtico a reticulcito. Por fim, estes passam dois a trs dias na medula ssea, para s ento irem para o sangue perifrico, onde por mais um dia completam a sntese da hemoglobina e se transformam em eritrcitos maduros. Os eritrcitos maduros duram em torno de 120 dias na circulao, quando ento, sob a forma de esfercitos, so retirados da circulao por meio do sistema reticuloendotelial. 5.3. ERITRCITOS MADUROS uma clula anucleada, constituda basicamente por uma membrana, um contedo citoplasmtico restrito protena hemoglobina, enzimas, ons e gua. Sua forma na circulao de um disco bicncavo (disccito), com dimetro de 7,2 a 8,2 M, a espessura mais externa (borda) de 2,3 a 2,8 M e a espessura mais interna (centro) de 0,5 a 0,11 M. Perfaz um volume mdio de aproximadamente 90 fentolitros (fL) (80 a 100 fL). Uma populao de eritrcitos de um indivduo normal apresenta-se aparentemente com a mesma forma (discide/arredondada), tamanho uniforme (a variao fisiolgica de tamanho considerada normal entre os eritrcitos de at 14,5%) e com a mesma colorao (mesma tonalidade de cor, que se deve a uma saturao de aproximadamente 34% de hemoglobina por volume total, em cada eritrcito). 5.3.1. Membrana Eritrocitria constituda essencialmente por uma camada bi lipdica qual esto inseridas protenas transmembrana (banda 3 e glicoforinas), que tem como base de sustentao um citoesqueleto constitudo por uma malha de espectrinas ( e ).

79 A membrana eritrocitria possui quantidade de lipdeos maior que a necessria para envolver seu contedo total. Este excesso lipdico, juntamente com as protenas integrais do citoesqueleto e do complexo juncional, concede ao eritrcito uma fluidez tima, para que este possa alongar-se quando houver necessidade de passagem por sinusides capilares com dimetros menores que o seu, para depois retornar forma discide. O complexo juncional formado basicamente por protena 4.1, monmeros de actina, aducina, tropomiosina, protena 4.9 e extremidades do tetrmero de espectrina. A protena 4.1 tambm se liga glicoforina C, interage com a -espectrina, no domnio de ligao com a actina, e aumenta a afinidade desta ligao. Os principais constituintes da membrana eritrocitria so: Protenas (pouco mais de 50%) - I) Integrais: so transmembranar; servem de canal de troca com o meio extracelular, de reforo para a bicamada lipdica. So as protenas banda 3 e as glicoforinas (A, B, C e D). II) Perifricas: formam o citoesqueleto de sustentao camada lipdica; permitem o alongamento reversvel e a capacidade regenerativa da membrana. So espectrinas ( e ), a anquirina (protena 2.1), a protena 4.1, a protena 4.2, a actina, a aducina, etc. Lipdeos (cerca de 40%) essencialmente fosfolipdeos e uma pequena quantidade de colesterol. Carboidratos (menos de 10%).

Funes e Eritrocitria

Caractersticas

das

Principais

Protenas

da

Membrana

Banda 3: um canal de passagem de nions, para a comunicao intraextracelular. Mantm o pH intracelular. Sua deficincia causa perda de lipdeos e formao de esfercitos (esferocitose hereditria). Espectrina ( e ): so responsveis pela sustentao face externa da membrana. A -espectrina se entrelaa com a , de modo a formar dmeros. Estes se associam em tetrmeros, essenciais para a integridade do citoesqueleto. Tambm se associam ao complexo juncional por meio da protena 4.1. Sua ausncia ou defeito de sntese nos locais de ligao entre as unidades e (locais de auto-associao para formao de tetrmeros) ou em locais de ligao protena 4.1 do complexo juncional leva formao de eliptcitos (eliptocitose hereditria). Sua diminuio quantitativa ou um defeito nos locais de ligao com a banda 3-anquirina (2.1) acarreta perda de lipdeos de membrana e formao de esfercitos (esferocitose hereditria). Anquirina (protena 2.1): ponte de ligao da banda 3 com a -espectrina, ajustada pela protena 4.2. Seu defeito pode causar formao de esfercitos. Protena 4.1: liga-se s espectrinas, permitindo maior articulao e deformabilidade ao eritrcito. Seu defeito ou deficincia dificulta a ligao da espectrina com o complexo juncional, favorecendo a formao de eliptcitos (eliptocitose hereditria).

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Esferocitose Hereditria (EH): Este distrbio herdado causado por defeitos intrnsecos na membrana dos eritrcitos que tornam as clulas esfricas, menos maleveis e vulnerveis ao seqestro e destruio esplnicos. Um padro de herana autossmica dominante visto em trs quartos dos casos. Os pacientes restantes tm uma forma autossmica recessiva grave da doena. A EH causada por diversas mutaes afetando a anquirina, banda 3, espectrina, ou banda 4.2, presumivelmente porque este complexo importante na estabilidade da bicamada lipdica. A causa mais comum de EH autossmica dominante a mutao da anquirina do eritrcito. O bao o rgo mais atingido na EH. Eritrcitos devem sofrer extrema deformao para deixar os cordes de Billroth e entrar nos sinusides. Enquanto os esfercitos so aprisionados no bao, a circulao j lenta dos cordes fica estagnada, produzindo microambiente progressivamente mais hostil. cido ltico se acumula e o pH cai, inibindo a gliclise. A incapacidade de gerar ATP prejudica a capacidade de os eritrcitos expulsarem Na+, adicionando um elemento de leso osmtica. A estagnao nos cordes tambm promove contato com abundantes macrfagos, os quais fagocitam os esfercitos. O principal papel do bao na morte prematura dos esfercitos evidenciado pelo invarivel efeito benfico da esplenectomia. Os esfercitos persistem, mas a anemia corrigida. Aumento moderado do bao caracterstico. Isto resulta da congesto dos cordes de Billroth e de hiperplasia por atividade devida ao aumento marcante da eritrofagocitose.

5.4. GRUPOS SANGNEOS 5.4.1. Introduo O termo grupos sangneos refere-se a um sistema de antgenos presentes na membrana das clulas vermelhas, que so a expresso de genes herdados. Esses antgenos no so encontrados apenas nos eritrcitos, mas tambm em uma variedade de tecidos e muitos lquidos biolgicos, incluindo saliva, leite, suco gstrico, lquido seminal, urina e lquido de cisto ovariano. H vrios sistemas de grupos sangneos herdados independentemente entre si, entre eles podemos citar os sistemas ABO, Rh, MNS, Kell, Lewis e outros. Os sistemas ABO e Rh, descobertos em 1900 e 1940, respectivamente, por Landsteiner, so os de maior importncia na prtica por serem os mais antignicos.

5.4.2. O sistema ABO Os genes ABO no codificam diretamente seus antgenos especficos, mas sim enzimas que tem a funo de transportar acares especficos para uma substncia precursora e, a partir da, produzir os antgenos A e/ou B. O antgeno A formado pela ao da enzima N-acetil galactosaminil transferase sobre a molcula precursora, e o antgeno B pela ao da enzima galactosil transferase. Se apenas a enzima N-acetil galactosaminil transferase estiver ativa, haver formao apenas do antgeno A e a pessoa pertencer ao grupo A. Por outro lado, se apenas a enzima galactosil transferase estiver ativa, haver formao apenas do antgeno B e a pessoa pertencer ao grupo B. Caso ambas as enzimas sejam ativas, haver formao de antgenos A e B e a pessoa pertencer ao grupo AB. Por outro lado, se nenhuma das duas enzimas estiverem presentes, no haver formao de antgenos A nem B e a pessoa pertencer ao grupo O (ver figura abaixo) .

81 Os antgenos A e B ficam expostos na membrana das hemcias, e no caso do grupo AB cada hemcia possui a mesma proporo de antgenos A e B expostos na sua membrana. Como os indivduos no possuem anticorpos contra os prprios antgenos, s produzem anticorpos contra antgenos estranhos. Desta forma o indivduo do grupo A possui anticorpo (aglutinina) anti-B em seu plasma; o do grupo B possui anticorpo (aglutinina) anti-A no plasma; o do grupo AB no possui anticorpos antiA nem anti-B em seu plasma e o do grupo O possui tanto anticorpo anti-A quanto anti-B em seu plasma.

Todos esses anticorpos produzidos no sistema ABO so de resposta inata, ou seja, so produzidos sempre, sem a necessidade de exposio prvia a um determinado antgeno. So da classe IgM, cuja estrutura pentamrica. As suas 5 cadeias so ligadas entre si por pontes dissulfeto e por uma cadeia polipeptdica inferior chamada de cadeia J. A IgM encontrada principalmente no sangue, sendo uma classe de anticorpos "precoces" ( tambm so produzidas nas fases agudas iniciais das doenas que desencadeiam resposta humoral). uma protena que no atravessa a placenta por ser grande (pentamrica).

J-chain

82 5.4.3. O antgeno H O antgeno H formado pela ao da enzima fucosil transferase (codificada pelo gene H) que catalisa a adio da fucose na galactose terminal da molcula precursora (polmero de carboidratos com uma seqncia especfica, ver figura abaixo). Isso necessrio para a adio dos carboidratos que vo formar os antgenos A e B, portanto o antgeno H precursor dos antgenos A e B. J o grupo O, que no apresenta antgenos A e B, apresenta o antgeno (H) na membrana das suas hemcias. O gene alelo h (recessivo) codifica uma fucosil transferase no funcionante, portanto os indivduos hh no so capazes de sintetizar o antgeno H, caracterizando o grupo O Bombaim. Nesse caso, mesmo que as enzimas N-acetilgalactosaminil transferase e galactosil transferase estejam presentes e ativas, estas no so capazes de adicionar os carboidratos especficos na molcula precursora. Portanto, esses indivduos no possuem nenhum antgeno (A, B ou H) na membrana das suas hemcias. As pessoas do grupo O Bombaim, alm de possuir anticorpos anti-A e anti-B, apresentam tambm anticorpos anti-H (classe IgM), por isso, durante uma transfuso sangnea para esse grupo, o doador deve ser obrigatoriamente O Bombaim.

5.4.4. O sistema Rh Existem seis tipos comuns de antgenos Rh, esses tipos so designados por C, D, E, c, d, e e. A pessoa que possui antgeno D no apresentar antgeno d, e vice-versa. O mesmo ocorrer com os antgenos C-c e E-e. Alm disso, devido ao modo de herana desses fatores, cada pessoa ter um antgeno de cada um dos trs pares. O antgeno tipo D muito prevalente na populao, sendo tambm, consideravelmente, mais antignico do que os outros antgenos Rh, por conseguinte, o de maior interesse e chamado de fator Rh.

83 O fator Rh determinado por um loco em que se situam dois gens alternativos (D e d), sendo D dominante em relao a d. Portanto, os indivduos Rh positivos so representados por homozigotos dominantes ou heterozigotos, e apresentam o antgeno D, que uma protena integral da membrana das hemcias. J os indivduos Rh negativos so representados por homozigotos recessivos e no apresentam o antgeno D na membrana das suas hemcias.

As pessoas que pertencem ao grupo Rh negativo comeam a produzir anticorpos anti-D somente aps a exposio a esse antgeno (D). Nesse caso, os anticorpos so da clase IgG, uma imunoglobulina monomrica simples que perfaz 80% das imunoglobulinas do organismo. Est igualmente distribuda nos compartimentos extracelulares, a nica que, normalmente, atravessa a placenta e o principal anticorpo nas respostas imunes secundrias.

5.4.5. O sistema MN O grupo sangneo MN determinado pelas isoformas da glicoforina. A glicoforina A contm o antgeno M e a glicoforina B o antgeno N. Essas duas glicoforinas diferem apenas nas suas seqncias NH2-terminal. Os indivduos do grupo M possuem apenas glicoforina A, enquanto os do grupo N possuem apenas glicoforina B, j os heterozigotos MN possuem ambas as glicoforinas.

5.4.6. O Sistema LEWIS Os antgenos Lewis, Le_a e Le_b, so de natureza glicdica semelhana dos antgenos A, B e H, no entanto, no so sintetizados na membrana eritroctria em desenvolvimento, mas so adsorvidos do plasma nas clulas adultas. So antgenos solveis, glicoesfingolipdios que permanecem adsorvidos na superfcie dos eritrcitos.

84 5.4.7. Doena Hemoltica do Recm Nascido (Eritroblastose Fetal) Tambm conhecida como eritroblastose fetal, caracterizada por aglutinao progressiva dos eritrcitos do feto por anticorpos presentes no sangue materno. Para que isso ocorra necessrio que a me pertena ao grupo Rh e a criana ao Rh+. O determinante antignico do sistema Rh protico e os seus anticorpos so do tipo IgG, que so produzidos apenas a partir do momento em que o organismo entra em contato com o antgeno. Durante a gravidez no h contato entre os sangues materno e fetal, no entanto, durante o parto esse contato pode ocorrer em pequena quantidade. No primeiro parto, portanto, no h complicaes, pois o contato entre os sangues materno e fetal mnimo, sendo capaz apenas de sensibilizar a me que passa a produzir anticorpos anti-Rh. Em uma segunda gestao de filho Rh+, como a me j foi sensibilizada anteriormente, os anticorpos maternos anti-Rh passaro pela placenta, pois so do tipo IgG, de pequeno tamanho, e iro provocar a aglutinao dos eritrcitos fetais, levando destruio dos mesmos, e eventualmente morte do feto. Isso tambm pode ocorrer na primeira gestao de uma me Rh , grvida de um filho Rh+, mas que j tenha sido sensibilizada anteriormente atravs de uma transfuso sangnea, por exemplo.

A preveno da doena hemoltica do recm nascido se d atravs da administrao de soro anti-Rh (Rhogan) na me no momento do parto. Com isso, as hemcias do feto que caem na circulao da me sero destrudas pelos anticorpos do soro antes que a me seja sensibilizada. 5.4.8. Doao de Sangue (Hemcias, Plasma e Sangue Total) Para a doao de sangue ser realizada, deve-se verificar a compatibilidade entre as aglutininas (plasma / anticorpos) e os aglutinognios (hemcias / antgenos) dos doadores com os receptores. Para isso, so realizados procedimentos que visam determinar a classificao pelo sistema ABO e pelo Rh. Tcnica de classificao direta em lminas: inicialmente, marcam-se lminas de microscpio com anti-A, anti-B e anti-AB para poderem ser diferenciadas posteriormente. Em cada lmina, coloca-se uma gota do soro com o anticorpo correspondente (anti-A, anti-B e anti-AB). Para cada gota de anti-soro coloca-se uma pequena quantidade de sangue total. Aps misturar o sangue total

85 com o anti-soro em cada lmina, deve-se observar em qual delas ocorreu aglutinao. Se aglutinar na lmina com soro anti-A, o sangue testado pertence ao grupo A, se aglutinar com soro anti-B pertence ao grupo B, se aglutinar com o soro anti-AB pertence ao grupo AB e se no aglutinar em nenhuma lmina pertence ao grupo O. Para determinar o sistema Rh deve-se proceder da mesma maneira: marca-se uma lmina com anti-Rh, e depois se coloca uma gota de soro anti-Rh nessa lmina. Uma pequena quantidade de sangue total adicionada. Aps misturar, se houver aglutinao o sangue testado Rh positivo, e se no aglutinar Rh negativo. Desta forma, as possibilidades de transfuso em relao ao sistema ABO so:

86 J em relao ao sistema Rh, as possibilidades de transfuso so:

Obs.: A transfuso de hemcias do doador Rh positivo para o receptor Rh negativo, no ter problemas na primeira vez, pois aps a doao o receptor ser apenas sensibilizado e produzir anticorpos anti-Rh tardiamente depois que hemcias forem substitudas. Em transfuses posteriores os anti-Rh, provocaro uma reao contrria ao fator Rh estranho, com resultados clnicos bastante srios.

Obs.: A transfuso de Plasma do doador Rh negativo para o receptor Rh positivo, no ter problemas se o doador no apresentar anti-Rh, caso contrrio os anticorpos do doador provocaro uma reao contrria ao fator Rh, com resultados clnicos bastante srios.

Autor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto Eduarda Pascarella Redenschi

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UNIDADE 6

88

6. METABOLISMO DE HEMCIAS
6.1. ERITROPOIESE Como as demais populaes de clulas do sangue, as hemcias so produzidas na medula ssea a partir da proliferao e diferenciao de clulas progenitoras em resposta a fatores de crescimento e estmulos hematopoiticos. No caso particular das hemcias, a eritropoietina (EPO) o principal fator hematopoitico envolvido nesta diferenciao. A EPO produzida nos rins em resposta a um estado de baixo aporte de oxignio e, atravs da circulao sangunea, alcana a medula ssea e estimula os progenitores da linhagem mieloctica a diferenciarem em eritrcitos. Esta diferenciao ocorre de maneira relativamente rpida, totalizando cerca de quatro divises celulares em um perodo de aproximadamente 72 horas (figura 30). Neste tempo, as clulas em diferenciao, alm de se expandirem em nmero, devem sintetizar todo o contedo protico da hemcia madura necessrio para o adequado funcionamento desta clula. Este perodo se caracteriza, portanto como um perodo de intensa sntese metablica, com intensa sntese de cidos nuclicos (para a replicao do DNA e a sntese de RNA), lipdeos (para membrana celular) e protenas (para o citoesqueleto e hemoglobina). Alm disso, a gerao de hemcias normais e funcionais , em grande parte, dependente de um aporte adequado de nutrientes, entre eles o Ferro e cofatores envolvidos na sntese da hemoglobina. Distrbios no metabolismo destas substncias ou deficincias nutricionais levam, portanto a alteraes na maturao das hemcias e um quadro clnico de anemia. Em seus estgios finais de maturao, os precursores eritrides perdem todas as organelas celulares (mitocndrias, complexo de Golgi, retculo endoplasmtico) e o ncleo. Este processo torna o eritrcito limitado em termos metablicos e implica na necessidade de se sintetizar tudo o que for necessrio para o correto funcionamento celular antes do final da diferenciao, uma vez que esta clula se torna incapaz de sintetizar protenas aps sua completa maturao.

Figura 30. Esquema da Diferenciao de um Progenitor Hematopoitico (Stem Cell) para a Formao de um Eritrcito Maduro.

89 Portanto, o eritrcito uma clula relativamente ativa em termos metablicos durante sua diferenciao na medula ssea e que se torna limitado metabolicamente aps sua maturao por perder suas organelas e ncleo.

6.2. HEMOCATERESE A vida til de um eritrcito de aproximadamente 120 dias. Aps este perodo, a clula retirada da circulao pelo sistema fagoctico mononuclear do bao, num processo denominado hemocaterese. Este processo tambm responsvel pela retirada de eritrcitos no funcionais ou anormais da circulao. A hemocaterese seguida da degradao dos componentes celulares e reaproveitamento de grande parte destes compostos. Lipdeos e protenas so degradados e reaproveitados para a sntese de novos lipdeos e protenas. O ferro da hemoglobina tambm recuperado e reaproveitado para a sntese de novas ferro-proteinas como a prpria hemoglobina. O heme sem o ferro (protoporfirina IX) degradado por um sistema enzimtico para formar bilirrubina, um precursor dos pigmentos biliares.

6.3. PARTICULARIDADES DO METABOLISMO DE HEMCIAS Como dito anteriormente, as hemcias so clulas limitadas em sua capacidade metablica. A ausncia de ncleo torna desnecessria a sntese de cidos nuclicos e a ausncia de organelas celulares indica que esta clula incapaz de sintetizar protenas, tornando desnecessria tambm a sntese de RNA e aminocidos. A ausncia de mitocndrias impossibilita o ciclo de Krebs, a fosforilao oxidativa e, portanto a metabolizao de lipdeos e a completa metabolizao da glicose. Desta forma, o eritrcito se torna ineficiente em termos de gerao de energia quando comparado a outras clulas. A metabolizao completa da glicose por clulas aerbias, por exemplo, gera 32 molculas de ATP. Na impossibilidade de se realizar o ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa, como no caso da hemcia, a metabolizao da glicose gera apenas 2 molculas de ATP. No entanto, esta ineficincia na gerao de ATP no s suficiente, como necessria, para o desempenho adequado de suas funes. Isto porque a eficincia metablica de clulas aerbicas, o ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa, dependem do consumo de oxignio e a hemcia, como uma clula cuja funo primria transportar oxignio, no poderia consumir o composto que transporta. Neste sentido, uma clula de metabolismo anaerbio se torna ideal para o transporte de oxignio a despeito de sua relativa ineficincia de gerao de energia. Como a gerao de energia em eritrcitos reside exclusivamente no metabolismo anaerbio da glicose, esta clula deve possuir um mecanismo que garanta o aporte constante de glicose para o interior celular. De fato, o eritrcito uma das poucas clulas que consomem exclusivamente glicose e, por isso, so

90 dotadas de um sistema de transporte facilitado de glicose que independe de insulina, o que garante a constante entrada de glicose na clula. 6.4. VIAS METABLICAS UTILIZADAS PELOS ERITRCITOS Como dito anteriormente, o metabolismo das hemcias reside exclusivamente na gliclise anaerbica. No entanto, o eritrcito, dependendo de suas necessidades, utiliza ainda dois desvios da via glicoltica: a via das pentoses e o desvio de Rapoport-Luebering. A via das pentoses supre a clula do composto redutor NADPH, enquanto que o desvio de Rapoport-Luebering gera o 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) que modula a afinidade da hemoglobina pelo oxignio. A gliclise responde por cerca de 90% de todo o metabolismo da glicose no eritrcito e os outros 10% so desviados para a via das pentoses. No entanto, em caso de necessidade de gerao de NADPH, pode-se desviar quase que 10 vezes mais glicose para a via das pentoses. Isto um exemplo de como opera o metabolismo em eritrcitos: o metabolismo da glicose pode ser desviado de sua via principal (gliclise anaerbica) para outras vias dependendo da necessidade da clula.

6.5. FUNES METABOLISMO

MECANISMOS

CELULARES

DEPENDENTES

DO

A funo primria do eritrcito o transporte de oxignio pelo corpo. Para desempenhar adequadamente esta funo, a clula deve manter um eficiente mecanismo antioxidante e manter a osmolaridade celular, com nveis intracelulares altos de potssio e baixos de sdio, clcio e magnsio. Estas necessidades so supridas por compostos formados durante a metabolizao da glicose pela hemcia atravs de uma das vias descritas anteriormente. A manuteno da osmolaridade celular, por exemplo, mantida pela atividade de bombas de ons que utilizam o ATP como combustvel para transportar ons atravs da membrana celular contra o gradiente osmtico. O ATP utilizado por estas bombas proveniente da gliclise anaerbia que, embora menos eficiente na gerao de ATP que a gliclise aerbia, perfeitamente capaz de suprir as necessidades celulares de energia. Os mecanismos antioxidantes, por sua vez, utilizam compostos redutores formados pela prpria gliclise ou na via das pentoses. A contribuio individual das vias metablicas para os processos celulares sero apresentados a seguir.

91 6.6. CONTRIBUIO DA GLICLISE PARA A FUNO DAS HEMCIAS

6.6.1. Gliclise como Fonte de ATP Uma das funes da gliclise nas hemcias suprir a demanda de ATP para as bombas de ons. A osmolaridade da hemcia mantida em nveis bem controlados e a distribuio de ons no interior da clula segue um padro particular com nveis intracelulares altos de potssio e baixos de sdio, clcio e magnsio. Esta distribuio mantida contra o gradiente osmtico e, por isso, depende da atividade de bombas de ons que fazem o transporte ativo de ons potssio para dentro e dos demais ons para fora da clula. A atividade destas bombas depende da quebra de molculas de ATP geradas durante a gliclise. Nas primeiras etapas da gliclise ocorre o consumo de duas molculas de ATP. A primeira reao, catalizada pela hexoquinase, fosforila a glicose no carbono 6, gerando glicose-6-fosfato e impedindo que a glicose se difunda novamente para fora da clula. A outra reao que consome ATP a fosforilao da frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato, catalizada pela fosfofrutoquinase. O consumo de duas molculas de ATP nas etapas iniciais da gliclise compensado pela gerao de quatro molculas de ATP nas reaes subseqentes. A converso de 1,3-difosfoglicerato em 3-fosfoglicerato, com a gerao de 1 ATP, e a converso de fosfoenolpiruvato em piruvato, com a gerao de outro ATP. Como estas duas reaes ocorrem duas vezes para cada molcula de glicose consumida, o saldo de gerao de ATP por estas reaes de 4 molculas, e o saldo final da gliclise de 2 ATPs por cada molcula de glicose consumida (figura 31). O destino das molculas de ATP formadas pela metabolizao da glicose basicamente prover energia para o bombeamento ativo de ons para dentro e para fora da clula, de modo a manter a distribuio inica e a osmolaridade celular.

92
GLICOSE HEXOQUINASE -ATP

GLICOSE-6-FOSFATO FRUTOSE-6-FOSFATO FOSFOFRUTOQUINASE -ATP

FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

G3P DESIDROGENASE 1,3-DIFOSFOGLICERATO +ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO LACTATO 1,3-DIFOSFOGLICERATO +ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO PIRUVATO QUINASE LACTATO DESIDROGENASE +ATP PIRUVATO LACTATO

Figura 31. Esquema da Via Glicoltica com Destaque para as Reaes de Consumo e Formao de ATP.

6.6.2. Gliclise como Fonte de NADH Um outro importante composto formado durante a metabolizao da glicose o agente redutor adenina dinucleotdeo reduzido ou NADH. O NADH formado durante a converso de gliceraldedo-3-fosfato em 1,3-difosfoglicerato, reao catalizada pela enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase. Este NADH formado , em grande parte, utilizado em uma reao subseqente da gliclise, a converso de piruvato em lactato. No entanto, a utilizao de NADH pode ser desviada para reaes de reduo que visam manter a funo celular em ambientes altamente oxidativos.

93
GLICOSE -ATP GLICOSE-6-FOSFATO

FRUTOSE-6-FOSFATO -ATP FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO NAD+ GAPDH NADH 1,3-DIFOSFOGLICERATO

+ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO NAD+ NADH 1,3-DIFOSFOGLICERATO

+ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO

NADH NAD+ LACTATO

LDH

NADH NAD+

LACTATO

Figura 32. Esquema da Via Glicoltica com Destaque para as Reaes onde Gerado ou Consumido o NADH.

A hemcia, por ser o transportador de um composto altamente reativo como o oxignio, constantemente submetida a ambientes altamente oxidantes. Sem um controle adequado, o oxignio forma radicais livres que podem reagir com protenas celulares ou lipdeos da membrana, interferindo com suas funes. Desta forma, a hemcia deve manter um ambiente intracelular redutor capaz de impedir as aes oxidativas do oxignio. Um outro importante efeito do oxignio e radicais livres derivados a oxidao do ferro da hemoglobina. O ferro que compe a hemoglobina encontrase no estado ferroso (Fe2+) e o oxignio capaz de oxid-lo, formando Fe3+ que no capaz de transportar oxignio. Esta reao de oxidao da hemoglobina, formando metemoglobina no funcional, ocorre espontneamente e cerca de 3% de todo o contedo de hemoglobina convertido em metemoglobina diariamente.

94 Para reduzir a metemoglobina e retorn-la ao seu estado funcional, a hemcia conta com uma enzima chamada metemoglobina redutase que utiliza o NADH formado pela gliclise para reduzir o Fe 3+ da metemoglobina para Fe2+. Neste momento, o consumo de NADH desviado da reao de formao de lactato a partir de piruvato, para suprir a enzima e permitir a reduo do ferro de volta ao seu estado funcional. 6.7. CONTRIBUIO DA VIA DAS PENTOSES PARA A FUNO DAS HEMCIAS A via das pentoses uma via metablica derivada da gliclise que, em outras clulas, inicia a sntese de bases nitrogenadas para a formao de cidos nucleicos. Nestas clulas, a via das pentoses considerada uma via metablica prpria porque utiliza um metablito (glicose) para a formao de um componente celular (ribose). Hemcias, no entanto, no sintetizam bases nitrogenadas e a ribose formada reconvertida em intermedirios da gliclise, como o gliceraldedo-3-fosfato e a frutose-6-fosfato. Desta forma, nas hemcias, a via das pentoses pode ser considerada um desvio da gliclise ao invs de uma via metablica. A vantagem de se desviar o metabolismo da glicose para uma srie alternativa de reaes que, atravs destas reaes, formado o composto redutor NADPH. Este composto, assim como o NADH discutido anteriormente, ser utilizado em reaes de oxirreduo que visam a manuteno de um ambiente redutor no interior da clula capaz de lidar com os efeitos oxidantes do oxignio.

6.8. CONTRIBUIO DO DESVIO DE RAPOPORT-LUEBERING PARA A FUNO DAS HEMCIAS Pelo desvio de Rapoport-Luebering, a hemcia transforma o intermedirio 1,3-difosfoglicerato (1,3-DPG) em 2,3-DPG. Esta reao catalizada pela difosfoglicerato mutase, que transfere o fosfato do carbono 1 para o carbono 2 do 1,3-DPG. O produto formado, 2,3-DPG, pode ser convertido em 3-fosfoglicerato (o intermedirio seguinte ao 1,3-DPG na via glicoltica) pela difosfoglicerato fosfatase, retornando para a via glicoltica. No entanto, a transferncia do fosfato para a posio 2 torna este fosfato pouco energtico e a defosforilao deste intermedirio (ao contrrio da defosforilao do 1,3-DPG) acaba no formando ATP. Desta forma, a hemcia possui um desvio da via glicoltica que no forma ATP para formar 2,3-DPG. Este desvio, despendioso em termos energticos para a clula, importante pois permite que a afinidade da hemoglobina pelo oxignio seja modulada atravs da concentrao de 2,3-DPG na clula.

95
GLICOSE -ATP GLICOSE-6-FOSFATO G6PDH FRUTOSE-6-FOSFATO -ATP FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO RIBOSE-5-FOSFATO RIBULOSE-5-FOSFATO NADP+ NADPH 6-FOSFOGLUCONA--LACTONA 6-FOSFOGLUCONATO NADP+ NADPH

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

1,3-DIFOSFOGLICERATO +ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO

1,3-DIFOSFOGLICERATO +ATP 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO

Figura 33. Esquema da Via das Pentoses com Destaque para as Reaes de Formao de NADPH.

A formao de 2,3-DPG regulada pela concentrao de prtons (H +) no meio, sendo que em meio cido, a atividade da fosfatase estimulada enquanto que a atividade da mutase inibida. Desta forma, em meios cidos (isto , durante acidose), a formao de 2,3-DPG diminui e seu consumo aumenta, diminuindo a concentrao final deste intermedirio na clula. Da mesma forma, a alcalose aumenta a concentrao de 2,3-DPG por estimular a mutase e inibir a fosfatase. A ligao do 2,3-DPG hemoglobina, torna a afinidade desta proteina ao oxignio menor. Com base nisso e com base na modulao da produo de 2,3DPG pela concentrao de H+, podemos afirmar que a concentrao de 2,3-DPG aumenta durante a alcalose e que, portanto, a afinidade da hemoglobina pelo oxignio menor na alcalose. A importncia deste efeito que a afinidade da hemoglobina pelo oxignio pode ser modulada rapidamente durante a adaptao do organismo baixas presses de oxignio, como nas grandes altitudes. Em baixas presses de oxignio, o organismo aumenta a fequncia respiratria, aumentando a eliminao de gs carbnico e consumindo H +, causando um quadro de alcalose respiratria. Esta alcalose ento leva a um aumento da produo de 2,3-DPG que diminui a afinidade da hemoglobina pelo oxignio. Isto que parece incongruente (diminuio da afinidade da hemoglobina em baixas presses de oxignio) pode ser explicado ao se analisar a curva de saturao da hemoglobina na presena de concentraes normais de 2,3-DPG (5mM) e a concentrao encontrada em hemcias ob baixa presso de oxignio

96 (8mM). De fato, a saturao da hemoglobina torna-se menor na presena de 8mM de 2,3-DPG, consequencia da menor afinidade da protena pelo oxignio. No entanto, esta menor saturao compensada por uma maior liberao de oxignio para os tecidos perifricos, o que torna o aporte tecidual de oxignio normal mesmo em um ambiente onde a presso atmosfrica de oxignio menor.

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

P O O

OH C C C - OPO3

1,3-DIFOSFOGLICERATO mutase P +ATP O O -Pi O C C C - OPO3 O OH 3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO +ATP PIRUVATO

H+
O

C C C - OPO3 2,3-DIFOSFOGLICERATO (2,3DPG) fosfatase

H+

Figura 34. Esquema das Reaes do Desvio de Rapoport-Luebering.

sat O2 2,3-DPG 0mM 2,3-DPG 5mM 2,3-DPG 8mM

pO2 tec

pO2 pul pO2 pul (alt) (mar)

Figura 35. Curva de Saturao da Hemoglobina em Funo da Presso de Oxignio na Presena de Diferentes Concentraes de 2,3-DPG.

97 6.9. MECANISMOS OXIDATIVOS DO OXIGNIO O oxignio um composto extremamente reativo. Devido a suas propriedades qumicas, o oxignio forma radicais livres capazes de reagir com componentes celulares (proteinas e lipdeos, por exemplo), interferindo com suas propriedades biolgicas. Dentre os radicais livres formados pelo oxignio, podemos destacar dois importantes para a hemcia: o perxido (O 22-) e o superxido (O2-). Estes radicais so capazes de reagir com componentes celulares e interferir com suas funes. A reao de radicais livres de oxignio com lipdeos, por exemplo, causa a peroxidao lipdica, que interfere com as propriedades dos lipdeos e a estabilidade da membrana celular, tornando a hemcia mais frgil a estresses mecnicos. O oxignio tambm capaz de oxidar protenas, principalmente em radicais de aminocidos reativos, como os radicais de cistena. A cistena, por possuir um tomo de enxofre em sua cadeia lateral, torna-se relativamente reativo e susceptvel ao ataque pelo oxignio. A oxidao de cistenas induz a formao de pontes dissulfeto entre cistenas dentro da prpria proteina ou cistenas de duas protenas diferentes. Alm disso, a cistena oxidada pode reagir com outros resduos de enxofre presentes em componentes celulares no proteicos (grupamentos tiol). A oxidao de cistenas pode acarretar perdas significativas de funo biolgica, principalmente em enzimas cujo stio ativo possui um resduo de cistena, como a enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase. Por fim, o oxignio pode oxidar o ferro do grupamento heme da hemoglobina, formando metemoglobina. O transporte de oxignio pela hemoglobina depende da presena de um on ferro no estado ferroso (Fe 2+). A oxidao deste ferro pelo oxignio, leva converso do ferro para seu estado frrico (Fe3+), formando a hemoglobina oxidada ou metemoglobina, incapaz de transportar oxignio. V-se, portanto, que o transporte de oxignio, embora essencial para a homeostase e o metabolismo celular, implica em grande risco para a clula que o transporta por impor um ambiente intracelular extremamente oxidante. Desta forma, a hemcia, como clula transportadora de oxignio, deve dispor de mecanismos moleculares que funcionem para manter um ambiente intracelular redutor que contrabalanceiem os efeitos oxidativos do oxignio.

6.10. MECANISMOS ANTI-OXIDANTES DAS HEMCIAS A hemcia possui alguns sistemas enzimticos capazes de detoxificar radicais livres de oxignio e prevenir o ataque oxidativo de seus componentes celulares. O sistema da glutationa funciona para detoxificar radicais perxido, disponibilizando um radical de cistena para ser oxidado no lugar das cisteinas de protenas celulares. O sistema superxido dismutase/catalase funciona para detoxificar o radical superxido formado durante a oxidao expontnea da

98 hemoglobina em metemoglobina. A enzima metemoglobina redutase, por fim, reduz a metemoglobina de volta a seu estado funcional de hemoglobina com Fe 2+. 6.10.1. Sntese de Glutationa A glutationa (GSH) sintetizada em duas etapas pela ao de duas enzimas. Na primeira etapa, a enzima -glutamil-cistena sintetase gera um dipeptdeo glutamil-cistena, a partir de um cido glutmico e uma cistena. Na segunda etapa, catalizada pela glutationa sintetase, adicionada uma glicina a este composto, gerando a glutationa. importante perceber que a glutationa nada mais que um tripeptdeo que possui uma cistena (cido glutmico-cistenaglicina). Esta cistena disponibilizada pela clula para ser oxidada, prevenindo a oxidao de cistenas de protenas celulares.

cido glutmico

cistena

-glutamil-cistena sintetase -glutamil-cistena glicina

glutationa sintetase

glutationa (GSH)
glu-cys-gli

Figura 36. Esquema da Via de Sntese da Glutationa.

6.10.2. Glutationa Peroxidase A glutationa peroxidase uma enzima que cataliza a reao de oxidao da glutationa por radicais perxido livres. Por ser uma reao catalizada enzimaticamente, esta reao ocorre preferencialmente em relao oxidao de grupamentos tiol de protenas ou outros componentes celulares. Alm de prevenir o ataque de protenas e lipdeos por estes radicais de oxignio, a glutationa peroxidase atua na detoxificao de perxidos, ajudando a manter um ambiente redutor intracelular.

99 6.10.3. Glutationa S-transferase Mesmo na presena de glutationa peroxidase, alguns radicais de oxignio conseguem atacar protenas ou outros componentes celulares. A glutationa Stransferase uma enzima que atua sobre componentes oxidados, transferindo eltrons para eles enquanto oxida a glutationa. Em outras palavras, esta enzima transfere a oxidao do componente celular para a glutationa, gerando glutationa oxidada (GSSG) e voltando o componente celular para seu estado natural. 6.10.4. Glutationa Redutase As glutationas oxidadas formadas nas reaes da glutationa peroxidase e da S-transferase devem ser retornadas a seu estado reduzido para recompor os nveis intracelulares de glutationa reduzida e manter o potencial redutor da clula. Esta recomposio da glutationa reduzida feita pela glutationa redutase, uma enzima que reduz a glutationa oxidada ao oxidar o NADPH formado na via das pentoses.

NADPH
glutationa redutase

GSSG
glutationa peroxidase
Se

H2O

NADP+

GSH

H2O2

NADPH
glutationa redutase

GSSG
Glutationa S-transferase

HS-

H2O2

NADP+

GSH

R SS-

H2O

Figura 37. Esquema da Utilizao de Glutationa pelos Sistemas Anti-Oxidantes da Glutationa Peroxidase e Glutationa S-transferase, e a Reposio de Glutationa Reduzida pela Glutationa Redutase com Utilizao de NADPH.

100 6.10.5. Superxido Dismutase A superxido dismutase (SOD) uma enzima que transforma radicais superxido em radicais perxido. A oxidao da hemoglobina em metemoglobina gera radicais superxido que so convertidos em radicais perxido por ao da SOD. Estes radicais perxido devem ento ser detoxificados por ao do sistema glutationa peroxidase/glutationa redutase, ou pela enzima catalase.

6.10.6. Catalase A catalase converte radicais perxido livres em gua e oxignio. Da mesma forma que o sistema glutationa peroxidase/glutationa redutase, a catalase funciona de forma a detoxificar perxidos intracelulares. No entanto, a ao desta enzima restrita a radicais livres (no reverte a oxidao de componentes celulares como a gluationa S-transferase), no utiliza cofatores (como NADPH ou NADH) e gera oxignio e gua. (a) 2H+ + O2(b) 2 H2O2
SOD

H2O2 2 H2O + O2

catalase

Figura 38. Reaes Catalizadas pela (a) Superxido Dismutase (SOD) e (b) Catalase.

6.10.7. Metemoglobina Redutase A oxidao da hemoglobina forma superxido, detoxificado pelo sitema SOD-catalase ou SOD-GSH, e metemoglobina. A metemoglobina afuncional, uma vez que no capaz de transportar oxignio. Desta forma, a metemoglobina deve ser rapidamente reduzida e reconvertida a seu estado funcional. Esta reduo da metemoglobina catalizado pela enzima metemoglobina redutase, que utiliza o cofator NADH, proveniente da gliclise, para reduzir o Fe 3+ da metemoglobina a Fe2+.

metemoglobina (no funcional)

Hb-Fe3+

Cytb5.RED

NAD+

hemoglobina (funcional)

Hb-Fe2+

Cytb5.OXI

NADH

Figura 39. Esquema da Reduo de Metemoglobina pela Metemoglobina Redutase, com Consumo de NADH. Cytb5 a unidade funcional da enzima, um citocromo.

101 6.11. ANEMIAS HEMOLTICAS O metabolismo das hemcias funciona para a manuteno da estrutura celular da hemcia e para a manuteno de um ambiente intracelular redutor capaz de contrapor os efeitos oxidativos do oxignio. Algumas deficincias genticas em enzimas-chave do metabolismo celular ou de enzimas envolvidas nos sistemas anti-oxidantes das hemcias, interferem com a funcionalidade da clula, tornando-as mais frgeis e predispondo o indivduo a episdios hemolticos.

6.11.1. Deficincia de Glicose-6-Fosfato Desidrogenase A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) a primeira enzima da via das pentoses. A deficincia gentica desta enzima relativamente comum e est associada a quadros anmicos. A deficincia de G6PDH diminui o aproveitamento da glicose para a via das pentoses, diminuindo portanto a formao de NADPH. Como o NADPH utilizado pela glutationa redutase para repor os nveis de glutationa reduzida, a baixa formao de NADPH nestes casos acarreta uma diminuio na reposio de glutationa reduzida, interferindo com este importante sistema redutor e tornando a clula mais sensvel a estresses oxidativos.

6.11.2. Deficincia de Piruvato Quinase A piruvato quinase cataliza a reao que forma piruvato a partir do fosfoenolpiruvato com gerao de uma molcula de ATP. Na deficincia desta enzima, ocorre um acmulo de fosfoenolpiruvato e uma menor formao de ATP, pois esta etapa da via encontra-se suprimida. O fosfoenolpiruvato acumulado reconvertido em 2-fosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 2,3-difosfoglicerato, 1,3difosfoglicerato, gliceraldeido-3-fosfato, at frutose-1,6-bisfosfato, pois todas estas reaes so reversveis. Alm do acmulo de intermedirios metablicos, a reverso destas reaes acarreta uma no produo de ATP (das reaes 1,3difosfoglicerato a 3-fosfoglicerato e fosfoenolpiruvato a piruvato) e NADH (da reao gliceraldedo-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato). A deficincia de piruvato quinase resulta, portanto, em uma diminuio da produo de ATP e de NADH. O comprometimento da produo de ATP leva a uma deficincia funcional das bombas de ons e consequentemente um comprometimento na manuteno do equilbrio osmtico da clula. A menor formao de NADH, por sua vez, compromete a atividade da metemoglobina redutase, resultando em um acmulo de metemoglobina e uma diminuio da capacidade de transporte de oxignio pelas hemcias. Alm disso, o acmulo intracelular de 2,3-DPG, leva a uma diminuio da afinidade da hemoglobina pelo oxignio, comprometendo ainda mais o transporte de oxignio para os tecidos. 6.11.3. Deficincia de Hexoquinase A hexoquinase a primeira enzima da via glicoltica e sua funo fosforilar a glicose que entra na clula para que esta no se difunda de volta para

102 o meio extracelular. Na deficincia desta enzima, a utilizao de glicose pela hemcia fica bem comprometida pois grande parte da glicose absorvida pela clula perdida por difuso para o meio extracelular. Como o aproveitamento de glicose comprometido, a formao de todos os produtos utilizados pela hemcia (ATP, NADH e NADPH) consequentemente comprometido. Esta clula se torna, portanto, extremamente susceptvel a rompimento (hemlise) por estresse osmtico (por falta de ATP para a atividade das bombas) e por estresse oxidativo (por falta de cofatores redutores, NADH e NADPH). Alm disso, a liberao de oxignio para os tecidos perifricos comprometida pela baixa concentrao de 2,3-DPG nestas clulas, o que aumenta a afinidade da hemoglobina pelo oxignio.

6.11.4. Deficincia de Selnio O selnio um importante cofator para a atividade da glutationa peroxidase. Na deficincia de selnio, a atividade da glutationa peroxidase e, portanto, a detoxificao de perxido estaro comprometidos. Com isso, a hemcia se torna mais sensvel a estresse oxidativo. importante lembrar que, na deficincia de selnio, outros mecanismos detoxificadores de radicais perxido esto atuantes como a catalase e a glutationa S-transferase. Portanto, a deficincia de selnio se manifesta como uma sensibilidade moderada ao estresse oxidativo, menos grave, por exemplo, do que a deficincia de glutationa redutase. 6.11.5. Deficincia de Glutationa Redutase Na deficincia da glutationa redutase, a reposio dos estoques celulares de glutationa reduzida diminuido. Desta forma, o potencial redutor da clula diminui e a clula se torna mais sensvel a estresse oxidativo. importante perceber que a deficincia da glutationa redutase compromete dois sistemas redutores da clula, o da glutationa peroxidase e o da glutationa S-transferase, pois ambos dependem de um estoque de glutationa reduzida. Isso, portanto, acarreta um aumento grande da sensibilidade das hemcias ao estresse oxidativo. Alm disso, como a glutationa redutase utiliza NADPH formado pela via das pentoses, a deficincia desta enzima leva a um acmulo de NADPH e uma inibio desta via. Isso resulta em uma modificao do aproveitamento da glicose, com o consumo de glicose quase que exclusivamente atravs da metabolizao pela gliclise. 6.11.6. Anemia Qumica Alguns frmacos utilizados clinicamente, bem como alguns compostos qumicos induzem estresse oxidativo em hemcias. Dentre os frmacos, destacam-se as sulfonamidas, um grupo de antibiticos, e a primaquina, um frmaco anti-malrico. Dentre os compostos qumicos, destacam-se o naftaleno e a anilina. Por gerarem a formao de radicais livres, a ingesto destes frmacos ou destes compostos geralmente acompanhada por um pequeno grau de

103 anemia. A grande importncia destes efeitos resulta de uma anemia severa em indivduos que j apresentam uma fragilidade das hemcias ou uma sensibilidade das hemcias ao estresse oxidativo, como observado nas deficincias enzimticas discutidas anteriormente. 6.11.7. Metemoglobinemia A metemoglobinemia caracterizada por uma proporo aumentada de metemoglobina, comprometendo o transporte de oxignio para os tecidos. A metemoglobinemia pode ser adquirida (qumica) ou hereditria. Na metemoglobinemia adquirida, alguns compostos qumicos favorecem a oxidao da hemoglobina, compromentendo o transporte de oxignio. Entre estes compostos, podemos destacar as sulfonamidas e a anilina. A metemoglobinemia hereditria resulta de mutaes nas cadeias da hemoglobina que a torna mais propensa a ser oxidada, gerando uma proporo aumentada de metemoglobina circulante. importante lembrar que a gerao de metemoglobina acompanhada da formao de radicais superxido e que, portanto, nestes casos de metemoglobinemia, o estresse oxidativo tambm est aumentado.

Autor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto

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UNIDADE 7

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7. HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA
7.1. INTRODUO A capacidade de utilizar completamente a glicose atravs do metabolismo aerbico d aos vertebrados uma disponibilidade de aproximadamente 18 vezes mais energia que a adquirida como metabolismo anaerbico. Porm, para suprir adequadamente as suas clulas com fluxo contnuo de oxignio, os vertebrados se utilizam de dois mecanismos principais: 1) o sistema circulatrio; e 2) protenas carreadoras de oxignio, para contornar a limitao imposta pela baixa solubilidade do oxignio em gua. Os carreadores de oxignio nos vertebrados so a hemoglobina e a mioglobina (Figura 40).

Figura 40. Estrutura da Hemoglobina e da Mioglobina. A) Hemoglobina A formada por quatro cadeias, duas alfa e duas beta; B) Mioglobina formada por uma nica cadeia (homloga s cadeias da hemoglobina).

Estudos detalhados da hemoglobina e da mioglobina ilustram tipos de relaes estruturais comuns a muitas protenas. A propriedade da mioglobina ou da hemoglobina de se ligar ao oxignio depende de uma unidade no peptdica, o grupamento hemo ou heme. Este grupo prosttico, um tetrapirrol cclico, responsvel pela cor avermelhada do sangue. O hemo constitudo de uma parte orgnica e de um tomo de ferro. A parte orgnica, protoporfirina, constituda de quatro anis pirrlicos. Estes esto ligados por pontes de meteno, para formar anis tetrapirrlicos. Quatro metilas, duas vinilas e duas cadeias laterais de propionato esto ligadas (Figura 41).

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Figura 41. Grupamento Heme e a Origem dos seus Nitrognios.

O tomo de ferro no heme se liga aos quatro nitrognios no centro do anel pirrlico. O ferro forma duas ligaes adicionais, uma em cada lado do plano do heme. O tomo de ferro pode estar no estado de oxidao ferroso (+2) ou no frrico (+3), e as formas correspondentes de hemoglobinas so chamadas ferrohemoglobina e Ferri-hemoglobina (tambm chamada de meta-hemoglobina). Somente a ferro-hemoglobina, o estado de oxidao +2, pode ligar-se ao oxignio. A mesma nomenclatura se aplica mioglobina.

7.2. A MIOGLOBINA A mioglobina uma protena monomrica de baixo peso molecular, encontrada nas musculaturas esqueltica e cardaca. uma protena ligadora de oxignio, e atua como reserva desta molcula, o que facilita a sua movimentao dentro das clulas musculares. Uma leso celular da musculatura esqueltica ou cardaca leva liberao de mioglobina para a circulao sangnea. A mioglobina uma protena globular, que contm diversos tipos de estruturas secundria, enrolados em esfera ou num arranjo que lembra um globo (Figura 42). uma protena conjugada, j que formada por uma cadeia peptdica e um grupo prosttico, heme. Aproximadamente 75% de seus resduos de aminocidos esto presentes em -hlices de passo direito, contendo de 7 a 20 resduos de comprimento. Iniciando no resduo N-terminal, essas hlices so denominadas de A a H. Os resduos individuais so designados por um nmero que indica a sua distncia do resduo N-terminal da hlice. Por exemplo, His F8 refere-se ao 8o resduo da hlice F e o identifica como um resduo de histidina. O Heme da mioglobina est localizado dentro de uma fenda entre as hlices E e F. Na mioglobina desoxigenada, o ferro hemnico est localizado

107 cerca de 0,03 nm para fora do plano do anel, na direo da His F8. Na mioglobina oxigenada, o tomo de oxignio ocupa a 6 a posio de coordenao do tomo ferro, que se localiza a cerca de 0,01 nm fora do plano do heme. Portanto a oxigenao a mioglobina determina uma mudana na conformao de pores da protena.

Figura 42. Representao Esquemtica da Estrutura da Mioglobina.

O local de ligao do oxignio compreende somente uma pequena frao do volume da molcula de mioglobina. Realmente, o oxignio est diretamente ligado somente ao tomo ferro do grupo heme. Ento, por que a poro polipeptdica da mioglobina necessria para o transporte e armazenamento do oxignio? A resposta est nas propriedades de ligao de um heme isolado para o oxignio. Na gua, um heme na forma de ferroso livre pode se ligar molcula de oxignio, mas o faz por um momento fugaz. A razo que o O 2 oxida muito rapidamente o heme ferroso a heme frrico, que no consegue se ligar ao oxignio. Um complexo de O2 em sanduche entre dois grupos hemes um intermedirio nesta reao. Na mioglobina, o heme muito menos susceptvel oxidao, porque duas molculas de mioglobina no conseguem se associar rapidamente para formar um complexo heme-O2-heme. A formao deste sanduche estericamente impedida pela histidina distal e outros aminocidos locais que cercam o sexto local de coordenao. Por que a mioglobina inadequada como protena transportadora de oxignio; porm eficaz no armazenamento de oxignio? A quantidade de O 2 ligado mioglobina (expresso como porcentagem de saturao) depende da concentrao de oxignio (expressa como presso parcial de oxignio, PO 2) no ambiente prximo do ferro hemnico. Para a mioglobina, a curva de saturao isotrmica hiperblica, ou seja, mediante uma PO 2 de apenas 1mmHg, ela atinge sua saturao mxima. Como a mioglobina no pode liberar grande parte do oxignio a ela ligado, mesmo a 20 mmHg (PO 2 do msculo), ela no serve como veculo adequado para transportar oxignio dos pulmes para os tecidos perifricos. Todavia, falta de oxignio, que acompanha exerccio fsico intenso, o PO2 do tecido muscular pode baixar at 5 mmHg. Nessa presso, a mioglobina facilmente libera o oxignio ligado, suprindo a sntese oxidativa de ATP na mitocndria da clula muscular (Figura 43).

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Figura 43. Grfico comparativo da Saturao da Mioglobina (azul) e da Hemoglobina (vermelho).

Em pacientes com infarto agudo do miocrdio (IAM), podemos encontrar nveis elevados de mioglobina em circulao j nas primeiras horas aps infarto, com pico entre 6 e 9 horas, retomando aos nveis normais em 24 a 48 horas aps o infarto. A elevao da mioglobina extremamente precoce quando comparada a outras enzimas cardacas, devido ao seu baixo peso molecular, que permite um rpido deslocamento para a circulao. Essa mesma caracterstica responde por sua curta permanncia em nveis alterados, j que rapidamente filtrada e eliminada pelos rins. A dosagem de mioglobina apontada como um marcador de rastreamento no diagnstico precoce do IAM, por sua rpida elevao aps a leso miocrdica. Entretanto, como j mencionado, valores elevados de mioglobina podem ser encontrados tambm nas leses da musculatura esqueltica, no tendo, portanto uma especificidade para leses cardacas. Por sua caracterstica de rpida eliminao renal, resultados alterados obtidos em pacientes com patologias renais devem ser interpretados com cautela, pois podem ser causados pela diminuio da eliminao renal.

7.3. HEMOGLOBINA A hemoglobina (Hb) o pigmento vermelho das hemcias, e foi a primeira molcula cuja funo fisiolgica especfica, ou seja, o transporte de oxignio foi caracterizada. Foi a primeira protena na qual se demonstrou que uma mutao pontual poderia levar a uma mudana de um nico aminocido, como na anemia falciforme. A Hb no simplesmente um tanque de oxignio, mas sim um sistema sofisticado de entrega adequada de oxignio aos tecidos sob diversas circunstncias. A hemoglobina dos vertebrados constituda por quatro cadeias polipeptdicas, de dois tipos distintos. As quatro so mantidas juntas por ligaes no covalentes. Cada monmero contm um grupo heme e um s centro de ligao ao oxignio. A hemoglobina A (HbA), a principal dos adultos, constituda

109 por duas cadeias alfa () e duas beta (). A outra hemoglobina dos adultos, que corresponde a cerca de 2% da hemoglobina total, a hemoglobina A 2 (HbA2), na qual as cadeias so substitudas por cadeias delta (). Sendo assim, a composio da hemoglobina A 2 2 e da hemoglobina A2 22. Os embries e os fetos apresentam hemoglobinas diferentes. Logo aps a concepo, os embries sintetizam cadeias zeta (), que so cadeias do tipo ; e cadeias psilon (), que so do tipo (). Durante o desenvolvimento, trocado por , e trocado por gama () e depois por . A principal hemoglobina durante os ltimos dois teros da vida intra-uterina a hemoglobina F (HbF), cuja composio em subunidades 22. As cadeias e contm 141 aminocidos e as cadeias , e contm 146. Logo, a hemoglobina consiste em vrios polipeptdios que diferem entre si e as interaes das subunidades determinam a capacidade da hemoglobina de transportar O2, CO2 e H+, atendendo s condies fisiolgicas. A hemoglobina dos eritrcitos dos vertebrados realiza duas funes biolgicas principais: 1) transporte de O 2 do rgo respiratrio aos tecidos perifricos e 2) transporte de CO2 e prtons do tecido perifrico ao rgo respiratrio para subseqente excreo. 7.3.1. Transporte de Oxignio O oxignio transportado no sangue sob duas formas: dissolvido no plasma e no fluido intracelular eritrocitrio e combinado quimicamente, de forma reversvel, com a hemoglobina. Quando o oxignio difunde dos pulmes para o sangue, uma pequena proporo fica em soluo nos lquidos do plasma e dos glbulos vermelhos, mas, quantidade de oxignio sessenta vezes maior combina imediatamente com a hemoglobina dos glbulos vermelhos e transportado, sob essa forma combinada, para os capilares dos tecidos. Somente uma pequena poro permanece dissolvida e transportada por difuso simples. Esta forma de transporte obedece Lei de Henry (A solubilidade de um gs dissolvido em um lquido proporcional presso parcial do gs acima do lquido.), de modo que a quantidade de oxignio dissolvido diretamente proporcional sua presso parcial no sangue. No sangue arterial normal (considerando-se PO2 igual a 100 mmHg), h somente 0,3 % do volume de O2 dissolvido. A quantidade de O2 dissolvida no , entretanto, suficiente para manter funcionante o organismo de um indivduo normal. Quando o sangue passa pelos capilares dos tecidos, o oxignio se separa da hemoglobina e se difunde para as clulas. Dessa forma, a hemoglobina atua como um carreador de oxignio aumentando a quantidade de oxignio que pode ser transportada desde os pulmes at os tecidos at cerca de 60 vezes mais do que poderia ser transportado apenas em soluo. No repouso, mais de 95% do oxignio fornecido aos tecidos so transportados em associao com a hemoglobina, e este valor ultrapassa 99% durante o exerccio fsico.

110 Em 1938, Flix Haurowitz descobriu que cristais de desoxi-hemoglobina se fragmentavam quando eram expostos ao oxignio. Os cristais de desoximioglobina, por outro lado, ligam-se e libertam oxignio sem alterao da sua forma. A fragmentao dos cristais da hemoglobina sugeriu que a protena passa por uma mudana conformacional importante quando se liga molcula de O2. De fato, estudos de cristalografia com raios X mostraram que a oxi- e a desoxi-hemoglobina diferem-se acentuadamente em suas estruturas quaternrias. A molcula oxigenada mais compacta. A estrutura quaternria da desoxihemoglobina chamada de forma T (Tensa), a da oxi-hemoglobina chamada de forma R (relaxada) (Figura 44).

Figura 44. Transio da Hemoglobina da Forma T para a Forma R.

Na hemoglobina no oxigenada, o ferro do grupo heme situa-se cerca de 0,03 nm (0,3 ) fora do plano do anel, na direo de His F8. Na hemoglobina oxigenada, uma molcula de oxignio ocupa a sexta posio de coordenao do tomo de ferro que, ento, se situa apenas a cerca de 0,01 nm (0,1 ) fora do plano do heme. A oxigenao da hemoglobina , portanto, acompanhada pelo movimento do on de ferro e, consequentemente, pelo movimento de His F8 e os resduos ligados covalentemente a His F8, em direco ao plano do anel. Este movimento gera uma nova conformao das pores da protena.

Curva de dissociao Oxignio-Hemoglobina As hemoglobinas ligam 4 molculas de oxignio por tetrmero (um em cada grupo heme), e as curvas de saturao das hemoglobinas por oxignio so sigmoidais. Assim, a facilidade de ligao do oxignio hemoglobina depende da presena de outras molculas de O2 no mesmo tetrmero. Se o O2 j est presente, ocorre mais facilmente a ligao subseqente de molculas de O 2. Assim a ligao das molculas de O 2 hemoglobina apresenta cintica de ligao cooperativa, uma propriedade que permite a hemoglobina ligar quantidade mxima de O2 no rgo respiratrio e liberar quantidade mxima de O2 no PO2 prevalente dos tecidos perifricos.

111 Essa curva estabelecida a partir da porcentagem de hemoglobina que est combinada ao oxignio, para determinada presso de oxignio (PO 2). O sangue aerado que deixa os pulmes tem, usualmente, presso do oxignio da ordem de 100 mmHg. Dependendo do organismo, a presso parcial em que as hemoglobinas encontram-se 50% saturadas pelo oxignio (P50) pode variar amplamente, porm em todos os casos est acima da PO2 dos tecidos perifricos do organismo considerado. A HbF humana fornece um exemplo ilustrativo. Para a HbA, P 50 de 26 mmHg; enquanto que, para a HbF, P50 igual a 20 mmHg. Esta diferena permite a HbF extrair o oxignio do sangue placentrio. Todavia, ps parto, a HbF inconveniente para este propsito, uma vez que alta afinidade pelo O 2 faz com que ela possa liberar menos O2 para os tecidos. Assim, algumas semanas aps o parto, o beb apresenta substituio completa das subunidades por subunidades , ou seja, passa a haver a predominncia da HbA.

Figura 45. Curva de Dissociao da Hemoglobina. Mostra os pontos normais arterial e venoso. Uma unidade KPa corresponde a 7,5 mmHg.

A curva de dissociao da hemoglobina consideravelmente ngreme no seu trecho inicial at cerca de 40 ou 50 mmHg de PO 2, enquanto na poro final gradualmente se horizontaliza. Na parte ascendente, as variaes da saturao de oxignio (SO2) so quase proporcionais s de PO2, ao passo que, na parte alta da curva, grandes modificaes de PO 2 correspondem a pequenas variaes de SO2. Fazendo referncia curva visto que, na presso de 60 mmHg (8 KPa), aproximadamente 97% da hemoglobina esto combinados com o oxignio. Como a saturao normal do sangue arterial sistmico de 97%, uma diminuio da PO2 arterial de 100 para 60 mmHg acompanha-se de dessaturao apenas discreta. Por outro lado, desprezvel o aumento de saturao resultante da hiperventilao em ar atmosfrico, uma vez que, em condies basais, j quase de 100% a SO2.

112 Quando o sangue oxigenado at o nvel arterial normal de 97% de saturao, cerca de 19 ml de oxignio estaro fixados hemoglobina. Ento, conforme o sangue perde oxignio para os tecidos e a saturao da hemoglobina cai a 70%, a quantidade de oxignio que permanece fixada ao sangue ainda da ordem de 14 ml para cada 100 ml de sangue. Por conseguinte, cada 100 ml de sangue que passam pelos tecidos, normalmente, liberam cerca de 5 ml de oxignio para as clulas. Durante o exerccio intenso, essa liberao pode aumentar at 15 a 18 ml para cada 100 ml de sangue que passa pelos tecidos. Em condies normais, um quarto da hemoglobina utilizado no transporte de oxignio aos tecidos. Quando os tecidos sofrem de extrema necessidade, a PO2 nos mesmos cai a valores muito baixos, permitindo que o oxignio difunda do sangue capilar com maior rapidez que a usual. Como resultado, a saturao da hemoglobina no sangue capilar pode cair a 10 - 20%, em lugar dos 70% normais. Portanto, sem qualquer aumento da quantidade de fluxo sanguneo, a quantidade de oxignio pode ser aumentada por mais trs vezes. Se tambm for lembrado que o dbito cardaco pode aumentar de at cinco a sete vezes nos perodos de estresse ento fica claro que a quantidade de oxignio que pode ser transportada para os tecidos pode ser aumentada de at 15 a 20 vezes a normal, parte desse aumento correspondendo queda do percentual de saturao da hemoglobina e parte ainda maior pelo aumento do dbito cardaco. 7.3.2. Transporte de CO2 e H+ No metabolismo aerbio a cada molcula de O 2 consumida, cerca de 0,8, em proporo, de CO2 produzida. Alm de transportar oxignio dos pulmes aos tecidos perifricos, a hemoglobina facilita o transporte de CO2 no sentido oposto, para eliminao. A hemoglobina pode ligar-se diretamente ao CO2 quando o oxignio liberado. Todavia, como CO2 est dissolvido no sangue, a anidrase carbnica dos eritrcitos catalisa a formao de cido carbnico. O cido carbnico se dissocia, rapidamente, em bicarbonato e um prton; e o equilbrio favorvel dissociao. CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+ Para prevenir a diminuio do pH sanguneo, deve haver um sistema tampo para neutralizar esse excesso de prtons. A hemoglobina liga 2 prtons para cada 4 molculas de O2 perdidas e assim funciona como principal tampo do sangue. A maioria dos H+ gerados por esta reao captada pela desoxihemoglobina, como parte do efeito de Bohr.

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Figura 46. Efeito Bohr.

O conjunto de fenmenos relacionados com o aumento do carter cido da Hb quando ela se liga ao oxignio, e o aumento do carter bsico causado pela desoxigenao, constitui o que se conhece como efeito Bohr alcalino ou normal: 4 Hb (O2) 4 Hb + 4 O2 Quando esta equao se desloca para a direita, a reao est ocorrendo nos capilares e os ons H+ promovem a liberao do oxignio. J quando a reao deslocada para a esquerda, nos pulmes ou brnquias, a oxigenao leva liberao do H+. A hemoglobina desempenha importante papel na manuteno do pH plasmtico: medida que a pO2 cai e a concentrao de H+ aumenta, a hemoglobina libera O2 e capta H+. Quando a pO2 aumenta e a concentrao de H+ diminui, a hemoglobina se liga ao O2 liberando o H+. O aumento da concentrao cida do plasma provoca uma queda na afinidade da Hb por oxignio. Este efeito normalmente encontrado nos vasos sangneos dos tecidos, onde h uma maior concentrao de prtons e dixido de carbono, decorrente da atividade celular.

7.3.3. Fatores que Interferem no Transporte de O2 H quatro fatores bem conhecidos que alteram a interao do O 2 com a hemoglobina: a PCO2, o pH, a temperatura e o nvel de 2,3-difosfoglicerato.

114 A Interferncia da PCO2 Aproximadamente 15% do CO2 do sangue carregado pela hemoglobina, na forma de bicarbonato. Os bicarbonatos ligados formam pontes salinas que estabilizam a forma T, por isso a ligao do CO 2 diminui a afinidade da hemoglobina pelo oxignio. Assim, aumentando a concentrao de CO2 (em pH constante), observamos que a curva de dissociao da hemoglobina deslocada para a direita.

Figura 47. Efeito do CO2 na Curva de Dissociao da Hemoglobina.

A Interferncia do pH Na hemoglobina, a acidez aumenta a liberao de oxignio. Fisiologicamente, baixando o pH h um deslocamento da curva de dissociao do oxignio para a direita, de tal maneira que a afinidade pelo oxignio fica diminuda. Contrariamente, o aumento do pH desvia a curva para a esquerda e a saturao de Hb para um dado PO2 aumenta, indicando uma maior afinidade da Hb pelo oxignio.

Figura 48. Efeito do pH na Curva de Dissociao da Hemoglobina.

115 Em tecidos em rpida metabolizao, tais como o msculo em contrao, muito CO2 e H+ so produzidos. A presena de maiores nveis de CO 2 e H+ nos capilares de tal tecido metabolicamente ativo promove a libertao de O 2 da oxihemoglobina. Estes importantes mecanismos para enfrentar a maior necessidade de oxignio nos tecidos metabolicamnte ativos foram descobertos por Christian Bohr, em 1904. O efeito recproco, descoberto 10 anos mais tarde por J. S. Haldane ocorre nos capilares alveolares dos pulmes. A alta concentrao de O 2 promove a libertao de H+ e CO2 da hemoglobina, assim como as altas concentraes de H+ e de CO2 nos tecidos ativos libertam o O2. Este elo entre a ligao do O 2, H+ e CO2 so conhecidos como o Efeito de Bohr. A Interferncia da Temperatura Variaes na temperatura tambm afetam a curva de dissociao da Hb. Enquanto a queda da temperatura redunda em desvio da curva para a esquerda, a temperatura elevada desvia a curva para a direita.

Figura 49. Efeito da temperatura na Curva de Dissociao da Hemoglobina.

A Interferncia do 2,3-difosfoglicerato Nos tecidos perifricos, a deficincia de oxignio determina um acmulo de 2,3-difosfoglicerato (DPG). Este composto formado de um intermedirio glicoltico, o 1,2-difosfoglicerato, e est presente nas hemcias humanas em uma concentrao molar semelhante da hemoglobina. Uma molcula de DPG liga-se hemoglobina tetramrica, numa cavidade central, formada pelas 4 subunidades. A cavidade central tem tamanho suficiente para acomodar o DPG somente quando o espao entre as hlices da cadeia suficientemente largo, isto , quando a hemoglobina est na sua forma T (tensa, desoxi-hemoglobina) (Figura 50).

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O estado T da Hb tem um stio para BPG (azul)

O estado R da Hb perde seu stio para BPG

Figura 50. Interao da Hemoglobina com o DPG.

O DPG est ligado hemoglobina atravs de pontes salinas entre os seus tomos de oxignio e ambas as cadeias via resduos de amino, grupos Nterminais (Val NA1), Lys EF6 e His H21. Assim, o DPG estabiliza a forma T, a forma desoxigenada, da hemoglobina, por ligao cruzada das cadeias , e contribui, adicionalmente, para a formao de pontes salinas, que devem ser rompidas para que a forma T se transforme na forma R da hemoglobina. Assim, importante notar que o DPG diminui a afinidade da hemoglobina pelo oxignio ligando-se desoxi-hemoglobina, mas no forma oxigenada. Na ausncia de DPG, o P50 da hemoglobina 1 mmHg, tal como a mioglobina. Na presena de DPG, o P50 vai a 26 mmHg. Assim, o DPG abaixa afinidade da hemoglobina pelo oxignio por um fator de 26, o qual essencial na habilitao da hemoglobina a descarregar o oxignio em capilares dos tecidos. O DPG liga-se com menor afinidade hemoglobina fetal, do que adulta, porque o resduo H21, da cadeia gama da hemoglobina fetal uma serina em vez da His,e aquela no pode participar na formao da ponte salina (que mantm o DPG na cavidade central). Portanto, o DPG tem um efeito menos pronunciado na estabilidade da forma T da hemoglobina fetal e responsvel pela maior afinidade que a hemoglobina fetal apresenta para o oxignio quando comparada com a hemoglobina do adulto.
Figura 51. A Hemoglobina Fetal Tem Maior Afinidade para o Oxignio do que a Hemoglobina Adulta.

117 Num ambiente pobre em oxignio, como o da placenta, o oxignio libertado da hemoglobina da me e a HbF do feto liga-se a ele. Esta pequena diferena na afinidade dada pela diferente capacidade de ligao ao DPG medeia a transferncia de oxignio da me para o feto. No feto, a mioglobina do msculo possui uma afinidade ainda maior para o oxignio, de forma que as molculas do oxignio passam da hemoglobina fetal para serem armazenadas e usadas no msculo.

7.3.4. Adaptao Mudana de Altitude Uma situao relevante de adaptao do nosso organismo ao ambiente constitui a reao mudana na altitude. A resposta ao baixo PO 2 arterial resultante da alta altitude comandada pelos quimiorreceptores perifricos, levando a hiperventilao e aumento do dbito cardaco (DC). Ocorre aumento na PO2 alveolar (por aumento na ventilao alveolar) e conseqentemente aumento na PaO2 e decrscimo na PaCO2. O decrscimo na PaCO2, entretanto, reduz o estmulo ao nvel dos quimiorreceptores centrais, limitando a hiperventilao.

Altitude (m) 0 (nvel do mar) 1.000 2.000 3.000 4.000 9.000

Presso Atmosfrica (mmHg) 760 674 596 526 462 231

PO2 (mmHg) 159,2 141,2 124,9 110,2 96,9 48,4

Figura 52. Grfico Comparativo entre a Saturao de Oxignio da Hemoglobina e a Presso Atmosfrica, em Situaes de Aumento da Altitude.

118 A compensao metablica compreende:

A curto prazo: Hiperventilao (taquipnia) estimulada pela baixa PO 2 que diminui o percentual de saturao da hemoglobina; maior eliminao de CO2 que baixa a PCO2 e aumenta o pH provocando a alcalose respiratria; tonturas, vertigens e enjo. A mdio prazo: Excreo de HCO3- pela urina para baixar o pH at o nvel normal; perda de gua, que provoca desidratao e diminuio do volume plasmtico; hemoconcentrao - aproximao das hemcias para facilitar o transporte de O2 por um processo difusional. A longo prazo: Secreo de eritropoietina pelo rim estimulando a medula ssea a fazer eritropoiese; aumento de volume sanguneo recuperao da capacidade de transporte de O 2 com o sangue com mais hemcias que o normal nvel do mar (policitemia/eritrocitose). Aumento do 2,3 DPG , desviando a curva de dissociao para a direita.

SO2 %

PO2 (mmHg)

Figura 53. Comportamento da Saturao da Hemoglobina por Oxignio em Situaes que Aumentam (azul) ou Diminuem (vermelho) a sua Afinidade por Esta Molcula.

Tempo de adaptao: At 2.100 m - 2 semanas; a cada 600 m a mais aumenta mais uma semana.

7.4. HEMOGLOBINOPATIAS As hemoglobinopatias so anemias hereditrias causadas por distrbios na intensidade de sntese (alterao de genes reguladores) ou na estrutura (troca de aminocidos alteraes em genes estruturais) das cadeias polipeptdicas da hemoglobina. So divididas basicamente em: alteraes quantitativas as talassemias, que se caracterizam pela diminuio ou ausncia de sntese de uma ou mais cadeias polipeptdicas de globina; alteraes qualitativas as hemoglobinas variantes, que aparecem como resultado de mutaes estruturais

119 dos genes , , ou e acarretam a substituio de aminocidos nas respectivas cadeias polipeptdicas. Existem mais de 700 variantes de hemoglobinas j caracterizadas no mundo, e em sua maior parte a substituio de aminocidos ocorrem na cadeia , seguida pela . Contudo, a grande maioria destas mutaes no d origem a anemias hemolticas. Alm das talassemias- e , as hemoglobinas variantes de importncia clnica so as hemoglobinas S, C, D, E em homozigose ou em heterozigose, as quas causam anemias hemolticas.

7.4.1. Sndromes Talassmicas As sndromes talassmicas so um grupo heterognio de distrbio hereditrios causados por leso gentica, que tm como conseqncia a diminuio parcial ou ausncia total de produo de cadeias globnicas (sem alteraes estruturais na seqncia de aminocidos). Caso o defeito seja em genes ligados sntese de cadeias , tem-se uma talassemia-. Quando a deficincia ocorre na sntese da cadeia , ocorre a forma talassmica . Para que a molcula da hemoglobina adulta seja considerada normal, necessrio que a quantidade de cadeias seja equivalente soma das cadeias (96 a 98%), (2,5 a 3,7%) e (0 a 1%). Em virtude da reduo no ritmo ou da ausncia total de sntese de certas cadeias peptdicas da hemoglobina, h hemoglobinizao deficiente e, conseqentemente, microcitose (volume mdio dos eritrcitos encontra-se diminudo) e hipocromia. Como a sntese de cadeias no afetadas permanece inalterada, h acmulo e formao de agregados instveis destas cadeias despareadas. A precipitao destes agregados provoca numerosos efeitos deletrios sobre os eritrcitos e seus precursores, causando sua destruio prematura. Por exemplo, na -talassemia, o excesso de cadeias livres se agregam na forma de incluses insolveis dentro dos eritrcitos e seus precursores, levando uma destruio prematura de eritroblastos em amadurecimento na medula (eritropoiese ineficaz) e lise de hemcias maduras no bao (hemlise). 7.4.2. Doena Falciforme Doena falciforme uma importante hemoglobinopatia hereditria caracterizada pela presena de hemoglobina S no interior dos eritrcitos, independentemente da sua quantidade ou da sua herana gentica (heretozigose ou homozigose). A anemia falciforme causada por uma mutao pontual na sexta posio na cadeia -globina, levando substituio do resduo cido glutmico por um

120 resduo de valina. As propriedades fsico-qumicas anormais resultantes da hemoglobina falcmica (HbS) so responsveis pela doena falcmica. Quando desoxigenadas, as molculas de HbS sofrem agregao e polimerizao. Inicialmente, o citosol do eritrcito se converte de um lquido fluido a um gel viscoso medida que a HbS forma agregados. Com a persistncia do estado desoxigenado, os agregados de HbS se renem na forma de fibras longas dentro dos eritrcitos, dando o aspecto de foice clula. A falcemizao ou falcizao do eritrcito , inicialmente, um fenmeno reversvel. Com oxigenao, HbS se despolimeriza e a forma das clulas se normaliza. Entretanto, com episdios repetidos de falcemizao, ocorrem danos membrana e os eritrcitos se tornam irreversivelmente falcemizados, mantendo sua forma anormal mesmo quando totalmente oxigenados. A falcemizao dos eritrcitos provoca aumento da viscosidade sangunea, estase (parada do fluxo sanguneo) e fenmeno venoclusivos dolorosos, tpicos da doena. Em rgos de circulao mais lenta, esse fenmeno ocorre com mais facilidade, causando formao de trombos e infarto de reas adjacentes. A longo prazo a isquemia pode acarretar comprometimento funcional de vrios rgos. 7.4.3. Outras Hemoglobinas Variantes

Hemoglobina C A hemoglobina C resultante da alterao molecular do cido glutmico na sexta posio da cadeia -globina por um resduo de lisina (C). Depois da HbS, o tipo mais comum no Brasil.

Hemoglobina D Esta hemoglobinopatia resulta da substituio do cido glutmico da posio 121 da cadeia -globina por glutamina (D). Mesmo em homozigose, caracteriza-se por uma anemia hemoltica branda. Seu diagnstico tem como importncia maior o aconselhamento gentico para evitar cruzamento com portadores assintomticos de outras hemoglobinopatias, como o trao falciforme. a terceira variante de hemoglobina mais freqente na populao brasileira.

Hemoglobina E A hemoglobina E originada a partir da troca de cido glutmico por uma lisina na posio 26 da cadeia de -globina (E). uma hemoglobina bastante instvel e no altera a vida mdia dos eritrcitos. comum nos povos do sudeste da sia.

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Autor(es):
Ana Carolina Soares Matos de Menezes

Revisor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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UNIDADE 1

Opie, L. H. The Heart: Physiology, from Cell to Circulation. 3 edio. 1998. Thurberg, B. L.; Maloney, C. L.; Vaccaro, C.; Afonso, K.; Tsai, A. C.; Bossen, E. H.; Kishnani, P.S.; OCallaghan, M. Characterization of pre- and posttreatment pathology after enzyme replacement therapy for pompe disease. Laboratory Investigation (2006) 86: 12081220.

UNIDADES 2 / 3 / 4

Kolde, H. J. Haemostasis (Physiology, Pathology and Diagnostics). 2 edio. 2004.

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Murray, R. K.; Graner, D. K. Harper: Bioqumica. 7a Edio. 1994. Lehninger, A. L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Principles of Biochemistry. 2a Edio. 1998. Strayer, L.; Berg, J. M.; Tymoczko, J. L. Bioqumica. 5a Edio. 2004. Aires, M. M. Fisiologia. 2a Edio. 1999. Kumar, V.; Fausto, N.; Abbas, A. K. Robbins & Cotran - Patologia. 7a Edio. 2005.

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ANEXOS

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Anexo I. Anemias e ndices Hematimtricos

INTRODUO Anemia (do grego, an = privao, haima = sangue) sndrome clnica caracterizada pela diminuio da concentrao intraeritrocitria de hemoglobina ou pela reduo da quantidade de eritrcitos circulantes, ou seja, diminuio do hematcrito. Como toda sndrome, ela pode ser caracterizada por um conjunto de sinais e sintomas, que podem variar conforme o tempo de instalao do quadro. Assim, as anemias so primariamente classificadas em anemias crnicas e anemias agudas. Na anemia aguda (perda sbita de sangue) a falta de volume no sistema circulatrio mais importante que a falta de hemoglobina. A perda de at 10% do volume sangneo, como a que ocorre numa doao de sangue, bem tolerada. Perdas entre 10 e 20% causam hipotenso postural, tonturas e desmaios. Nas perdas acima de 20% h taquicardia, extremidades frias, palidez extrema, e hipotenso, depois choque; se a perda ultrapassar 30%, sem reposio imediata de lquidos intravenosos, o choque torna-se rapidamente irreversvel e mortal. Nas anemias crnicas no h baixa do volume sangneo, que compensado por aumento do volume plasmtico. A falta de hemoglobina, como regra acompanhada de diminuio do nmero de eritrcitos, causa descoramento do sangue, com palidez do paciente, e falta de oxignio em todos os rgos, com os sinais clnicos da decorrentes. Hipcrates (@400 a.C.) descreveu-os: palidez e fraqueza devem-se corrupo do sangue. O sistema nervoso central, o corao e a massa muscular so os rgos mais afetados, pois so os que mais necessitam oxignio para suas funes. A sintomatologia aumenta com a atividade fsica, pois esta consome oxignio. Com hemoglobina entre 9 e 11 g/dL h irritabilidade, cefalia e dficit de concentrao; nos pacientes idosos h astenia (fraqueza muscular) e podem ocorrer dores anginosas. Com hemoglobina entre 6 e 9 g/dL h taquicardia, dispnia e fadiga aos menores esforos (como por exemplo, fraqueza que surge ao tomar banho ou ao percorrer pequenas distncias). Com hemoglobina abaixo de 6 g/dL a sintomatologia est presente mesmo em atividades sedentrias e quando abaixo de 3,5 g/dL a insuficincia cardaca iminente e toda a atividade impossvel. Quando a anemia torna-se grave (Quadro1), ela pode inclusive acarretar um acidente vascular cerebral ou um infarto do miocrdio. As queixas espontneas dos pacientes, entretanto, so menos exuberantes que a descrio acima: sem se aperceberem diminuem progressivamente a atividade fsica at nveis assintomticos, e dizem nada sentir.

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Quadro 1. Valores de Referncia (para indivduos residentes ao nvel do mar).

No-anmicos: Homens Hb > 14,0g/dl Mulheres Hb > 12,0g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb > 11g/dl Anemia Leve: Homens Hb de 11,5 a 13,9g/dl Mulheres Hb de 10,0 a 11,9g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb de 9,5 a 10,9g/dl Anemia Moderada: Homens Hb de 9,0 a 11,4g/dl Mulheres Hb de 8,0 a 9,9g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb de 7,6 a 9,4g/dl Anemia Grave: Homens Hb < 9,0g/dl Mulheres Hb <8,0g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb < 7,5g/dl

CLASSIFICAO MORFOLGICA Esta classificao tem por base a caracterizao dos eritrcitos do ponto de vista morfolgico, ou seja, quanto ao seu contedo de hemoglobinas e ao tamanho da clula. Deste modo as anemias so divididas em trs grandes grupos:

Microctico-hipocrmicas: eritrcitos de pequeno tamanho e pouca concentrao de hemoglobina, no obrigatoriamente com baixo nmero de eritrcitos circulantes (eritrcitos normais ou diminudos);

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Normoctico-normocrmicas: tamanho dentro da mdia, concentrao e contedo de hemoglobina na mdia, normais, mas com pouco nmero de eritrcitos circulantes; Macroctica: glbulos grandes, com concentrao interna de hemoglobina normal, mas com contedo interno (peso) de hemoglobina aumentado, tambm com baixo nmero de glbulos circulantes (eritrcitos diminudos).

CLASSIFICAO FISIOPATOLGICA A Sndrome Anmica pode advir de inmeras etiologias. Podemos agruplas, segundo a sua fisiopatologia, em trs grandes grupos: a) anemia por falta de produo, com ou sem comprometimento do sistema hematopoitico; b) anemia por aumento da destruio; c) anemia por perda sangunea (Quadro2). Anemias por Diminuio da Produo As anemias por diminuio da produo dizem respeito a qualquer estado em que, mesmo havendo hipxia, no h aumento da produo de eritrcito. Elas so conseqncia de algum problema no rgo formador de sangue (medula ssea); ou, quando esta sadia, da no disponibilidade de elementos nutrientes para uma eritropoiese tima (anemias carenciais); ou de defeitos genticos ou adquiridos que impedem a formao do heme; ou da falta de eritropoietina (hormnio secretado pelos rins cuja funo estimular a formao de eritrcitos). Estes estados so muitas vezes chamados de anemias arregenerativas, posto que no h aumento de produo mesmo havendo hipxia. Para estas anemias a produo s aumentaria (regenerao) caso houvesse a soluo da causa, ou seja, a reposio do ferro, folato, cura da aplasia (transplante de medula), etc.

Anemias Hemolticas As anemias por excesso de destruio so caracterizadas pela diminuio do tempo de vida mdia do eritrcito na circulao sem que o aumento da produo se faa suficiente para compensar o grau de hemlise. So tambm chamadas regenerativas, pois h aumento a produo como conseqncia da hipxia. Apesar de sempre existirem alguns pontos em comum (como o aumento da contagem de reticulcitos, da bilirrubina indireta e da LDH) pode haver grande divergncia de sinais, sintomas e quadros laboratorial nas diferentes anemias hemolticas. O local e a intensidade da hemlise, bem como a causa da destruio (se por problemas do prprio eritrcito ou extra-eritrcitrio) conduzem a quadros laboratoriais bastante variados.

128 Hemlise Extravascular De modo distinto ao ocorrido no processo normal de destruio dos eritrcitos senescentes (1% ao dia), os casos de anemias por hemlise extravascular ocasionaro apenas elevao da LDH e da bilirrubina indireta sricas (desde que o grau de hemlise seja maior que a capacidade de conjugao heptica), do urobilinognio e estercobilonognio, sem, entretanto haver hemoglobinemia e/ou hemoglobinria e/ou hemossiderinria. So exemplos de hemlise extravascular as hemoglobinopatias, as anemias por defeito da membrana ou por dficits enzimticos hereditrios (G6PD, GR, PK, etc.), aps o uso de drogas oxidantes, doena heptica, etc.

Hemlise Intravascular Na hemlise intravascular do eritrcito, a hemoglobina livre no plasma formar um complexo com a haptoglobina, e o heme da metamoglobina ligar-se- com a hemopexina, para s ento formar metamalbumina. Dependendo do grau de hemlise, haver depleo parcial ou total da haptoglobina. Quaisquer das causas de destruio intravascular dos eritrcitos, cuja hemlise for suficiente para liberar hemoglobina livre que causa depleo da haptoglobina e da hemopexina, resultaro em metalbuminemia e hemossiderinria. Entretanto, nem sempre levam hemoglobinria. So exemplos de hemlise intravascular: trmicas (queimaduras), por destruio osmtica, por destruio mecnica por prtese cardaca, na microangiopatia, na vasculite, por formao de trombos intravasculares, por incompatibilidade transfusional, por malria, na septicemia por clostrdio, Mycoplasma pneumoniae, etc. Anemias Hemorrgicas As anemias decorrentes da perda sangunea podem ocorrer de forma aguda ou crnica, gerando quadros clnicos e laboratoriais distintos.

Anemias por Perda Aguda de Sangue Imediatamente aps a perda aguda de sangue (volume plasmtico e celular juntos), ocorre hipovolemia. As determinaes da hemoglobina, do hematcrito e do nmero de eritrcitos permanecem semelhantes quelas anteriores ao quadro hemorrgico agudo. Apenas aps processo de normovolemizao que possvel avaliar a real diminuio da massa eritride circulante. Como a reserva de reticulcitos mais imaturos medulares pequena e h necessidade de, pelo menos, uma semana para formao de novos eritrcitos, durante os primeiros dias ps normovolemizao, a anemia revela-se

129 normoctico-normocrmica (decorrncia dos eritrcitos anteriores ao sangramento, com apenas poucas clulas policromticas circulantes- uns poucos eritrcitos). Por volta do oitavo ao dcimo dia, ocorre um pico de reticulcitos. Caso o paciente no disponha de reservas suficientes de ferro e/ou folato, poder desenvolver secundariamente e apresentar quadro superponvel de anemia ferropriva e/ou anemia megaloblstica.

Anemias por Perda Crnica de Sangue So decorrentes de pequenos sangramentos crnicos que promovem um espoliamento paulatino das reservas dos fatores nutricionais essenciais para eritropoiese, principalmente o ferro. A cintica do ferro fechada, ou seja, o ferro dos eritrcitos senescentes totalmente recuperado pela transferrina e volta para a medula, resultando em uma necessidade diria mnima de absoro de ferro (apenas para o ferro perdido com as clulas epiteliais). A perda de sangue quebra esse ciclo e aumente cada vez mais a necessidade de aporte de ferro alimentar, o que na maioria dos casos no obtido, provocando assim o desenvolvimento de anemia ferropriva. A anemia ferropriva sem causa definida pode ser conseqncia de um carcinoma, lceras, gastrites, hrnia de hiato, varizes de esfago, parasitoses intestinais, hemorridas, hematria por carcinoma geniturinrio, etc. Alm do quadro clnico-laboratorial tpico de cada doena de base, os achados hematolgicos so de anemia microctica-hipocrmica, para a carncia de ferro, de anemia megaloblstica se houver apenas falta de folato, ou anemia pluricarencial para deficincia simultnea destas duas substncias.

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Quadro 2. Classificao Fisiopatolgica das Anemias. Anemias por falta de produo Com sistema hematopoitico ntegro: o Deficincia de ferro o Deficincia de folato o Deficincia de vitamina B12 o Deficincia de eritropoietina: insuficincia renal crnica; hipotireoidismo; o Deficincia de piridoxina (B6) Com sistema hematopoitico comprometido (medula ssea alterada ou falha na regulao da eritropoiese): o Aplasia medular (anemia aplstica) o Sndromes mielodisplsicas (SMD) e sideroblsticas o Leucemias o Linfomas leucemizados o Metstases o Mielofibrose o Estados inflamatrios e/ou infecciosos o Drogas que inibam a hematopoiese o Doenas de depsito Anemias por excesso de destruio Anemias hemolticas por defeito hereditrio: o Eritroenzimopatias (metablicas): Deficincia de G6PD Deficincia de piruvato quinase Outras enzimopatias (glicolticas, no glicolticas) o Hemoglobinopatias (defeitos na sntese de globinas): Com globina de estrutura anormal: anemia falciforme (SS), hemoglobinopatias CC, SC, SD, SE, etc. Com globina de estrutura normal: talassemias o Por defeitos proticos da membrana eritrocitria: Esferocitose Eliptocitose Anemias hemolticas por defeito adquirido: o Imunes: Anemia hemoltica auto-imune (AHAI): induzida por drogas, aglutininas a frio, etc. Anemia hemoltica aloimune: doena hemoltica do recm nascido, transfuses. o No-imunes (dano direto ao eritrcito, sem desenvolvimento primrio de resposta imune): Por trauma mecnico: anemias microangiopticas, prteses cardacas, hemoglobinria da marcha, etc. Por danos trmicos: queimados, danos qumicos, venenos Txicas, agentes infecciosos: protozorios (malaia, Babesia), bactrias (Clostrdium).

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Quadro 2. Classificao Fisiopatolgica das Anemias (continuao).

Anemias por perdas sanguneas: Perdas crnicas: epistaxe, hemorridas, sangramento menstrual intenso, etc. Perdas agudas: acidentes, cirurgias, parto, ruptura de vasos sanguneos. Pseudo-anemias: (resultantes apenas do aumento do volume do plasma): Edema: ltimo trimestre de gravidez; tratamento com drogas esterides; desbalano hidrosmtico. Hiperesplenismo (aumenta a quantidade de glbulos retidos no compartimento extravascular) Outros: uso de soro intravenoso, atletas em treinamento, etc.

DIAGNSTICO O diagnstico de anemia pode ser feito atravs de uma anamnese (histria do paciente e da sua queixa principal) bem colhida e um exame fsico acurado. Contudo, para determinar a etiologia da sndrome anmica, podemos fazer uso de exames complementares. O protocolo inicial para investigao das anemias constitui-se de: Hemograma completo; Contagem de reticulcitos; Ferrocintica (para avaliar a absoro de ferro); Dosagem de uria/ creatina (para avaliao da funo renal); Bilirrubinas (a fim de avaliar se h aumento da hemlise); LDH; Albumina e globulinas; Exame Parasitolgico de Fezes (EPF) e Pesquisa de Sangue Oculto; EAS (elementos anormais no segmento da urina); Hepatoglobinas.

Para nosso estudo, interessa analisarmos os achados do hemograma, bem como os ndices Hematimtricos obtidos a partir da amostra de sangue. Este contedo ser mais detalhado a seguir.

Hemograma O hemograma contempla diversas provas efetuadas com a finalidade de avaliar quantitativa e qualitativamente os componentes celulares do sangue. Os itens avaliados incluem: hemcias, hemoglobina, hematcrito, ndices hematimtricos, leuccitos totais, contagem diferencial de leuccitos, plaquetas e exame microscpico de esfregao de sangue corado.

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O sangue colhido com anticoagulante (EDTA), para se evitar a coagulao do mesmo. No h necessidade de colher o sangue com o indivduo em jejum. Contagem de Eritrcitos A contagem de hemcias a primeira informao fornecida e expressa em milhes por mm3. A contagem dos eritrcitos feita atravs de contadores eletrnicos, ou microscpio em cmara de Neubauer, com acurada diluio interna do sangue. Valores de referncia: Homens adultos: 4,6 a 6,2 milhes de hemcias/ mm3 de sangue venoso Mulheres adultas: 4,2 a 5,4 milhes de hemcias/ mm3sangue venoso Crianas: 3,8 a 5,5 milhes de hemcias/ mm3de sangue venoso Bebs a termo: 4,4 a 5,8 milhes de hemcias/ mm3de sangue capilar ao nascimento, diminuindo para 3,8 milhes de hemcias/ml na idade de 2 meses, e aumentando lentamente da em diante.

Os nveis de hemcias iguais ou maiores que 6,20 milhes/mm 3 em homens e iguais ou maiores que 5,70 milhes/mm3 em mulheres so considerados poliglobulia.

Dosagem de Hemoglobina A concentrao de hemoglobina expressa em g/dL, e sua avaliao de grande importncia pelo papel no transporte de oxignio e por estar diretamente relacionada anemia, sendo sua melhor forma de avaliao laboratorial. A concentrao de hemoglobina correlaciona-se estreitamente com a contagem de hemcias. Valores de referncia: Recm-nascidos: 14 a 20 g/dl 1 semana de idade: 15 a 23 g/dl 6 meses de idade: 11 a 14 g/dl Crianas de 6 meses a 18 anos: 12 a 16 g/dl Homens: 14 a 18 g/dl Mulheres: 12 a 16 g/dl.

Baixas concentraes de hemoglobina podem indicar anemia, hemorragia recente ou reteno de lquido causando hemodiluio. Hemoglobina elevada sugere hemoconcentrao, originria de policitemia ou desidratao.

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Hematcrito O volume relativo das hemcias dentro do volume de sangue fornecido pela anlise do hematcrito, que expresso percentualmente. Por exemplo, 40% de Ht indica 40 ml de hemcias contidas em uma amostra de 100ml. Essa concentrao obtida centrifugando-se o sangue total anti-coagulado em um tubo capilar, de forma que as hemcias sejam firmemente concentradas sem hemlise. Valores de referncia: Recm-nascidos: 42% a 60% de Ht 1 semana de idade: 47% a 65% de Ht 6 meses de idade: 33% a 39% de Ht Crianas de 6 meses a 18 anos: 35% a 45% de Ht Homens: 42% a 54% de Ht Mulheres: 36% a 46% de Ht.

Um hematcrito baixo sugere anemia, hemodiluio ou uma perda macia de sangue. Um hematcrito alto indica policitemia ou hemoconcentrao devido perda sangnea ou desidratao. Contagem de Leuccitos A contagem global e diferencial de leuccitos e suas alteraes quantitativas e qualitativas so as principais informaes fornecidas na anlise da srie branca. Os leuccitos totais so expressos em mil/mm3. A contagem diferencial de grande importncia, podendo definir perfis patolgicos, e fornecida pela anlise conjunta dos equipamentos automatizados e pela leitura do esfregao corado, que avalia as diferentes formas leucocitrias e as expressa de forma percentualmente (relativa) e em mm3 (absoluta). A anlise das alteraes morfolgicas dos leuccitos tambm realizada por observao microscpica do esfregao corado. A contagem de leuccitos varia de 4.000 a 10.000/ mm3. Uma contagem elevada de leuccitos (leucocitose) com freqncia assinala uma infeco, como, por exemplo, um abscesso, meningite, apendicite ou amigdalite. Uma contagem alta de leuccitos pode tambm resultar de leucemia e necrose tecidual devido queimaduras, infarto do miocrdio ou gangrena. Uma contagem diminuda de leuccitos (leucopenia) indica depresso da medula ssea, que pode resultar de infeces virais ou de reaes txicas, como, por exemplo, as que acompanham o tratamento com antineoplsicos, ingesto de mercrio ou outros metais pesados, ou exposio ao benzeno ou arsnicos. A leucopenia caracteristicamente acompanha influenza, febre tifide, sarampo, hepatite infecciosa, mononucleose e rubola.

134 Os leuccitos podem ser divididos em granulcitos (mielcito, metamielcito, basto, neutrfilos, eosinfilos e basfilos), moncitos e linfcitos. O diferencial de leuccitos usado para avaliar a distribuio e morfologia dos glbulos brancos, fornecendo informao mais especfica sobre o sistema imune do paciente do que a contagem de leuccitos isoladamente. Na contagem diferencial dos linfcitos, estes so classificados de acordo com os cinco tipos principais neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfcitos e moncitos sendo determinada a porcentagem de cada tipo. A contagem diferencial o valor percentual de cada tipo de glbulo branco no sangue. O nmero absoluto de cada tipo de glbulo branco obtido por meio da multiplicao do valor percentual de cada tipo pela contagem total de glbulos brancos.

Basfilos: 0 a 200/ml; 0 a 2% Eosinfilos: 40 a 500/ml; 1 a 5% Linfcitos: 880 a 4.000/ml; 22 a 40% Moncitos: 120 a 1.000/ml; 3 a 10% Neutrfilos: 1.800 a 7.500/ml; 45 a 75%.

Para crianas, os valores absolutos e porcentagens normais podem diferir.

Basfilos: 0 a 2% Eosinfilos: 1 a 5% Linfcitos: 45 a 75% Moncitos: 3 a 10% Neutrfilos: 22 a 40%.

Contagem de Plaquetas A avaliao das plaquetas pode ser feita de forma quantitativa, expressa em mm3, e de modo qualitativo, pela avaliao das caractersticas analisadas no esfregao corado, o que permite a identificao de alteraes morfolgicas das plaquetas. A contagem de plaquetas o mais importante teste de rastreamento da funo plaquetria. A utilizao de equipamentos automatizados, alm de fornecer contagens mais precisas, permite que se obtenham informaes em relao presena de anisocitose e grumos plaquetrios, e tambm de ndices plaquetrios, que, em sua maioria, ainda no esto liberados para uso clnico. As alteraes quantitativas podem ser tanto o aumento da quantidade de plaquetas, chamada hiperplaquetemia (ou trombocitose), quanto a diminuio, denominada plaquetopenia (ou trombocitopenia). Valores de referncia: Adultos: 150-450 mil/mm3

135 Crianas: 150-550 mil/mm3

Uma contagem diminuda de plaquetas (trombocitopenia) pode resultar de medula ssea aplstica ou hipoplstica; uma doena infiltrativa de medula ssea, como, por exemplo, carcinoma ou leucemia; hipoplasia megacarioctica; trombopoiese infecciosa proveniente de deficincia de cido flico ou vitamina B12; acmulo de plaquetas em um bao aumentado; destruio aumentada de plaquetas devido drogas ou desordens imunes; coagulao intravascular disseminada; sndrome de Bernard-Soulier; ou leses mecnicas s plaquetas. Uma contagem aumentada de plaquetas (trombocitose) pode resultar de hemorragias, desordens infecciosas; cncer; anemia por deficincia de ferro; cirurgia recente, gravidez, ou esplenectomia e desordens inflamatrias. Em tais casos, a contagem de plaquetas retorna ao normal aps o paciente recuperar-se da desordem primria. Todavia, a contagem permanece elevada em trombocitemia primria, mielofibrose com metaplasia mielide, policitemia vera e leucemia mielide crnica. Em tais desordens, as plaquetas podem estar disfuncionais, resultando em sangramento.

NDICES HEMATIMTRICOS A relao entre os achados da contagem de hemcias, dosagem de hemoglobina e hematcrito pode ser obtida pela anlise dos ndices hematimtricos. Estes iro fornecer informaes adicionais sobre variaes de volume e concentrao da hemoglobina. Os achados morfolgicos do esfregao corado fornecem mais informaes sobre contedo da hemoglobina, forma, tamanho e incluses eritrocitrias.

Velocidade de Hemossedimentao Este ndice um dado complementar ao Hemograma completo. A velocidade de hemossedimentao (VHS) reflete o resultado entre as foras envolvidas no movimento de sedimentao das hemcias e os mecanismos oponentes exercidos por substncias plasmticas, principalmente o fibrinognio e as protenas de fase aguda. A capacidade de agregao das hemcias depende de fatores ligados s mesmas, como a fora de coeso entre as hemcias e sua carga eltrica, que tem uma fora repulsiva que mantm as hemcias afastadas em condies normais, e fatores plasmticos que tm como funo atenuar o efeito das foras repulsivas. A presena de processos inflamatrios leva a uma agregao maior das hemcias, formando agregados conhecidos como rouleaux. Esse fenmeno favorece o aumento da velocidade de sedimentao das hemcias. O aumento da concentrao plasmtica de imunoglobulinas e fibrinognio leva a uma diminuio da fora repulsiva entre as hemcias, facilitando a

136 agregao e aumentando portanto a VHS. A presena de protenas anmalas, como no mieloma, de hemcias alteradas em nmero, forma ou tamanho e o uso de medicamentos podem levar a uma alterao da VHS, mesmo na ausncia de resposta de fase aguda. As principais alteraes que podem levar a um aumento significativo da VHS (=100mm na 1a hora) so processos infecciosos, doenas do tecido conjuntivo, neoplasias e doenas renais. A velocidade de hemossedimentao (VHS) um indicador no-especfico de infeco e leso tecidual. til para monitorar inflamao crnica, inclusive a atividade da doena como na artrite reumatide. A VHS mais til do que a protena C reativa para o diagnstico e a monitorizao da polimialgia reumtica e a artrite de clulas gigantes, em que se encontra freqentemente elevada durante a recada. Homens entre 45-64 anos com VHS no limite superior tm duas vezes mais risco de morte de doena coronria do que os homens com VHS na faixa inferior, depois de ajustar outros fatores de risco. O mtodo tem alta sensibilidade com baixa especificidade, o que leva a alteraes em inmeras situaes patolgicas e em algumas situaes fisiolgicas como perodo menstrual, gravidez, temperatura, sexo e idade.

ALTERAES DA VELOCIDADE DE HEMOSSIMENTAO ELEVADA DIMINUDA Infeces bacterianas Policitemia Hepatite aguda, hepatopatia crnica Hemonoglobinopatia Pancreatites, colites e ilites, peritonite Esferocitose Processos inflamatrios agudos e crnicos Alteraes da forma das hemcias Febre reumtica Microcitose Lpus eritematoso sistmico Hipofibrinogenemia Artrite reumatide Insuficincia cardaca Vasculites e dermatomiosites Cardiopatia congnita Anemias graves Desnutrio grave Leucemias e linfomas Leses hepticas graves Metstases Uso de antiflamatrios Sndrome nefrtica, glomerulonefrite aguda, pielonefrite Tireoidites Mieloma, crioglobulimia e macroglobulinemia Necrose tecidual (cirurgias, queimaduras, quimioterapia e radioterpia) Uso de heparina

Volume Corpuscular Mdio (VCM) Avalia a mdia do tamanho (volume) das hemcias, que podem estar em seu tamanho normal, quando so ditas normocticas, diminudas (microcticas) ou aumentadas (macrocticas). Onde, Ht = hematcrito (L/L); e Hm = nmero de hemcias x 1012/L. O resultado dado em fentolitros (fL) = 10-15L .

137 Valor de referncia para >12anos: 80 a 98 fL. ALTERAO DE TAMANHO NORMOCITOSE MICROCITOSE MICROCITOSE DISCRETA MICROCITOSE ACENTUADA MACROCITOSE MACROCITOSE ACENTUADA ANISOCITOSE ADULTOS CRIANAS AT 3 ANOS 73,0 <ou= 71,0 71 a 72,9 < 60 > 99 > 120 CRIANAS DE 4 A 14 ANOS 73,0 <ou= 73,0 73 a 74,9 < 60 > 99 > 120

80,0 <ou = 80 79 a 79,9 < 60 > 98 >120

Presena de hemcias de volumes diferentes

Hemoglobina Corpuscular Mdia (HCM) ndice hematimtrico que corresponde mdia de hemoglobina por eritrcito ou seja, a quantidade, em peso, de hemoglobina contida em cada clula. Pode estar elevado na presena de macrocitose e diminudo na presena de hemcias microcticas. Onde, Hb = hemoglobina (g/L) e Hm = nmero de hemcias x 1012/L. O valor dado em picogramas (pg)= 10 -12g.

Valor de referncia para >12anos: 27 a 31 pg. Concentrao de Hemoglobina Corpuscular Mdia (CHCM) a avaliao da hemoglobina encontrada em 100 mL de hemcias, ou seja, a relao do peso da hemoglobina para o volume do eritrcito que a contm. Esse ndice permite a avaliao do grau de saturao de hemoglobina no eritrcito. A saturao da hemoglobina normal indica a presena de hemcias ditas normocrmicas. Quando diminuda, teremos hemcias denominadas hipocrmicas e, quando aumentadas, hemcias hipercrmicas. Onde, Hb = hemoglobina (g/dL) e Ht = hematcrito (dl/dl). A unidade de medica g/dl ou g%.

Valor de referncia: 32 a 36 g%. Tendo em vista os conceitos expostos acima, podemos reescrever a classificao de anemias quanto morfologia vista no incio do captulo, relacionando-as com as etiologias associadas (ver tambm Quadro 3).

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Microctico-hipocrmicas: eritrcitos de pequeno tamanho (VCM baixo) e pouca concentrao de hemoglobina (CHCM baixa), no obrigatoriamente com baixo nmero de eritrcitos circulantes (eritrcitos normais ou diminudos); Normoctico-normocrmicas: tamanho dentro da mdia, concentrao e contedo de hemoglobina na mdia, normais, mas com pouco nmero de eritrcitos circulantes (VCM normal, CHCM normal e HCM normal e eritrcitos diminudos, respectivamente); Macroctica: glbulos grandes (VCM alto), com concentrao interna de hemoglobina normal (CHCM normal), mas com contedo interno (peso) de hemoglobina aumentado (HCM alta), tambm com baixo nmero de glbulos circulantes (eritrcitos diminudos).

Quadro 3. Classificao das Anemias segundo Tamanho do Eritrcito e Etiologias Associadas. MICROCTICA: Ferroprivas: Carncia alimentar Absoro inadequada Aumento na demanda Hemorragias No ferroprivas: Doenas crnicas Talassemia / Esferocitose Anemia Sideroblstica MACROCTICA Deficincia de viamina B12: Carncia alimentar Absoro deficiente Aumento na demanda Erros congnitos Deficincia de cido Flico: Carncia alimentar Absoro deficiente Aumento na demanda Drogas (AZT, quimioterapia, lcool) Outras: Sndrome Mielodisplsica Adiser congnita Eritroleucemia Hipotireoidismo Doena hepatica NORMOCTICA: Anemias nutricionais: deficincia simultnea de Fe+2 e vitamina B12 Anemias da insuficincia renal e da medula ssea Anemias hemolticas

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Autor(es): Ana Carolina Soares Matos de Menezes

Referncias Bibliogrficas: Modificado de: Oliveira, R. & Neto, A.: Anemias e Leucemias: conceitos bsicos e diagnsticos por tcnicas laboratoriais. 1a Edio-2004 Failace. R: HEMOGRAMA: manual de interpretao. 4a Edio-2003

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Anexo II. Aula Prtica 1 Testes de Hemostasia

Provas de Hemostase e Coagulao Hemostase: o conjunto de fenmenos fisiolgicos capaz de atuar em um vaso para estancar uma hemorragia e reduzir a leso vascular. Para que isso ocorra, so acionados: a) o endotlio vascular e as plaquetas, levando formao de uma rolha plaquetria e parada do sangramento fenmeno chamado de Hemostase Primria; b) as protenas do plasma, atravs do mecanismo de Coagulao, levando formao de um cogulo de fibrina organizado que evita a retomada da hemorragia fenmeno chamado de Hemostase Secundria. Em seguida, ocorre o processo de reparao tecidual, concomitante ao mecanismo de Fibrinlise. Testes para Plaquetas e Vasos Sangneos 1. Tempo de Sangramento Mtodo de Duke: Princpio: a medida da durao de um sangramento quando se pratica com uma lanceta uma inciso cutnea, cuja profundidade no ultrapasse 4 mm. Material: Lanceta estril descartvel ou lanceta de Bensaude; lcool 70% ou lcool iodado; Algodo; Papel de filtro; Cronmetro. Mtodo: Fazer a assepsia do lbulo da orelha com lcool e deixar secar. Executar a inciso de 3 a 4 mm de profundidade com a lanceta estril. Deixar o sangue fluir naturalmente (sem fazer presso). Disparar o cronmetro junto com a inciso e par-lo quando o sangramento cessar. Absorver com papel de filtro a gota formada a cada 15 segundos, sem tocar a ferida diretamente para no perturbar a formao do tampo hemosttico. Interpretao: O valor normal de 1 a 4 minutos. Tempos prolongados podem ser observados em: Trombocitopenia, Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doena de von Willebrand, Parahemofilia, Afibrinogenemia Congnita e Sndrome Fibrinoltica. Resultados normais so encontrados nas Hemofilias.

2. Prova do Lao ou Prova de Fragilidade Capilar Prova de Rampel-Leede: Princpio: A fragilidade capilar testada pelo aumento da presso intracapilar por obstruo do fluxo venoso, aplicando-se um torniquete de borracha (garrote) ou manguito do esfigmomanmetro no brao do paciente.

141 O nmero de petquias formadas mostra a fragilidade capilar. O impedimento de formao petequial em indivduos depende da resistncia da parede capilar e tambm ocorre em funo do nmero e funcionalidade das plaquetas. Material: Torniquete de borracha (garrote) ou esfigmomanmetro; Cronmetro. Mtodo: Verificar previamente se existem petquias no brao do paciente. Colocar o garrote no brao de forma que seja feita certa presso. Se for utilizado o esfigmomanmetro, aferir a presso e mant-la entre a mxima e a mnima (presso arterial mdia, dada pela mdia aritmtica das presses sistlica e diastlica) durante 5 minutos. No fim, contar o nmero de petquias que aparecem. Interpretao: Considerar a prova positiva quando houver formao de mais de seis petquias por rea circular de 5 cm de dimetro (ou 20-25 cm2). O aumento da fragilidade capilar pode ser observado na Trombocitopenia, Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doena de von Willebrand, Prpura Henoch-Schonlein, Disproteinemias, Prpura Senil, Diabetes Mellitus, Hipertenso, Artrite Reumatide e Escorbuto. O teste de difcil interpretao e tende a ser de ajuda limitada, particularmente na mulher, porque ela desenvolve petquias mais facilmente.

Testes de Coagulao 1. Tempo de Ativao de Protrombina (T.A.P.) Mtodo de Quick: Princpio: Este teste avalia a VIA EXTRNSECA da coagulao. A protrombina transformada em trombina na presena de tromboplastina. O teste consiste na adio ao plasma de uma mistura de tromboplastina tecidual e clcio, de modo que o tempo de coagulao depender dos fatores I, II, X, V, e VII contidos no plasma. Material: Tubos de ensaio (10 x 75 mm); Pipetas de escoamento total; Banho-Maria a 37C; Cronmetro. Reagente: Plasma citratado na proporo adequada; Suspenso de tromboplastina + Cloreto de Clcio 0.02 M (segundo Quick). Mtodo: Em um tubo de ensaio conservado em banho-maria a 37C, pipetar 0,1 mL de plasma, adicionar 0,2 mL de tromboplastina clcica, agitar a mistura e, simultaneamente, disparar o cronmetro para marcar o tempo de coagulao (inclinando o tubo vrias vezes).

142 Interpretao: O tempo de protrombina de um plasma normal humano de 11,5 a 12,5 s (segundo Quick), embora resultados com preparaes comerciais variem de 12 a 15 segundos. Tempo de protrombina prolongado indica deficincia de um ou mais fatores: II, X, V, e VII, ou presena de inibidores de coagulao.

2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado ou Tempo de Cefalina (P.T.T.a.): Princpio: Esta uma prova que avalia a VIA INTRNSECA da coagulao. Adiciona-se ao plasma tromboplastina parcial ou cefalina (que ir substituir o fator plaquetrio 3), e uma suspenso de cido elgico (para ativar o fator XII), medindo-se assim a atividade do sistema intrnseco em condies padronizadas. Material: Tubos de Ensaio (10 x 75 mm); Banho-Maria a 37C; Cronmetro; Pipetas de escoamento total. Reagente: Plasma citratado; Soluo de CaCl2 0,02 M; Suspenso de cido elgico + Cefalina em soluo fisiolgica. Mtodo: Para um tubo de ensaio mantido a 37C, pipetar:

0,1 mL de Cefalina + 0,1mL de Plasma 0,1 mL de CaCl2 0,02 M

Misturar bem e deixar a 37C por 2 minutos. Agitar levemente. Acionar o cronmetro, colocar a 37C e deixar durante 30 segundos. A seguir observar a cada 5 segundos a coagulao do plasma.

Interpretao: O PTTa para um plasma humano normal ativado de 32 a 46 segundos. Tempos mais prolongados indicam deficincia de um ou mais fatores da via intrnseca da coagulao (fatores XII, XI, IX, VIII, fator de Fitzgerald e fator de Fletcher) e da via efetora (fatores X, V, II e I) de um modo global. Esta prova s no mede o fator VII e o fator plaquetrio 3 (FP3). til no controle pr-operatrio. Serve para demonstrar deficincia de um dos fatores anti-hemoflicos e serve tambm como controle da teraputica heparnica. Obs1: Esta prova deve ser efetuada sempre em paralelo com um plasma normal. Relao Paciente/Normal at 1/3 considerada normal. Obs2: Fator de Fitzgerald Cininognio de Alto Peso molecular (HMWK); Fator de Fletcher Pr-Calicrena.

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Anexo III. Aula Prtica 2 ndices Hematimtricos e Determinao de Grupo Sanguneo

Valores Fundamentais da Srie Vermelha ndices Hematolgicos 1. Determinao da Velocidade de Hemossedimentao (VHS) Mtodo de Westergreen:

Fundamento: No sangue colhido com anticoagulante, as hemcias em suspenso no plasma tendem a sedimentar pela ao da gravidade. A velocidade de hemossedimentao expressa como a distncia (em milmetros) da queda das hemcias na unidade de tempo (usualmente uma hora). Concentraes elevadas de alfa-2 globulinas, gama-globulinas e fibrinognio provocam aumento da velocidade porque facilitam a formao de aglomerados de hemcias (rouleaux). Esta prova est aumentada nos processos inflamatrios agudos e crnicos: artrite reumatide, enfermidade do aparelho genital feminino, processos neoplsicos, etc. Tem utilidade no acompanhamento de uma enfermidade e no como valor diagnstico. Na gravidez, aps o 3 ms, o VHS encontra-se aumentado. Material: - Material de colheita de sangue; - Anticoagulante: soluo de Citrato de Sdio a 3,8% (p/v); - Pipeta de Westergreen, graduada de 0 a 200 mm e dimetro interno de 2,5 mm; - Suporte apropriado. Tcnica: - Colher sangue venoso com anticoagulante Citrato de Sdio a 3,8% na proporo de uma parte de Citrato para quatro partes de sangue total; - Homogeneizar e encher a pipeta de Westergreen at a marca zero; - Colocar a pipeta no suporte adequado, de modo que permanea na posio vertical, e marcar o tempo; - Proceder a leitura em milmetros aps a 1 hora.

Valores Normais 3 a 5 mm/1 hora Homens Mulheres Crianas 4 a 7 mm/1 hora 4 a 7 mm/1 hora

144 2. Determinao do Hematcrito (Ht) ou Volume Globular (VG): Fundamento: O Hematcrito definido como o volume ocupado pelos eritrcitos em um dado volume de sangue e usualmente expresso em volume (mL) de eritrcitos por mL de sangue ou volume (Litro) de eritrcitos por litro de sangue. Material: - Tubo de Wintrobe; - Seringa munida de agulha longa; - Frascos para colheita de sangue, contendo anticoagulante. Tcnica: - Colher o sangue cuidadosamente para evitar hemlise; - Verter para o vidro contendo o anticoagulante; - Homogeneizar o sangue e encher o tubo de Wintrobe com seringa munida de agulha longa; - Centrifugar a 3000 rpm em uma centrfuga clnica de 15 cm de raio durante 30 minutos (1500 x g); - Proceder a leitura do Hematcrito, desprezando a parte correspondente aos glbulos brancos e plaquetas. Nota: O valor do Hematcrito depende do nmero, da forma e do tamanho das hemcias circulantes. Pode-se empregar tambm o Microhematcrito, que fornece resultados mais rpidos (de 3 a 4 minutos) e utiliza menor quantidade de sangue obtido por puno digital. Tem maiores aplicaes em Pediatria e Medicina de Urgncia.

Valores Normais Homens 40 a 54% ou 0,40 a 0,54 L/L Mulheres 36 a 47% ou 0,36 a 0,47 L/L Obs: Os recm-nascidos tm valores mais elevados que se reduzem na , 1 infncia at atingirem os valores da idade adulta.

Interpretao: - Valores elevados so encontrados na Poliglobulia genuna (Policitemia Vera), onde h um aumento patolgico do nmero de eritrcitos, e nas Poliglobulias Falsas, onde h hemoconcentrao causada por diminuio do volume plasmtico por perdas aquosas importantes (desidrataes, choque e queimaduras). - Valores diminudos so encontrados nas anemias, que tm diminuio do nmero de eritrcitos, e em condies associadas a Hidremia (descompensao cardaca, gravidez e administrao excessiva de fluidos).

145 3. Dosagem da Hemoglobina no sangue integral pelo Mtodo da Cianometemoglobina [Van Kampen, E.J. and Zijlstra, W.G. Clin Clin Acta 6:538 (1961)]: Fundamento: Baseia-se na oxidao da Hemoglobina Metemoglobina pelo Ferricianeto de Potssio e subsequente reao com o Cianeto de Potssio originando Cianometemoglobina, derivado estvel que tem o mximo de absoro em 546 nm (filtro verde). Material: - Soluo de Drabkin; - Padro de Cianometemoglobina correspondendo a concentraes de 14 g/dL de Hb; - Pipeta automtica de 20 L; - Espectrofotmetro ou Fotocolormetro; - Sangue colhido com anticoagulante. Tcnica: - Pipetar 5 mL de Soluo de Drabkin para um tubo de ensaio; - Pipetar 20 L de sangue para o tubo acima, tendo o cuidado de lavar a pipeta 3 vezes com a soluo; - Homogeneizar bem e aguardar 3 minutos; - Medir a extino da amostra em 546 nm (filtro verde) contra branco (H 2O destilada).

Clculos: A concentrao de Hemoglobina (Hb) pode ser obtida: - Atravs da curva padro de Cianometemoglobina; - Atravs da tabela que acompanha a tcnica; - Utilizando um fator. Valores Normais Homens Mulheres

14,0 a 18,0 g/100mL ou g/dL 12,0 a 16,0 g/100mL ou g/dL

4. Contagem de Eritrcitos: Fundamento: A enumerao dos eritrcitos pode ser feita pelo mtodo clssico - Contagem em Cmara por Mtodo Opaciomtrico (fotoeltrico) - ou por mtodo eletrnico. Tcnica: Pipetar o sangue e diluir de 1:200 com soluo salina tamponada. O sangue diludo colocado na cmara e contado com o auxlio do microscpio.

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Valores Normais Homens Mulheres

4,5 a 6,3 x 1012/Litro 4,2 a 5,5 x 1012/Litro

5. ndices Hematolgicos: Os valores de contagem de eritrcitos (Hm), concentrao de Hemoglobina (Hb) e Hematcrito (Ht) podem ser usados para a obteno dos ndices Hematolgicos que definem o tamanho e o contedo de Hemoglobina dos eritrcitos.

a) Volume Corpuscular Mdio: Indica o volume de um eritrcito mdio de uma dada amostra de sangue em fentolitros (fL) 10-15 Litro. em fl ou 3 = 83 x 10-15L = 83

VCM =

Ht (L/L) Hm x 1012/L

Ex: fL

Ht = 45% = 0,45 L/L Hm = 5,4 milhes/mm3 = 5,4 x 1012/L Valores Normais Normoctico Macroctico Microctico

VCM =

0,45

5,4 x 1012

Entre 83 e 96 Fl >96 fL <83 fL

b) Hemoglobina Corpuscular Mdia: Indica o peso de Hemoglobina em um eritrcito mdio de uma dada amostra de sangue em picograma (pg) 10-12 g. HCM = Hb (g/L) Hm x 1012/L em pg = 30 x 10-12 g =

Ex: Hb = 15 g/dL = 150 g/L 30 pg Hm = 5,0 milhes/mm3 = 5 x 1012/L

HCM =

150 5 x 1012

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Valor Normal Entre 28 e 32 pg

c) Concentrao de Hemoglobina Corpuscular Mdia: Indica a concentrao de Hemoglobina na mdia de eritrcitos, isto , a relao entre o peso de Hemoglobina para o volume de eritrcitos que a contm em grama/decilitros (g/dL).

CHCM =

Hb (g/dL) Ht (dL/dL)

em g/dL ou g%

Ex:

Hb = 15 g/dL Ht = 0,45 dL/dL

CHCM =

15 0,45

= 33,33 g/dL

Valores Normais Normocrmica Hipocrmica Hipercrmica

Entre 32 e 36 g/dL <32 g/dL >32 g/dL

6. Exerccio: Determinar os ndices Hematolgicos e classificar morfologicamente o tipo de anemia dos pacientes abaixo segundo seus eritrogramas. Paciente A B C D E Ht (%) 40 40 32 25 25 Hb (g/dL) 13,5 11,5 10,5 7,5 5,0 Hm x 1012/L 4,5 4,5 4,5 2,2 2,2 VCM (fl) HCM (pg) CHCM (g/dL) Tipo de Anemia

148 Determinao do Tipo Sangneo 1. Classificao pelo sistema AB0: A tipagem AB0 deve ser feita pelo mtodo chamado Classificao direta, que diz respeito pesquisa de antgenos AB0 nas hemcias. Tcnica de Classificao Direta em Lmina: 1) Marcar lminas de microscpio com anti-A, anti-B e anti-AB. 2) Colocar uma gota de soro anti-A na lmina marcada anti-A, uma de soro anti-B na lmina marcada anti-B e uma de soro anti-AB na lmina marcada anti-AB. 3) Para cada gota de anti-soro, colocar pequena quantidade de sangue total (cerca de metade da quantidade do soro). 4) Misturar as clulas e o anti-soro com palito de madeira de modo circular, cobrindo uma rea de aproximadamente 1,5 a 2,0 cm de dimetro. 5) Inclinar a lmina com movimentos circulares e suaves. Observe o aparecimento de AGLUTINAO. 6) O tempo mximo para se observar a lmina deve ser de 2 minutos. Obs: O teste deve ser realizado temperatura ambiente e nunca em placa aquecida. 2. Classificao Rh (D): A classificao de antgeno Rh (D) feita testando-se hemcias com soro anti-Rh (D). Rotineiramente utiliza-se o soro Rh (D) bloqueador, tambm chamado de soro de tcnica em lmina. Em situaes especiais pode-se utilizar o soro anti-Rh ou anti-D salino. Tcnica de Classificao Direta: 1) Marcar uma lmina com anti-Rh. 2) Colocar uma gota de soro Anti-Rh (D) na lmina marcada anti-Rh. 3) Adicionar uma pequena quantidade de sangue numa proporo de aproximadamente metade da quantidade de anti-soro. 4) Misturar as clulas e o anti-soro com um palito de madeira com movimentos circulares e suaves. 5) Observar o aparecimento de AGLUTINAO. O tempo mximo para observao de 2 minutos.