Produo de Invertase de Alternaria sp.

por Fermentao Semi-Slida

Naiane Sangaletti1, Tatiane Luiza Cadorin1, Diogo Henrique Hendges1, Dayane Fortes Dartora1, Sideney Becker Onofre1, Severino Matias de Alencar1
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Centro Federal de Educao Tecnolgica do Paran (CEFET PR)- Laboratrio de Qualidade Agroindustrial Via do Conhecimento Km 01 - Caixa Postal 571 - CEP: 85501-970 Pato Branco- PR E-mail: smalencar@pb.cefetpr.br

RESUMO A invertase uma enzima hidrolase, tambm denominada de -frutofuranosidase. Dentre as vrias aplicaes para a invertase se destaca a fabricao do acar invertido que tem grande importncia industrial por ter poder adoante superior ao da sacarose. Neste trabalho foi isolada uma linhagem de Alternaria sp, de sementes de soja, produtora de invertase extracelular. A produo de invertase foi feita pela inoculao do fungo em meio de cultura semi-slido a base de farelo de trigo umedecido, a 30C. O microrganismo acumulou grande quantidade de invertase, que foi produzida constitutivamente, sem a necessidade de indutor. INTRODUO Em funo da facilidade de produo muitas enzimas so obtidas a partir de fermentaes microbianas, sendo um dos campos da biotecnologia que mais tem avanado. Neste contexto encontram-se as invertases que so enzimas potencialmente teis na produo de xaropes com alto teor de frutose e glicose a partir da sacarose como matria-prima (Rubio et al., 2002). Segundo Chen e Liu (1996), a invertase obtida de plantas e fungos possuem atividades enzimticas muito similares. Estas enzimas tm sido bastante estudadas, especialmente as das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schwanniomyces occidentalis (Fontana et al., 1992; Costaglioli et al., 1997) e dos fungos Aureobasidium sp. ATCC 20524 (Hayashi et al., 1992a) e Aspergillus niger (Romero-Gmez et al., 2000). Entretanto, poucos estudos foram realizados at o momento com fungos do gnero Alternaria sp para a produo de invertase. O objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar fungos de crescimento rpido produtores de invertase em meio semi-slido, bem como a caracterizao do extrato enzimtico bruto. MATERIAL E MTODOS Microrganismo: O microrganismo utilizado foi uma linhagem Alternaria sp., selecionada dentre os vrios fungos produtores de invertase que foram isolados de sementes de soja. Produo de invertase por fermentao semi-slida: O fungo foi cultivado em frascos erlenmeyer de 250 mL, contendo farelo de trigo umedecido pela adio de 30 mL de gua para cada 100 g de farelo, e incubados a 30C, por 4 dias. Aps o crescimento, foi adicionada

gua destilada e o meio triturado com basto de vidro para liberao da enzima obtendo-se, aps filtrao, o extrato enzimtico (enzima bruta). Determinao da atividade enzimtica: A atividade enzimtica foi determinada pela mistura de 1,0 mL da enzima diluda 1:5 e 4,0 mL de sacarose 10 mg/mL em tampo citrato (pH 5,0), a 50C, por 20 minutos. Aps este perodo foi determinado o produto da hidrlise pelo mtodo de Somogy Nelson (1944), usando glicose como padro. Uma unidade atividade (U) foi definida como a quantidade de extrato enzimtico que catalisa a produo de 1 g de acar redutor como glicose por minuto. Determinao das caractersticas bioqumicas da -frutofuranosidase Determinao do pH timo de atividade da enzima bruta: A mistura de 1,0 mL da soluo de enzima (20 U/mL) e 4,0 mL de sacarose (10 mg/mL) em diferentes tampes, foram incubadas a 40 C, por 20 minutos. Em seguida, os tubos contendo a mistura de reao foram colados em banho de gelo para a paralisao da reao. A atividade enzimtica foi determinada conforme descrito anteriormente. Foram utilizados as solues tampo: citrato pH 3,0, 4,0 e 5,0; fosfato pH 6,0, 7,0 e 8,0 e borato pH 9,0. Determinao da temperatura tima de atividade da enzima bruta: A mistura de 1,0 mL da soluo de enzima (20 U/mL) e 4,0 mL de sacarose (10 mg/mL) em tampo citrato pH 5,0, foi incubada nas temperaturas de 20, 30, 40, 50, 60 e 70 C, por 20 minutos. Em seguida, os tubos contendo a mistura de reao foram colados em bando de gelo para a paralisao da reao. A atividade enzimtica foi determinada conforme descrito anteriormente. Efeito do pH na estabilidade da enzima bruta: A mistura de reao contendo 1,0 mL da soluo da enzima (20 U/mL) e 1,0 mL de solues de tampes de diferentes pH foram incubadas a 50 C, durante 120 minutos. Aps a incubao o pH foi ajustado com tampo para pH 5,0 e a atividade residual determinada como descrito anteriormente. Efeito do tratamento trmico na estabilidade da enzima bruta: Para o estudo do efeito da temperatura de estabilidade da enzima, 1,0 mL da soluo da enzima (20 U/mL) foi submetida a tratamento trmico a 20, 40, 50 e 80 C durante 30, 60, 90 e 120 minutos. Aps o tratamento trmico, os tubos de ensaio foram resfriados e a atividade residual determinada como descrito anteriormente. Determinao do Km e Vmx: A Constante de Michaelis-Menten e a velocidade mxima da invertase bruta foram determinadas utilizando-se sacarose como substrato na faixa de 0,1 a 1,0 mg/mL em pH 5,0, a 50 C. A atividade da enzima foi determinada como descrito anteriormente. Os valores de Km e Vmx foram determinados de acordo com o mtodo grfico de Lineweaver-Burk. RESULTADOS E DISCUSSO Dos 6 microrganismos isolados apenas o fungo do gnero Alternaria sp. mostrou uma boa produo da enzima invertase. O microrganismo selecionado cresceu bem no substrato semislido e produziu a enzima invertase a qual apresentou atividade, aps o quarto dia de fermentao, de 20 U/mL. O fungo sintetizou a enzima sem a necessidade de qualquer indutor, demonstrando que uma enzima constitutiva.

O efeito do pH na atividade do extrato enzimtico bruto pode ser visualizado na Figura 1. Para os valores de pH de 3,0 e 9,0 no se detectou nenhuma atividade enzimtica no extrato enzimtico de Alternaria sp. O pH em que o extrato apresentou a maior atividade foi 5,0. Este resultado coincide com o pH timo de enzimas isoladas de cogumelos e outros fungos (Ranwala et al., 1991 e Rubio et al., 2002).
100 80 60 40 20 0 3 4 5 6 pH 7 8 9

Figura 1: Efeito do pH na atividade enzimtica do extrato enzimtico bruto de Alternaria sp, com substrato sacarose 10 mg/mL, incubado por 20 minutos a 40 C. A temperatura de incubao em que o extrato enzimtico apresentou melhor atividade para as condies testadas foi de 50 C (Figura 2).
100 80 60 40 20 0 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C)

Figura 1: Efeito da temperatura na atividade enzimtica do extrato enzimtico bruto de Alternaria sp, com substrato sacarose (10 mg/mL), incubado por 20 minutos, em pH 5,0. A temperatura tima de atividade para as invertases varia bastante, desde 25 C (Edelman e Jefford, 1968) at 30 C (Vandenende e Vanlaere, 1995) para invertases de alcachofra, e de 37 C (Kaur et al., 1992) a 45 C (Gupta et al., 1991) para invertases de chicria.

Atividade realtiva (%)

Atividade realtiva (%)

A enzima apresentou-se estvel aps 120 minutos a 20 C, porm quando incubada a 40 C por 60 e 120 minutos reteve 79 e 73%, respectivamente da atividade inicial. A invertase incubada a 50 C reteve 62, 57 e 50% aps 60, 90 e 120 minutos de tratamento, enquanto que a incubao a 80 C inativou rapidamente a enzima (figura 3). A invertase de Rhodotorula glutinis apresentou meia vida de 3 minutos quando incubada a 60 C (De la Vega et al., 1991). Em um outro trabalho realizado com invertases de plen, Sing e Knox (1984) demonstraram que estas enzimas so termoestveis a temperaturas abaixo de 40 C, entretanto perdem 60% de sua atividade a 50 C.
100 Atividade relativa (%) 80 60 40 80 C 20 0 0 30 60 Tempo (min) 90 120 20 C 40 C 50 C

Figura 3: Termoestabilidade da enzima invertase bruta de Alternaria sp. A invertase de Alternaria sp. apresentou estabilidade mxima em pH 6,0 aps 3 horas de tratamento a 50 C (figura 4). Em pH 5,0 a enzima manteve 81% de sua atividade. Em pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0 a enzima no possui estabilidade, perdendo totalmente a sua atividade. Rubio et al. (2002) verificaram que a invertase de Rhodotorula glutinis apresentou 48% da atividade relativa aps 30 minutos a pH 3,0, entretanto a pH 8,0, 93% de sua atividade relativa foi perdida.
120 Atividade relativ (%) 100 80 60 40 20 0 3 4 5 6 pH 7 8 9

Figura 4: pH de estabilidade da invertase bruta de Alternaria sp. aps 3 horas de tratamento a 50 C.

A cintica da invertase pode ser acompanhada na figura 5. A invertase de Alternaria sp. seguiu a cintica de Michaelis-Menten, com um Km de 0,1924mM (0,00019M) e Vmx de 132 g/min/mL. Estes valores foram muito diferentes dos obtidos para a invertase purificada de A. japonicus, 0,21 M (Hayashi et al., 1992b), S. occidentalis, 0,020 M (Klein et al., 1989) e A. niger, 0,060 M (Rubio e Maldonado, 1995).
0,0200 1/Atividade (U/mL)

0,0160

0,0120 y = 0,0005x + 0,0076 R2 = 0,9846

0,0080

0,0040

-20

-1/Km -10

0,0000 0 10 20 1/Concentrao de sacarose (mg/mL) 30

Figura 5: Determinao das constantes de Km e Vmx da invertase bruta de Alternaria sp. de acordo com o grfico de Lineweaver-Burk. CONCLUSES A invertase de Alternaria sp. apresentou atividade tima em pH 5,0 e a 50 C, e estabilidade na faixa de pH 5,0 a 6,0 e em temperaturas inferiores a 40 C. O Km da invertase produzida de Alternaria sp. (0,1924 mM) foi menor do que o Km de enzimas invertase produzidas por leveduras e fungos relatados na literatura. O farelo de trigo demonstrou ser uma boa fonte, e de baixo custo, para a produo de invertase por Alternaria sp. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Hayashi, S.; Matsuzaki, K.; Takasaki, Y.; Ueno, H. e Imada, K. (1992b), Purification and properties of betafructofuranosidase from Aspergillus japonicus. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 8, n. 3, p.276-279. Hayashi, S.; Nonoguchi, M.; Shimokawa, Y.; Takasaki, Y. e Imada, K. (1992a), Effect of deglycosylation on the properties of -fructofuranosidase P-1 from Aureobasidium sp. ATCC 20524. Journal of Industrial Microbiology, v.9, n. 3-4, p.251-255. Kaur, N.; Kaur, M.; Gupta, A. K. e Singh, R. (1992), Proprierties of -fructosidases (invertases and inulinases) of Fusarium oxysporim grown on an aqueous extract of Chicorium intybus roots. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 53, n. 3, p. 279-284. Klein, R.; Deibel, M.; Sarcich, J.; Zurcher, H.; Reardon, I. e Heinrikson, R. (1989), Purification and characterization of invertase from a novel industrial yeast, Schwanniomyces occidentalis. Biochemical Journal, v. 172, p. 1522. Nelson, N. A. (1944), A photometric adaptation of the Somogy method for determination of glucose. Journal of Biological Chemistry, v. 153, p.379-380. Ranwala, A. P.; Iwanami, S. S. e Masuda, H. (1991), Acid and neutral invertases in the mesocarp of developing muskmelon (Cucumis melo L. cv Prince) fruit. Plant Physiology, v. 96, n. 3, p. 881-886. Romero-Gmez, S.; Augur, C. e Vinegra-Gonzlez, G. (2000), Invertase production by Aspergillus niger in submerged and solid-state fementation. Biotechnology Letter, v. 22, n. 15, p. 1255-1258. Rubio, M. C. e Maldonado, M. C. (1995), Purification and characterization of invertase from Aspergillus niger. Current Microbiology, v. 31, n. 2, p. 80-83. Rubio, M. C.; Runco, R. e Navarro, A. R. (2002), Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis. Phytochemistry, v. 61, n. 6, 605-609. Singh, M. B. e Knox, R. B. (1984), Invertases of Lilium pollen - characterization and activity during in vitro germination. Plant Physiology, v. 74, n. 3, p. 510-515. Vandenende, W. e Vanlaere, A. (1995), Purification and properties of a neutral invertase from roots of Cichorium intybus. Physiologia Plantarum, v. 93, n. 2, p. 241-248.