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APLICACIONES ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION EN LA REGIN VISIBLE

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepcin

Reactivo Cromognico

Hay 2 tipos de compuestos: 1.- Sustancias coloreadas (absorbente) ej: KMnO4 (e altos) 2.- Sustancias incoloras (no absorbente) ej: Fe 3+ Para sustancias que no absorben en el visible se puede hacer reaccin para que absorban:

Analito

reactivo cromognico

compuesto coloreado

Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepcin

REQUISITOS DE LOS REACTIVOS UTILIZADOS COMO REACTIVOS CROMOGNICOS

Estable y soluble en solucin Desarrollar rpidamente el color Reaccionar estequiomtrica con el analito No absorber a la longitud de onda donde se va a determinar el complejo Ser selectivo Ser puro y libre de interferentes. PUEDEN SER
Inorgnicos: Poco sensibles, poco selectivos y afectados por interferentes. Ej: SCN- para Fe3+, NH3 para Cu2+. Orgnicos: Colores selectivos, bastante reproducibles, sin interferencia y sensibles. Ej. 1,10-fenantrolina, quinalizarina, batocuprona.
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CARACTERSTICAS QUE DEBEN TENER LAS SUSTANCIAS COLOREADAS Y LOS COMPUESTOS COLOREADOS FORMADOS MEDIANTE UNA REACCIN CON UN REACTIVO CROMOGNICO

Estables en funcin del tiempo Color intenso Cumplir con la LLB Ser soluble Tener composicin perfectamente definida No deben ser afectados por cambios de pH, temperatura, luz y/o interferentes

Facultad de Farmacia. Departamento de Anlisis Instrumental

ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


1 Formar el complejo coloreado utilizando informacin bibliogrfica 2 Confeccionar un espectrograma para determinar l de trabajo 3 Estudiar efecto del tiempo: La formacin del complejo puede ser lenta o el complejo puede descomponerse en el tiempo

4 Estudiar efecto del medio (pH): La formacin del complejo, como muchas reacciones qumicas, depende del pH. Su ajuste puede eliminar ciertas reacciones interferente
5 Estudiar de concentracin de reactivo cromognico: Es necesario determinar la concentracin ptima de reactivo cromognico (R.C.) para que sea suficiente (o en exceso) para reaccionar con el analito a determinar

6 Estudiar de efecto de presencia de interferentes: Hay analitos que pueden reaccionar con el R.C. disminuyendo la concentracin disponible de ste para su reaccin con el analito a determinar, razn por la cual hay que determinar su efecto.
APLICACIONES CUANTITATIVAS: 1 VERIFICACIN DE LA LLB: Construccin de curva de calibracin A vs C 2 DETERMINACIN DE CONCENTRACIN DE UNA MUESTRA PROBLEMA ej. Por Interpolacin en curva de calibracin
Dra. C. Mardones / Dr. D. von Baer, Depto. A. Instrumental. Fac. Farmacia, U.de Concepcin

SEMINARIO ABSORCIOMETRA II UTILIZACIN DE UN REACTIVO CROMOGNICO


OBJETIVOS

1.- ESTUDIAR CARACTERSTICAS DE ABSORCIN Y ESTABILIDAD DE UN COMPLEJO COLOREADO Determinacin de l de mxima absorcin Influencia del tiempo Influencia del pH Influencia de cantidad de reactivo cromognico Determinacin de la frmula del complejo Influencia de interferentes
2.- APLICACIONES CUANTITATIVAS Verificar cumplimiento de LLB (curva de calibracin) Determinacin de concentracin de M.P.

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ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


1 Formar el complejo coloreado utilizando informacin bibliogrfica

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ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


1 Formar el complejo coloreado utilizando informacin bibliogrfica

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ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


2 Confeccionar un espectrograma para determinar l de trabajo A

lT

l (nm)

Nota: Tambin se puede obtener informacin bibliogrfica, en cuyo caso es necesario verificar lT barriendo con un espectrofotmetro, la zona donde se encuentra el mx. En caso de contar slo con un fotmetro de filtro, se deben evaluar los filtro que tengan una lN cercana a la informada en bibliografa para el compuesto en estudio

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Datos Bibliogrficos

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ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


3 Estudiar efecto del tiempo: La formacin del complejo puede ser lenta o el complejo puede descomponerse en el tiempo A (lT) Formacin rpida y estable Se descompone despus de formado Necesita un tiempo para formacin

Tiempo (min)

Objetivo: Determinar cual es el momento ptimo para hacer la medida absorciomtrica

ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


4 Estudiar efecto del medio (pH): La formacin del complejo, como muchas reacciones qumicas, depende del pH. Su ajuste puede eliminar ciertas reacciones interferente A Estable en todo el rango de pH (lT)

Se puede trabajar en un rango adecuado Es necesario tamponar a un pH determinado


pH

Objetivo: Establecer el pH o rango de pH ptimos para hacer la medida absorciomtrica

ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


5 Estudiar de concentracin de reactivo cromognico: Es necesario determinar la concentracin ptima de reactivo cromognico (R.C.) para que sea suficiente (o en exceso) para reaccionar con el analito a determinar A Concentracin de analito debe ser constante. (lT) Se va aumentando la concentracin de R.C

Concentracin ptima de R.C.=3 X


X Vol. o [ ] R.C.

ESTUDIO DE UN SISTEMA COLOREADO


6 Estudiar de efecto de presencia de interferentes: Hay analitos que pueden reaccionar con el R.C. disminuyendo la concentracin disponible de ste para su reaccin con el analito a determinar, razn por la cual hay que determinar su efecto.

APLICACIONES CUANTITATIVAS

1 VERIFICACIN DE LA LLB: Construccin de curva de calibracin A vs C 2 PREPARACIN DEL COMPLEJO COLOREADO CON MUESTRA PROBLEMA: Interpolacin en C.de C. y determinacin de su concentracin.

EN EL LABORATORIO
Determinacin de Fe 3+ mediante la formacin de un complejo coloreado con el reactivo cromognico 1,10-fenantrolina en medio acuoso.

DE BIBLIOGRAFA SE OBTIENE EL PROCEDIMIENTO :

1.- Alcuota de Fe3+ 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina (NH2OH en HCl al 10% p/v) 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,3 % p/v 5.- Enrase con agua destilada a 50 ml
Nota: EL ORDEN DE REACTIVOS ES MUY IMPORTANTE

Intrumentos -Espectrofotmetro Spectronic 20 con fototubo azul -Espectrofotmetro Shimadzu UV 120-02 fotoelemento de silicio -Espectrofotmetro UV-mini -Espectrofotmetro Thermo Spectronic Helios Delta* -Fotocolormetros (Merck y Jenwey)

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Construccin del espectrograma

-Preparar una solucin de Fe3+ de absorbancia aproximada 0,8 -Considerar los valores tericos
e508 nm= 11,1 *103cm2/mmol A=ebC si b=1 cm C=[0,8/1cm*11,1 *103cm2/mmol] C= 7,20*10-5 M Concentracin patrn de Fe3+ : 4,6*10-4 M y matraces aforados de 25 ml C1V1=C2V2 7,20*10-5 M*25 ml/4,6*10-4 M= V2 V2= 3,91 ml 4 ml

Recalcular concentracin con los 4.0 mL tomados

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Soluciones Iniciales
Blanco
1.- nada 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,15 % p/v

Solucin para espectrograma


1.- Alcuota de Fe
3+

(3,3 ml de patrn)

2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina al 0,15 % p/v

Verifique la lT en las cercanas del mximo de absorcin obtenido en literatura (600-400nm). Recuerde que es necesario ajustar el 100% de transmisin cada vez que cambie la longitud de onda si trabaja con espctrofotmetro monohaz. - Calcule absortividad molar prctica en el mximo de absorcin.

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Seminario. Reactivo Cromognico

Imagine que segn el espectrograma que Ud. realizo obtuvo un coeficiente de absortividad molar de 11800 cm2/mmol.

ESTABILIDAD DEL COMPLEJO


Efecto del tiempo Con el coeficiente de absortividad molar obtenido desde el espectrograma prepare una solucin de absorbancia aproximada 0,434. C= [0,434]/[1cm*11800 cm2/mmol]= 4,02 *10-5 M C1V1=C2V2

3.68 *10-5 M*25 ml/4.6*10-4 M= V2


V2= 2.0 ml ojo: recalcular concentracin real preparada si es necesario
No olvidar de agregar los reactivos necesarios para formar el complejo 1.- Mida el % de transmisin de la solucin anterior inmediatamente recin preparada (tiempo=0). 2.- Mida el % de transmisin de la solucin cada 1 minutos durante los primeros 5 minutos y cada 5 los siguientes 30 minutos y cada 30 hasta terminar el laboratorio. 3.- Construya un grfico de absorbancia en funcin del tiempo.
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Seminario. Reactivo Cromognico

Efecto del pH Las soluciones se encuentran preparadas a diferentes pH: 1,5 - 4,0 5,0 6,0 9,0 - 12 Solo es necesario medir el % de transmisin de dichas soluciones. Construya un grfico de absorbancia en funcin del pH. DISCUTA Efecto de Interferentes Las soluciones se encuentran preparadas con diferentes interferentes

Catin Fe 3+ Cu 2+ Ni 2+ Co 2+ DISCUTA
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Concentracin 4,03*10-5 M 30 mg/l 0,1% 0,1 %

Evaluar en trminos cuantitativos el posible efecto interferente de los compuestos

Seminario. Reactivo Cromognico

Cantidad de reactivo cromognico. Con el coeficiente de absortividad molar obtenido desde el espectrograma prepare un solucin de absorbancia aproximada 0,434 . (2.0 ml de patrn).

1.- Alcuota de Fe3+ (2.0 ml de patrn) 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- X ml de ortofenantrolina

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Seminario. Reactivo Cromognico

Cantidad de reactivo cromognico

Considere 7 matraces aforados.


N Matraz Cantidad Ortofenantrolina. mL Concentracin (% P/V)

1 2 3 4 5 6 7

0 2 4 6 8 1 2

0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,15 0,15

1.- Graficar Absorbancia en funcin de la cantidad de reactivo cromognico 2.- Traspase la concentracin P/V a concentracin molar y grficamente determine la cantidad de reactivo cromognico necesaria para formar el complejo. (PM ortofenantrolina =182,2 g/mol)
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Estudio de la Cantidad de Reactivo Cromognico

PM ortofenantrolina =182,2 g/mol C=0,15% = 1.5 g/L = 0,0082 M V final= 25 mL


C RC (ml) 0,15% 0 0.1 0.2 0.4 0.6 1 3 A 0 0.097 0.235 0.42 0.426 0.426 0.428 C (M) 0 0.000032 0.000064 0.000128 0.000192 0.00032 0.00096

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Estudio de la Cantidad de Reactivo Cromognico


PM ortofenantrolina =182,2 g/mol C=0,15% = 1,5 g/L = 0,0082 M *0.38mL/25mL = 1.24*10-4 C Fe= 3,68*10-5 M
1

Absorbancia

0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2,8 3,2

Cantidad reactivo cromognico (ml)

Moles/LRC=0.000124

Moles/LFe=3,68 * 10-5 M Fe(Phen)3

1.24e-4/3,68e-5=3,3=3

Seminario. Reactivo Cromognico

Determinacin cuantitativa
Construya una curva de calibracin entre 0,2 y 1.2 de absorbancia aproximada, considerando el coeficiente de absortividad prctica y mida a la longitud de onda de mxima absorcin que determin en el espectrograma. Recordando el procedimiento inicial 1.- Alcuota de Fe3+ (X ml de patrn) 2.- 1 ml de clorhidrato de hidroxilamina 3.- 5 ml acetato de sodio (CH3COONa) 4.- 2 ml de ortofenantrolina 0,3 % p/v Determine la concentracin de su muestra problema Informe el resultado por: Interpolacin en la curva de calibracin Mtodo del factor Mtodo absoluto
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Procedimiento
Considerando los datos TEORICOS
1.-Prepare el blanco y la solucin del espectrograma 2.-Realice el espectrograma segn la metodologa conocida 3.-Estudio de estabilidad en el tiempo 4.-Efecto del pH 5.- Efecto de Interferentes 6.- Cantidad de reactivo cromognico 7.- Anlisis Cuantitativo 5.-Informar Concentracin por: Interpolacin en la Curva de calibracin Mtodo del factor Mtodo Absoluto

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PROBLEMA
Emplee un mtodo absorciomtrico para determinar hierro en soluciones provenientes del tratamiento de muestras de sangre animal. Estudie la posibilidad de emplear cido sulfosaliclico en medio alcalino como reactivo cromognico. La muestra fue obtenida a partir de 0,3060 g de sangre animal (contenido aproximado 2400 mg/kg) liofilizado y despus de un tratamiento adecuado fue disuelta y llevada a un volumen de 25 ml. Posteriormente 20 ml de la solucin anterior fueron llevado a 50 ml en matraz aforado. Por ltimo con 5 ml de esta ltima solucin prepar el complejo coloreado aforando a 50 ml. Su muestra problema corresponde a esta solucin. Exprese su resultado en concentracin molar y en mg de hierro por Kg de muestra.

e= 5500 cm2/mmol l=420 nm


PREPARACIN DEL COMPLEJO Alicuota de Hierro 2 ml de cido sulfosaliclico Gotas de NH4OH Enrasar con buffer pH= 8,2 a 50 ml

Datos tericos

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Datos tericos: e= 5500 cm2/mmol l=420 nm


Para la construccin del espectrograma se pesaron 0,2201 g de NH4Fe(SO4)2 x 12 H2O (PM=482,2 g/mol), y se llevaron a 100 ml, posteriormente 40 ml de la solucin anterior se llevaron a 100 ml. Por ltimo 4 ml de esta ltima solucin se llevaron a 50 ml en matraz aforado. Con esta solucin se construyo un espectrograma, observndose un mnimo de transmisin de 13,5% a 422 nm y un mximo de transmisin de 86 % a 540 nm. Que puede obtener con estos datos

e, a y lexperimental
e= 5958 cm2/mmol a= 106.7 cm2/mg
lexperimental= 422 nm

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Con los valores obtenidos anteriormente Ud. decide construir una curva de calibracin, de la cual obtuvo los siguientes valores:
C (M) 0 3,30E-05 6,60E-05 9,90E-05 1,32E-04 1,65E-04 A 0 0,207

m 6272 6090

1 0,8 y = 5858,4x 0,6 R2 = 0,9867

0,412

6121
0,614

A
0,4 0,2 0 0 0,00005 0,0001 C (M) 0,00015 0,0002

6090
0,815

2575
0,9

1 0,8 0,6
A

Rango en que se cumple LLB 3.3 *10-5 -1.32 *10-4 M


y = 6194,9x

0,4 0,2 0 0 0,00005 0,0001 C (M)

R2 = 0,9999

0,00015

0,0002

CMP

Determinacin cuantitiativa 5 mL de M.P 2 ml de cido sulfosaliclico Gotas de NH4OH Enrasadas con buffer pH= 8,2 a 50 ml %T=37.5 A=0.426

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Mp % T = 37.5

A= 0.426

La muestra fue obtenida a partir de 0,3060 g de sangre animal (contenido permitido 2400 mg/kg) liofilizado y despus de un tratamiento adecuado fue disuelta y llevada a un volumen de 25 ml. Posteriormente 20 ml de la solucin anterior fueron llevado a 50 ml en matraz aforado. Por ltimo con 5 ml de esta ltima solucin prepar el complejo coloreado aforando a 50 ml. Su muestra problema corresponde a esta solucin. Exprese su resultado en concentracin molar y en mg de hierro por Kg de muestra.

0,423/6195 (cm3/mmol)= 6,87 *10-5 M 6.87*10-5 *50/5 *50/20 = 1.71 *10-3M 1.71 *10-3M *55.85=0.0959 g/L

0.0959g/L*25/1000 = 2.40 *10-3 g


2.40 *10-3 g *100/0.3060=0.78 % de Fe en sangre 2.40 mg *1000g/0.3060= 7843 mg de Fe por Kg de sangre

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