Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepcin
Reactivo Cromognico
Hay 2 tipos de compuestos: 1.- Sustancias coloreadas (absorbente) ej: KMnO4 (e altos) 2.- Sustancias incoloras (no absorbente) ej: Fe 3+ Para sustancias que no absorben en el visible se puede hacer reaccin para que absorban:
Analito
reactivo cromognico
compuesto coloreado
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Estable y soluble en solucin Desarrollar rpidamente el color Reaccionar estequiomtrica con el analito No absorber a la longitud de onda donde se va a determinar el complejo Ser selectivo Ser puro y libre de interferentes. PUEDEN SER
Inorgnicos: Poco sensibles, poco selectivos y afectados por interferentes. Ej: SCN- para Fe3+, NH3 para Cu2+. Orgnicos: Colores selectivos, bastante reproducibles, sin interferencia y sensibles. Ej. 1,10-fenantrolina, quinalizarina, batocuprona.
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CARACTERSTICAS QUE DEBEN TENER LAS SUSTANCIAS COLOREADAS Y LOS COMPUESTOS COLOREADOS FORMADOS MEDIANTE UNA REACCIN CON UN REACTIVO CROMOGNICO
Estables en funcin del tiempo Color intenso Cumplir con la LLB Ser soluble Tener composicin perfectamente definida No deben ser afectados por cambios de pH, temperatura, luz y/o interferentes
4 Estudiar efecto del medio (pH): La formacin del complejo, como muchas reacciones qumicas, depende del pH. Su ajuste puede eliminar ciertas reacciones interferente
5 Estudiar de concentracin de reactivo cromognico: Es necesario determinar la concentracin ptima de reactivo cromognico (R.C.) para que sea suficiente (o en exceso) para reaccionar con el analito a determinar
6 Estudiar de efecto de presencia de interferentes: Hay analitos que pueden reaccionar con el R.C. disminuyendo la concentracin disponible de ste para su reaccin con el analito a determinar, razn por la cual hay que determinar su efecto.
APLICACIONES CUANTITATIVAS: 1 VERIFICACIN DE LA LLB: Construccin de curva de calibracin A vs C 2 DETERMINACIN DE CONCENTRACIN DE UNA MUESTRA PROBLEMA ej. Por Interpolacin en curva de calibracin
Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepcin
1.- ESTUDIAR CARACTERSTICAS DE ABSORCIN Y ESTABILIDAD DE UN COMPLEJO COLOREADO Determinacin de l de mxima absorcin Influencia del tiempo Influencia del pH Influencia de cantidad de reactivo cromognico Determinacin de la frmula del complejo Influencia de interferentes
2.- APLICACIONES CUANTITATIVAS Verificar cumplimiento de LLB (curva de calibracin) Determinacin de concentracin de M.P.
lT
l (nm)
Nota: Tambin se puede obtener informacin bibliogrfica, en cuyo caso es necesario verificar lT barriendo con un espectrofotmetro, la zona donde se encuentra el mx. En caso de contar slo con un fotmetro de filtro, se deben evaluar los filtro que tengan una lN cercana a la informada en bibliografa para el compuesto en estudio
Datos Bibliogrficos
Tiempo (min)
APLICACIONES CUANTITATIVAS
1 VERIFICACIN DE LA LLB: Construccin de curva de calibracin A vs C 2 PREPARACIN DEL COMPLEJO COLOREADO CON MUESTRA PROBLEMA: Interpolacin en C.de C. y determinacin de su concentracin.
EN EL LABORATORIO
Determinacin de Fe 3+ mediante la formacin de un complejo coloreado con el reactivo cromognico 1,10-fenantrolina en medio acuoso.
1.- Alcuota de Fe3+ 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina (NH2OH en HCl al 10% p/v) 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,3 % p/v 5.- Enrase con agua destilada a 50 ml
Nota: EL ORDEN DE REACTIVOS ES MUY IMPORTANTE
Intrumentos -Espectrofotmetro Spectronic 20 con fototubo azul -Espectrofotmetro Shimadzu UV 120-02 fotoelemento de silicio -Espectrofotmetro UV-mini -Espectrofotmetro Thermo Spectronic Helios Delta* -Fotocolormetros (Merck y Jenwey)
-Preparar una solucin de Fe3+ de absorbancia aproximada 0,8 -Considerar los valores tericos
e508 nm= 11,1 *103cm2/mmol A=ebC si b=1 cm C=[0,8/1cm*11,1 *103cm2/mmol] C= 7,20*10-5 M Concentracin patrn de Fe3+ : 4,6*10-4 M y matraces aforados de 25 ml C1V1=C2V2 7,20*10-5 M*25 ml/4,6*10-4 M= V2 V2= 3,91 ml 4 ml
Soluciones Iniciales
Blanco
1.- nada 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,15 % p/v
(3,3 ml de patrn)
2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,15 % p/v
Verifique la lT en las cercanas del mximo de absorcin obtenido en literatura (600-400nm). Recuerde que es necesario ajustar el 100% de transmisin cada vez que cambie la longitud de onda si trabaja con espctrofotmetro monohaz. - Calcule absortividad molar prctica en el mximo de absorcin.
Imagine que segn el espectrograma que Ud. realizo obtuvo un coeficiente de absortividad molar de 11800 cm2/mmol.
Efecto del pH Las soluciones se encuentran preparadas a diferentes pH: 1,5 - 4,0 5,0 6,0 9,0 - 12 Solo es necesario medir el % de transmisin de dichas soluciones. Construya un grfico de absorbancia en funcin del pH. DISCUTA Efecto de Interferentes Las soluciones se encuentran preparadas con diferentes interferentes
Catin Fe 3+ Cu 2+ Ni 2+ Co 2+ DISCUTA
Facultad de Farmacia. Departamento de Anlisis Instrumental
Cantidad de reactivo cromognico. Con el coeficiente de absortividad molar obtenido desde el espectrograma prepare un solucin de absorbancia aproximada 0,434 . (2.0 ml de patrn).
1.- Alcuota de Fe3+ (2.0 ml de patrn) 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- X ml de ortofenantrolina
1 2 3 4 5 6 7
0 2 4 6 8 1 2
1.- Graficar Absorbancia en funcin de la cantidad de reactivo cromognico 2.- Traspase la concentracin P/V a concentracin molar y grficamente determine la cantidad de reactivo cromognico necesaria para formar el complejo. (PM ortofenantrolina =182,2 g/mol)
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Absorbancia
0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2,8 3,2
Moles/LRC=0.000124
1.24e-4/3,68e-5=3,3=3
Determinacin cuantitativa
Construya una curva de calibracin entre 0,2 y 1.2 de absorbancia aproximada, considerando el coeficiente de absortividad prctica y mida a la longitud de onda de mxima absorcin que determin en el espectrograma. Recordando el procedimiento inicial 1.- Alcuota de Fe3+ (X ml de patrn) 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina 0,3 % p/v Determine la concentracin de su muestra problema Informe el resultado por: Interpolacin en la curva de calibracin Mtodo del factor Mtodo absoluto
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Procedimiento
Considerando los datos TEORICOS
1.-Prepare el blanco y la solucin del espectrograma 2.-Realice el espectrograma segn la metodologa conocida 3.-Estudio de estabilidad en el tiempo 4.-Efecto del pH 5.- Efecto de Interferentes 6.- Cantidad de reactivo cromognico 7.- Anlisis Cuantitativo 5.-Informar Concentracin por: Interpolacin en la Curva de calibracin Mtodo del factor Mtodo Absoluto
PROBLEMA
Emplee un mtodo absorciomtrico para determinar hierro en soluciones provenientes del tratamiento de muestras de sangre animal. Estudie la posibilidad de emplear cido sulfosaliclico en medio alcalino como reactivo cromognico. La muestra fue obtenida a partir de 0,3060 g de sangre animal (contenido aproximado 2400 mg/kg) liofilizado y despus de un tratamiento adecuado fue disuelta y llevada a un volumen de 25 ml. Posteriormente 20 ml de la solucin anterior fueron llevado a 50 ml en matraz aforado. Por ltimo con 5 ml de esta ltima solucin prepar el complejo coloreado aforando a 50 ml. Su muestra problema corresponde a esta solucin. Exprese su resultado en concentracin molar y en mg de hierro por Kg de muestra.
Datos tericos
e, a y lexperimental
e= 5958 cm2/mmol a= 106.7 cm2/mg
lexperimental= 422 nm
Con los valores obtenidos anteriormente Ud. decide construir una curva de calibracin, de la cual obtuvo los siguientes valores:
C (M) 0 3,30E-05 6,60E-05 9,90E-05 1,32E-04 1,65E-04 A 0 0,207
m 6272 6090
0,412
6121
0,614
A
0,4 0,2 0 0 0,00005 0,0001 C (M) 0,00015 0,0002
6090
0,815
2575
0,9
1 0,8 0,6
A
R2 = 0,9999
0,00015
0,0002
CMP
Determinacin cuantitiativa 5 mL de M.P 2 ml de cido sulfosaliclico Gotas de NH4OH Enrasadas con buffer pH= 8,2 a 50 ml %T=37.5 A=0.426
Mp % T = 37.5
A= 0.426
La muestra fue obtenida a partir de 0,3060 g de sangre animal (contenido permitido 2400 mg/kg) liofilizado y despus de un tratamiento adecuado fue disuelta y llevada a un volumen de 25 ml. Posteriormente 20 ml de la solucin anterior fueron llevado a 50 ml en matraz aforado. Por ltimo con 5 ml de esta ltima solucin prepar el complejo coloreado aforando a 50 ml. Su muestra problema corresponde a esta solucin. Exprese su resultado en concentracin molar y en mg de hierro por Kg de muestra.
0,423/6195 (cm3/mmol)= 6,87 *10-5 M 6.87*10-5 *50/5 *50/20 = 1.71 *10-3M 1.71 *10-3M *55.85=0.0959 g/L