Tomo 5 - El Islote Pancreático en El Desarrollo Y Tratamiento de La Diabetes

El islote pancretico en el desarrollo y tratamiento de la diabetes
COORDINADOR
5 5
Eduard Montanya
EDITORIAL DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
COORDINADOR
Eduard Montanya
MIEMBROS DEL GRUPO DE TRABAJO ISLOTES PANCREATICOS DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.

Dr. Manuel Aguilar Diosdado
Jefe de Servicio, Hospital Puerta del Mar, Cdiz
Dr. ngel Nadal Navajas

Instituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.
Dr. Albert Barber Lluis

Laboratorio de Diabetes y Obesidad Experimentales. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Barcelona
Dra. Anna Novials Sard

Endocrinloga. Directora Fundaci Sard Farriol
Dr. Ivan Quesada Moll

Dr. Francisco Jos Bedoya Bergua

Centro Andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla
Dra. M Jos Redondo Velasco

Clnica Universitaria de Navarra
Dr. Enrique Blzquez Fernndez

Catedrtico y jefe de Servicio departamento de bioqumica y biologa molecular, facultad de Medicina Universidad Complutense.
Dr. Enrique Roche Collado

Profesor Titular de Universidad. Departamento de Biologa Aplicada, rea de Nutricin Universidad Miguel Hernndez. Alicante
Dr. Jess Cancelas Navias

Dpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.
Dra. Petra Snchez Garca Cervign

Hospital Gregorio Maran
Dr. Lus Castao Gonzlez

Hospital de Cruces- Bilbao
Dr. Bernat Soria Escoms

Centro andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa, Universidad Pablo Olavide, Sevilla
Dra. Mara Gasa Amaldich

Dr. Juan R. Tejedo Huamn

Investigacin, CABIMER, Sevilla
Dra. Isabel Valverde Alonso

Consultora, FJD, Departamento de Metabolismo, Nutricin y Hormonas, Madrid
Dr. Fernando Gmez Peralta,

Adjunto Hospital Clnico Universitario de Salamanca
Dr. Ramn Gomis Barber

Hospital Clinic i Provincial. Barcelona
Dra. Mara Luisa Villanueva-Peacarrillo

Dr. Antonino Jara Albarrn

Jefe de Servicio Hospital Gregorio Maran
Dra. Marta Vives-Pi

Servei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona
Dra. Judith Lpez Fernndez

Adjunto Hospital Universitario de Canarias
Dr. Franz Martin Bermudo

Investigacin, CABIMER, Sevilla
Dr. Eduard Montanya Mias

Jefe de Seccin. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Clinicas. Facultad de Medicina Universidad de Barcelona.
SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.
JUNTA DIRECTIVA
PRESIDENTE. Dr. Ramon Gomis de Barbar
Hospital Clnic i Provincial. Barcelona
VICEPRESIDENTE 1. Dr. Lus Castao Gonzlez

Hospital de Cruces. Bilbao
VICEPRESIDENTA 2. Dra. Adela Rovira Loscos

Fundacin Jimnez Daz. Madrid
SECRETARIA. Dra. Lucrecia Herranz de la Morena

Hospital La Paz. Madrid
VICESECRETARIO. Dr. Juan Emilio Feliu Albiana

Institut de Recerca. Hospital Vall dHebron. Barcelona
TESORERO. Dr. Jos Manuel Fernndez-Real Lemos

Hospital Joseph Trueta. Girona
VOCAL 1. Dra. Sara Artola Menndez

Centro de Salud Loranca. Fuenlabrada (Madrid)
VOCAL 2. Dra. Ana Chico Ballesteros

Hospital Cruz Roja Dos de Maig. Barcelona
VOCAL 3. Dr. Alberto Moreno Carazo

Centro Hospitalario de Jan
VOCAL 4. Dr. Joseph Franch Nadal

ABS Raval Sud-ICS Drassanes. Barcelona
VOCAL 5 Dr. Alfonso Lpez Alba

Hospital Universitario de Canarias. Tenerife
NDICE DE AUTORES
Quesada Moll I
Sancho Bmez V
Tudur Lpez E
Valverde Alonso I
Nadal Navajas, A
Villanueva-Peacarrillo ML
Vives-Pi M Lucas Martn A

Servei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona
Montanya Mias E
Planas Bas R
Laboratori dImmunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnostiques (LIRAD). Banc de Sang i Teixits (BST). Fundaci Institut dInvestigaci en Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol
Nacher Garca M
Facultativo Especialista. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge.
Tllez Besol N
Investigador, Institut dInvestigaci Biomdica de Bellvitge (IDIBELL), Servicio de Endocrinologa, Hospital Universitari de Bellvitge.
Roche Collado E
Barber Lluis A
Bedoya Verruga FJ
Tejedo Huamn JR
Gasa Amaldich RM
Cahuana G
Martn Bermudo F
Novials Sard A
Endocrinloga. Directora Fundaci Sard Farriol
Vaca Snchez P
Casas Fontdevila S
Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol
Soria Escoms B
Cancelas Navias A
NDICE DE CAPTULOS
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Introduccin.
Eduard Montanya 92 CAPTULO 6
18 CAPTULO 1
Regulacin por la glucosa de la funcin de las clulas alfa, beta y delta del islote de Langerhans.
Ivan Quesada, Eva Tudur, Angel Nadal 34 CAPTULO 2
Las incretinas en la secrecin de insula

Jess Cancelas, Vernica Sancho, Isabel Valverde, Mara Luisa Villanueva-Pealcarrillo. 108 CAPTULO 7
Autoinmunidad frente a los islotes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1

M Vives-Pi, A Lucas, R. Planas 50 CAPTULO 3
Terapia celular en diabetes: trasplante de islotes

Eduard Montanya, Montserrat Ncher, Noelia Tllez. 124 CAPTULO 8
Glucolipotoxicidad en la clula beta y su relacin con la diabetes tipo 2

Enrique Roche Collado 66 CAPTULO 4
Desarrollo embrionario del pncreas y regeneracin en el pncreas adulto

Albert Barber, Rosa Gasa 140 CAPTULO 9
Lesin y supervivencia de las clulas beta pancreticas

Francisco Bedoya, Juan Tejedo, Gladys Cahuana 78 CAPTULO 5
Celulas Troncales en el tratamiento de la diabetes

Franz Martin, Pilar Vaca, Bernat Soria
Amilina y toxicidad beta pancretica

Anna Novials Sard
Edita: Sociedad Espaola de Diabetes
Diseo, realizacin y produccin:
Orfila, 5. 28010 Madrid 2007 Sociedad Espaola de Diabetes (SED) Don Ramn de la Cruz, 88 28006 Madrid Impresin: Grficas Monterreina Impreso en Espaa- Printed in Spain Depsito Legal: ISBN: 978-84-691-0089-9
Todos los derechos reservados. Prohibido reproducir ninguna parte de esta publicacin, ni transmitirla a ningn medio electrnico, mecnico, fotocopiarlo, en discos, ni de cualquier otra forma, sin la previa autorizacin escrita del copyright. Responsabilidad de productos: el editor no puede garantizar los datos sobre posologa y aplicaciones de los productos indicados en este libro. En cada uno de los casos, el usuario tiene que comprobar su precisin consultando otra literatura farmacutica.
www. sediabetes.org
Introduccin
AUTOR
Eduard Montanya
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Introduccin
Introduccin
La edicin de este nuevo libro de la coleccin de monografas de la Sociedad Espaola de Diabetes es una oportunidad para hacer una breve presentacin del Grupo de Islotes Pancreticos. El Grupo de Islotes est integrado por investigadores cuyas lneas de trabajo estn centradas en el estudio de la biologa celular y molecular del islote pancretico desde perspectivas diversas. A partir del nexo comn que significa el inters por el islote pancretico, el grupo incorpora perfiles profesionales y reas de conocimiento diversas con mdicos, bilogos, bioqumicos o farmacuticos con lneas de investigacin bsicas, preclnicas y clnicas. Los captulos de la monografa tienen una relacin directa con las lneas de trabajo que los miembros del Grupo de Islotes desarrollan y refleja la diversidad y complementariedad de sus lneas de investigacin. En un entorno en el que la interrelacin entre investigadores es fundamental, el Grupo de Islotes ofrece un foro de comunicacin, intercambio y participacin entre profesionales de mbitos distintos que a menudo es difcil encontrar en otras sociedades o grupos de trabajo. La monografa que presentamos pretende ofrecer al lector interesado pero no especializado, una visin actual del papel fundamental del islote pancretico en la etiopatogenia y el tratamientos de la diabetes. El captulo 1 muestra una visin global de la funcin del islote como rgano endocrino en el que la integracin de las respuestas de los distintos tipos celulares del islote conforman su funcin. El papel fundamental de la destruccin autoimmune del islote en el desarrollo de la diabetes tipo 1, cuyos mecanismos se revisan de forma actualizada en el captulo 2, est bien establecido desde hace aos. Por el contrario, la aceptacin del concepto de que la disfuncin y prdida de clulas beta es tambin esencial para la aparicin de la diabetes tipo 2 es ms reciente. En este sentido en el capitulo 3 se discute el papel de la glucotoxicidad en la clula beta en el desarrollo de diabetes tipo 2. Recientemente se ha postulado que aunque con orgenes distintos, los mecanismos de destruccin de las clulas beta del islotes pueden ser comunes en la diabetes tipo 1 y tipo 2, y estos aspectos, junto con los procesos de supervivencia que se ponen en marcha tras la lesin de la clula beta se discuten en el captulo 4. Las controversias acerca del papel de la amilina en la etiopatognesis de la diabetes tipo 2 se analizan en el captulo 5, que incluye los interesantes hallazgos de mutaciones en el gen de la amilina en
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Introduccin
pacientes con diabetes. Las aportaciones de la investigacin en islotes al tratamiento de la diabetes se aprecian en el captulo 6, dedicado al papel de las incretinas en el estmulo de la secrecin de insulina, aspecto de gran actualidad por la reciente aprobacin de los primeros frmacos basados en la accin de GLP-1 para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Finalmente, la sustitucin o la regeneracin de las clulas beta ofrece la apasionante posibilidad de lograr la curacin de la diabetes. La situacin actual del trasplante celular en la diabetes y en especial del trasplante de islotes se revisa en el captulo 7, y la posibilidad de generar clulas productoras de insulina a partir de clulas madres embrionarias o adultas, para cuyo fin el conocimiento de la embriognesis del pncreas endocrino aporta una informacin que puede ser fundamental, se analiza en los captulos 8 y 9 de la monografa. Es el deseo de los miembros del Grupo de Islotes que hemos participado en la elaboracin de esta monografa que sea de utilidad para facilitar una mejor comprensin del papel central del islote pancretico en el desarrollo de la diabetes, y acerque de una forma rigurosa pero comprensible las implicaciones que para el conocimiento y curacin de la diabetes puede aportar la actividad de los miembro del grupo desde los resultados de sus lneas de trabajo.
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CAPTULO 1
Regulacin por glucosa de la funcin de las clulas alfa, beta y delta en el islote de Langerhans
AUTORES
Ivan Quesada Eva Tudur ngel Nadal
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1. Introduccin
La regulacin de la glucemia por parte del islote depende principalmente de la funcin individual de las diferentes poblaciones celulares que lo integran y de la interaccin entre stas. La masa de clulas endocrinas del pncreas apenas constituye un 1% del total del rgano, y se agrupa en poblaciones de 1000-3000 clulas formando los islotes de langerhans. El tipo celular predominante corresponde a la clula -pancretica, responsable de la liberacin de insulina, mientras que la clula secretora de glucagn y la secretora de somatostatina estn representadas en una menor proporcin. Si bien en ratn la clula constituye alrededor del 70-80 % del islote y la clula en torno al 20 %, estudios recientes en humano han demostrado una presencia mayor de clulas (55 % de clulas frente a un 40 % de ). Estos trabajos han puesto de manifiesto la especial relevancia de las clulas secretoras de glucagn en la funcin del islote humano. En el caso de las clulas secretoras de somatostatina, stas pueden llegar a constituir el 10 % del total del islote. Otros tipos celulares minoritarios como las clulas PP productoras del polipptido pancretico constituyen menos del 1 %. El control de la glucemia por parte del islote se debe mayoritariamente a la accin directa de las clulas y . Mientras que la clula libera insulina con concentraciones crecientes de glucosa, la secrecin de glucagn por parte de la clula tiene lugar en condiciones hipoglucmicas. La poblacin ejerce una funcin reguladora indirecta a travs de mecanismos paracrinos ya que la somatostatina inhibe la secrecin de las clulas y . Adems de la funcin y la interaccin de estos tipos celulares, la regulacin de la glucemia est tambin sometida a varios niveles de control neuronal y hormonal aunque no vamos a abordarlos en este captulo. Casi todos los trabajos cientficos han sido dirigidos al estudio de la clula y la secrecin de insulina, de manera que hoy en da se tiene un gran conocimiento de la regulacin de este tipo celular. Sin embargo, se sabe muy poco de la fisiologa de las poblaciones no- pese a su importancia en el islote y a su papel en el control de la glucosa. Esta falta de informacin en los estudios del islote se debe a varios factores; siendo el principal la escasa representacin de estos tipos celulares en el islote frente a la presencia dominante de la clula . Igualmente contribuye el hecho de que debido a la escasa caracterizacin de estas clulas hayan faltado patrones de identificacin y que las metodologas convencionales presentaban limitaciones tcnicas para poder estudiar de forma inequvoca e independiente estas poblaciones en el islote entero. Las innovaciones recientes en mltiples tcnicas ha propiciado en
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los ltimos aos la aparicin de varios estudios abordando la fisiologa de las clulas y . Una caracterstica especialmente interesante es que varios de estos trabajos se han realizado en el islote intacto. Si bien la informacin acerca de las clulas y basndose en lneas celulares o en clulas aisladas en cultivo resulta relevante, se ha constatado que estos modelos presentan diferencias fisiolgicas con respecto a las observaciones realizadas en el islote de Langerhans intacto. De hecho, segn han evidenciado algunos trabajos in vivo, el islote intacto como modelo de estudio se acerca mucho ms al comportamiento fisiolgico. Estas diferencias resultan principalmente de la importancia crtica en el funcionamiento del islote del contacto clula-clula y de la regulacin autocrina y paracrina. En base a estos motivos, en los ltimos aos varios grupos de investigacin han tratado de caracterizar la fisiologa de las clulas , y en el islote intacto, o incluso revisar conceptos cuyas conclusiones previas derivaban de estudios procedentes de modelos diferentes. En este captulo nos centraremos en la descripcin de los mecanismos que regulan la funcin de los tipos celulares , y , principalmente en base a estudios realizados en el islote intacto. La funcin individual e interaccin de estos tres tipos celulares constituye la principal lnea de accin en la regulacin de la glucemia.
2. Regulacin de la secrecin de insulina de la clula por glucosa.

El esquema de acoplamiento estmulo-secrecin en clula est ampliamente aceptado, si bien algunos datos de este modelo se han revisado tras diversos estudios en islote entero utilizando tcnicas electrofisiolgicas y de microscopa confocal. La glucosa extracelular entra en el citosol a travs de transportadores especficos (tipo GLUT-2), donde se metaboliza a piruvato mediante la gliclisis. El piruvato en la clula es mayoritariamente metabolizado por va aerbica, de manera que entra en la mitocondria, activando el ciclo de Krebs que da lugar a la produccin de CO2 y los nucletidos NADH y FADH2. Estos ltimos actan como fuente de transferencia de electrones en la cadena de reacciones que participan en la fosforilacin oxidativa y en la sntesis de ATP. El incremento en la razn ATP/ADP da lugar al cierre de los canales de K+ dependientes de ATP (KATP), lo cual lleva a una despolarizacin respecto a los valores de potencial de reposo que se sitan de -60 a -80 mV (ver figura 1A). En ausencia de
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glucosa, la conductancia de los canales KATP es de 4 nS, y con el incremento de la concentracin de este azcar se produce una disminucin creciente de esta conductancia con una inhibicin media en torno a 5 mM glucosa. La despolarizacin derivada del cierre de canales KATP activa canales de Ca2+ dependientes de voltaje, permitiendo as la entrada de Ca2+ desde el exterior. En condiciones de concentraciones estimulatorias de glucosa, la actividad elctrica en la clula sigue un patrn oscilatorio en el islote de manera que se generan oscilaciones del potencial de membrana entre un valor de despolarizacin, sobre el que se generan potenciales de accin (fase activa), y una fase silente de repolarizacin del potencial de membrana. Si bien durante los potenciales de accin de la fase activa slo intervienen corrientes de Ca2+ mediadas por canales tipo L en ratn, en humano adems participan corrientes de Na+ dependientes de voltaje. El incremento de Ca2+ citoslico derivado de la apertura de canales de Ca2+ dependientes del potencial de membrana es la seal que desencadena la secrecin de insulina. Ante un estmulo de glucosa por encima de 8 mM, se produce una seal de Ca2+ oscilatoria que da lugar a una liberacin pulstil de insulina (ver figura 2). A diferencia de lo que ocurre cuando se encuentran aisladas en cultivo, las clulas en el islote intacto generan un patrn oscilatorio regular y sincrnico tanto a nivel de la actividad elctrica como de la seal de Ca2+. En ratn, esta coordinacin se debe a la existencia de un alto grado de acoplamiento celular mediado por uniones tipo gap (gap-junctions) que permiten el funcionamiento en forma de sincitio de toda la poblacin . Este acoplamiento en islotes de ratn se cree que es indispensable para una adecuada liberacin de insulina, dando lugar a una secrecin ms vigorosa. Sin embargo, estudios recientes en islotes humanos indican que el acoplamiento celular y la coordinacin de las seales de Ca2+ tienen lugar en grupos de clulas, coincidiendo con su organizacin espacial, pero no en todo el islote. En el islote de ratn la poblacin est agrupada en el centro con ramificaciones hacia la superficie, mientras que las clulas y se disponen en las capas ms superficiales. Sin embargo, la organizacin espacial en el islote humano es mucho ms azarosa con grupos celulares ubicados sin un patrn espacial definido. El significado funcional de esta estructuracin en el caso del islote humano est an por resolver. Adems de un efecto directo sobre la secrecin de la clula , la glucosa tambin ejerce una accin indirecta al estimular la exocitosis de la propia poblacin y de clulas vecinas, favoreciendo as la co-secrecin junto a las hormonas del islote, de diferentes molculas que permiten una regulacin autocrina y paracrina. En condi22
ciones de hipoglucemia se secreta glucagn, que tiene un efecto positivo sobre la secrecin de insulina, posiblemente por incremento de los niveles de AMP cclico en clula . En cambio, a concentraciones elevadas de glucosa extracelular se secretan varias molculas con efecto inhibitorio. Una de ellas es la somatostatina liberada desde las clulas . Aunque el mecanismo de accin no est todava completamente analizado, parece que implica una disminucin de niveles de AMP cclico. Por otro lado, el cido -aminobutrico (GABA) cosecretado con la insulina regula negativamente y de manera autocrina al unirse a receptores GABAB que se expresan en la clula . La disminucin de la exocitosis tiene lugar por activacin de protenas G inhibitorias. Por ltimo comentar el papel autocrino y paracrino del ATP extracelular que se cosecreta junto a las hormonas del islote desde los grnulos. Estudios recientes utilizando tcnicas electrofisiolgicas demuestran que el ATP es capaz de reducir la secrecin inducida por glucosa actuando a varios niveles pero sobretodo por una interferencia directa con el proceso de exocitosis. Aunque los mecanismos de control de las clulas y no estn todava muy definidos, existen importantes paralelismos con respecto a la clula . Las clulas y no slo son elctricamente excitables sino que adems la glucosa regula su actividad elctrica, y su secrecin hormonal es dependiente de Ca2+ y de canales dependientes de voltaje.
3. Regulacin de la secrecin de glucagn de la a clula por glucosa

A pesar de que la regulacin de la glucemia en unos determinados lmites depende tanto de la insulina como del glucagn en base a perfiles de funcionamiento antagnicos, se sabe muy poco de la regulacin de la clula . El inters por su estudio ha ido creciendo no slo por una comprensin de la fisiologa integral del islote, sino tambin por razones clnicas. En el caso de pacientes diabticos se pueden observar niveles de glucagn elevados que, junto a los niveles bajos de insulina, agravan la hiperglucemia. Se puede observar adems en estos casos que la inhibicin caracterstica de la secrecin de glucagn al aumentar la glucemia est alterada, e incluso falla. Hasta hace poco, los nicos datos acerca del comportamiento de este tipo celular se basaban en estudios de secrecin de glucagn. En los ltimos aos se han desarro23
llado mltiples estudios que abordan su fisiologa tanto a nivel celular como molecular. No obstante, an no se ha llegado a un consenso respecto a los mecanismos que dirigen su funcionamiento ya que son mltiples los niveles de regulacin que afectan a la poblacin , incluyendo un control neural, un importante control paracrino a partir de la secrecin de clulas y vecinas, y tambin un control directo por parte de la glucosa. Debido a que el efecto paracrino es importante dentro del islote, todava no se sabe con exactitud si la inhibicin en la secrecin de glucagn a concentraciones elevadas de glucosa es debida estrictamente al azcar o a un efecto paracrino de las clulas vecinas. En cualquier caso, en base a varios estudios realizados principalmente en islote entero, se sabe que la respuesta ante la glucosa de las clulas y es totalmente opuesta en cuanto a la actividad elctrica, las seales de Ca2+ y la liberacin hormonal, de manera que las primeras son ms activas en bajas concentraciones de glucosa y se inhiben a altas concentraciones, mientras que la poblacin responde antagnicamente. El grupo de Patrick Rorsman propuso un modelo de funcionamiento para la clula que reconciliaba los datos aportados por varios laboratorios y explicaba el mecanismo de actuacin de la glucosa (ver figura 1B). A continuacin detallamos algunas de las caractersticas fisiolgicas de este tipo celular en base a este modelo, si bien muchos de los trabajos de los ltimos dos aos empiezan a proponer varios cambios de menor o mayor consideracin. La clula presenta canales KATP, al igual que la clula , y su actividad es la principal responsable del potencial de membrana en este tipo celular. En bajas concentraciones de glucosa, estos canales tienen una baja actividad dando lugar a un potencial de membrana por debajo de -60 mV A este potencial negativo se genera . una actividad elctrica basada en potenciales de accin mediados por canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo T, los cuales llevan el potencial de membrana a niveles ms positivos donde se activan canales de Na+ y canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo L y N. La repolarizacin tendra lugar mediante la activacin de canales de K+ tipo A. La entrada de Ca2+ a travs de los canales tipo L y N sera responsable del aumento citoslico de este in que da lugar a la exocitosis. En cambio, el incremento de la concentracin extracelular de glucosa, llevara a un aumento intracelular de la relacin ATP/ADP que dara lugar al bloqueo de los canales KATP, despolarizando as la membrana hasta valores de potencial para los cuales se inactivan las corrientes dependientes de voltaje mencionadas anteriormente y que sustentan los potenciales de accin. Esto, por tanto, llevara a la disminucin de la actividad elctrica. La apertura de canales de Ca2+ en la fase elctrica activa a baja concentracin de glucosa facilita la entrada de Ca2+ extracelular dando lugar a una
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seal oscilatoria (figura 2). Este aumento de Ca2+ en el citosol favorece la exocitosis de los grnulos de glucagn. Este modelo propone, por tanto, un efecto directo de la glucosa, y un mecanismo de accin donde los canales KATP tendran un papel fundamental en acoplar cambios metablicos a cambios inicos y seales de Ca2+ que controlaran la liberacin de glucagn, de manera muy similar a como ocurre en clula pero generando cambios opuestos. Sin embargo, varios estudios acerca del metabolismo de la glucosa observan importantes diferencias entre las clulas y que el modelo anteriormente expuesto no recoge. Aunque ambos tipos celulares disponen de transportadores de glucosa diferentes, principalmente GLUT-2 en el caso de las clulas y GLUT-1 en el caso de , se ha demostrado que el transporte de glucosa no es un factor limitante en el metabolismo del azcar. No obstante, parece que las diferencias tienen lugar a nivel mitocondrial. Se ha observado mediante diversas aproximaciones tcnicas que los cambios inducidos por glucosa en la activacin del metabolismo aerbico mitocondrial son mucho menores en las clulas . De hecho, algunos estudios bioqumicos en clulas del islote separadas por cell sorting indican una mayor grado de metabolismo anaerbico en clulas frente a una mayor actividad metablica mitocondrial en las clulas . Esta idea se sustenta adems por estudios que indican que la razn lactato deshidrogenasa / glicerol fosfato deshidrogenasa mitocondrial es baja en la poblacin , lo cual favorecera la oxidacin mitocondrial de la glucosa, mientras que esta razn es ms elevada en clulas no-. Parece por tanto que la clula presenta un acoplamiento muy bajo entre la gliclisis en el citosol y la sntesis de ATP en la respiracin mitocondrial. Estos datos podran explicar porqu se observan apenas cambios en la relacin ATP/ADP en respuesta a la glucosa en clulas comparado con la poblacin . Por tanto, en el modelo anteriormente expuesto por el grupo de Rorsman habra que proponer mecanismos alternativos de regulacin del canal KATP por parte de la glucosa, a parte del incremento en la razn ATP/ADP. Como hemos comentado anteriormente, aparte de un posible efecto directo de la glucosa sobre la clula , la regulacin paracrina juega un papel importante en el islote. La elevacin de la concentracin de la glucosa tiene un inevitable efecto estimulatorio sobre la exocitosis de clulas y vecinas. De entre varios mecanismos, uno de los ms importantes en la inhibicin de la secrecin de glucagn es el llevado a cabo por la insulina. Varios estudios coinciden en que la insulina activa canales KATP en clula , inhibiendo la actividad elctrica y la secrecin. Algunos trabajos tambin indican un papel significativo del Zn2+ aunque estos datos son an controvertidos. Los tomos de Zn2+ almacenados junto a la insulina en los grnulos
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de las clulas quedan en forma libre en el medio extracelular una vez que se ha producido la exocitosis. En clulas de islotes de rata se observ inhibicin sostenida tanto de la actividad elctrica como de la secrecin hormonal en presencia de Zn2+. Este proceso parece estar mediado tambin por la apertura de canales KATP. En cambio, estudios realizados en ratn, tanto en clulas aisladas como en islotes, concluyeron que el Zn2+ no inhiba la secrecin de glucagn y que tampoco se produca activacin de los canales KATP. Al margen de estos agentes paracrinos tambin se han descrito otros como la somatostatina y el cido -aminobutrico (GABA), con un notable efecto regulador. El GABA se libera desde los grnulos de secrecin durante la exocitosis, difundiendo por los intersticios del islote y activando receptores GABAA de clulas . La activacin de estos receptores se encuentra acoplada a la activacin de corrientes de entrada de Cl-. Dependiendo de la concentracin de Cl- intracelular, la apertura de estos canales suprimir la actividad elctrica por hiperpolarizacin o despolarizacin de la membrana respecto a los valores en los que se generan los potenciales de accin de Ca2+ y Na+ (modelo explicado anteriormente), inhibindose en ambos casos la liberacin del glucagn. La somatostatina (SST) tiene un efecto negativo sobre la liberacin de glucagn. Esta hormona se produce y secreta en varios rganos adems de en las clulas , abundando la forma activa SST-14 en el pncreas, la cual inhibe tanto la secrecin de insulina como la de glucagn al interaccionar con receptores de membrana especficos. En ratn, el efecto de la somatostatina sobre la clula se ha estudiado a nivel de la actividad elctrica, observando que activa canales de K+ acoplados a protenas G, induciendo hiperpolarizacin de la membrana e inhibiendo los potenciales de accin espontneos que permiten la entrada de Ca2+ y la secrecin de glucagn. En rata, se ha estudiado el papel de la somatostatina en la clula a nivel de capacitancia de la membrana, indicando efectos similares sobre la secrecin. Tambin se ha observado una accin inhibitoria por parte de la amilina o polipptido amiloide pancretico, tanto sobre los niveles basales de glucagn como sobre los niveles alcanzados tras estimulacin con L-arginina. Esta hormona peptdica de 37 aminocidos se cosecreta junto con insulina o somatostatina desde las clulas o del islote de Langerhans. Por tanto, la elevacin de la glucemia puede ejercer un efecto directo sobre la clu26
la y la secrecin de glucagn, y/o puede participar indirectamente al estimular la secrecin de clulas y activando respuestas paracrinas.
4. Regulacin de la secrecin de somatostatina d en la clula por glucosa.

La clula apenas est caracterizada, mucho menos que en el caso del tipo celular , y an es prematuro proponer un modelo de funcionamiento consolidado. Son pocos los estudios realizados a nivel molecular y celular acerca de su fisiologa. No obstante, la escasa informacin existente indica que estas clulas tienen un comportamiento fisiolgico y unos mecanismos de control con grandes paralelismos con la clula : incrementos en la concentracin extracelular de glucosa llevan a un aumento de la actividad elctrica, la seal de Ca2+ y la liberacin de somatostatina. La omisin de Ca2+ en el medio bloquea la secrecin de la hormona, sugiriendo que la liberacin de somatostatina es dependiente de Ca2+. Con los pocos datos existentes se ha propuesto un mecanismo, todava precario, para explicar la fisiologa de la clula . En ausencia de glucosa el potencial de membrana se sita en torno a -70 mV posiblemente debido a la actividad de cana, les KATP. Estos canales han sido medidos e identificados en la clula por tcnicas electrofisiolgicas, y se ha demostrado que las sulfonilureas que bloquean estos canales, despolarizan la membrana de estas clulas, aumentan el Ca2+ intracelular y la liberacin de somatostatina. Por tanto, se propone que estos canales tienen el mismo papel que en clula , de manera que acoplan los cambios metablicos inducidos por la glucosa a cambios elctricos y de la seal de Ca2+. Se cree, por tanto, que el incremento en la glucosa extracelular tambin aumenta la razn ATP/ADP bloqueando los canales KATP y generando la despolarizacin de la membrana. Esto llevara a un nivel de potencial en torno a -50 mV en el que se desarrollan potenciales de accin de Ca2+ y Na+, y por encima de los -30 mV se activaran canales de K+ (del tipo Kv3.4) que colaboraran en la repolarizacin. La apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje permitira la entrada de Ca2+ al citosol y la exocitosis de los grnulos de somatostatina. Las clulas generan una seal oscilatoria de Ca2+ a partir de concentraciones tan bajas de glucosa como 3 mM (figura 2). Esta mayor respuesta a la glucosa en comparacin a las clulas se
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ha explicado debido a una menor densidad de canales KATP en las clulas secretoras de somatostatina (un 50 % menos). Con una menor densidad, la despolarizacin de membrana hasta llegar al potencial al que se generan los potenciales de accin tendra lugar mucho antes de que se generara una completa inhibicin de los canales KATP en comparacin con las clulas , y por tanto, podran responder antes a la glucosa. Estudios recientes utilizando microscopa confocal redox en islote entero muestran que la glucosa aumenta el metabolismo aerbico mitocondrial en clula , aunque del orden de cuatro veces menos que en el caso de la poblacin . Estos datos sugieren que el metabolismo de la glucosa en estas clulas tiene ms similitud con el de la clula , al contrario de lo que ocurre en . Estos experimentos, junto a los existentes de electrofisiologa y seal de Ca2+, tambin sugieren que el canal KATP en clula juega un papel fundamental en acoplar cambios metablicos en elctricos en respuesta a la glucosa. La regulacin paracrina inducida por glucosa debe ser relevante en clula , sin embargo existen muy pocos trabajos abordando este aspecto en detalle. Dado que la clula contiene grnulos con GABA que se cosecretan con los de insulina, y las clulas expresan receptores de GABA acoplados a canales de Cl-, es plausible que el aumento de glucemia active esta sealizacin paracrina. La activacin de estas corrientes de Cl- posiblemente afecte a la actividad elctrica de las clulas y a su secrecin. Recientemente se ha visto tambin que el L-glutamato incrementa la liberacin de somatostatina a bajas concentraciones de glucosa. En estas condiciones el L-glutamato es cosecretado con el glucagn desde las clulas . Se ha demostrado que la poblacin expresa receptores ionotrpicos de glutamato que mediaran este efecto positivo sobre la secrecin de somatostatina. Por ltimo comentar que tanto la poblacin de clulas como , funcionan como unidades individuales a diferencia de lo que ocurre en la clula que se comporta como un sincitio en ratn o en pequeos grupos coordinados en humano, tal como hemos mencionado anteriormente. Si bien trabajos clsicos utilizando transferencia de sondas fluorescentes indicaron la existencia de acoplamiento homlogo y heterlogo entre los tres tipos celulares del islote, estudios posteriores con tcnicas electrofisiolgicas y medidas de las seales de Ca2+ tanto en islotes de ratn como de humanos, demuestran que las clulas y no estn acopladas entre s ni con otros tipos celulares, de manera que tienen un comportamiento individual.
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5. Conclusiones.
Si bien cada tipo celular del islote tiene un papel particular con relacin a la regulacin de la glucemia, la funcin del islote depende de la integracin de las respuestas de cada tipo celular y a sus interacciones, a parte de otros mecanismos de control como el neural. Si bien los estudios en lneas celulares y en clulas del islote aisladas aportan informacin relevante sobre la respuesta especfica de una clula o tipo celular, es relevante estudiar tambin esta respuesta en el islote intacto, pues es en este escenario donde se integran los diferentes mecanismos de comunicacin clula-clula, aproximndose en mayor medida a la realidad fisiolgica.
Agradecimientos Los laboratorios de los autores estn financiados por el Ministerio de Educacin y Ciencia y el Instituto de Salud Carlos III.
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6. Bibliografa seleccionada
Cabrera O, Berman DM, Kenyon NS, Ricordi C, Berggren PO, Caicedo A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103: 2334-2339. Gilon P, Shepherd RM, Henquin JC. Oscillations of secretion driven by oscillations of cytoplasmic calcium as evidences in single pancreatic islets. J Biol Chem. 1993; 268: 2226522268. Gopel SO, Kanno T, Barg S, Rorsman P. Patchclamp characterisation of somatostatin-secreting -cells in intact mouse pancreatic islets. J Physiol. 2000; 528: 497-507. Gopel SO, Kanno T, Barg S, Weng XG, Gromada J, Rorsman P. Regulation of glucagon release in mouse alpha-cells by KATP channels and inactivation of TTX-sensitive Na+ channels. J Physiol. 2000; 528: 509-520. Nadal A, Quesada I, Soria B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. J Physiol. 1999; 517: 85-93. Prentki M, Matchinsky FM. Ca2+, cAMP and phospholipid-derived messengers in coupling mechanisms of insulin secretion. Physiol Rev. 1987; 67: 1185-1248. Quesada I, Nadal A, Soria B. Different effects of tolbutamide and diazoxide in alpha, beta and delta-cells within intact islets of Langerhans. Diabetes. 1999; 48: 2390-2397. Quesada I., Todorova M.G., Alonso-Magdalena P., Beltr M., Carneiro E.M., Martin F., Nadal A., Soria B. Glucose induces opposite [Ca2+]i oscillatory patterns in identified a- and b-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 2006; 55: 2463-2469. Quesada I., Todorova M.G., Soria B. Different metabolic responses of a, b and d-cells monitored by redox confocal microscopy within the intact islet of Langerhans. Biophys. J. 2006; 90: 2641-2650. Santos RM, Rosario LM, Nadal A, GarciaSancho J, Soria B, Valdeolmillos M: Widespread synchronous [Ca2+]i oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflugers Arch. 1991; 418: 417-422.
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Tablas y Figuras
FIGURA 1
Modelo de acoplamiento estmulo-secrecin en la clula b (A) y a (B). Ver texto para detalles acerca de estos dos modelos.
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Tablas y Figuras
FIGURA 2
A. Imagen de un islote de ratn cargado con una sonda fluorescente sensible a Ca2+. La imagen fue adquirida mediante microscopa confocal e ilustra una seccin ptica de 8 mm. Barra de calibracin = 100 mm. B. Seales oscilatorias de Ca2+ en clulas a, b y d al pasar de 3 a 11 mM glucosa (G).
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CAPTULO 2
AUTORES
M. Vives-Pi, A.Lucas* R. Planas

Laboratori dImmunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnostiques (LIRAD) Banc de Sang i Teixits (BST) Fundaci Institut dInvestigaci en Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol *Servei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona
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1. Introduccin
La autoinmunidad se define como una reaccin del sistema inmunitario frente a componentes del organismo causada por una prdida de tolerancia inmunolgica. Cuando el sistema inmunitario causa dao tisular y afectacin con manifestaciones clnicas, aparecen las enfermedades autoinmunitarias. La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmunitaria resultante de la destruccin de las clulas pancreticas insulares productoras de insulina por un proceso destructivo selectivo. Los autoantgenos de clulas beta, linfocitos T y B, macrfagos y clulas dendrticas estn involucrados en la patognesis de esta enfermedad. Tras una etapa de autoinmunidad asintomtica, la enfermedad suele manifestarse en la infancia o adolescencia, en el momento en que aproximadamente un 80% de las clulas beta ha desaparecido. Las evidencias existentes a favor de que la DM1 es una enfermedad de origen autoinmunitario en humanos se especifican en la tabla 1.
TABLA 1
Evidencias de autoinmunidad en la DM1

AUTOINMUNIDAD
Infiltrado insular leucocitario Autoanticuerpos circulantes Asociacin con otras enfermedades AI Asociacin gentica a HLA Transferencia de la enfermedad Efecto de inmunosupresores
CARACTERSTICAS
T CD4, T CD8, M, DCs ICA, IAA, anti-GAD, anti IA-2 Tiroiditis, Addison, Anemia perniciosa, vitligo Aumento del riesgo relativo para ciertos haplotipos Trasplante de mdula sea en gemelos idnticos Mejora de la enfermedad
A pesar de los importantes avances en el conocimiento de los fenmenos que acompaan esta prdida de tolerancia hacia los autoantgenos insulares, la etiopatogenia de la enfermedad mantiene muchas incgnitas, entre ellas el elemento o elementos iniciadores del proceso. El estudio de la misma es complicado por el periodo asintomtico y por la dificultad de acceder al tejido diana. Como en otras muchas enfermedades autoinmunitarias, hay factores que confieren susceptibilidad a desarrollar la enfermedad, pero que por s solos no la desencadenan. Estos factores se clasifican en genticos (HLA), ambientales (dieta, latitud, patgenos) e incluso estocsticos (repertorio clonotpico individual). En el caso de la predisposicin gentica, ciertos
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haplotipos de los antgenos de histocompatibilidad de clase II (HLA-DR3/4, -DQ) as como otros loci de susceptibilidad (IDDM) contribuiran a una presentacin ms eficaz de un pptido relevante en la enfermedad; otros haplotipos confieren un papel protector. Evidencias epidemiolgicas apuntan a la existencia de un papel crtico de los factores ambientales en el desarrollo de autoinmunidad contra la clula beta: concordancia de la enfermedad del 50% en gemelos univitelinos, variaciones geogrficas, incidencia estacional, estudios epidemiolgicos de emigrantes a zonas de mayor incidencia que resultan en un aumento de la enfermedad, dieta, patgenos etc. Respecto a los patgenos y su influencia en autoinmunidad, destaca la hiptesis de la higiene, segn la cual, la exposicin a patgenos contribuira a la correcta maduracin del sistema inmunitario; por tanto, en una sociedad avanzada con pocas infecciones, antibiticos, ausencia de parsitos y vacunacin a edades muy tempranas, el sistema inmune no madurara de forma correcta influyendo en la mayor incidencia de alergia y autoinmunidad en dicha poblacin.
2. Alteraciones inmunolgicas en el islote asociadas a DM1: antes, durante y despus del inicio clnico
2.1 Antes
El inicio clnico de la diabetes coincide con la fase final de destruccin de las clulas beta, iniciados durante el perodo asintomtico o prediabetes. Esta interesante etapa latente de difcil estudio debido a la falta de manifestaciones y lo inaccesible del tejido diana- puede durar aos. El nico marcador de dao insular son los autoanticuerpos sricos, siendo los anti-insulina los primeros en aparecer. De esta etapa, se sabe que no todos los individuos con anticuerpos anti-islote desarrollarn la enfermedad, lo que significa que la autoinmunidad contina de forma silente o bien acaba desapareciendo. La positividad para uno o varios autoanticuerpos anti-islote es determinante para la actividad de la respuesta autoinmunitaria que es muy activa en esta etapa, lo que sugiere que podra ser la mejor fase para utilizar la inmunomodulacin preventiva. Datos obtenidos de modelos animales indican que esta fase se caracteriza por el inicio y progresin de la insulitis o infiltracin leucocitaria de los islotes con el consiguiente establecimiento de un microambiente proinflamatorio. El avance de la destruccin se interpreta gracias a la descripcin de los procesos de migracin leucocitaria. As, las clulas endoteliales de los capilares insulares regularan la llegada leu37
cocitaria a los tejidos y sus poros ayudaran a una rpida difusin de los mensajeros qumicos entre la sangre y el espacio insular: la insulitis -infiltracin leucocitaria de los islotes- va acompaada por un incremento de los elementos vasculares de los tejidos, dato que sugiere la participacin activa del endotelio en el proceso patognico de la DM1.
2.2 Durante
Los fenmenos autoinmunitarios en el islote al inicio clnico de la DM1 se han estudiado en los pocos casos de pacientes que han fallecido en esta etapa y en las biopsias pancreticas que practican algunos grupos en Japn. Tras identificar la esperada disminucin del nmero de clulas beta, se describi una infiltracin leucocitaria relativamente escasa con predominio de linfocitos T CD4+ y CD8+ y algunos macrfagos. Parece ser que los macrfagos y las clulas dendrticas seran los primeros tipos celulares en infiltrar los islotes. La lesin inflamatoria de los islotes o insulitis, es una caracterstica comn en los escasos pncreas analizados histolgicamente procedentes de pacientes diabticos y se correlaciona, a nivel molecular, con una alteracin de marcadores inmunolgicos en las clulas beta (tabla 2): hiperexpresin de molculas de HLA de clase I y clase II, aumento de molculas de adhesin (ICAM-1, LFA3, VLA-4), aumento de molculas de transporte antignico endgeno (TAP-1), Fas, as como depsitos de inmunoglobulinas y complemento. Todas estas molculas estn implicadas en la respuesta inmune. Este hecho otorga un papel activo de la clula beta en el proceso de su desaparicin, sugiriendo un incremento de la presentacin antignica por parte de la clula diana. A nivel del microambiente insular, se han definido alteraciones del patrn de expresion de citocinas y quimiocinas, observndose un perfil de citocinas proinflamatorio y caracterstico de linfocitos T citotxicos: (IFN-, IFN- e IL-6) y perforina. Los experimentos in vitro sometiendo islotes humanos a condiciones similares a las proinflamatorias y antivirales demuestran la capacidad de los islotes para producir quimiocinas proinflamatorias que podran contribuir al homing y activacin de leucocitos y clulas autoreactivas en los islotes. En esta fase, se observan tambin fenmenos de puesta en marcha de procesos de regeneracin de la clula beta con aparicin de neoislotes a partir de ductos pancreticos. Estudios en modelos animales han determinado que la regulacin de la respuesta hacia un componente Th1 conlleva la aparicin de la enfermedad. Las citoquinas de tipo 1, producidas por linfocitos T (IFN-, TNF-, IL-2 y IL-12) se relacionan con
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una insulitis destructiva, mientras que las de tipo Th2 (IL-4, IL-10) estaran asociadas con una insulitis benigna. El reclutamiento de estas clulas hacia los islotes es un paso crtico en la patognesis de la enfermedad. Las quimiocinas son citocinas que promueven la migracin de clulas mononucleares, por lo que el trfico hacia la clula diana, podra asociarse a la expresin temporal de quimiocinas, y que la polarizacin de la expresin de las mismas por clulas Th1 vs Th2 determinara la composicin de la insulitis y la posterior destruccin o proteccin de las clulas beta. Resultados de estudios in vitro indican que las clulas beta de rata son capaces, bajo el estmulo de IL-1, de expresar ciertas quimiocinas que podran afectar al reconocimiento de la clula beta por parte del sistema inmunitario.
TABLA 2
Alteraciones inmunolgicas en pncreas de pacientes con DM1

ALTERACIN
Insulitis con predominancia de linfocitos TCD8+ Hiperexpresin de HLA I
LOCALIZACIN
Islote y periferia insular
REFERENCIA
Bottazzo, 1985; Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994; Imagawa, 2001. Bottazzo, 1985; Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Botazzo, 1985; Foulis, 1986 Hanninen, 1992; Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994 Vives-Pi, 1996 Sai, 1984; Botazzo, 1985; Somoza, 1994 Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Somoza, 1994 Stassi, 1997; Moriwaki, 1999 Foulis, 1987; Somoza, 1994; Yamagata 1996
Islote
Expresin inapropiada de HLA II Hiperexpresin de molculas de adhesin (ICAM-1, VLA) Hiperexpresin de TAP-1 (Transportador de pptidos) Depsitos de anticuerpos IgG fijadores de complemento Prdida de la expresin de autoantgenos (GAD, Insulina) Presencia de perforina Expresin de Fas Presencia de mRNA de IFN-, IFN-, IFN- e IL-6
Islote
Islote y endotelios
Islote Islote y periferia insular Clulas beta Pncreas Clulas beta y alfa Pncreas
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2.3 Despus
Tras el inicio clnico de la DM1, suele presentarse una etapa llamada luna de miel. Se define la luna de miel como el periodo en que los requerimientos de insulina son inferiores al 50% de los iniciales. Esta etapa sugiere un descanso de la clula beta tras la administracin de insulina exgena y probablemente un intento de regeneracin insular. A pesar de que existen pocos estudios de los fenmenos insulares que ocurren al iniciar la insulinizacin, parece ser que a partir de esta etapa iran disminuyendo las alteraciones inmunolgicas observadas en el inicio clnico de la DM1: en pncreas de pacientes con ms de diez aos de evolucin de la enfermedad ya no se detecta insulitis, hiperexpresin de HLA clase I, molculas de adhesin, inmunoglobulinas, complemento, y como es de esperar, tampoco clulas positivas para insulina. Sin embargo, estudios recientes demuestran la presencia de clulas beta remanentes en pncreas de pacientes de hasta 67 aos de evolucin de la enfermedad, que son ms numerosas en pacientes con glicemias ms bajas. Estos datos, junto con un aumento de la fibrosis periductal y la apoptosis de clulas beta implican una inflamacin crnica con nueva formacin/destruccin de clulas productoras de insulina. Algunos autores postulan que en esta etapa, la enfermedad podra remitir si se inhibiera la destruccin autoinmunitaria mediante el restablecimiento de la tolerancia.
3. Autoantgenos: Protagonistas o figurantes?

Los antgenos son molculas que portan una serie de determinantes antignicos o eptopos que son reconocidos por anticuerpos o por el receptor de los linfocitos T (TCR) del sistema inmunitario especfico y pueden iniciar una respuesta adaptativa. La mayora son ajenos al individuo pero cuando un componente del propio organismo es reconocido por componentes del sistema inmunitario adaptativo, se denomina autoantgeno. Tanto en humanos como en modelos murinos, se han identificado numerosos antgenos y eptopos insulares frente a los que responden linfocitos T CD4 o CD8 autoreactivos y frente a los que se producen autoanticuerpos. En la DM1 los autoantgenos se pueden dividir en funcin de su distribucin tisular: en antgenos especficos de clula beta como la insulina, los derivados de la insulina y IGRP (Islet-specific Glucose-6-phosphatase catalytic subunit Related Peptide); antgenos neuroendocrinos como la carboxipeptidasa H, IA-2 (Insulinoma Associeted Antigen), GAD65 (Glutamic Acid Decarboxylase), periferina y carbo40
xipeptidasa E y en antgenos de amplia expresin como hsp60 (Heat Shock Protein 60). Los mejor caracterizados en funcin de la respuesta de autoanticuerpos- son la insulina, GAD e IA-2. La insulina es un autoantgeno diana segn demuestran numerosos estudios en modelos animales. Adems, el polimorfismo del gen de la insulina es un determinante importante en la DM1. El locus VNTR (variable nucleotide tandem repeat) afecta la expresin de la insulina en el timo y por tanto, puede influir en el establecimiento de la tolerancia central hacia dicha molcula. Recientemente, se ha demostrado que la liberacin de autoantgenos en DM1 y en otras enfermedades autoinmunitarias tiene un papel quimioatrayente de leucocitos, especialmente de clulas dendrticas inmaduras. ste sera un mecanismo de alerta hacia el sistema inmunitario en forma de seales de peligro para facilitar la reparacin tisular y esto supondra, en algunos individuos predispuestos, el desarrollo de autoinmunidad.
4. La importancia de los marcadores de autoinmunidad

Durante el perodo asintomtico de inicio y progresin de la destruccin de la clula beta aparecen anticuerpos circulantes anti-islote, marcadores de autoinmunidad humoral que identifican individuos en fase pre-diabtica y que distinguen esta enfermedad autoinmunitaria de otras formas de diabetes mellitus. Hasta el momento, estos marcadores sirven, junto con los datos metablicos, para llevar a cabo un mejor seguimiento del paciente. Los marcadores ICA (Islet Cell Antibodies) se detectan mediante immunofluorescencia indirecta y se expresan en unidades JDF (Juvenile Diabetes Foundation). Engloban un conjunto de anticuerpos contra diferentes determinantes antignicos, entre ellos GAD (Decarboxilasa del cido glutmico), insulina e IA-2 (proteina tirosin-fosfatasa-like). Se han estandarizado ensayos moleculares especficos para la deteccin de cada anticuerpo: La mayora de los pacientes pre-diabticos y el 90% de los diabticos presenta autoanticuerpos anti-GAD y/o IA-2. Los anticuerpos anti-insulina son muy determinantes en la fase pre-diabtica en nios. La positividad de varios de estos anticuerpos incrementa el riesgo de desarrollo de la enfermedad y permite seleccionar a los individuos para ensayos clnicos de prevencin. Los pacientes con DM1 tienen clulas T autorreactivas contra varios autoantgenos insulares lo que sugiere que, si bien en la fase
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inductiva de la enfermedad la respuesta ira dirigida contra uno o unos pocos autoantgenos, la progresin de la destruccin requerira el esparcimiento de una serie de molculas (GAD65, GAD67, ICA512, IA-2b, GM2-1 ganglisido, CPH, ICA69, Imogen, hsp65, periferina, REG, sinapsina...) que amplificaran la respuesta y daran paso a los autoanticuerpos contra molculas de las clulas beta como consecuencia de la liberacin del contenido citoplasmtico. Otro parmetro inmunolgico, adems de los autoanticuerpos, es la determinacin de linfocitos T autoreactivos contra antgenos insulares en pacientes diabticos o individuos pre-diabticos. Esta tcnica, que se basa en la determinacin de la capacidad de respuesta de los linfocitos T en sangre perifrica a autoantgenos insulares est actualmente en fase de estandarizacin.
5. Contribuyen las infecciones al proceso autoinmunitario que causa la DM1?

Adems de la predisposicin gentica, los factores ambientales contribuyen a la susceptibilidad frente la DM1, ya que la concordancia de la enfermedad en gemelos univitelinos es tan slo un 40-50%. Las infecciones vricas se han relacionado indirectamente con la diabetes autoinmunitaria durante muchos aos, en humanos y en modelos animales. Junto con la incidencia estacional de la enfermedad, la deteccin de virus en pncreas y en clulas mononucleares de sangre perifrica de pacientes en el inicio de la DM1 y la presencia de interferones de tipo 1 citocinas antivirales- en los islotes apoyan la hiptesis vrica en la etiologa de la diabetes. Adems, se han reportado varios casos clnicos de desarrollo de diabetes autoinmunitaria en pacientes con hepatitis viral crnica tras un tratamiento con interferones de tipo 1, principalmente con IFN-. Algunos datos epidemiolgicos recientes parecen indicar que las infecciones vricas como factor de riesgo tendran ms impacto en los individuos genticamente menos predispuestos. Se han propuesto distintos mecanismos para explicar la asociacin entre virus y DM1: 1) La hiptesis ms aceptada es el mimetismo molecular entre eptopos de protenas propias de agentes infecciosos y eptopos de autoantgenos. Tras una infeccin vrica, podra darse una reaccin cruzada y generarse una respuesta con42
FIGURA 1
Hiptesis sobre mecanismos de accin para explicar la asociacin entre las infecciones vricas y la DM1:
1) Mimetismo molecular entre eptopos de protenas propias de agentes infecciosos y eptopos de autoantgenos. Tras una infeccin vrica, una reaccin cruzada generara una respuesta contra eptopos de protenas propias en individuos susceptibles; 2) La destruccin tisular y celular producida por una infeccin vrica puede comportar la liberacin de nuevos eptopos (epitope spreading) que de ser presen-
tados y reconocidos por linfocitos T autoreactivos, stos podran activarse e iniciar una respuesta autoinmunitaria. 3) Una inflamacin del rgano diana en el contexto de una infeccin sera el desencadenante del proceso autoinmunitario, mediada por interferones de tipo 1, quimiocinas, citocinas proinflamatorias y otros factores de la inmunidad innata, que contribuiran a la activacin de clulas T
autoreactivas. 4) Se ha propuesto la destruccin citoltica directa de las clulas beta aunque parece un mecanismo incompatible con el largo perodo asintomtico que precede a la enfermedad. 5) Otra posibilidad es la presentacin de nuevos eptopos procesados de una forma distinta despus de una infeccin, o bien secuestrados hasta este momento en un rgano inmunoprivilegiado.
tra eptopos de protenas propias en individuos susceptibles; este mecanismo podra estar implicado en la patognesis de algunas enfermedades como la miocarditis post-viral o la enfermedad de Chagas. En referencia a la DM1 se ha observado, por
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ejemplo, reactividad cruzada entre eptopos de GAD y coxsackievirus, citomegalovirus y rotavirus. 2) La destruccin tisular y celular producida por una infeccin vrica puede comportar la liberacin de nuevos eptopos (epitope spreading). Si algunos de estos eptopos fueran presentados y reconocidos por linfocitos T autoreactivos, stos podran activarse y proliferar, iniciando una respuesta autoinmunitaria. 3) Otra hiptesis sugiere que la inflamacin del rgano diana en el contexto de una infeccin sera el desencadenante del proceso autoinmunitario: esta inflamacin suele estar mediada por interferones de tipo 1, quimiocinas, citocinas proinflamatorias y otros factores de la inmunidad innata, que contribuiran a la activacin de clulas T autoreactivas, de forma colateral e inespecfica. 4) La destruccin citoltica directa de las clulas beta se ha propuesto en algunas infecciones vricas en modelos animales. An y as, el mecanismo de una infeccin aguda de las clulas beta parece incompatible con el largo perodo asintomtico que precede a la enfermedad en humanos. 5) Otra posibilidad es la presentacin de nuevos eptopos, antes eptopos crpticos, procesados de una forma distinta despus de una infeccin, o bien secuestrados hasta este momento en un rgano inmunoprivilegiado. Sin embargo, todos estos mecanismos son hasta el momento hipotticos, ya que no se ha podido demostrar una relacin causa-efecto en la enfermedad en humanos. Estos mecanismos propuestos se resumen en la figura 1. Hasta el momento ms de una decena de virus, con y sin tropismo por el pncreas, han sido asociados a la DM1 en humanos y en modelos experimentales. Un ejemplo clsico es el virus de la rubola -Rubella, que pertenece a la familia Togaviridae, ya que se ha visto que nios con sndrome de la rubola congnito presentan una mayor incidencia de diabetes. Probablemente, los virus que ms se han relacionado con la DM1 son los enterovirus (familia de los Picornavirus) y, dentro de este grupo, los echovirus y coxsackievirus A y B (especialmente el serotipo B4). Algunos estudios epidemiolgicos sugieren una asociacin entre infecciones por enterovirus y el posterior desarrollo de DM1. Se han detectado anticuerpos y respuesta de linfocitos T contra enterovirus en pacientes diabticos. Adems, se report un caso en el que se pudo aislar un virus del pncreas de un paciente diabtico en el inicio clnico de la enfermedad: se trataba de una variante de coxsackievirus B4 que adems era capaz de inducir la enfermedad en ratones. Los coxsackievirus son trpicos para las clulas beta humanas y el mecanismo que se propone para el desarrollo de la enfermedad es el mimetismo molecular. Los rotavirus, pertenecientes a la familia de los reovirus, son los principales causantes de gastroenteritis durante la infancia y se han relacionado tambin con DM1. Las infecciones por rotavirus
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se han asociado a la aparicin de autoanticuerpos especficos de islote, segn datos epidemiolgicos. Adems, se ha observado una similitud entre eptopos de rotavirus VP7 y autoantgenos de islote (GAD e IA-2). stos son los ejemplos ms evidentes, pero existen otros virus que tambin se han relacionado con la DM1 en humanos y en modelos animales, como el citomegalovirus, el virus de la encefalomiocarditis, el mengovirus, los retrovirus endgenos, el virus Epstein-Barr, el virus Ljungan, etc. Por el contrario, a algunas infecciones tambin se les atribuye un papel protector frente a la DM1. La incidencia de la enfermedad ha aumentado notablemente en las ltimas dcadas en los pases desarrollados, paralelamente a una mayor atencin a la higiene y mejor control de las enfermedades infecciosas. Tambin se ha observado, mediante estudios epidemiolgicos, que el hecho de que los nios empiecen antes su etapa pre-escolar, asociada a sus primeras exposiciones a patgenos, tiene un efecto protector frente la enfermedad.
6. Regeneracin y autoinmunidad. Un crculo vicioso?

En el inicio clnico de la DM1 la destruccin de la poblacin celular beta alcanza el 80%. Las clulas beta humanas adultas tienen una baja tasa de replicacin, pero en los ltimos aos se han publicado estudios que demuestran la existencia de regeneracin de clulas beta incluso en pacientes diabticos. En el pncreas de pacientes que murieron justo en el inicio clnico de la enfermedad, se detectan signos de regeneracin y neoformacin de islotes en zonas ductales. Adems, en pacientes con hasta 67 aos de evolucin de la enfermedad siguen existiendo tanto clulas beta cmo apoptosis de stas mismas, lo que sugiere la cronicidad de la autoinmunidad. Los mecanismos de regeneracin propuestos son tres: la replicacin de clulas beta preexistentes; la neoformacin de clulas beta a partir de clulas ductales y la transdiferenciacin a partir de otros tipos celulares. REG es una familia de genes implicados en la regeneracin de clulas beta. Las protenas REG actan de forma autocrina y paracrina a travs de la interaccin con su receptor (REG receptor), induciendo la proliferacin de clulas beta. En humanos existen distintos genes pertenecientes a la familia REG: REG1, REG1,
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REG3, REG3, REG4. Estos genes se expresan, entre otros tejidos, en islotes en procesos de regeneracin y se hiperexpresan en condiciones de inflamacin y diabetognesis, en un intento de regeneracin mediado en parte por REG para intentar contrarrestar la destruccin de clulas beta. Sin embargo, REG podra tener un papel dual en la DM1, ya que por otro lado se ha descrito una respuesta autoreactiva contra REG en la enfermedad. En el modelo murino NOD, se aisl una clona diabetognica TCD4+ REG3-especfica a partir del infiltrado de islotes. Recientemente, se ha descrito la presencia de autoanticuerpos anti-REG en el 25% de pacientes con DM1 y en el 15% de pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estos anticuerpos son neutralizantes de la actividad anti-REG in vitro. Estos datos indican que REG es a su vez un factor de regeneracin y un autoantgeno en DM1. As pues, el intento de regeneracin paralelo a la destruccin de la masa celular beta podra contribuir al proceso autoinmunitario.
7. Inmunoterapia y perspectivas de futuro

Por el momento, no disponemos de prevencin frente a la DM1 aunque sta es la finalidad de los ensayos clnicos de administracin de antgenos insulares. En sujetos con alto riesgo de desarrollar la enfermedad, pueden aplicarse tratamientos de tolerancia que sirvan para impedir su desarrollo, como es el caso de la administracin de insulina a travs de las mucosas. Esta insulina podra actuar, quiz como inmunomodulador, induciendo tolerancia o favoreciendo el reposo de la clula beta. Por el momento, los resultados de estos ensayos no son excesivamente esperanzadores. En la actualidad, se estan desarrollando inmunoterapias en humanos para evitar o suprimir el desarrollo de la autoinmunidad contra la clula beta. Las estrategias teraputicas se clasifican en base al aspecto inmunolgico a tratar, es decir, inmunomodulacin de linfocitos T (citocinas, anticuerpos anti CD3, dmeros pptido+HLA clase II y clulas T reguladoras), modulacin de la inmunidad innata ( alfa-galactosilceramida o pptido 277), vacunacin antgeno especfica (GAD e insulina) etc. Cabe destacar la terapia con anticuerpos monoclonales anti CD3 nomitognicos que ha supuesto un xito al restaurar la tolerancia hacia las clulas beta lo que se traduce en una remisin de la enfermedad. Adems, numerosos estudios de nuevas inmunoterapias estn en marcha en modelos experimentales.
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Otros campos prometedores como la terapia gnica, las clulas troncales, la regeneracin de las clulas beta y el transplante de islotes -cuya finalidad es en todos los casos conseguir una fuente de insulina endgena con regulacin metablicadeben apoyarse en disminucin del proceso autoinmunitario o de lo contrario puede suponer la recurrencia de la enfermedad. A pesar de la expresin tmica de autoantgenos insulares, algunas clulas T autoreactivas frente al islote escapan del timo durante la tolerancia central, lo cual es un primer paso a la susceptibilidad a la enfermedad. Sin embargo, su activacin se ve favorecida por factores genticos, ambientales y por ciertas condiciones microambientales que capaciten a las clulas T en el entorno de la clula diana: frecuencia de precursores especficos autoreactivos, estado ptimo de activacin y expresin de molculas accesorias, accesibilidad del autoantgeno y posibilidad de encuentro con elementos ambientales que favorezcan el mimetismo y las reacciones inflamatorias. El rgano diana podra tener un papel activo en la presentacin de antgenos, o quiz sera un dao inicial de la clula beta lo que dispersara sus autoantgenos al entorno donde seran presentados por clulas presentadoras profesionales. Al mismo tiempo, la clula beta es capaz de producir quimiocinas y citocinas que atraeran a los componentes leucocitarios a un microambiente proinflamatorio. El ataque autoinmunitario y la persistencia de hiperglicemia causan un aumento en la produccin de radicales libres que si se asocia a una disminucin de las defensas antioxidantes, producto de los llamados genes de respuesta protectora (glutation, HO-1, hsp...) puede aumentar la susceptibilidad al dao celular, al no bloquear la apoptosis mediada por NFkB. La presentacin clnica de la enfermedad es el resultado de un complejo proceso en el que dominan los elementos inflamatorios y destructivos del propio sistema inmunitario frente a elementos reparadores o regeneradores del islote. La investigacin sobre DM1 es un campo prioritario por la prevalencia y gravedad de la enfermedad. Es de esperar que los prximos avances en este campo consigan determinar las causas de la DM1 y conseguir su prevencin mediante la aplicacin de vacunas o tratamientos de tolerancia eficaces.
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Tratamiento de la Diabetes con Bombas la Insulina El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de de Diabetes
CAPTULO 3
Glucolipotoxicidad en la clula y su relacin con la diabetes tipo 2
AUTOR
Enrique Roche Collado
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1. Introduccin
La clula juega un papel central en la homeostasis de los nutrientes que llegan al organismo a travs de la dieta, no slo por ser capaz de fabricar y secretar la insulina, sino adems por hacer que dicha secrecin sea en el momento justo y en la cantidad adecuada. Para ello, la clula es capaz a travs de un sistema sensor de poder medir las concentraciones extracelulares de glucosa, el principal nutriente inductor del proceso secretor. Por otro lado, los cidos grasos tambin son capaces de inducir la liberacin de insulina, pero mecansticamente es necesaria la presencia de glucosa para inducir dicho efecto secretor. Este acoplamiento entre las concentraciones extracelulares del estmulo (glucosa o cidos grasos) y la liberacin de la hormona, se lleva a cabo a travs de complejas rutas metablicas, cuyo estudio ha sido un tema clave de investigacin en los ltimos aos. Mientras que las elevaciones posprandiales de glucosa generan una respuesta secretora aguda en la clula , en la patologa diabtica el escenario cambia radicalmente. En estas circunstancias, las concentraciones circulantes de glucosa y cidos grasos estn anormalmente elevadas de forma crnica, resultando en una disfuncin a nivel de la clula que se caracteriza por un proceso secretor alterado y mltiples cambios fenotpicos. En estas circunstancias en las que los nutrientes glucosa y cidos grasos estn elevados de forma crnica, stos se convierten en sustancias txicas que con el tiempo pueden llegar a provocar la muerte de la propia clula . En este sentido, se acu el trmico de toxicidad a los nutrientes para explicar cmo una exposicin crnica de la clula a elevadas concentraciones de glucosa y cidos grasos generaba cambios irreversibles que culminaban en la muerte de este tipo celular. Dado que no existe ninguna hormona que pueda reemplazar funcionalmente a la insulina, aparece la diabetes tipo 2. Cuando sta se declara se pueden observar ciertos puntos coincidentes con la diabetes tipo 1. As por ejemplo, en ambos casos la clula sufre una destruccin, aunque en el caso de la diabetes tipo 1 es por causas autoinmunes, y en ambos casos el paciente debe recurrir a las inyecciones de insulina para salvar su vida. Recientes investigaciones se han centrado en averiguar las causas moleculares que subyacen a este proceso de toxicidad a los nutrientes permitiendo caracterizar las fases en las que ste se divide y la verdadera naturaleza de los cambios funcionales y fenotpicos ms importantes que operan (Tabla 1).
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TABLA 1
Fases caracterizadas en el proceso de toxicidad a los nutrientes.

FASE
IGluco/Lipo-adaptacin Gluco/Lipo-deoxificacin
CARACTERSTICAS
Repuesta secretora aguda Homeostasis correcta de nutrientes Respuesta secretora incrementada Activacin de procesos detoxificadores Cambios fenotpicos y funcionales reversibles Posibilidad de intervencin diettica-farmacolgica Respuesta secretora nula Activacin de programas apoptticos Cambios fenotpicos y funcionales irreversibles Necesidad de insulina inyectada
Gluco/Lipo-toxicidad
Las primeras investigaciones en este campo all por los aos 60, acuaron el trmino de glucotoxidad, indicando que las elevadas concentraciones circulantes de glucosa tpicas de la patologa diabtica, eran la causa principal de esta disfuncin observada a nivel de la clula . Estudios posteriores en los aos 80, acuaron el trmino lipotoxicidad al observar la estrecha relacin entre diabetes tipo 2 y obesidad, considerando de esta forma a los cidos grasos como los factores desencadenantes de dicha disfuncin celular. Aunque ambas hiptesis permitieron avanzar mucho en el campo, ninguna de las 2 lograba explicar satisfactoriamente los acontecimientos moleculares que concurran en la diabetes tipo 2. De hecho, numerosos estudios in vitro e in vivo demostraron que la clula era capaz de activar mecanismos de defensa (Tabla 1) para corregir las alteraciones producidas ante la presencia crnica de estos nutrientes. Adems la glucosa per se no suele ser txica, ya que hay numerosos estados fisiolgicos en los que el azcar est elevado en circulacin, como por ejemplo tras una ingesta de sobrecarga o en determinadas patologas pancreticas. Lo mismo podra decirse para los cidos grasos que se encuentran elevados en situaciones de ayuno prolongado. Adems un 50% aproximadamente de las personas obesas no son diabticas y lo mismo se ha constatado en modelos animales bien establecidos, como la rata ZDF (Zucker Diabetic Fatty) frente a la ZF (Zucker Fatty). Actualmente, el concepto emergente es el de glucolipotoxicidad, en el que las concentraciones elevadas tanto de glucosa, como de cidos grasos conjuntamente seran la causa real y particular de la disfuncin de la clula en la diabetes tipo 2. En estas circunstancias, cuando ambos nutrientes estn presentes y eleva53
dos al mismo tiempo, la clula no puede activar correctamente su respuesta adaptativa y su capacidad detoxificadora. En la fase adaptativa, los cambios funcionales que concurren intentan asegurar una secrecin adecuada a pesar del exceso de nutrientes y por tanto de demanda extracelular. Esto puede observarse porque la curva que monitoriza la cintica de secrecin, muestra ya respuesta secretora a concentraciones muy bajas de azcar, cuando en condiciones normales la clula suele estar silente (Figura 1). Por otro lado, los mecanismos detoxificadores tienen como misin eliminar el exceso de molculas sealizadoras intracelulares, que como respuesta a la elevada concentracin extracelular de nutrientes, estn generando informaciones errneas en la propia clula. Sin embargo, estos cambios son el resultado de un proceso continuo y de acuerdo con el estado actual de los conocimientos, es muy difcil adscribirlos exclusivamente a una respuesta adaptativa o detoxificadora propiamente dicha.
FIGURA 1
Ejemplo representativo de una hipottica curva secretora de dosis dependencia en condiciones normales (lnea continua) y en condiciones de glucolipotoxicidad (lnea discontinua). Obsrvese que en la situacin patolgica existe ya una respuesta a bajas concentraciones de glucosa (alrededor de 5 mM) y que la curva alcanza una menor saturacin y mucho antes que en la situacin normal. En lneas generales se puede indicar que la clula ha perdido la sensibilidad a la glucosa.
En cualquier caso, una caracterizacin detallada de estos aspectos es crucial, ya que stos ocurren antes de la destruccin de la clula por mecanismos apoptticos. Todo ello implicara por un lado la reversibilidad del proceso y la posibilidad de corregirlo antes de llegar a un callejn sin salida. Uno de los principales obstculos que no ha permitido avanzar a un ritmo adecuado en este campo es la gran variedad de sistemas experimentales utilizados con sus correspondientes ventajas e inconvenientes. stos comprenden cultivos de lneas celulares, cultivo de islotes aislados y modelos animales. As, en los cultivos se pueden utilizar concentraciones extremadamente elevadas de nutrientes que desarrollan sus
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efectos txicos a los pocos das. Esto contrasta con lo que ocurre en humanos o en ciertos modelos animales, donde las concentraciones crnicas de nutrientes ya no pueden ser tan elevadas y los efectos txicos tardan en aparecer meses e incluso aos. Para poder comprender todo este proceso de la glucolipotoxicidad hay que tener en cuenta 2 observaciones clave que concurren en la propia clula . Por un lado, los nutrientes glucosa y cidos grasos son capaces de modular programas especficos de expresin de genes. Por otro lado, los metabolismos de la glucosa y de los cidos grasos estn interrelacionados. As por ejemplo, las concentraciones intracelulares del precursor de la sntesis de cidos grasos, el malonil-CoA, varan en funcin de la concentracin intracelular de glucosa. Adems la enzima encargada de la sntesis de malonil-CoA, la acetil-CoA carboxilasa, viene codificada por un gen regulado por la propia glucosa. Otro ejemplo que ilustra la conexin de ambos metabolismos, seran la utilizacin de intermediarios metablicos de la glucolisis para sintetizar triglicridos y diacilgliceroles. Teniendo en cuenta estas premisas, se puede proponer que la glucolipotoxicidad sea un fenmeno que pudiera estar ms cercano al desarrollo de la diabetes tipo 2 que las propias glucotoxicidad o lipotoxicidad. Aunque las evidencias experimentales son todava muy escasas, se van a presentar algunos datos preliminares que podran avalar dicha hiptesis. En cualquier caso, el caballo de batalla sigue siendo la transferencia de la experiencia acumulada in vitro y en modelos animales, a la situacin real del paciente diabtico tipo 2.
2. Glucolipotoxicidad
Como ya se ha sealado anteriormente, la evidencia experimental ha establecido que las concentraciones elevadas y persistentes de glucosa o de cidos grasos por separado alteran el funcionamiento de la clula , llegando a provocar la muerte de sta por mecanismos de suicido o apoptticos. Sin embargo, los modelos experimentales tambin han revelado que ciertos mecanismos intracelulares de tipo adaptativo y/o detoxificador pueden retrasar e incluso corregir esta situacin desfavorable (Tabla 2). Sin embargo, cuando ambos nutrientes se encuentran juntos en el medio extracelular y elevados al mismo tiempo, dichos
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mecanismos son ms ineficaces y la progresin hacia la muerte celular por apoptosis es ms rpida.
2.1 Evidencias de glucolipotoxicidad en cultivos celulares in vitro

Estudios en islotes cultivados han mostrado que la exposicin prolongada de stos a altas concentraciones de glucosa (16,7 mM) y palmitato (0,5 mM), result en una disminucin en la expresin del gen de la insulina y un incremento en los depsitos intracelulares de triglicridos. Adems, islotes aislados de la rata hiperglicmica y prediabtica ZDF e incubados en presencia de cidos grasos elevados presentaban apoptosis que poda prevenirse bloqueando las rutas de sntesis de ceramidas o de activacin de la xido ntrico sintasa inducible. Tratamientos farmacolgicos en estos modelos experimentales tambin permitieron restablecer la funcionalidad de los islotes y poder identificar la existencia de factores de transcripcin especficos como mediadores del proceso de glucolipotoxicidad. Entre ellos cabe destacar por su inters SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein) y los PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors). La expresin de SREBP-1c se encuentra incrementada en condiciones de hiperglucemia en el medio de cultivo. Este factor es clave en la expresin de genes que codifican enzimas de la ruta lipognica, observndose un incremento intracelular en los
TABLA 2
Eventos moleculares que concurren durante las fases de glucoadaptacin, glucodetoxificacin, lipoadaptacin y lipodetoxificacin.
Glucoadaptacin
Activacin gnica Metabolismo incrementado Aumento de la sensibilidad a la glucosa Secrecin a bajas concentraciones de glucosa Hipertrofia e hiperplasia de la clula
Glucodetoxificacin
Eliminacin de glucosa* Incremento del estado redox Cataplerosis de citrato Esterificacin lipdica Adaptacin del ciclo celular
Lipoadaptacin
Activacin gnica Modulacin metablica Secrecin de insulina alterada
Lipodeoxificacin
-oxidacin incrementada Desacoplamiento mitocondrial Deposicin de triglicridos
(*) Todava por demostrar experimentalmente. Por ejemplo incrementando hipotticamente la expresin o actividad de IGPR (islet-specific glucose-6-phosphate-related protein).
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depsitos de triglicridos. Esta deposicin en condiciones de alta glucosa pudo evitarse induciendo un mutante dominante negativo en clulas cultivadas INS-1. Estos datos confirman que glucotoxicidad y lipotoxicidad estn interrelacionadas y forman parte de un mismo fenmeno. Por otro lado PPAR- es un factor de transcripcin clave en la expresin de la acil-CoA oxidasa (enzima clave en la -oxidacin peroxisomal) y de la protena desacopladota mitocondrial UCP-2. Ambas protenas juegan un papel clave en el proceso de lipodetoxificacin eliminando el exceso de lpidos intracelulares y preservando la funcin mitocondrial. La expresin de PPAR- se ve severamente disminuida a altas concentraciones de glucosa, impidiendo con ello la eliminacin del exceso de lpidos. A todo esto hay que unir el hecho de que el malonil-CoA tambin se encuentra elevado en estas condiciones de alta concentracin de glucosa. Este metabolito, a parte de ser el precursor de la sntesis de cidos grasos, es el inhibidor fisiolgico de la carnitina-palmitoil transferasa I, la enzima clave en la -oxidacin mitocondrial y que tambin podra jugar un papel detoxificador clave eliminando el exceso de lpidos (Figura 2).
FIGURA 2
Esquema tentativo intentando enfatizar los puntos clave a nivel molecular en el proceso de glucolipotoxicidad. La glucolipotoxicidad ocurre cuando la glucosa (G) y los cidos grasos libres (FFA) a elevadas concentraciones aparecen juntos. Bajo estas condiciones, dichos nutrientes son capaces de modular programas gnicos especficos que imposibilitan la activacin de mecanismos detoxificadores. La inhibicin de la expresin de PPARs impide la expresin de la protena desacopladora mitocondrial (UCP-2) y la acil-CoA oxidasa (ACO). La carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I) es inhibida por la alta concentracin de malonil-CoA como resultado de un metabolismo incrementado de la glucosa. La baja expresin de la ACO y la inhibicin de la CPT-I dan como resultado una reduccin en la oxidacin (-ox) de los cidos grasos en exceso. Los procesos de esterificacin se ven favorecidos por la induccin de la expresin de SREBP-1c por la alta concentracin de glucosa, que contribuye tambin proporcionando esqueletos de glicerol para la biosntesis de triglicridos (TG). Se establece una disfuncin mitocondrial progresiva con produccin de radicales libres del oxgeno (ROS) y activacin de
mecanismos apoptticos por parte de los propios cidos grasos, como sntesis de ceramidas y activacin de la sintetasa inducible del xido ntrico (iNOS). El gen de la insulina no se expresa en estas condiciones por una inhibicin de la expresin de factores de trascripcin clave, como Pdx-1. todo ello conjuntamente da como resultado una carencia en la produccin de insulina y una secrecin defectuosa. Ver el texto para ms detalles
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De todo ello se deduce que ciertas estrategias farmacolgicas dirigidas a modular la expresin de estos factores de transcripcin, podran ser efectivas en el tratamiento de la diabetes tipo 2, muy probablemente retrasando la aparicin de las alteraciones descritas. En este sentido, activadores farmacolgicos de los PPARs han permitido restaurar muchas de las alteraciones funcionales de la clula , abriendo un campo de posibilidades muy interesantes que merecen ser exploradas en mayor detalle.
2.2 Evidencias de glucolipotoxicidad en modelos animales

Aunque ninguno de los sistemas animales existentes reproduce con fidelidad los eventos que concurren en el desarrollo de la diabetes tipo 2 en humanos, existen modelos que permiten obtener informacin parcial de algunas fases de la enfermedad. Quizs, las evidencias ms slidas han venido de los modelos genticos de diabetes, en particular de la rata ZDF. Este animal desarrolla sntomas de la enfermedad de una forma muy rpida durante su etapa adulta, presentando hiperglucemia, hiperlipidemia y acumulacin de triglicridos en los islotes. La aparicin de todos estos sntomas es coincidente con un fallo funcional y progresivo a nivel de la clula . Por lo tanto, adems de tener un defecto gnico en el receptor de la leptina, la rata ZDF tiene una secrecin de insulina deficiente, lo que la distingue de la rata ZF, que siendo obesa no llega a desarrollar enteramente diabetes. Determinadas manipulaciones, como una restriccin en la ingesta, o tratamientos farmacolgicos permiten retrasar o incluso impedir la progresin hacia la diabetes en la rata ZDF. Estos estudios han revelado que agentes hipolipemiantes como el bezafibrato, aunque fueron efectivos a nivel sistmico, no lograron disminuir los depsitos de triglicridos de los islotes ni normalizar los niveles de expresin del gen de la insulina. Por el contrario, si se aplicaba un agente hipoglucemiante, como la florizina se lograba eliminar los triglicridos en el islote y restituir la expresin de la insulina, aunque los niveles de triglicridos plasmticos permanecan elevados. Todos estos resultados parecen apoyar la hiptesis de la glucolipotoxicidad, indicando que la hiperlipidemia no es suficiente para causar lipotoxicidad, tal y como se constata en la rata ZF. Sin embargo, el aumento progresivo en la glucemia en un entorno de hiperlipidemia (rata ZDF), crea las condiciones idneas para la progresin hacia la intolerancia a la glucosa y la diabetes tipo 2. Diversos mecanismos son operativos para compensar la disfuncin generada en la clula , as como las posibles prdidas celulares por apoptosis. En este sentido, la
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proliferacin a nivel del islote intenta compensar la resistencia a la insulina y los defectos secretores a corto plazo. Sin embargo, la apoptosis creciente impide desarrollar dicha respuesta adaptativa en la rata ZDF a ms largo plazo. Los ligandos de los PPARs, como rosiglitazona y troglitazona, protegen a la clula contra la apoptosis cuando son administradas en estados prediabticos de hiperglucemia. La leptina tambin parece jugar un efecto protector en este modelo animal, reduciendo la acumulacin de triglicridos a nivel del islote al activar mecanismos de eliminacin de stos por -oxidacin. Sin embargo, estos mecanismos parecen funcionar ms eficientemente en periodos de prediabetes, cuando otros agentes estresantes como la glucosa apenas son operativos. Resultados muy similares han sido reproducidos en otros modelos animales como la rata OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) y la rata GK (Goto-Kakizaki), confirmando la teora de la glucolipotoxicidad. La rata OLETF se caracteriza por presentar una hiperglucemia y una hiperlipidemia progresivas, con posibilidad incluso de producir fibrosis a nivel de los islotes. Una caracterstica clave que la diferencia de la rata ZDF es que sus receptores de leptina son funcionales y que estas disfunciones mencionadas suelen aparecer tarde en el ciclo vital del animal, por lo que muchos investigadores sealan que este modelo se asemeja ms a la diabetes tipo 2 de los humanos. Estas alteraciones pueden retrasarse o prevenirse con frmacos ligandos agonistas de PPAR- (fenofibrato) y PPAR- (rosiglitazona), observndose al mismo tiempo un mantenimiento de la funcionalidad de los islotes. La rata GK desarrolla una diabetes tipo 2 que no viene acompaada de obesidad. Parece ser que estas ratas tienen un contenido en insulina menor (60% del normal) debido a una masa de clula reducida, lo que genera una situacin de hiperglucemia crnica. Si la condicin diabtica se agrava en este modelo animal, por ejemplo mediante una pancreatectoma, se observa que las clulas residuales carecen de la capacidad para regenerarse. Por otro lado, una dieta rica en grasa afecta a la respuesta secretora e induce la expresin de UCP-2. La administracin de un 30% de sacarosa en al agua de bebida incrementa la tasa de apoptosis en la clula por mecanismos mediados por desequilibrio oxidativo. La normalizacin de la glucemia con florizina produce una recuperacin parcial de la funcionalidad a nivel de la clula en la rata GK. Respecto a modelos de ratn, el equivalente a la rata ZDF, el ratn db/db tambin presenta recuperacin funcional del islote al tratar con pioglitazona, reduciendo los niveles de triglicridos. El tratamiento con antioxidantes tambin resulta beneficioso en este modelo animal.
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2.3 Evidencia en humanos

La diabetes tipo 2 es una enfermedad multifactorial en la que los componentes ambientales y la predisposicin gentica juegan un papel esencial. La transferencia de todo el conocimiento acumulado con los diferentes modelos celulares y de animales es todava muy compleja. Las evidencias directas de glucolipotoxicidad en humanos todava son escasas. Los estudios observacionales en determinados grupos han podido dar algunas claves en este sentido. As, los indios Pima han sido uno de esos grupos de estudio por su elevada prevalencia de la enfermedad y la limitada variabilidad gentica. Estos indios desarrollan diabetes tipo 2 conjuntamente con obesidad, resistencia a la insulina, disfuncin en la secrecin y gluconeognesis heptica incrementada. Un reciente estudio longitudinal ha establecido que la intolerancia a la glucosa (hiperglucemia) viene acompaada de un aumento de peso y resistencia a la insulina. Los estudios postmortem han confirmado en estos indios una reduccin de la masa de clula debida a mecanismos apoptticos. Sin embargo, tal y como se ha apuntado antes, son necesarios ms estudios para poder encontrar evidencias de que la glucolipotoxicidad juega un papel preponderante en el desarrollo de las disfunciones a nivel del islote en la diabetes tipo 2 en humanos.
3. Discusin
La complejidad para entender la diabetes tipo 2 reside en la gran variedad de factores que convergen en el desarrollo de la enfermedad. Esto hace muy difcil el diseo de estrategias para tratar, retrasar o prevenir este desorden. Est claro que la dieta es un pilar bsico, dado el efecto adverso de los nutrientes cuando stos se encuentran elevados de forma crnica. Sin embargo, esto requiere pacientes motivados y preparados, que controlen da a da las caloras ingeridas. Por otro lado, la diabetes se diagnostica en la mayora de los casos demasiado tarde para que una intervencin diettica pueda tener efectos positivos, recurriendo en estos casos al tratamiento farmacolgico e incluso a la inyeccin de insulina. Por ello, es esencial conocer los cambios moleculares que operan en la clula en condiciones de glucolipotoxicidad por 2 razones principales. En primer lugar
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para poder identificar marcadores moleculares que permitan establecer el estado de desarrollo de la enfermedad y poder aplicar un tratamiento a tiempo y adecuado. En segundo lugar, para poder identificar dianas moleculares que permitan el diseo de frmacos especficos que retrasen e incluso eviten la progresin del deterioro funcional en la clula pancretica. A da de hoy, no se dispone de marcadores especficos de la progresin de la enfermedad ni de tratamientos farmacolgicos eficientes al 100%. Sin embargo, hay que constatar que la investigacin ha permitido un espectacular avance en el tratamiento de la enfermedad que en nada se parece a la situacin que se viva hace algunas dcadas. Lejos de ser excesivamente optimistas por lo lejos que queda una aplicacin clnica inmediata de los hallazgos de la investigacin actual, s que se puede asegurar sin lugar a dudas que la investigacin debe continuar para poder ir avanzando poco a poco en la comprensin de los complejos mecanismos que subyacen en el desarrollo de la enfermedad diabtica. La tecnologa de los biochips (microarrays) puede ser una herramienta muy valiosa en la investigacin bsica en clula en condiciones de glucolipotoxicidad. Desde luego, el siguiente paso es validar los resultados obtenidos en modelos animales de la enfermedad e incluso en los propios pacientes diabticos. Los primeros intentos realizados por nuestro laboratorio en colaboracin con el laboratorio del Dr Marc Prentki (Universidad de Montreal, Canad) en clulas INS1 han revelado cambios importantes en grupos de genes clave para el funcionamiento de la clula , como por ejemplo factores de transcripcin, molculas de sealizacin, enzimas metablicos, protenas apoptticas y componentes de la maquinaria exocittica. Respecto al tratamiento farmacolgico, las evidencias experimentales apuntan que los ligandos de los PPARs podran jugar un papel clave en el tratamiento de las alteraciones observadas en condiciones de glucolipotoxicidad. Sin embargo, ste es todava un campo muy incipiente y quedan muchas cuestiones sobre la mesa. La primera hace referencia al amplio abanico de tejidos sobre los que estos compuestos pueden ejercer su accin. En este sentido, sera necesario encontrar ligandos que actuaran ms especficamente a nivel de la clula . En segundo lugar, todava se desconoce el perfil de expresin de los PPARs en clulas humanas en condiciones normales y en condiciones patolgicas. En tercer lugar, seran necesarios estudios farmacocinticos para establecer la dosis y el tiempo de actuacin de los frmacos en el organismo. Finalmente, los PPARs no
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son los nicos factores de transcripcin cuya expresin est alterada en condiciones de glucolipotoxicidad, sino que existen muchos otros factores cuya posible modulacin farmacolgica todava no ha sido conseguida con xito en modelos experimentales. Por otro lado, los procesos de muerte celular (apoptosis) que concurren en la clula vienen mediados, al menos parcialmente, por mecanismos de desequilibrio oxidativo. Por ello tratamientos farmacolgicos basados en la administracin de determinados antioxidantes podran tener tambin un cierto sentido. Esto viene adems corroborado por una presencia muy escasa de antioxidantes endgenos generados por la propia clula . De esta forma, el tratamiento con N-acetil cisterna o aminoguanidina en diversos modelos animales y clulas cultivadas redujo considerablemente los efectos deletreos causados por la glucolipotoxicidad. Sin embargo y al igual que en el caso anterior, todava quedan muchos puntos por resolver en este respecto. En primer lugar, hay que definir las dianas sobre las que deben actuar estos agentes antioxidantes para inducir una mejora en la funcin de la clula . Las posibles dosis de antioxidantes y los tiempos de actuacin todava estn por determinar con ms precisin. Finalmente y dado que la apoptosis parece ser el mecanismo dominante de muerte celular en el caso de la clula en condiciones de glucolipotoxicidad, cabra esperar que la administracin de frmacos antiapoptticos podra jugar un papel relevante a este respecto. Para ello sera importante nuevamente definir las rutas implicadas en este proceso en la patologa humana y encontrar marcadores especficos que permitieran el seguimiento y progresin de la enfermedad. En conclusin, aunque se ha avanzado mucho en este campo, la bsqueda de tratamientos farmacolgicos ms dirigidos y efectivos sigue siendo un desafo para la ciencia actual. La caracterizacin molecular de los cambios funcionales que operan en condiciones de glucolipotoxicidad es necesaria para poder seguir avanzando en este terreno. Un punto interesante a considerar es que esta hiptesis de la glucolipotoxicidad podra adems encontrar tambin interesantes implicaciones en la diabetes tipo 1. Aunque ha quedado muy bien establecido el componente autoinmune en esta patologa, cabra sealar la existencia de una etapa conocida como de luna de miel que suele ser de duracin variable y que todos los pacientes suelen experimentar antes de proceder a las inyecciones de insulina. De hecho esta fase requiere bajas dosis de insulina y algunos pacientes, los menos, suelen restaurar la funcin secre62
tora y detener la progresin hacia una diabetes abierta. Se podra postular que la presencia de sustancias txicas en circulacin, posiblemente altas y persistentes concentraciones de glucosa y cidos grasos, podran detener o interferir con la recuperacin de la clula . Esto podra explicar el fallo secretor de los modelos animales diabticos por inyeccin de estreptozotocina, donde el componente inmunitario es inexistente. Por otro lado, el transplante de islotes podra representar un interesante modelo de estudio de glucolipotoxicidad, estableciendo de esta forma pautas que permitan la supervivencia y la efectividad funcional del implante. Por todo ello, aunque todava queda mucho por estudiar, est claro que el deterioro de la clula parece ser progresivo en condiciones de hiperglucolipemia y parece estar relacionado con el tipo de nutriente, su concentracin y tiempo de exposicin. La investigacin bsica en este sentido es crucial para disear estrategias preventivas y teraputicas que permitan retrasar e incluso frenar la progresin de la diabetes tipo 2. La extensin de estos conocimientos a la diabetes tipo 1, de ser posible, supondra tambin un importante campo de actuacin en el tratamiento de esta patologa.
Agradecimientos Este trabajo ha sido realizado gracias a una ayuda concedida por la Generalitat Valenciana a Enrique Roche: GV06/334.
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CAPTULO 4
Lesin y Supervivencia de las Clulas Pancreticas
AUTORES
Francisco Bedoya* Juan Tejedo** Gladys Cahuana***
*Catedrtico de la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla **Contratado Doctor de la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla ***Ayudante de la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla
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La evidencia acumulada por un nmero considerable de artculos experimentales y clnicos indica que un descenso relativo absoluto de la masa de clulas pancreticas es el comn denominador de la diabetes tipo 1 y tipo 2. La reserva funcional del pncreas endocrino es considerable, por lo que los sntomas clnicos de comienzo de la enfermedad en el caso de la diabetes tipo 1 o de empeoramiento del cuadro metablico en el caso de la diabetes tipo 2 aparecen cuando la masa de clulas pancreticas es inferior al 10-20%. Una estrategia teraputica eficiente debera combinar el control de los factores causales de la enfermedad junto con la proteccin de la masa de clula residual y la atenuacin de los factores agravantes (control glucmico, control del sobrepeso, etc). No hay abordajes eficaces que combatan el proceso destructivo de la clula pancretica y tampoco hay tratamientos etiolgicos para esta enfermedad. Por ello, la proteccin frente al ataque inmunitario especfico (diabetes tipo 1) natural (diabetes tipo 2) pudiera constituir un objetivo de investigacin con buenas perspectivas de aplicacin en el tratamiento de ambas formas de diabetes. Los aspectos relacionados con la proliferacin, supervivencia y destruccin de la clula pancretica ha sido objeto de estudio por varios grupos de investigacin a lo largo de los 15 ltimos aos. Sus investigaciones y las de otros laboratorios estn generando un modelo patognico en el que la muerte celular por apoptosis de la clula junto con una capacidad limitada de regeneracin de la clula a partir de sus clulas progenitoras conducen a una insuficiencia del pncreas endocrino para controlar el metabolismo energtico del organismo Los efectos colaterales de esta prdida de control conducen a complicaciones importantes que estn asociadas con una glucemia elevada. La muerte de la clula es el factor clave en la diabetes tipo 1, ya que cuando la masa celular disminuye por debajo de unos niveles crticos, aparecen los sntomas clnicos que a su vez son reflejo de la hiperglucemia grave y de las complicaciones metablicas resultantes. En cambio, este proceso destructivo tiene un papel ms insidioso en la diabetes tipo 2, ya que los estudios sobre la masa de clulas en la diabetes tipo 2 muestran resultados contradictorios. Ello sea debido probablemente a que la masa de clulas vara a lo largo de la historia natural de la enfermedad. Una evidencia clara del papel de la muerte celular en estados tardos de diabetes tipo 2 proviene de estudios realizados en modelos animales de diabetes tipo 2 como el roedor Psammomys obesus, que desarrolla la enfermedad durante el cautiverio y cuando es alimentado con una dieta rica en energa. Entonces, la enfermedad se inicia con hiperinsulinemia/normoglu68
cemia y resistencia a la insulina y evoluciona a hiperglucemia y muerte de la clula . Una situacin parecida podra tener lugar en personas en las que la evolucin de su diabetes conduce a un estado en el que se necesita la administracin de insulina para controlar la glucemia. La evidencia experimental sugiere que la hiperglucemia y otros factores como una concentracin elevada de cidos grasos libres estn implicados en el proceso de muerte celular apopttica de la clula pancretica en estos casos de Diabetes tipo 2 insulinodependiente. La apoptosis es un proceso de muerte celular regulada que participa en el modelamiento del organismo durante el desarrollo embrionario y en el control de las poblaciones celulares en la vida adulta. Tanto el exceso de muerte apopttica como su defecto estn actualmente implicados en el desarrollo de numerosas enfermedades. Esta va de muerte programada est regulada de una manera compleja y bsicamente consiste en su control por seales extracelulares de muerte que ponen en marcha un proceso autodestructivo en el que la mitocondria actuara como arsenal que libera factores apoptognicos que inician un proceso de destruccin de protenas claves para la supervivencia celular y del ADN. Estas seales extracelulares de muerte pueden ser protenas producidas por otras clulas que este caso actuaran como inductoras de muerte, pero tambin pueden ser molculas pequeas que pueden llegar a ser txicas para clulas con defensas disminuidas incluso factores ambientales como radiaciones, o sustancias presentes en los alimentos. Es importante resaltar que la muerte celular por apoptosis es consecuencia de una accin predominante de factores denominados pro-apoptticos y que las clulas tienen mecanismos de defensa que contrarrestan buena parte de las seales exgenas de muerte que est recibiendo. Por ello, el destino final de la clula resulta de la capacidad que tienen sus sistemas de defensa para contrarrestar el ataque. Dada la complejidad del proceso de muerte celular por apoptosis y de su regulacin, los estudios experimentales realizados en modelos animales y celulares de diabetes tipo 1 y 2 muestran un escenario diverso. Los estudios realizados con tejido pancretico pacientes diabticos fallecidos por otras causas, han sido poco reveladores ya que dado el carcter progresivo de este proceso destructivo, slo en algunos casos se ha encontrado evidencia clara que muestre un proceso apopttico activo, ya que sta es una muerte limpia, que no suele dejar huellas. Por todo ello, los modelos animales y celulares de diabetes tipo 1 fundamentalmen69
te han sido muy tiles para perfilar el proceso apoptico en la clula . La naturaleza de los antgenos celulares, su mecanismo de presentacin al sistema inmune y la reaccin anmala de este sistema que subyacen a todo el proceso son expuestos en otro captulo de esta monografa. En lo que se refiere a los mecanismos de destruccin celular propiamente dichos, las citoquinas solubles del tipo interleuquina 1, interfern y factor de necrosis tumoral alfa tienen una accin apopttica marcada sobre clulas y podran por tanto estar implicados en el proceso destructivo en la diabetes. Buena parte de las acciones deletreas de la interleuquina 1 dependen de la produccin de xido ntrico en el interior de la clula. Esta molcula tiene diversas acciones dependiendo de su concentracin en el interior de la clula y de su combinacin con otras molculas generadas en situaciones de estrs oxidativo. La interleuquina-1 induce la expresin de una forma muy activa de la enzima que cataliza la generacin de xido ntrico a partir del aminocido arginina la isoforma 2 de la sintasa del xido ntrico (NOS2). En estas condiciones, la produccin de altas concentraciones de xido ntrico desborda los mecanismos de neutralizacin que por otra parte son poco eficaces en la clula y por tanto se pone en marcha el proceso de destruccin celular por apoptosis.
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El estrs oxidativo inducido por el xido ntrico conduce a una peroxidacin lipdica con generacin de productos derivados de la peroxidacin avanzada que inducen una alteracin oxidativa importante de protenas mitocondriales implicadas en la apoptosis. La mitocondria es un almacn de molculas proapoptticas y alteraciones incluso transitorias de su permeabilidad conducen a la salida de factores como el citocromo c y otras molculas bien caracterizadas. El citocromo c as liberado en el citoplasma participa en la activacin de proteasas que degradarn sustratos proteicos especficos. Otros factores mitocondriales como el Factor Inductor de Apoptosis (AIF) y SMAC/DIABLO estimulan procesos apoptticos en el ncleo (fragmentacin del ADN en escalera) neutralizan inhibidores naturales de la apoptosis cuya funcin es la de bloquear activaciones espontneas de la cascada apopttica. Pues bien, la salida de factores apoptognicos est controlada por cambios transitorios en su permeabilidad inica. La estructura reponsable del trasiego de iones y agua y que est implicada en el proceso apopttico, es un complejo multiproteico denominado poro PT. Un componente clave de este poro PT es la protena transportadora de nucletidos de adenina (ANT). Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran que esta protena es una diana del dao oxidativo inducido por el xido ntrico; otra protena implicada en el control de la apoptosis es Bcl-2, que desempea mltiples funciones como las de formar dmeros y neutralizar las acciones proapoptticas de otras protenas de su familia, o actuar como antioxidante eficaz. Esta protena est incrustada en las membranas de organelas subcelulares como mitocondria y ncleo. Nuestro grupo ha observado que la degradacin de esta protena es un acontecimiento inicial en el proceso apopttico iniciado por el oxido ntrico en las clulas secretoras de insulina y que su carbonilacin es un marcador para su degradacin. Estos hallazgos proceden de estudios con inhibidores de la carbonilacin, en los que se aprecia una inhibicin de la degradacin de la protena Bcl-2, as como un bloqueo de las acciones apoptticas del xido ntrico. Datos recientes sugieren que el proceso de apoptosis en clulas es dependiente de una sobreregulacin y subregulacin transcripcional paralela y/o secuencial de un considerable numero de genes Pero el xido ntrico desempea otras funciones relevantes para la fisiologa de la clula . Cuando se produce en cantidades moderadas, juega un papel regulador de la respuesta secretora de esta clula. Adems, es un potente factor contra la apoptosis producida por la ausencia de factores trficos. Nuestro grupo ha descrito que la produccin de bajas concentraciones de NO -bien generado exgenamente o bien generado dentro de la clula por activacin de las isoformas constitutivas (NOS1 y
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NOS3)- protegen de la apoptosis. Esta accin protectora del NO depende de la activacin de la c-Src tirosina quinasa y del sistema de la sGC/PKG. Por ltimo, hemos descrito que la activacin de c-Src es un evento temprano en la sealizacin antiapopttica que conduce a la activacin del sistema PI3K/Akt/Bad. Nuestro grupo ha descrito tambin la implicacin de las protenas sustrato del receptor de la insulina (IRSs) en la sealizacin protectora del NO en la clula . En dicha respuesta protectora participa la fosforilacin de IRS-1, que tambin es dependiente de la activacin de c-Src. Se han descrito dianas adicionales del NO en otros sistemas celulares. As, la va Ras/Raf1/ Elk-1 se activa en linfocitos T en presencia de NO, lo que sugiere que este mensajero gaseoso puede participar en la regulacin de una importante ruta sealizadora de proliferacin. Por otro lado, se ha descrito en clulas endoteliales que la respuesta antiapopttica iniciada por factores de crecimiento est ligada a la activacin de Raf-1. Esta activacin de Raf-1 desencadenada por el factor de crecimiento vascular (VEGF) est asociada a la fosforilacin de sus residuos de tirosina 340 y 341 en un proceso dependiente de c-Src . Dado que el cultivo en ausencia de suero conduce a la muerte por apoptosis de la clula , es razonable proponer que la supervivencia y el crecimiento de la clula est modulado por factores trficos extracelulares. Se haba descrito previamente que el IGF-1 era capaz de bloquear la respuesta apopttica inducida por citoquinas inflamatorias en la clula . Por este motivo, nuestro grupo inici una serie de experimentos encaminados a estudiar el papel del NO en la sealizacin del sistema IGF-1/insulina. Nuestros resultados muestran que la retirada de suero provoca la apoptosis celular que se acompaa de un descenso en los niveles de la protena eNOS/NOS3 y de la produccin de NO. Estos efectos se cancelan sustancialmente tras la exposicin de las clulas a insulina IGF-1. Adems, los efectos protectores de la insulina/IGF-1 se cancelan en buena proporcin con inhibidores de la NOS. La sealizacin por protenas IRS est involucrada en las acciones antiapotticas de estos factores y la activacin por fosforilacin de estas protenas es un proceso parcialmente dependiente de la activacin de Src y del NO. El perfil de protenas IRS de las clulas RIN muestra que ambas IRS-1 y 2 pueden estar involucradas en la transmisin de la seal antiapopttica . Queda por determinar el papel de las diferentes IRS en clulas diferenciadas murinas y humanas. Por una parte, se ha descrito que la protena IRS-2 juega un
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papel relevante en el control de la masa de clulas durante el desarrollo del pncreas en ratones . Por otro lado, los hallazgos de que la variante polimrfica Arg972 IRS-1 que es abundante en diabticos tipo 2 causa apoptosis en islotes humanos in vitro, indican que esta IRS puede jugar un papel relevante en humanos. En este sentido, tambin son relevantes los estudios con una insulina modificada [LysB3, GluB29], que posee una accin protectora sobre la clula b asociada con una unin ms fuerte al receptor .
La figura resume la red de acciones antiapotticas del NO que hemos descrito en la clula pancretica. Los procesos de apoptosis/supervivencia celular implican, adems de la activacin de vas de sealizacin intracelulares, la modificacin de la transcripcin de un cierto nmero de genes. En este contexto, parece razonable plantear la hiptesis de que la expresin de un conjunto de genes antiapoptticos estara incrementada en respuesta a seales de supervivencia celular; la expresin de genes proapotticos estara, por el contrario, disminuida. La funcin clsica de la acetilacin de las histonas es la de permitir la descompactacin de la cromatina como paso previo a la expresin de genes. Se ha mostrado recientemente que las histonas acetilasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC) actan como coactivadores y correpresores respectivamente en la expresin y silenciamiento gnico y que tambin juegan un papel importante en la acetilacin de factores de transcripcinn. As, la acetilacin de los grupos -amino de
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residuos especficos de lisina de las histonas H3 y H4 estn asociados con su neutralizacin y con la exposicin de zonas promotoras de genes y el inicio de su transcripcin. El reclutamiento de HAT a genes especficos depende de la interaccin de factores de transcripcin con sus secuencias especficas en las zonas potenciadoras (enhancers). Si bien quedan por definir los factores que permiten la unin de estos factores a sus enhancers, la acetilacin de histonas forma parte de los procesos biolgicos implicados en la regulacin de la expresin de genes. Su relevancia biolgica queda reflejada en el hecho de que el patrn de acetilacin de las histonas est alterado en lneas tumorales y en cnceres en humanos. Por ltimo, frmacos inhibidores de las HDAC estn siendo evaluados en ensayos clnicos para el tratamiento del cncer. De hecho, hay una acetilacin incrementada de las histonas H3 y H4 en clulas cultivadas en medio carente de suero. Adems, la accin protectora del NO se asocia con un descenso la acetilacin de ambas histonas. Por otra parte, nuestro grupo ha encontrado que el incremento en la acetilacin de histonas provocado por la Tricostatina A (inhibidor de las HDACs) est asociado con la puesta marcha del programa apopttico en la clula pancretica y con la expresin incrementada de protenas proapoptticas. La regulacin epigentica de la expresin de genes involucrados en la supervivencia y muerte de la clula est siendo objeto de una creciente atencin por varios grupos de investigacin. Si bien queda por establecer el papel de la acetilacin de protenas histonas y no histonas en la sealizacin protectora de Insulina/IGF-1 en clulas secretoras de insulina, tiene relevancia el hallazgo de que el programa de supervivencia en el gusano C. Elegans dependiente la insulina/IGF-1 implica a una protena desacetilasa dependiente de NAD (Sir-2). La posible implicacin de las HATs/HDACs en el control de la expresin de diabetogenes durante la patognesis de la diabetes ha sido propuesta recientemente en una extensa revisin sobre el tema as como la posible utilidad como diana terapetica en el tratamiento farmacolgico de la diabetes.
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Ya que el NO juega un papel relevante en la regulacin de la supervivencia y muerte de la clula pancretica, entendemos que puede formar parte de la sealizacin protectora desencadenada por factores del tipo de la insulina, el IGF-1, el GLP-1, y de su agonista la exendina, etc. Esta hiptesis se apoya adems en la accin estimuladora de la insulina sobre la produccin de NO en clulas endoteliales. El islote de Langerhans es una estructura muy vascularizada y el flujo sanguneo est controlado por nutrientes como la glucosa y por factores trficos. Es posible que el NO generado localmente por las clulas endoteliales ejerza efectos trficos sobre las clulas endocrinas del islote. Alternativamente, la especificidad de las acciones trficas del NO sobre la clula pancretica dependera de la sntesis de este mediador gaseoso en la propia clula en un proceso desencadenado por la interaccin de factores trficos con sus receptores especficos. Dado que la clula del pncreas tiene receptores para la insulina y responde al IGF-1, as como a incretinas como GLP-1 y al propio glucagn, es factible que alguno de estos factores participe en la regulacin de la produccin endgena de NO. Resulta especialmente atractiva la idea de que la insulina tenga alguna accin sobre la propia clula que la produce. El posible papel autocrino de la insulina ha sido estudiado a lo largo de los aos con resultados conflictivos. La evidencia experimental indica que la insulina no regula de manera determinante su secrecin. Sin embargo, la anulacin del gen para la protena sustrato para el receptor de la insulina IRS-2 en este
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tipo celular conlleva a un desarrollo defectuoso del pncreas endocrino y a la diabetes en ratones. Este hallazgo muestra que esta va de sealizacin intracelular juega un papel relevante durante la organognesis del pncreas y que su puesta en marcha por factores como el IGF-1 pudiera ser relevante durante el perodo del desarrollo embrionario y fetal. Esta va de sealizacin pudiera jugar tambin un papel en la vida adulta, interviniendo en el control de la regeneracin de la masa celular y en la generacin de factores de supervivencia antiapoptticos que permiten al pncreas modular su masa en respuesta a demandas sostenidas del organismo y hacer frente a situaciones de ameneza como el estrs metablico/ oxidativo y el ataque de la inmunidad adquirida/natural. Un fallo en este sistema de proteccin pudiera estar involucrado en la gnesis de ambas formas de diabetes, bien por condicionamientos genticos, bien por su capacidad limitada para hacer frente a estmulos lesivos o bien por una disfuncin provocada por el propio proceso que destruye a la clula . En este sentido, es interesante pensar que las citoquinas inflamatorias bloqueen la sealizacin a travs de esta ruta de supervivencia en la patognesis de ambas formas de diabetes en humanos.
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Bibliografa seleccionada
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El Islote Pancretico y Supervivencia deTratamiento?de la Diabetes Lesin en el Desarrollo y las Clulas Pancreticas
CAPTULO 5
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica
AUTORES
Anna Novials Sard* Slvia Casas Fontdevila**
*Endocrinloga. Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol **Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol
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1. Amiloide pancretico
Amiloidosis engloba un grupo de entidades clnicas caracterizadas por el depsito extracelular de protenas de estructura fibrilar en rganos y tejidos. Algunas formas de amiloidosis fueron consideradas como un fenmeno inespecfico asociado al proceso de envejecimiento. No obstante, el aumento de la longevidad y la mejor definicin clnica de las enfermedades crnicas han demostrado que el depsito de amiloide puede ser especfico para determinadas enfermedades, como son las placas de amiloide en el tejido nervioso de la enfermedad de Alzehimer o el amiloide pancretico en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). El trmino amiloide fue introducido por Virchow en 1853, basndose en las propiedades tintoriales de los depsitos amorfos en las secciones histolgicas: los rganos infiltrados adquiran coloracin negruzca al ser tratados con yodo, de forma anloga al almidn (del griego amylos, almidn). A pesar que cada tipo de amiloidosis se caracteriza por la agregacin y deposicin de una protena fibrilar especfica, los depsitos de sustancia amiloide comparten caractersticas histoqumicas y una morfologa estructural parecida. En primer lugar, durante el proceso de formacin, aparecen oligomeros solubles del componente proteico, los cuales pasan a adoptar una estructura secundaria en conformacin beta, lo que significa que las cadenas polipeptdicas estn dispuestas en lminas plegadas, unidas transversalmente mediante enlaces de hidogeno intercatenarios. La presencia de una estructura cuaternaria se muestra con un aspecto tpico al microscopio electrnico, en la que la sustancia amiloide est constituida por agregados fibrilares rgidos, lineares no ramificados, de 7-10 nm de dimetro y de longitud variable. Todos los depsitos de amiloide, independientemente de la protena especfica formadora de fibras, contienen protenas comunes, como la glucoprotena denominada SAP (serum amyloid P component), los componentes del complemento C1q y C3, la apoprotena E y los proteoglicanos del tipo heparn sulfato. La presencia de depsitos de sustancia amiloide en los islotes pancreticos es una caracterstica fisiopatolgica en la diabetes mellitus tipo 2, que se ha descrito en mas del 90% de las necropsias de los pacientes afectos de dicha enfermedad. Estos depsitos fueros originalmente descritos por Opie en 1900, pero debido a su elevada insolubilidad que dificultaba el anlisis de los compuestos qumicos, se pens errneamente que consistan en depsitos de insulina. Fue en 1986 cuando Westermark et al. (1) aislaron el principal componente proteico a partir de un insu80
linoma pancretico, siendo purificado y secuenciado parcialmente. En 1987, Cooper et al. (2) identificaron un pptido idntico en extractos de tejido pancretico rico en amiloide procedente de pacientes diabticos. Se trataba de una protena de 37 aminocidos, sintetizada y secretada por las clulas beta pancreticas, llamada amilina o IAPP (islet amyloid polypeptide).
2. Amilina: sntesis, secrecin y funciones biolgicas

La amilina presenta homologa estructural del 43 y 46%, respectivamente, con los neuropptidos CALCA y CALCB (calcitotnin gene-related polypeptides), sintetizados por las clulas C de la glndula tiroides. Los tres pptidos tienen longitud idntica, residuos de cistena en la posicin 2 y 7, y presentan dos modificaciones postraduccionales homlogas (amidacin del residuo carboxiterminal y un puente disulfuro intramolecular). Ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un alto grado de conservacin entre diferentes especies de mamferos, lo que sugiere puede tener una significativa funcin biolgica. La amilina es sintetizada en la clula beta a partir de un precursor proteico de 89 aminocidos, la preproamilina. En el retculo endoplasmtico se realiza la escisin proteoltica de la secuencia de 22 aminocidos del pptido seal, liberndose la proamilina de 67 aminocidos. Las modificacioes postraduccionales para formar la amilina madura incluyen perdida de los propptidos aminoterminal (11 aminocidos) y carboxiterminal (19 aminocidos) por enzimas proteasas convertasas (NEC2 y NEC1/3) responsables tambin del procesamiento de la proinsulina. En el extremo carboxiterminal, la seal dibsica est procedida de una glicina, lo que permite la amidacin de la tirosina en la posicin 37 de la amilina madura. Modificaciones adicionales incluyen la formacin de un puente disulfuro entre los residuos 2 y 7 de cistena. La amilina se localiza juntamente con la insulina en los grnulos secretores de las clulas beta pancreticas. Existen evidencias en humanos de que se secreta juntamente con la insulina en condiciones basales y en respuesta tanto a la glucosa como a diferentes estmulos secretagogos. Experimentos in vitro con islotes humanos aislados han demostrado que la regulacin del gen de amilina depende de las concentraciones de glucosa y de las seales derivadas de su metabolismo de una forma similar al gen
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de la insulina (3,4). En la mayora de condiciones, los cambios de secrecin de la amilina se producen de forma paralela a los cambios en la secrecin de insulina, constituyendo aproximadamente una relacin equimolar entre 1/20 y 1/50. Entre sus acciones biolgicas para algunas de las cuales se han descrito receptores especficos, destaca la inhibicin de la secrecin de glucagon, el estmulo sobre el eje renina-angiotensina, el retraso del vaciamiento gstrico, y la inhibicin sobre los centros hipotalmicos reguladores del apetito. Algunas de estas acciones se estn estudiando como tratamiento coadyuvante de la insulina para ciertos casos de diabetes.
3 Factores determinantes para la formacin del depsito de amiloide en la DM2

A pesar de que ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un alto grado de conservacin entre diferentes especies de mamferos, nicamente humanos, primates y gatos expresan una forma de amilina capaz de formar depsitos de sustancia amiloide. Los residuos 20-29, localizados en el centro de la secuencia de aminocidos de la amilina, presentan un mayor grado de variabilidad entre especies, y son crticos para la formacin de la estructura secundaria beta. En esta regin, tres residuos de prolina estn presentes en la amilina de rata y ratn. Puesto que la prolina inhibe el cambio a conformacin beta, la presencia de tres residuos de prolina en sta regin crtica de la amilina prevendra de la formacin de lminas beta plegadas necesarias para la creacin de fibras amiloides y explicara la ausencia de amiloidosis pancretica en roedores. sta hiptesis ha sido demostrada en experimentos donde se substituyen aminocidos en la regin 20-29 de la amilina humana, vindose modificadas las propiedades amiloidognicas del pptido. En este sentido, se iniciaron estudios genticos poblacionales en busca de mutaciones en el gen de la amilina que pudieran dar origen a cambios crticos en la secuencia del pptido, y que pudieran explicar la presencia de depsitos de amiloide en individuos diabticos. La mutacin S20G fue descrita en poblacin japonesa en el 4% de pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estudios in vitro confirmaron que, la substitucin de serina en la posicin 20 por glicina de la molcula de amilina mutada, otorga mayor potencial amiloidognico. No obstante, esta mutacin no ha sido detectada en otras poblaciones estudiadas de origen caucsico. La presencia de depsitos de amiloide es excepcional en individuos sanos no diabti82
cos. Por tanto, la secuencia crtica amiloidognica de la amilina es necesaria, pero no suficiente, para la formacin de tales depsitos en los islotes pancreticos de pacientes con DM2. En consecuencia, otros factores estaran involucrados en el proceso de amiloidognesis para explicar la frecuente asociacin entre amiloide y DM2. En condiciones fisiolgicas, la amilina no forma fibras de amiloide, sugiriendo que deben existir mecanismos en la clula beta pancretica que mantengan la estructura nativa de la amilina. El nivel de pH y la concentracin de calcio estn altamente controlados en el granulo de secrecin para permitir el correcto trfico y maduracin de la insulina y amilina. Alteraciones en ambos parmetros se han relacionado con anomalas en el proceso de formacin de amiloide. Parece que un ambiente normal dentro del grnulo de secrecin mantiene la amilina en forma soluble no fibrilar. Asimismo, estudios in vitro sugieren que una proporcin molar normal entre amilina e insulina, proinsulina o pptido C protegera de la formacin de fibras de amiloide, puesto que insulina y amilina pueden formar complejos estables que impiden el cambio a conformacin beta. Alteraciones en cualquiera de estos componentes del grnulo de secrecin, que bien se puede dar en una situacin de disfuncin de la clula beta pancretica, podran contribuir a la formacin de fibras de amiloide. La DM2 est asociada a niveles elevados de glucosa y cidos grasos libres, condiciones que pueden contribuir a la formacin de depsitos de amiloide. La hiperglucemia crnica en combinacin con el estrs oxidativo da lugar a la formacin de AGEs (advanced glycation end products). Existen evidencias de glicosilacin de amilina por AGEs en la diabetes, as como que la amilina glicosilada tiene mas potencial amilogognico que el pptido no modificado. Situaciones en que la disfuncin de la clula beta provoca una secrecin elevada de proinsulina, es decir que se incrementa el ratio proinsulina respecto a insulina, es un hecho observado en la diabetes, y en individuos con riesgo de padecer la enfermedad. Dado que proamilina es procesada por las mismas proteasas que la insulina, se postula que la disfuncin de la clula beta provocara una alteracin en el procesamiento de la amilina, que conducira a su precipitacin y acumulo en el espacio pericapilar. Se ha propuesto que la sobre-expresin de amilina podra conducir tambin a la acumulacin y agregacin del pptido. Ensayos in vitro utilizando amilina sinttica muestran que es posible generar fibras de amilina espontneamente, y que ste proceso depende mayoritariamente de la concentracin inicial de pptido (figura 1). La expresin de amilina en modelos celulares mediante promotores potentes, como
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FIGURA 1
Morfologa de los depsitos de amiloide pancreticos

A A: Obtencin de fibras de amilina humana mediante ensayos in vitro utilizando pptido sinttico, tincin negativa de stas y anlisis morfolgico mediante microscopio electrnico de transmisin. B: Morfologa ultraestructural de clulas beta pancreticas cultivadas con concentraciones amiloidognicas de amilina humana. Derecha: La formacin de fibras de amilina (indicadas con flechas) induce importantes alteraciones en la membrana plasmtica (indicadas con asteriscos), tales como plegamientos e invaginaciones. Izquierda: Cultivo control. Casas et al: (8)
promotores vricos, han reproducido la formacin de depsitos de amiloide. Existen tambin diversos modelos de animales transgnicos para la amilina humana dnde se han detectado depsitos de amiloide. En humanos, en una situacin de actividad excesiva de la clula beta, es posible observar la formacin de depsitos de amiloide, siendo el ejemplo ms demostrativo el amiloide asociado a insulinomas. Tambin se ha documentado abundante amiloide insular en pacientes con hiperpla84
sia de islotes pancreticos. Por otro lado, existe el caso de los pacientes no diabticos con insuficiencia renal terminal, en los que junto a elevadas concentraciones de amilina se ha descrito una mayor prevalencia de amiloide pancretico en relacin con sujetos no diabticos y sin insuficiencia renal. Estudios realizados por nuestro grupo de investigacin en poblacin diabtica han detectado en la regin promotora del gen de la amilina la presencia de una mutacin, consistente en la substitucin guanina por alanina, en la posicin -132 bp del punto de inicio de transcripcin (5)(figura 2). Dicha mutacin presenta una frecuencia significativamente superior en poblacin diabtica en relacin con la poblacin control (10.1% vs. 0.9%). Asimismo, los niveles de amilina en los individuos portadores eran significativamente superiores a los de los individuos diabticos no portadores. Estudios in vitro han demostrado que dicha mutacin causa un incremento de la actividad transcripcional del gen (6), capaz de producir una sobreexpresion de la amilina, sugiriendo que podra desempear un papel potencial en la formacin de depsitos de amiloide.
FIGURA 2
Anlisis de la mutacin 132 G/A de la regin del promotor del gen de amilina.
NO PORTADOR
HOMOZIGOTO
HETEROZIGOTO
Figura 2. Anlisis de la mutacin 132 G/A de la regin del promotor del gen de amilina. A: Deteccin de distintos patrones de migracin del ADN genmico de pacientes con DM2, mediante tcnica de SSCP. Carriles 1 y 6, patrn normal. Carriles 2,3 y 4 patrn heterozigoto. Carril 5, patrn homocigoto. B: Secuenciacin de ADN de las muestras anteriores donde se detecta el punto mutado de cambio de base guanina por adenina. En las muestras heterozigotas se detectan dos picos superpuestos que representan los dos alelos distintos de ADN. Novials et al (5)
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No existe todava un claro consenso en relacin al lugar donde se inicia la formacin de amiloide. Las necropsias de pncreas diabticos humanos, de gato, o de primates no humanos indican la formacin de los depsitos siempre extracelulares a la clula beta pancretica y cerca de los capilares. Slo en modelos de sobreexpresin de amilina, tales como animales transgnicos, lneas celulares expresando amilina humana mediante promotores gnicos potentes, o en insulinomas humanos, se ha detectado depsitos de amiloide dentro de la clula beta pancretica.
4. Citotoxicidad de la amilina
Actualmente se considera que la asociacin entre formacin de amiloide y citotoxicidad es comn para la mayora de amiloidosis, y se produce por induccin de apoptosis. La formacin de depsitos de amiloide en los islotes pancreticos se caracteriza in vivo por presentar una reduccin del 40 al 50% de masa celular beta pancretica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estudios con animales transgnicos o lneas celulares expresando amilina humana han demostrado su capacidad citotxica. Asimismo, varios estudios in vitro muestran que la citotoxicidad por amilina humana es concentracin-dependiente para varios tipos celulares, incluidas las clulas beta pancreticas. Sin embargo, existen aun varios puntos crticos que estn por clarificar. Por ejemplo, cabe preguntarse cual es el estado de agregacin y conformacin de la amilina citotxica? as cmo cual es el mecanismo detallado de induccin de apoptosis? Los primeros estudios dirigidos a investigar los mecanismos de citotoxicidad por amilina en islotes pancreticos humanos fueron realizados por Lorenzo et al. (7), y demostraron una correlacin directa entre muerte celular por apoptosis y presencia de fibras insolubles de amilina humana en contacto con los islotes. Se demostr tambin que los agregados solubles de amilina humana no eran txicos, ni tampoco amilina de rata que no es capaz de formar fibras insolubles. La citotoxicidad de amilina humana fue confirmada en varias lneas celulares neuronales y pancreticas, tratadas con elevadas dosis del pptido en forma insoluble, aportando evidencias adicionales de la apoptosis como el proceso responsable de muerte celular. Por otra parte, estudios in vitro identificaron alteraciones en la expresin de varios genes relacionados con vas especficas
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de induccin apopttica. Se ha asociado citotoxicidad de la amilina humana con formacin de ROS (reactive oxygen species). De hecho, han sido descritos marcadores de estrs oxidativo en clulas tratadas con amilina humana. Otra caracterstica de la citotoxicidad de la amilina humana es la induccin de alteraciones en los niveles intracelulares de calcio, documentada en estudios in vitro en varios modelos celulares. Resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de investigacin muestran que alteraciones en la homeostasis intracelular del calcio son crticas para la viabilidad de la clula beta pancretica. Tales alteraciones conllevan a la aparicin de estrs de retculo endoplasmtico, que a su vez influirn sobre la cascada de sealizacin de apoptosis (8). En las necropsias de pncreas diabticos humanos y de animales transgnicos se observan alteraciones morfolgicas en la membrana plasmtica de las clulas beta pancreticas en contacto con los depsitos de amiloide extracelulares. Lorenzo et al. (7) demostraron que para detectar citotoxicidad por amilina humana era necesario el contacto de las fibras insolubles con los islotes. Para el estudio de las interacciones de la amilina humana con la membrana celular plasmtica se han utilizado, en la mayora de los trabajos, membranas fosfolipdicas artificiales. Mirzavecov et al. (9) demostraron que concentraciones citotxicas de amilina humana causaban un incremento de la conductancia a travs de la membrana celular, sugiriendo como posible mecanismo de accin, la formacin de canales permeables a iones. Se obtuvieron resultados similares con concentraciones citotxicas del pptido amiloide de Alzehimer pero no con amilina de rata. Estos hallazgos corroboran la especificidad de la molcula humana para desarrollar fibras txicas. Por otro lado, el grupo de Janson et al. (10) evidenciaron diferencias en la capacidad de elevar la conductancia de membrana al tratar in vitro con concentraciones de amilina humana recin disuelta versus administracin de fibras de amilina maduras. A partir de estos trabajos surgi la hiptesis de que durante la formacin de fibras de amilina, aparecen oligomeros solubles de amilina, especies transitorias con conformacin diferente al monmero original, y que serian desde el punto de vista citotxico, ms agresivas que las fibras de amilina maduras. sta capacidad seria compartida por otros pptidos amiloides, tales cmo Ab, pero se propone cmo mecanismo el incremento de la permeabilidad de membrana, independiente a la formacin de canales inicos o a la disrupcin de la integridad de la membrana plasmtica. En la actualidad, ste es un campo interesante de investigacin en pleno desarrollo.
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5. Depsito de amiloide y DM2: un componente precoz o tardio?

Cul seria la relacin entre amiloide pancretico y la patogenia de la DM2?, Podemos establecer realmente si el fenmeno de amiloidognesis es una complicacin de la diabetes o se trata de un efecto casual? Desafortunadamente, la relacin entre amiloide, diabetes, resistencia a la insulina y disfuncin de la clula beta, es muy difcil de establecer in vivo, y no existen marcadores clnicos que puedan cuantificar el proceso, debido en parte a que las biopsias pancreticas son ticamente inaceptables. Estudios longitudinales en monos muestran la aparicin de depsitos de amiloide antes del desarrollo de la diabetes. En cambio, en pacientes diabticos de larga evolucin, en el anlisis de las autopsias de pncreas el grado de amiloidosis puede ser muy variable, desde tan solo un 1% de los islotes con pequeos cmulos perivesculares, hasta un 90% de afectacin con grandes cmulos que desplazan y destruyen las clulas insulares. De estos hallazgos podemos deducir que el papel del amiloide en el inicio y progresin de la diabetes en el hombre es extremadamente complejo y se requiere ms amplios estudios para determinar su importancia etiopatognica. La creacin de animales transgnicos proporcion la oportunidad de estudiar el efecto de un factor determinado en una enfermedad multifactorial como es la diabetes. Los ratones transgnicos heterocigotos iniciales que sobreexpresaban la amilina humana no fueron capaces de formar depsitos de amiloide, pero si en ciertos casos en ratones homocigotos. Estos hallazgos indican que la citotoxicidad de la clula beta inducida por el transgn depende de los valores de expresin del gen. Incrementos en la incidencia de aparicin de amiloide se consigui al tratar los animales transgnicos con hormonas de crecimiento y dexametasona para inducir resistencia a insulina, o al cruzarlos con animales modelos genticos de obesidad (mutantes para los genes Agrp o leptina). En los animales trangnicos para amilina humana y ob/ob, el grado de amiloidosis se correlacion significativamente con la severidad de diabetes. Mediante el estudio de los diferentes animales transgnicos se propuso que los depsitos de amiloide eran tanto causa como consecuencia de la DM2. As, los depsitos de amiloide podran ser una consecuencia de la sobreproduccin de amilina que acompaa a la sobreproduccin de insulina, y a continuacin, contribuiran a la degeneracin y prdida de masa celular beta del islote.
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6. Conclusiones
El papel de la amilina sigue siendo enigmtico, a pesar que hace ya ms de un siglo que se conoce su implicacin en la diabetes. La complejidad de este pequeo pptido pancretico lo ha hecho muy atractivo para un gran nmero de cientficos que siguen investigando a nivel molecular el proceso de amiloidognesis, as como la forma de revertir la formacn de fibras de amilina. La sntesis de nuevos frmacos que inhiban la formacin de fibras de amiloide podr representar una nueva opcin teraputica para la DM 2.
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1. Westermark P, Wernstedt C, Wilander E, Hyden DW, OBrien TD, Johnson KH. Amyloid fibrils in human insulinoma and islets of Langerhans of the diabetic cat are derived from a neuropeptide-like protein also present in normal islet cells. Proc Natl Acad Sci USA 84:38813885, 1987. 2. Cooper GJ, Willis AC, Clark A, Turner RC, Sim RB, Reid KB. Purification and characterization of a peptide from amyloid-rich pancreases of type 2 diabetic patients. Proc Natl Acad Sci USA 84:8628-8632, 1987. 3. Novials A, Sarri Y, Casamitjana R, Rivera R, Gomis R. Regulationa of islet amyloid polypeptide in human pancreatic islets. Diabetes 42: 1514-1519, 1993 4. Gasa R, Gomis R, Casamitjana R, Rivera F, Novials A: Glucose regulation of islet amyloid polypeptide gene expression in rat pancreatic islets. Am J Physiol 272: E543-E549, 1997 5. Novials A, Rojas I, Casamitjana R, Usac EF, Gomis R. A novel mutation in islet amyloid polypeptide (IAPP) gene promoter is associated with Type II diabetes mellitus. Diabetologia 44:10641065, 2001. 6. Novials A, Mato E, Lucas M, Franco C, Rivas M, Santiesteban P, Gomis R: Mutation at position 132 in the islet amyloid polypeptide (IAPP) gene promoter enhances basal transcriptional activity through a new CRE-like binding site. Diabetologia 47:1167-1174, 2004. 7. Lorenzo A, Razzaboni B, Weir GC, Yankner BA. Pancreatic islet cell toxicity of amylin associated with type-2 diabetes mellitus. Nature 368:756-760, 1994. 90 8. Casas S, Gomis R, Gribble FM, Altirriba J, Knuutila S, Novials A. Impairment of the ubiquitin-proteasome pathway is a downstream ER stress response induced by extracellular human islet amyloid polypeptide and contributes to pancreatic -cell apoptosis. Diabetes 56: 22842294, 2007 9. Mirzabekov T, Lin MC, Yuan WL, Marshall PJ, Carman M, Tomaselli K, Lieberburg I, Kagan BL. Channel formation in planar lipid bilayers by a neurotoxic fragment of the beta-amyloid peptide. Biochem Biophys Res Commun 202:11421148, 1994. 10. Janson J, Ashley RH, Harrison D, McIntyre S, Butler PC. The mechanism of islet amyloid polypeptide toxicity is membrane disruption by intermediate-sized toxic amyloid particles. Diabetes 48:491-498, 1999.
CAPTULO 6
Las incretinas en la secrecin de insulina
AUTORES
Jess Cancelas Navia Vernica Sancho Brnez Isabel Valverde Alonso Mara L. Villanueva-Peacarrillo Molina
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La ingestin de alimentos induce la activacin de mltiples respuestas fisiolgicas que proporcionan seales neuronales y endocrinas, reguladoras de la digestin, absorcin y asimilacin de los nutrientes ingeridos. En cierto momento se observ que, en sujetos normales, los niveles de insulina circulante en respuesta a la administracin oral de glucosa eran significativamente mas altos que los correspondientes tras la administracin intravenosa del azcar, y esta potenciacin de la secrecin de insulina asociada al intestino fue atribuida a uno o varios factores humorales o neuronales que se dieron en llamar incretinas. El termino incretina, por tanto, corresponde a aquellos factores liberados por el intestino tras la absorcin de glucosa y otros nutrientes, que actan directamente en el pncreas estimulando su secrecin endocrina, concretamente la de insulina. Por ello, el concepto incretina esta muy relacionado con el eje entero-insular propuesto por Unger y Eisentraut en 1969, el cual comprende a todos aquellos estmulos que, partiendo del intestino delgado, inciden por distintas vas, incluida la nerviosa, en el islote de Langerhans, afectando a la liberacin de sus distintas hormonas. El inicio de la identificacin de factores incretina no tuvo lugar hasta 1970, momento en el que se purific y caracteriz el primero de ellos, el GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide). Pero aunque el GIP mostr ser un potente estimulador de la secrecin de insulina tras la administracin oral de glucosa, la eliminacin del GIP por inmunoabsorcin en la rata no anulaba el efecto incretina. Ello evidenciaba la existencia de otros factores con dicha actividad; de hecho, aos despus, en el transcurso del proceso de clonaje y caracterizacin del gen del proglucagn, se identific un segundo factor, el GLP-1 (glucagon like peptide-1). El GIP es un pptido con 42 aminocidos, que se produce predominantemente en las clulas K del duodeno, en el extremo proximal del intestino delgado, aunque tambin se localiza en el sistema nervioso central, donde participa en el control de la supervivencia celular. El estimulo ms importante para su secrecin son los nutrientes, de forma que en el ayuno sus niveles permanecen bajos, y aumentan en pocos minutos tras la comida. La molcula de GIP contiene una alanina en la posicin 2, que lo convierte en un sustrato idneo de enzima esencial en la regulacin del proceso de degradacin no slo del GIP sino tambin del GLP-1, la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4). Los efectos del GIP estn mediados por un receptor especfico del que existen dos isoformas, una de 466 aminocidos y otra de 493, que se expresan en clula pancretica, tejido adiposo, corazn y cerebro. Aunque se ha observado que ambos
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receptores, el de GIP y el de GLP-1, sufren in vitro una rpida y reversible desensibilizacin homloga y heterloga, in vivo sta slo se detecta en el del GIP; no se ha encontrado relacin entre los genes que codifican para ambos receptores y la posible susceptibilidad gentica a padecer diabetes. Ambos, el GIP y el GLP-1, estimulan la secrecin de insulina de forma dependiente a la glucosa, por activacin de una protena G especifica acoplada al receptor que se expresa directamente en la clula . El mecanismo por el cual ambas incretinas activan la secrecin de insulina slo a altas concentraciones de glucosa, se desconoce por el momento, pero su efecto est acoplado a la adenilato ciclasa, a un incremento del [Ca2+]i y al flujo de cido araquidnico, y en su accin se activan rutas dependientes de factores de crecimiento como la de las MAPKs (ERK 1 y 2), la PI3K o la PKB (AKT). El GIP, adems de insulinotrpico, muestra cierta accin proliferativa y antiapopttica en la clula del islote, y mejora la supervivencia de clulas INS-1 de rata expuestas a wortmanina o estreptozotocina (STZ). Esta accin antiapopttica del GIP est asociada a una reduccin de la activacin de caspasa 3 y es dependiente de la ruta p38MAPK. As mismo, el GIP mejora la supervivencia de clulas INS-1 (832/13), sujetas a glucolipotoxicidad, y de islotes murinos, va retroinhibicin de la transcripcin de un gen pro-apopttico como Bax, y a travs de una reduccin de la expresin nuclear del factor transcripcional Foxo-1. Dos semanas de infusin de GIP retroinhiben Bax e incrementan la expresin de Bcl2 en clula del pncreas de ratas obesas ZDF Zucker diabetic fatty. Aunque la accin insulinotrpica del GIP est disminuida en roedores hiperglucmicos, en parte debido a una disminucin de la expresin de su receptor, se desconocen los factores implicados en el desarrollo de diabetes, y si los efectos del pptido sobre el crecimiento y supervivencia celular pueden estar afectados. El GLP-1 se produce en las clulas enteroendocrinas de la regin distal del intestino delgado y en el colon; sus niveles aumentan en escasos minutos tras la ingestin de nutrientes, y parece que tanto factores neuronales como endocrinos promueven su secrecin mucho antes de que los nutrientes atraviesen la pared intestinal y entren en contacto directo con las clulas L enteroendocrinas, responsables de su liberacin. Aunque el GIP estimula la secrecin de GLP-1 en algunas especies, se desconoce la totalidad de factores que participan en la liberacin del pptido en el hombre. La molcula del proglucagn humano, deducida de la de los nucletidos del gen, y
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tambin la de otros mamferos, tiene 180 aminocidos, veinte de los cuales forman el pptido seal, y el resto, la prohormona. Pero la cualidad de los pptidos originados del proglucagn depende del tejido de traduccin, pncreas o intestino En las clulas pancreticas, se produce, predominantemente, el fragmento 1-30, llamado tambin, GRPP o pptido pancretico relacionado con la glicentina, el 33-61 o glucagn, el 64-69, el 1-61, y la porcin carboxi-terminal 72-158, denominada MPGF (Major Proglucagon Fragment). En las clulas L del intestino, del proglucagn se origina, fundamentalmente, la fraccin 1-69, llamada glicentina, la 33-69 u oxintomodulina, el GLP-1, proglucagn 78-108 o proglucagn 78-107amida, y el GLP-2 o proglucagn 126-158. La glicentina y la oxintomodulina corresponden a las fracciones I y II, respectivamente, del GLI (glucagon-like immunoreactivity) de extractos de intestino, que se liberan tras la administracin, exclusivamente oral, de glucosa. Por otro lado, tanto en las clulas del pncreas como en las L enteroendocrinas, se expresa el factor de transcripcin cdx 2/3, que se encarga de la regulacin del gen del proglucagn. En el intestino, el origen del GLP-1 parece estar condicionado a la expresin especfica de tejido de las convertasas de prohormonas (PCs) en las clulas enteroendocrinas; mientras que tanto la PC1 como la PC2 escinden el proglucagn para generar MPGF, glicentina y oxintomodulina, slo la PC1 parece ser la enzima responsable de la produccin de GLP-1 y GLP-2.
FIGURA 1
Proceso postraduccional de la molcula de proglucagn. Origen y localizacin de pptidos glucagon-like.
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De todos los productos posibles de glucagon-like-peptide-1, el GLP-1 es la forma predominante en el intestino de varios mamferos, incluido el hombre, en los que su secuencia de aminocidos no slo es idntica, sino coincidente con la del glucagn en la posicin de catorce de ellos. Adems, el GLP-1 es el mayoritario en el plasma, tanto en condiciones basales como en el incremento observado tras una comida mixta o sobrecarga oral de glucosa. Tambin, el aumento de inmunorreactividad al perfundir intraluminalmente glucosa en el leon del cerdo y del perro se debe al GLP-1, cuya secrecin aumenta tras la ingestin o infusin intraduodenal de grasas en el hombre y en el cerdo, respectivamente. Sin embargo, la informacin relativa a los niveles basales del GLP-1 en plasma, tanto en condiciones normales como en estados que cursan con alteraciones del metabolismo de la glucosa, ha sido, por lo general, y durante bastante tiempo, controvertida; de hecho, mientras que algunos autores describan niveles plasmticos significativamente ms altos en pacientes diabticos no dependientes de insulina que en sujetos sanos, otros decan ser ms bajos. ltimamente, los resultados parecen ms slidos, e indican que en pacientes diabticos tipo 2, y tambin en tipo 1, hay una menor liberacin de GLP1 que podra estar justificada por una ulterior desensitizacin de la clula L. Por otro lado, algunos afirman que la respuesta del pptido a estmulos est disminuida en los obesos. En 1987 se document por primera vez la capacidad del GLP-1 para estimular la liberacin de insulina, tras ser perfundido en el pncreas del cerdo, y tambin en infusin intravenosa en el hombre. Trabajos posteriores ampliaron la confirmacin de este efecto a concentraciones fisiolgicas en el pncreas aislado y perfundido del perro y de la rata, y en el islote aislado de ratn, as como su accin dependiente de la concentracin de glucosa, tanto in vitro como in vivo. Adems, se supo que el GLP-1 estimula la transcripcin del gen de la insulina, que induce su acumulacin en los grnulos secretores de clulas de lneas tumorales pancreticas, que propicia la proliferacin de las clulas y la neognesis del islote pancretico, con lo que su accin no extena la capacidad de la clula; adems, su efecto insulinotrpico es ms potente que el del GIP, si bien ambos participan en el efecto incretina. En 1992, se document por primera vez un efecto antidiabtico del GLP-1 independiente de los niveles de insulina circulante, tanto en sujetos normales como diabticos. A lo anterior, hay que aadir su posible accin beneficiosa en relacin a la secrecin de insulina en la diabetes tipo 2, donde la clula parece sufrir de una espe97
cie de ceguera especfica hacia la hexosa por subexpresin del gen del GLUT-2, mutacin del de la glucoquinasa, hiperactividad de la glucosa-6-fosfatasa, ausencia, heredada o adquirida, de la glicerolfosfato deshidrogenasa asociada al FAD mitocondrial, o incluso por una hiper-acumulacin de glucgeno. De hecho, se sabe que, en el islote aislado de pncreas de rata, el GLP-1 mejora marcadamente la respuesta secretora de la clula a determinados steres de cidos tricarboxlicos nutrientes no glucdicos intermediarios en el ciclo de Krebs, aun en ausencia total de glucosa. Est documentado que la secrecin de insulina inducida por GLP-1 tambin es mayor en presencia del dimetil ester del cido succnico y glutmico, y de metilpiruvato, tanto en la rata normal como en la diabtica tipo 2 generada por tratamiento con STZ al nacer. Tambin, se ha observado que la -D-glucosa pentaacetato, que no necesita del transportador de glucosa para acceder al interior de la clula , potencia la respuesta secretora de sta al GLP-1 en modelos de diabetes experimental, y aumenta, adems, la secrecin de insulina inducida por una sulfonilurea gliquidona y por un anlogo de la meglitinida repaglinida. En relacin a ello, se detect y caracteriz una unin especfica del pptido, amidado y no amidado, en clulas pancreticas de insulinoma de rata de la lnea RINm5F, que no slo no era desplazable por glucagn, GLP-2 o GIP, sino que tambin pareca estar asociada a un aumento en la produccin de AMPc, sin modificacin de los niveles de calcio. El receptor para GLP-1 en esa lnea de clulas est constituido por una protena monomrica de 63 kDa de peso molecular que, por tcnicas de estudios de unin, tambin se identific en clulas pancreticas normales de rata. Mediante hibridacin y clonaje, se dedujo su estructura, que result tener 463 aminocidos, y de la que se supo pertenece a la familia de receptores con siete hlices transmembrana acoplados a protenas G, que incluye los de secretina, VIP (pptido intestinal vasoactivo), calcitonina, GHRH (hormona liberadora de la hormona de crecimiento), PTH (hormona paratiroidea) y glucagn, entre otros. En los islotes, el receptor para GLP-1 se encuentra mayoritariamente localizado en las clulas , aunque tambin se expresa en las y ; su activacin implica un aumento del contenido celular de AMPc, una activacin de PKA y la alteracin de factores de intercambio nucleotdico de guaninas regulados por AMPc. Adems, agonistas del receptor promueven la fosforilacin de CREB -elemento proteico de respuesta a AMPc-, y regulan su activacin en respuesta a glucosa, a travs de la traslocacin del citosol al ncleo de TORC2 -coactivador de CREB -. La activacin del receptor est tambin acoplada a un incremento del [Ca2+]i, inhibicin de los
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canales de K+ dependiente de voltaje y activacin de la expresin temprana de genes a travs de efectos sobre Erk1/2, PKC y PI3K.
FIGURA 2
Vas de sealizacin del GLP-1 en la clula pancretica. Mecanismos de liberacin de insulina y proliferacin celular.
El GLP-1, como el GIP, activa la formacin de AMPc y PKA, aunque inhibidores de la PKA no anulan por completo el efecto de las incretinas sobre la secrecin de insulina. Esta secrecin de insulina independiente de PKA ha sido atribuida a los GEFs -factores de intercambio de nucletidos guanina-, concretamente a Epac 2, tambin llamado GEFII-AMPc, ya que una reduccin de la expresin de GEFII atena sustancialmente los efectos del GLP-1 sobre la secrecin de insulina. Se ha descrito cierto papel del receptor de sulfonilurea -SUR- en la modulacin del cierre del canal de K+ dependiente de voltaje asociado al receptor de GLP-1. Aunque ambas incretinas activan la formacin de AMPc en islotes SUR-/-, la secrecin de insulina est claramente disminuida en estos ratones, seguramente debido a un defecto en el acoplamiento entre el AMPc y las rutas que regulan la exocitosis de insulina. Todo esto concuerda con la modulacin por SUR 1 de la exocitosis regulada por Ca2+ dependiente de AMPc. El GLP-1, pero no el GIP, mantienen la accin insulinotrpica en clulas Kir 6.2-/-, lo que evidencia una vez ms la divergencia existente entre las rutas de sealizacin de ambas incretinas y la complejidad de la accin del canal de K+ dependiente de ATP en la clula . A diferencia de otros secretagogos que actan prioritariamente a travs del canal de K+ dependiente de ATP, el GLP-1 es capaz de restablecer los depsitos de insulina estimulando la expresin del gen de la proinsulina. Este efecto estara mediado por la activacin del proceso de transcripcin del gen de la proinsulina y la estabilizacin del ARNm por mecanismos dependientes de AMPc e independientes de PKA.
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Concretamente, el factor de transcripcin Pdx-1 se comporta como una diana esencial en la accin del GLP-1 sobre la expresin del gen de la insulina. El GLP-1 incrementa Pdx-1, potenciando la expresin de su gen, y a su vez estimula la unin del factor al gen promotor de la insulina. Estudios realizados in vitro, en lneas celulares e islotes pancreticos, e in vivo, en ratones con una inactivacin del gen Pdx1, demuestran que una disminucin o una supresin de Pdx-1 est asociada a una disminucin de la expresin del receptor de GLP-1 y una prdida de accin del pptido en la clula. El GLP-1 tambin disminuye la glucosa en sangre, en parte, por inhibicin directa de la secrecin de glucagn en las clulas del islote, a travs de la unin a su receptor y, en parte de forma indirecta, por su efecto sobre la secrecin de insulina y somatostatina. Ratones con una inactivacin especfica en la clula del gen de Pdx-1 muestran un defecto en la accin supresora de la exendina-4 (Ex-4) agonista del receptor pancretico del GLP-1 en diferentes sistemas celulares sobre la secrecin de glucagn, lo que ilustra cierto papel de la clula sobre la actividad secretora de la clula . La supresin de la secrecin de glucagn por el GLP-1, est regulada por glucosa, de manera que si la glucemia es normal este efecto supresor del pptido sobre la clula es bloqueado, lo que ayuda a que el riesgo de hipoglucemia prcticamente no exista. La activacin del receptor pancretico del GLP-1 desencadena en lneas celulares exocrinas de roedores y humanos un programa de diferenciacin hacia distintos fenotipos endocrinos, asociado a un incremento de la expresin de genes tales como Pdx-1, glucoquinasa y GLUT-2. Agonistas del receptor de GLP-1 pueden inducir diferenciacin por activacin de factores de transcripcin tales como Foxa-2, que permiten un aumento en la expresin del gen Pdx-1. El GLP-1 es capaz adems de promover la diferenciacin de progenitores derivados de islotes humanos a clulas funcionales. Estudios llevados a cabo con lneas celulares aisladas, en islotes normales o en roedores in vivo, muestran cmo la activacin del receptor de GLP-1 tambin potencia la proliferacin de clulas . Tratamientos de cinco das con GLP-1 o Ex-4 en ratas Wistar expuestas a STZ el da de su nacimiento diabticas tipo 2, mejoran la masa de clula , y el efecto se prolonga incluso hasta dos meses. Un tratamiento similar con Ex-4, en este caso a ratas sometidas a un periodo de crecimiento uterino retardado, provoca, tras su nacimiento, una expansin de la masa celular que previene del desarrollo de diabetes. Este efecto de la Ex-4, agonista del receptor pancretico de GLP-1, sobre la expansin de la masa de islote, parece, al menos en
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ratones diabticos y en ratas con pancreatectoma parcial, asociado a la expresin de Pdx-1. Tanto la accin proliferativa como la apopttica de los agonistas del receptor pancretico del GLP-1 sobre la clula , es dependiente de la expresin de Pdx-1. En este sentido, se ha observado que si se reduce la expresin de Pdx-1, tambin disminuye el nmero de receptores de GLP-1 as como la respuesta in vitro a la Ex-4; y tambin cmo en ratones con Pdx-1-/- inactivado de forma especifica a nivel de clula tienen un mayor apoptosis y una menor respuesta a la Ex-4. El GLP-1 tambin mejora la proteccin y expansin de la clula inhibiendo distintas rutas apoptticas. El pptido disminuye la expresin del gen de la caspasa 3 y la fragmentacin nuclear en islotes de ratas Zuker diabticas, mientras la Ex-4 atena la apoptosis en ratones db/db y ratones salvajes tratados con STZ. La activacin del receptor de GLP-1 reduce la apoptosis en clulas Min6 expuestas a especies reactivas del oxigeno mediadoras de la citotoxicidad en la clula como el H2O2, de manera dependiente a AMPc y PI3K, y asociado a un incremento en la expresin de Bcl2 y BclxL y a una reduccin de la hidrlisis por PARP poli(ADP-ribosa)polimerasa. Ambos, GLP-1 y Ex-4, reducen la activacin de caspasa 3 mediada por palmitato y la apoptosis mediada por PKA en clulas RINm5F. El aumento de AMPc inducido por el GLP-1 conduce a un aumento de la expresin de CREB, a una activacin de IRS2 y a la potenciacin de AKT. Por otro lado, el bloqueo dominante negativo de AKT in vitro suprime la accin antiapopttica de la Ex-4 en islotes murinos pancreticos tras exposicin a citoquinas. La activacin del receptor de GLP-1 in vivo tambin reduce el estrs del retculo endoplsmico (RE) en islotes de ratn, reduce la fosforilacin de F2, promueve la activacin de ATF4, CHOP y sXBP-1, y modula PERK en la ruta de estrs del RE en la clula pancretica. Agonistas del receptor de GLP-1 estimulan la proliferacin de clula , en parte a travs de la transactivacin de EGFR o receptor del factor de crecimiento epidrmico. El GLP-1 tambin inhibe el factor transcripcional Foxo-1 en clulas del islote, a travs de la exclusin nuclear dependiente de fosforilacin de manera dependiente de EGFR, y la Ex-4 no estimula la replicacin de la clula ni la expansin de masa del islote en ratones transgnicos con expresin constitutiva de Foxo-1 en el ncleo. En islotes murinos, el IRS-2 resulta esencial para que Ex-4 estimule, por fosforilacin de AKT, la expresin de Pdx-1 y con ello el crecimiento de la clula , pero no as en la secrecin de insulina. Desde el punto de vista clnico, ambas acciones del GLP-1, proliferativa y antiapopttica, han elevado la posibilidad de que ste
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pueda ser utilizado para preservar el crecimiento de la masa celular tras transplante de islotes. Aunque la administracin de Ex-4 a ratones transplantados no mejora el control glucmico, el pretratamiento con sta de los cultivos de islotes que van a ser transplantados ayuda a revertir la hipoglucemia tras la intervencin. Cabe destacar que todos estos efectos del GLP-1 sobre la secrecin de insulina, proliferacin de clula y supervivencia celular, han sido tambin confirmados en experimentos realizados con islotes humanos aislados. El GLP-1 induce la despolarizacin de la membrana, inhibe el flujo de K+ dependiente de ATP y potencia la exocitosis de Ca2+ en clula de humanos; adems, acelera el flujo de Ca2+ a travs de canales dependientes de voltaje (tipo L) y potencian la exocitosis en una zona alejada del punto de acumulacin de Ca2+ intracelular. As mismo, el pptido produce un rpido incremento del Ca2+ intracelular, que es inhibido por antagonistas de: AMPc ([Rp]-cAMPs), del canal de Ca2+ tipo L (nimodipines), de la ATPasa de Ca2+ presente en el RE (thapsigargina), o por rianodine. Tambin promueve una de las rutas dependientes del factor de crecimiento epidrmico en islotes humanos in vitro con activacin de Rap y B-Raf y, en ocasiones, con un incremento de la actividad ERK, AKT y PI3K; adems, mejora la secrecin de insulina estimulada por glucosa, incrementa la expresin de Bcl2 y disminuye la de Bax, mejorando la supervivencia celular en islotes humanos en cultivo durante 72 horas. Tambin reduce la apoptosis en islotes humanos inducida por la elevacin de glucosa y/o palmitato. Desde el punto de vista evolutivo, existen evidencias de que las rutas de sealizacin del GLP-1 estn muy conservadas, siendo prcticamente idnticas en roedores y humanos. El GLP-1 tambin acta directamente en el estmago, donde inhibe la secrecin cida y enlentece su vaciamiento; adems, tiene accin sobre el sistema nervioso central, y parece intervenir en el control de la ingestin de alimentos, generando sensacin de saciedad. Pero la investigacin constante sobre las propiedades del GLP-1 est sacando a la luz otros efectos que, como el que se acaba de mencionar, no estn directamente relacionados con el metabolismo de la glucosa. De hecho, se ha propuesto al GLP-1, y a anlogos con capacidad de unin a su receptor cerebral, y de accin ms prolongada, como posibles agentes teraputicos en la enfermedad de Alzheimer y en otros procesos neurodegenerativos del sistema nervioso central y perifrico. Esta ltima propiedad de pptido est basada en su demostrada accin neurotrfica en clulas neuronales en cultivo a las que protege contra la apoptosis inducida por glutamato, y contra el dao oxidativo y en su capacidad para modificar el proceso precursor de la protena amiloide, y reducir, en neuronas del
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hipocampo, in vitro, y en funcin de la dosis, los niveles de la propia protena. En relacin a esto, se ha documentado en ratones, que el GLP-1 es un potente neuroprotector, y su receptor cerebral ha sido relacionado con el aprendizaje, puesto que aquellos animales con sobreexpresin del mismo en el hipocampo muestran una mayor capacidad de memorizacin. Adems, el GLP-1 incrementa en roedores la frecuencia cardiaca y la presin sangunea, mejora la funcin endotelial en pacientes con diabetes tipo 2 y la funcin del miocardio aumentando la captacin de glucosa y la contractibilidad ventricular, y tambin reduce el tamao de los infartos en corazones perifundidos de rata y en modelos animales de isquemia miocrdica. Por lo que se propone al GLP-1 como un factor protector frente a la isquemia. ltimamente, se ha postulado, adems, que hormonas con carcter incretina, es decir, el GLP-1 y el GIP, intervendran, directa o indirectamente, en el proceso de remodelado seo que se produce tras la absorcin de nutrientes.
FIGURA 3
Acciones del GLP-1 en tejidos perifricos. Efectos directos e indirectos sobre el pncreas, msculo, corazn, cerebro, tejido adiposo e hgado.
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Las caractersticas del efecto antidiabtico del GLP-1 dieron lugar a intuir su accin directa sobre el metabolismo de la glucosa, y ello impuls la bsqueda de su receptor, a parte de en el pncreas, en otros tejidos participantes en la homeostasis del azcar. Como consecuencia, se ha descrito la presencia de receptores especficos para GLP-1 en el tejido adiposo de la rata y del hombre normal y diabtico, y su efecto estimulador de la concentracin intracelular de AMPc. Los receptores para GLP-1 tambin estn presentes en el hgado y en el msculo esqueltico de la rata, tejidos en los que parece ser estructural y funcionalmente distinto del pancretico, puesto que no propicia en ellos la produccin de AMPc; en el adiposo, sin embargo, no slo estimula la generacin de cAMP sino que, como en el caso del hgado y msculo, tambin promueve la generacin de inositolfosfoglicanos (IPGs) un segundo mensajero en la accin de la insulina, con lo cual cabe la posibilidad de que la accin del GLP-1 en el adipocito est mediada por dos tipos de receptor. Adems, el GLP-1 mimetiza a la insulina en su efecto estimulador sobre los IPGs en una lnea celular de miocitos en cultivo, la BC3H-1, en otra de hepatoma humano, la HepG2, y en adipocitos y hepatocitos aislados de rata; tambin es mimtico de su accin en el tejido adiposo, en el msculo abdominal de ratn, y en distintas lneas de clulas musculares en cultivo. De hecho, el tejido adiposo de la rata, el GLP-1 no slo estimula la lipolisis sino tambin la lipognesis, adems de la sntesis de glucgeno a travs de la activacin de la glucgeno sintasa, y el transporte, oxidacin y utilizacin de glucosa, efectos, varios de ellos, adicionalmente descritos en el hgado y en el msculo esqueltico tanto de la rata como del hombre. Tambin se han detectado receptores para GLP-1 en las glndulas oxnticas del estmago, en el pulmn y, en el cerebro. La accin directa del GLP-1 sobre el metabolismo de la glucosa en tejidos extrapancreticos concuerda, adems, con resultados de estudios in vivo, en los que el tratamiento de la rata con el pptido durante 48 horas mejora la intolerancia a la glucosa que aparece con el envejecimiento. Adems, el GLP-1 regula, a nivel traduccional o post-traduccional, la expresin del GLUT-2 y GLUT-4 en hgado, msculo y tejido adiposo de la rata normal y diabtica. Tambin se ha demostrado que, en el perro, el GLP-1 incrementa la utilizacin de glucosa en el hgado, que la consecucin de su efecto requiere su infusin prolongada, y que ste es aditivo al de la insulina, independientemente de la va de administracin. La propuesta de utilizacin del GLP-1 como agente teraputico en la diabetes tipo 2 no slo viene reforzada por lo anterior, sino tambin por el hecho de que el carc104
ter antidiabtico del GLP-1 es evidente tras su inyeccin subcutnea en estos pacientes, en los que, sea o no amidado, tiene, adems, efecto insulinotrpico. Pero la vida media del GLP-1, una vez en el torrente circulatorio, es menor de 2 minutos, al ser degradado por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), que le hace perder sus dos residuos aminoacdicos N-terminales, transformndolo en GLP-1(9-36)amida, al cual no se atribuye, de momento, ningn efecto fisiolgico. Si bien se han puesto grandes expectativas, ese inconveniente conduce a otro: su administracin habra de ser en infusin continua o inyeccin subcutnea frecuente. Ello, no obstante, no descarta al GLP-1 para su posible utilizacin futura, y la eliminacin del obstculo es investigada, de forma constante, en distintos laboratorios. De hecho, hace tiempo se propuso su dosificacin en forma de tableta inserta en la mucosa bucal, va sin efectos secundarios, por la que el pptido aumenta la secrecin de insulina, disminuye la de glucagn, y reduce la glucemia hasta niveles normales, tanto en ayunas como tras la absorcin de nutrientes por el intestino. Pero tambin se estn tratando de confeccionar anlogos del GLP-1 resistentes a la accin de la DPP-IV , como es un derivado acilado del pptido, el NN2211, de efecto prolongado, con el que una sla inyeccin diaria reduce la glucemia, basal y post-prandium, en el diabtico tipo 2; o de obtener inhibidores de la accin de la propia enzima. Mientras tanto, no obstante, surge otro pptido, la exendina 4 (Ex-4), para su estudio, del que se ha descrito que posee todos los beneficios fisiolgicos y farmacolgicos del GLP-1, y no es degradado por la DPP-IV La propiedad de la Ex-4 como agonista del receptor del GLP-1 se describi en 1993. Es un pptido de 39 aminocidos, presente en el veneno de la glndula salival de una especie de lagarto Heloderma suspectum, y que tiene un 53% de homologa estructural con el GLP-1. A pesar de que su naturaleza no es mamfera, se ha tratado, aunque sin xito, de identificar en el hombre su gen homlogo; sin embargo, est demostrado que la Ex-4 es un potente insulinotrpico en roedores y en el hombre, y que posee todas las propiedades del GLP-1, con dos ventajas: su potencia, mucho mayor, y su accin in vivo, ms prolongada. Como el GLP-1, la Ex-4 tiene la propiedad de mejorar el grado de tolerancia a la glucosa, tanto en estado normal como diabtico, y de inducir la formacin de AMPc en la clula pancretica, adems de incrementar su masa bien por diferenciacin y neognesis, o por replicacin de clulas pre-existentes. La mayor estabilidad in vivo de la Ex-4 respecto al GLP-1 que puede atribuirse a la ausencia de puntos sensibles a la DPP-IV en su secuencia amino-terminal, y a su
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reducida susceptibilidad a degradacin por endopeptidasa neutra 24.11, ilustra su carcter beneficioso. Concretamente, la Ex-4 sinttica, o AC2993, que es utilizada en investigacin clnica como hipoglucemiante, y otros anlogos del GLP-1 ms resistentes a la DPP-IV como el LY307161, producen, en modelos animales de diabetes, efectos antidiabticos muy prometedores. Ensayos clnicos en fase 3, en los que se inyecta exenatide (Ex-4), dos veces al da 5 o 10 g durante 30 semanas, a pacientes en los que ni metformina ni sulfonilureas eran capaces de ejercer un buen control glucmico, muestran cmo este agonista del receptor de GLP-1 es capaz de reducir, en el 34-46% de los pacientes, los niveles de HbA1c en un 0,9% y de forma modesta el peso corporal; su principal efecto adverso fue la nausea, y aunque se detectaron anticuerpos anti-exendina-4 en el 41-49% de los pacientes tratados, ello no estuvo relacionado con la respuesta teraputica al pptido. Un tratamiento durante 26 semanas con exenatide produce adems una reduccin de HbA1c comparable a la de la insulina glargina (~1,1%), una potente disminucin de la glucemia postprandial aunque su efecto sobre la glucemia en ayunas es algo mas limitada que la de glargina, y una prdida de peso de 2,3 Kg frente a la ganancia 1,8 Kg observada con insulina glargina. En el caso de anlogos de GLP-1 resistentes a la accin de la DPP-IV Liraglutide (NN2211) molcula de GLP-1 acila, da que se asocia de forma no covalente a la molcula de albmina es capaz de mimetizar la accin del pptido nativo reduciendo los niveles de glucosa en sangre de pacientes diabticos tipo 2. La forma resistente de la Ex-4 (exanitide-LAR) es tambin capaz de alcanzar el control glucmico en semanas tras una sola inyeccin en ratas diabticas, efecto que est en fase 2 de ensayos clnicos en humanos. El papel de las incretinas ha sido objeto de estudio los ltimos 20 aos, concretamente los numerosos efectos descritos del GLP-1, tanto sobre la clula , como sobre tejidos extrapancreticos tales como el cerebro, el msculo, la grasa o el corazn, han hecho que algunos derivados de est y de una molcula estructuralmente relacionada, como es la Ex-4, se encuentren en fase avanzada de investigacin clnica, con resultados ms que prometedores en cuanto al control de la homeostasis de la glucosa y peso corporal. El conocimiento de los mecanismos que controlan la secrecin y accin del GLP-1 a nivel proliferativo y antiapopttico, aun escaso, permitir su aplicacin en la posible reversin del desarrollo natural de la diabetes tipo 2.
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CAPTULO 7
Trasplante de islotes de pncreas y terapia celular en diabetes
AUTORES
Eduard Montanya Mias* Montserrat Nacher Garca** Nolia Tllez Besol***

*Jefe de Seccin. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Clinicas. Facultad de Medicina Universidad de Barcelona. **Facultativo Especialista. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. ***Investigador, Institut dInvestigaci Biomdica de Bellvitge (IDIBELL), Servicio de Endocrinologa, Hospital Universitari de Bellvitge.
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La diabetes mellitus es un grave problema sanitario tanto por la prevalencia de la enfermedad como por las graves complicaciones crnicas que desarrollan los pacientes. Las previsiones para los prximos aos son pesimistas ya que se espera que el nmero de pacientes aumente desde los 171 millones del ao 2000 a 366 millones en el ao 2030, en lo ya se conoce como epidemia de diabetes. Aunque los resultados obtenidos en la ltima dcada del siglo pasado han establecido con certeza que el control metablico adecuado permite reducir y posponer el desarrollo de las complicaciones crnicas de la diabetes, el tratamiento actual con insulina o con otros agentes hipoglicemiantes no permite alcanzar en la mayora de los casos el grado de control necesario para evitar las complicaciones crnicas de la diabetes. Por otra parte, el tratamiento impone unas elevadas demandas sobre el paciente, tiene riesgos importantes como la hipoglicemia grave, y reduce la calidad de vida. Un aspecto central en el desarrollo de la diabetes es la reduccin en el nmero de clulas beta pancreticas productoras de insulina, y la incapacidad para producir suficiente insulina para mantener la normoglucemia. En el caso de la diabetes tipo 1 la destruccin progresiva de las clulas beta da lugar a una reduccin en trminos absolutos de la masa beta. En la diabetes tipo 2, la funcin y masa de las clulas beta es insuficiente para hacer frente al aumento en la demanda de insulina generado por la resistencia a la insulina. Las limitaciones del tratamiento actual de la diabetes han estimulado la bsqueda de teraputicas que permitan restaurar la masa beta perdida para conseguir alcanzar la normoglicmia. El trasplante de pancreas es en la actualidad el nico tratamiento de la diabetes que consigue restaurar la normoglicmia a largo plazo, pero puede ser ofrecido tan solo a un nmero limitado de pacientes y aunque su mortalidad se ha reducido notablemente presenta una morbilidad importante. Alternativamente, el trasplante celular de la diabetes, ya sea de islotes pancreticos o nicamente de clulas productoras de insulina ofrece numerosas ventajas potenciales que lo hacen particularmente atractivo. En la tabla 1 se enumeran las distintas posibilidades de obtencin de clulas productoras de insulina que se contemplan en la actualidad. De todas ellas el trasplante de islotes es la nica que ha alcanzado por el momento un uso clnico. El trasplante de islotes ofrece ventajas comprobadas como son el bajo ries110
TABLA 1
Origen potencial de las clulas productoras de insulina para el trasplante celular

Islotes humanos
- Islotes de donantes cadver. (usados en el trasplante de islotes en la actualidad) - Expansin ex-vivo de los islotes.
Islotes Xenognicos Clulas productoras de insulina generadas por bioingeniera

- Lineas celulares beta de roedores transformadas. - Lineas celulares beta humanas transformadas. - Clulas neuroendocrinas transformadas - Clulas somticas: - con algunas propiedades de las clulas beta (clulas hepticas, intestinales, clulas K) - no relacionadas con las clulas beta (fibroblastos, clulas musculares)
Clulas Madre
- Embrionarias - Adultas : - pancreticas - extrapancreticas
go del procedimiento, su realizacin en rgimen casi ambulatorio y la facilidad para llevar a cabo repetidos trasplantes. Como objetivo de ms largo alcance, el trasplante de islotes pretende evitar la necesidad de tratamiento inmunosupresor, y para ello se investigan estrategias basadas en el uso de metodos para separar fisicamente los islotes del sistema inmunolgico (encapsulacin) o en la modificacin de las caractersticas inmunognicas de los islotes trasplantados. Si se lograse suprimir el riesgo asociado al tratamiento inmunosupresor, sera clnica y ticamente aceptable llevar a cabo el trasplante en fases iniciales de la enfermedad para restaurar as la normoglicemia desde el diagnstico de la diabetes, mucho antes de la aparicin de las complicaciones.
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Historia del Trasplante de Islotes

Aunque existen intentos de finales del siglo XIX y principios del XX de trasplantar fragmentos de pncreas que podrian considerarse como los antecendentes del trasplante de islotes, la era moderna del trasplante de islotes empieza con la descripcin por Paul Lacy en 1967 de un mtodo para obtener los islotes mediante la digestin del pncreas con colagenasa que le permiti aislar y trasplantar suficientes islotes para conseguir en 1972 curar la diabetes de animales diabticos. El progreso en el campo del trasplante de islotes ha estado condicionado en buena medida por la dificultad del aislamiento de los islotes, y los sucesivos avances tcnicos del procedimiento. Los trasplantes realizados en los aos 70 y 80 fracasaron de forma sistemtica, hasta que en 1988 Camillo Ricordi introdujo un mtodo semiautomatizado para el aislamiento que permiti obtener un nmero elevado de islotes y el ao siguiente Lakey describi un mtodo automatizado para la purificacin de los islotes que permiti acelerar de forma importante el proceso. Estos mtodos se han convertido, con modificaciones, en la tcnica usada universalmente para el aislamiento de islotes para el trasplante en humanos y que permiti que en 1990 diversos grupos lograran por primera vez que pacientes con diabetes tipo 1 pudieran suspender el tratamiento con insulina y mantener la normoglicemia tras un trasplante de islotes. El entusiasmo inicial que estos resultados generaron se vio pronto frenado al comprobar la pronta reaparicin de la hiperglicemia en los escasos trasplantes con xito. A pesar de que la sustitucin de la colagenasa por la Liberasa (colagenasa muy purificada) como enzima para la digestin del pncreas exocrino supuso una avance muy importante que permiti un mayor rendimiento y reproducibilidad del aislamiento con un menor dao a los islotes, de los pacientes trasplantados en la dcada de los 90, tan solo el 12% alcanzaron en algn momento la insulin-independencia, y nicamente el 8% la mantuvieron durante ms de un ao. Esta situacin se vi modificada radicalmente en el ao 2000 con la obtencin y mantenimiento de la insulin-independencia en siete pacientes consecutivos que fueron trasplantados en Edmonton (Canada) usando un protocolo que combinaba el trasplante de un nmero muy elevado de islotes junto con una inmunosupresin libre de esteroides, en lo que se conoce desde entonces como el protocolo de Edmonton. Este protocolo ha sido adaptado por el resto de centros que trasplantan islotes y ha conseguido aumentar de forma muy importante el xito del
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procedimiento. Los datos de seguimiento ms recientes indican sin embargo, que la funcin del injerto se deteriora progresivamente de forma que en la gran mayora de los casos los pacientes vuelven a recibir insulina a los 5 aos del trasplante, aunque en general con dosis muy reducidas y que permiten mantener un buen control metablico. Si bien la historia del trasplante de islotes es la combinacin de avances que generan grandes expectativas y de decepciones que ocasionan el desnimo y escepticismo respecto a las posibilidades reales como tratamiento de la diabetes, una visin de conjunto permite apreciar el enorme progreso conseguido.
Dificultades y Limitaciones Actuales del Trasplante de Islotes

A pesar del progreso logrado en los ltimos aos, persisten aun dificultades y limitaciones que impiden la aplicacin generalizada del trasplante de islotes en el tratamiento de la diabetes, y que de forma clarificadora pueden agruparse en la dificultad tcnica del proceso de aislamiento de islotes, la insuficiente cantidad de islotes disponibles para trasplantar y la prdida de funcin y destruccin de los islotes una vez trasplantados.
Aislamiento de Islotes
La obtencin de los islotes se lleva a cabo a partir de pncreas de donantes multiorgnicos mediante el mtodo de Ricordi. Los elementos fundamentales del proceso son la digestin mediante colagenasa y la purificacin posterior mediante centrifugacin. El pncreas es transportado en frio al laboratorio desde el quirfano donde se distiende por la inyeccin intraductal de la solucin que contiene la colagenasa y se coloca en una cmara de Ricordi conectada a un circuito cerrado con recirculacin constante de la solucin a temperatura controlada, para ser digerido por la combinacin de la accin enzimtica de la colagenasa y la agitacin suave de la cmara (figura 1a). El proceso se mantiene hasta la separacin de los islotes del pncreas exocrino, lo que requiere una toma secuencial de muestras que se monitorizan bajo el microscopio para identificar los islotes y detener la digestin en el momento adecuado, ya que una digestin
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FIGURA 1
Aislamiento de islotes pancreticos
Figura 1b
Figura 1a: Digestin del pncreas en la cmara de Ricordi mediante proceso enzimtico y agitacin en circuito cerrado con control de temperatura y velocidad de flujo. Figura 1b: Purificacin de los islotes tras la digestin del pncreas en el procesador de clulas sanguineas COBE 2991.
Figura 1a
demasiado corta no permite la separacin de los islotes y una digestin prolongada conlleva su destruccin. La preparacin obtenida es a continuacin purificada mediante un gradiente de densidad continuo en un procesador de clulas sanguneas (COBE 2991) (figura 1b). Una vez purificada, la preparacin de islotes obtenida puede ser ya trasplantada o mantenida en cultivo entre 1-3 dias hasta su trasplante. El procedimiento lo realiza un equipo de unas 4 personas que invierten en el proceso una jornada laboral. Todo el proceso se lleva a cabo en un laboratorio con condiciones GMP (good manufacturing practice) y control de partculas ambientales, presin positiva y control de temperatura.
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El procedimiento tiene numerosos aspectos crticos de los que depende que se pueda conseguir un nmero suficiente de islotes, con una viabilidad y funcionalidad adecuada, y con la pureza precisa. Un aspecto fundamental es la obtencin del pncreas en ptimas condiciones por parte de un equipo quirrgico entrenado. Otros aspectos importantes estn relacionados con la calidad de la colagenasa, con el donante (edad, obesidad, estabilidad hemodinmica previa) y por supuesto con la habilidad tcnica del equipo que realiza el aislamiento. El conjunto del proceso da lugar a una prdida importante de islotes y permite recuperar, en los casos exitosos tan solo alrededor del 3050% de los islotes del pncreas. As mismo, el aislamiento y purificacin dan lugar a un stress mecnico y qumico que lesiona los islotes. La dificultad global del proceso queda demostrada si consideramos que incluso en los centros ms entrenados menos del 50% de los pncreas procesados permiten obtener una preparacin de islotes adecuada para ser trasplantada. El elevado coste de la construccin del laboratorio GMP y su equipamiento es una dificultad aadida al proceso, igual que el coste de los fungibles utilizados, en particular la Liberasa, y los gastos de personal que supone el equipo de aislamiento.
Escasez de Islotes para trasplante

La nica fuente actual de clulas beta para trasplante son los donantes de rganos. En Espaa, que tiene la tasa ms alta de donacin de rganos del mundo, se producen unas 1500 donaciones por ao. Sin entrar a considerar que una parte de estos rganos estarn destinados al trasplante de pncreas, o que en muchos casos el aislamiento no conseguir obtener una preparacin islotes vlida para el trasplante, ni la posible indicacin del trasplante en la diabetes tipo 2, es a todas luces imposible hacer frente a los alrededor de 100.000 pacientes con diabetes tipo 1 y ni tan solo a los cerca de 2000 nuevos pacientes que cada ao se diagnostican entre la poblacin menor de 30 aos en Espaa. La desproporcin es an ms grave si se considera que, en las condiciones actuales, se necesita ms de un pncreas para obtener suficientes islotes para trasplantar un nico paciente. Por lo tanto, se hace imprescindible disponer de fuentes alternativas de clulas productoras de insulina, que podrin ser islotes, clulas beta u otras clulas modificadas para secretar insulina, para que el trasplante pueda ser un tratamiento generalizado de la diabetes.
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Las opciones que se contemplan actualmente para resolver la falta de islotes se enumeran en la tabla 1. El xenotrasplante permitira recurrir a otras especies para incrementar el nmero de islotes disponibles de forma prcticamente ilimitada. El cerdo es el potencial donante que ha suscitado mayor inters, no slo en el caso del trasplante de islotes, y cabe recordar que la insulina porcina ha sido usada durante aos sin problemas en el tratamiento de la diabetes. El xenotrasplante se enfrenta al reto de superar el problema del rechazo, y al riesgo de la transmisin de zoonosis de la especie donante a los humanos. La generacin de animales transgnicos, diseados para ser fuente de rganos para el trasplante en humanos, podra permitir disponer de una fuente ilimitada de islotes y al mismo tiempo resolver o paliar el problema del rechazo. Alternativamente, los sistemas de encapsulacin de islotes podran tener su principal aplicacin en el xenotrasplante. Sin embargo, el riesgo de la transmisin de zoonosis ha llevado a la instauracin de moratorias para el xenotrasplante en algunos paises. Este riesgo que estara incrementado por el uso de tratamientos inmunosupresores que podran facilitar la infeccin, o en caso de proteger a los islotes mediante encapsulacin por la dificultad de acceder a la fuente de la zoonosis. Una va alternativa para superar el dficit de islotes es la generacin de clulas productoras de insulina mediante la estimulacin de la replicacin de los islotes, la creacin de lneas celulares, o la induccin de diferenciacin a partir de precursores pluripotenciales, campos en los se han producido avances muy significativos en los ltimos aos. Aunque la capacidad de crecimiento de los islotes adultos es limitada, ha sido posible inducir su proliferacin in vitro. Sin embargo, el incremento de la proliferacin se ha visto hasta el momento inevitablemente acompaado de la desdiferenciacin de las clulas beta humanas que pierden la capacidad de producir insulina. El ducto pancretico se considera la fuente de clulas precursoras de los islotes, y recientemente se ha conseguido demostrar que es posible expandir in vitro tejido del ducto pancretico humano, para a continuacin dirigir su diferenciacin hacia islotes pancreticos. Las posibilidades que ofrecen las tcnicas de bioingeniera para la generacin de clulas productoras de insulina son mltiples, ya sea para inducir la diferenciacin de islotes a partir de clulas precursoras, estimular la replicacin de las clulas beta, o crear lneas celulares productoras de insulina a partir de clulas beta o de clulas no endocrinas. Diferentes revisiones han analizado estas posibilidades de forma exhaustiva, y los captulos 8 y 9 de esta monografa proporcionan una perspectiva excelente de la situacin actual.
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FIGURA 2
Destruccin de islotes pancreticos en los primeros dias despus del trasplante

Necrosis Apaptosis
Las figuras muestran las abundantes zonas de necrosis (figura a) y la presencia de apoptosis en las clulas beta (figura b), a los tres dias del trasplante singnico en ratones diabticos. En conjunto se produce una prdida inicial de alrededor del 60% del tejido trasplantado. Esta prdida precede a la destruccin posterior que pueda ocasionar el rechazo o la recurrencia del proceso autoimmune (ref. 4).
Destruccin de los Islotes Trasplantados.

Un aspecto especfico del trasplante de islotes es la lesin y muerte que se produce en los primeros das, y que no depende del rechazo ni de la reaparicin del proceso autoimmune que ocasi la diabetes en el paciente. Datos de trasplantes experimentales indican que en los primeros das tras el trasplante se produce la muerte del 60-70% de las clulas beta trasplantadas por procesos de necrosis y apoptosis (figura 2), y estudios funcionales en pacientes sugieren que ocurre un proceso similar en el trasplante de islotes en pacientes. Esta prdida inicial de islotes contribuye a elevar el nmero de islotes preciso para restaurar la normoglicemia y puede jugar tambin un papel en el pronstico a largo plazo del trasplante. Las causas de la lesin inicial de los islotes son mltiples, y entre ellas se ha considerado la lesin de los islotes durante el proceso de aislamiento, problemas tcnicos del aislamiento, hipoxia de los islotes, ausencia de factores de supervivencia presentes en el pncreas, disrupcin de las conexiones con la matriz extracelular, o inflamacin no especfica en el lugar de implante. Numerosos estudios experimentales estn centrados en la investigacin de estos aspectos, y algunos de ellos han centrado el inters de nuestro grupo a nivel experimental.
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Pasado el periodo inicial, la supervivencia de los islotes trasplantados requiere la necesidad de evitar el rechazo del tejido trasplantado, al igual que ocurre con otros trasplantes, pero plantea tambin la necesidad de evitar la destruccin de las clulas beta trasplantadas por la recurrencia del proceso autoinmune que en su momento caus la destruccin de las clulas beta del pncreas del paciente con diabetes tipo 1. La necesidad de usar tratamiento inmunosupresor para evitar esta destruccin del injerto por parte del sistema inmune del receptor es una limitacin para la aplicacin del trasplante de islotes a una mayora de la poblacin diabtica ya que, a diferencia del trasplante de rganos vitales como corazn o hgado para los que no existe terapia sustitutiva, el trasplante de islotes debe competir en seguridad con el tratamiento con insulina, y la relacin beneficio/riesgo del binomio trasplante/inmunosupresin debe demostrar ser superior a la de mantener el tratamiento con insulina. Los tratamientos inmunosupresores actuales dan lugar a efectos secundarios importantes, con toxicidad sobre rganos que pueden verse afectados tambin por la diabetes, en particular el rin, y aumentan el riesgo de neoplasias y de infecciones oportunistas. Esta toxicidad limita la indicacin del trasplante a los pacientes en los que el beneficio superar claramente al riesgo, en la prctica los pacientes que ya reciben tratamiento inmunosupresor por la presencia de otro trasplante, casi en su totalidad pacientes con nefropata diabtica con un trasplante renal, o los pacientes que padecen una inestabilidad metablica realmente grave. As mismo debe considerarse la toxicidad del tratamiento inmunosupresor sobre los propios islotes trasplantados, que parece contribuir de forma significativa a la prdida de islotes trasplantados a los que tericamente protege. Es patente que mientras no se posible evitar el tratamiento inmunosupresor es necesario conseguir pautas de inmunosupresin menos txicas tanto para el receptor como para los islotes trasplantados.
Otras consideraciones
Adems de las dificultades cientficas y tcnicas, el avance y desarrollo de los programas de trasplante de islotes han contado con otros impedimentos. Una cuestin que quizs no ha sido suficientemente comprendida son las especiales necesidades de infraestructura y recursos humanos que son imprescindibles para establecer un programa de trasplante de islotes con garantas de xito. Por
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lo que respecta a infraestructura, es preciso contar con un laboratorio especializado en islote pancretico, en el que pueda llevarse a cabo la digestin del pncreas y la purificacin de los islotes, adems de poder valorar la viabilidad y funcin de los islotes aislados tanto in vitro como in vivo al trasplantarlos a animales de experimentacin. Este aspecto es relevante, ya que la calidad de las preparaciones de islotes obtenidas, y que condicionaran las posibilidades de xito del trasplante, es variable incluso an dentro de un mismo laboratorio. Las condiciones del laboratorio y de los productos empleados en el aislamiento y cultivo deben garantizar que los islotes obtenidos cumplan las garantas de esterilidad y falta de toxicidad exigidas para tratamientos en humanos, lo que eleva de forma significativa el coste de la instalacin para que cumpla las condiciones de GMP. Es preciso contar en el laboratorio con la presencia de personal tcnico cualificado, con un buen conocimiento de la fisiologa del islote pancretico, capaz del procesamiento y anlisis de los islotes. Esta infraestructura de material y personal es ajena a la mayora de servicios clnicos hospitalarios, y ha limitado de forma importante el nmero de centros con capacidad para realizar trasplante de islotes.
El Protocolo de Edmonton. Caractersticas y Resultados Actuales

Antes del ao 2000 tan solo alrededor del 10% de los pacientes que reciban un trasplante de islotes podan suspender el tratamiento con insulina por ms de un ao, y un 28% mantenan una funcin beta residual del injerto indicada por los niveles detectables de pptido C plasmtico. En el ao 2000, Shapiro y colaboradores en la Universidad de Alberta, en Edmonton, describieron un nuevo protocolo para el trasplante de islotes con el que con el que ha pasado a conseguir la insulino-independencia en hasta el 80 % de pacientes al ao del trasplante. Estos resultados han sido parcialmente reproducidos en un estudio internacional, el International Network Trial (INT), y en el que el 58% de pacientes consiguieron la independencia de la insulina, aunque con amplias variaciones entre centros (desde el 100% al 0% de pacientes) que obedecan fundamentalmente a la experiencia previa del grupo en trasplante de islotes. Sin embargo, los datos de seguimiento a ms largo plazo muestran un deterioro de la funcin del injerto de forma que a los 2 aos del trasplante tan solo el 24% de pacien119
tes mantenan la insulin-independencia en el estudio INT, porcentaje que el grupo de Edmonton ha descrito que se reduce hasta el 10% a los 5 aos. Estos resultados a largo plazo han supuesto una cierta de decepcin, pero es importante sealar que en cerca del 70% de los pacientes el injerto muestra una funcin beta residual, y que estos pacientes mantienen un control glucmico ptimo con dosis muy bajas de insulina, con gran estabilidad metablica (indicado por una reduccin en la amplitud de las excursiones glucmicas), y sin episodios de hipoglucemias graves. Los cambios ms importantes introducidos por el protocolo de Edmonton y que pueden haber contribuido al xito obtenido han sido: 1) el uso de una fuerte inmunosupresin en la que se prescindi de los glucocorticoides y se incluy sirolimus, bajas dosis de tacrolimus y un anticuerpo monoclonal frente al receptor de la interleuquina-2 (daclizumab); 2) la evitacin en el proceso de aislamiento de los islotes del uso de productos que pudieran contener xenoproteinas con la intencin de reducir la destruccin inmediata tras el trasplante; 3) la minimizacin del tiempo de isquemia trasplantando los islotes inmediatamente despus del aislamiento, aunque este aspecto se ha abandonado en estudios posteriores siendo comn en la actualidad transplantar los islotes tras 2-3 das de cultivo; 4) el trasplante de una masa beta superior a la usada previamente, con una media de ms de 4000 islotes equivalente por kilogramo de peso y la repeticin del trasplante en 2-3 ocasiones en caso de detectar glicemias superiores a 200 mg/dl en las semanas posteriores al trasplante; 5) trasplantar a una poblacin receptora distinta de las usadas hasta entonces, que no presentaba insuficiencia renal, en su mayora pacientes con episodios repetidos de hipoglucemia grave. Aunque el proceso no ha tenido mortalidad y su morbilidad es baja comparada con el trasplante de rganos, el procedimiento no est exento de efectos adversos algunos de ellos graves. En relacin al procedimiento quirrgico son destacables la presencia de sangrado grave -que en algn caso ha requerido nueva ciruga en un 10% de pacientes, la trombosis de la porta o alguna de sus ramas (6%), y la elevacin transitoria de enzimas hepticos. Como eventos adversos no graves ms frecuentes se describen las lceras bucales (92%), anemia (81%), leucopenia (75%), diarrea (64%), cefalea (56%), neutropenia (53%), nausea (50%), vmito (42%), acn (39%) y astenia (39%). Hasta el momento no se ha descrito la aparicin de neoplasias malignas en los pacientes con trasplante de islotes y tratamiento inmunosupresor.
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Tratamiento de la Diabetes con Bombas de Insulina
Futuro
La terapia celular de la diabetes, bien mediante el trasplante de islotes bien de clulas productoras de insulina, es una opcin muy atractiva para la curacin de la diabetes. Sin embargo, en las actuales circunstancias su aplicacin est limitada a unos escasos pacientes y centros. Para poder generalizar esta opcin a la mayora o al menos a un nmero significativo de pacientes la investigacin debe resolver problemas fundamentales que se han mencionado a lo largo de este captulo. Deben mejorarse las condiciones tcnicas del aislamiento de islotes para aumentar el rendimiento y la reproducibilidad del proceso, y la funcionalidad de los islotes obtenidos. La preservacin de la masa beta trasplantada ofrece diversos campos de actuacin, antes y despus del trasplante. Debe reducirse la muerte de islotes que ocurre inmediatamente despus del trasplante y que no obedece a rechazo, aspecto en el que se han reportado interesantes datos a nivel experimental con el uso de estrategias de terapia gnica para mejorar la capacidad de supervivencia de los islotes. Se deben encontrar tambin nuevas formas de proteger a medio y largo plazo los islotes del rechazo y de la recurrencia de la destruccin autoinmune con sistemas menos txicos para el paciente y para los propios islotes que los actuales frmacos innmunosupresores. Los avances en estos aspectos pueden venir, entre otros, del uso de nuevos innmunosupresores, de la induccin de tolerancia, o de la proteccin de los islotes con estrategias de terapia gnica o fsicas por sistemas de encapsulacin. Finalmente, para poder hacer frente a la enorme demanda debida al potencial numero de receptores del trasplante es preciso disponer de sistemas de expansin de los islotes in vitro, o de fuentes alternativas de clulas productoras de insulina ya sea de origen humano o de otras especies. La generacin de clulas beta a partir de clulas madre embrionarias o de posibles clulas madre adultas es una alternativa prometedora. Sin embargo, es improbable que los conocimientos actuales en este campo permitan obtener en los prximos aos una fuente ilimitada de clulas productoras insulina vlida para uso clnico, por lo que posiblemente el trasplante de islotes seguir siendo a corto plazo la nica terapia celular sustitutiva aplicable clnicamente al tratamiento de la diabetes.
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CAPTULO 8
AUTORES
Albert Barber Rosa Gasa
Investigadores Laboratorio Diabetes y Obesidad Instituto de Investigaciones Biomdicas August Pi i Sunyer www.diabetisiobesitat.org
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En la actualidad se sabe que la prdida de masa y funcin de la clula beta es un punto determinante en el desarrollo de la mayora de diabetes. Por lo tanto, cualquier aproximacin teraputica a la cura de esta enfermedad debe afrontar la necesidad de reemplazar o evitar esta disminucin de clula beta. Para conseguir este objetivo se pueden utilizar diferentes estrategias: por un lado se puede estimular la renovacin de las clulas beta in situ, o por el otro reponer las clulas beta mediante el transplante de islotes procedentes de un donante o de clulas beta generadas in vitro. Sea cual sea la estrategia que se escoja, se necesita un amplio conocimiento de los mecanismos que regulan la proliferacin, diferenciacin y supervivencia de la clula beta in vivo. Es por eso que en la actualidad se estn haciendo grandes esfuerzos para conocer las bases moleculares que controlan la homeostasis y la diferenciacin de la masa de clula beta. En este captulo pretendemos dar una resumen general sobre el proceso de diferenciacin de la clula beta durante la embriognesis as como explicar a grandes rasgos como se regula la masa de clula beta en el individuo adulto y cuales son los procesos de regeneracin que tienen lugar en determinadas situaciones fisiopatolgicas.
1. Morfognesis del pncreas

Los tres linajes celulares (exocrino, endocrino y ductal) que forman el pncreas adulto proceden de un grupo comn de clulas precursoras de origen endodrmico. El conocimiento de los factores y de los mecanismos de sealizacin implicados en el proceso de diferenciacin pancretica constituye un reto complejo pero a la vez fascinante de la biologa del desarrollo. Adems, muchos investigadores buscan pistas en el rea del desarrollo pancretico que puedan ser tiles para el diseo de protocolos de generacin de clulas productoras de insulina a partir de fuentes celulares renovables como las clulas madre. La formacin del pncreas se inicia de manera temprana durante el desarrollo embrionario. En el ratn, la primera indicacin visual de morfognesis pancretica se da alrededor del da embrionario 9 (e9), cuando dos rudimentos, uno dorsal primero y otro ventral despus, se hacen visibles en la zona del endodermo del intestino primitivo que dar lugar al duodeno. Hacia el da 10.5 se inicia el crecimiento
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y ramificacin del epitelio de los dos primordios pancreticos, los cuales entre e13 y e14 sufren una reorientacin y se fusionan en un nico rgano bipolar. La diferenciacin endocrina es aparente desde las etapas ms iniciales del desarrollo pancretico. Entre e9.5 y e12.5 la mayora de clulas formadas son positivas para glucagn. A partir de e12.5 se produce la diferenciacin exponencial de clulas endocrinas, en su mayora clulas beta, a partir de precursores (neognesis) en la etapa conocida como transicin secundaria. Hacia el da e16 las clulas endocrinas empiezan a agruparse, pero no es hasta poco antes de nacer (e18-e19) que los islotes estn plenamente formados. La maduracin final del islote se da durante las primeras semanas despus del nacimiento. El pncreas exocrino empieza a diferenciarse hacia el da e14.5 y en el da e15.5 los acinos ya son claramente distinguibles de los ductos. Por el contrario, se conoce muy poco sobre la diferenciacin de las clulas ductales, a excepcin de que la mayoria de precursores ductales se distinguen de los progenitores de los linajes endocrino/exocrino antes de e12.5. En humanos, los primordios pancreticos son evidentes en la semana 4 de gestacin y su fusin se produce al final de la semana 6. Clulas endocrinas positivas para las cuatro hormonas insulares estn presentes ya en la semana 10. Cabe destacar que existen pocos estudios moleculares sobre organognesis pancretica en humanos y los modelos vigentes y descritos a continuacin se basan mayoritariamente en informacin obtenida en ratn y pollo.
2. Control transcripcional del desarrollo pancretico endocrino

Desde un punto de vista molecular, la expansin y diferenciacin de los precursores endodrmicos hacia los distintos linajes pancreticos son el resultado de una secuencia altamente regulada de seales extracelulares y de cambios en programas de expresin gnica. Dichos cambios son dirigidos por una cascada de factores de transcripcin cuyas activaciones-inactivaciones coordinadas permiten la progresin del precursor pluripotente a la clula pancretica diferenciada. La identificacin de estos factores y de las relaciones epistticas existentes entre ellos es indispensable para llegar a comprender los procesos que culminan en la formacin de las clulas del islote. En muchos casos, protenas ya conocidas debido a su papel en el mante127
nimiento del fenotipo de la clula endocrina diferenciada han resultado ser cruciales para el desarrollo de este mismo tipo celular durante la embriognesis. Por ejemplo, factores reguladores del gen de la insulina como Pdx-1 o NeuroD/BETA2 son clave para el desarrollo endocrino y/o pancretico. La informacin obtenida mediante tcnicas de biologa molecular clsica y, en especial, mediante el estudio de modelos genticos en ratn ha permitido elaborar la cascada de factores de transcripcin propuesta en la Figura 1. No obstante, se trata de un modelo an incompleto y posiblemente mucho ms simple de lo que ocurre en la realidad. Por ejemplo, muchos de los factores enumerados actan en ms de un momento del desarrollo y con funciones marcadamente distintas en cada uno de dichos momentos. Los factores Pdx-1 y Hb9 se expresan en el endodermo prepancretico antes de que se inicie la formacin de los primordios. En ausencia de Hb9 no se forma el primordio dorsal pero s el ventral. En cambio, en ausencia de Pdx-1 se inicia la formacin de ambos primordios pero su crecimiento y morfognesis queda interrumpida en las etapas ms tempranas del desarrollo, tanto en ratones como en humanos. La importancia de Pdx-1 en el desarrollo pancretico ha sido confirmada en
FIGURA 1
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estudios recientes de linaje celular que han demostrado que todas las clulas pancreticas derivan de clulas positivas para Pdx-1. La expresin de Pdx-1 y Hb9 decae despus de e10.5 pero vuelve a reaparecer en las clulas beta ya diferenciadas. La especificacin del linaje endocrino en precursores pancreticos viene determinada por la expresin de los factores de transcripcin pro-endocrinos. Esta terminologa hace referencia a (1) el requerimiento de estos factores para iniciar la cascada de diferenciacin endocrina y (2) su capacidad para inducir diferenciacin endocrina en contextos adecuados. Neurogenina3 (Ngn3) es el factor pro-endocrino clave en el pncreas. Ratones genoanulados para el gen que codifica este factor no tienen clulas endocrinas en el pncreas y mueren poco despus de nacer, lo que demuestra que Ngn3 ejerce una funcin no redundante en la diferenciacin endocrina. Ngn3 acta a modo de interruptor de la cascada transcripcional que culmina en la formacin de las clulas endocrinas del islote. No obstante, su expresin es transitoria y despus de alcanzar un punto mximo alrededor de e15.5 decae hasta niveles indetectables en el pncreas neonato. Por lo tanto, otros factores, activados directa o indirectamente por Ngn3, deben continuar y finalizar el proceso de diferenciacin endocrina iniciado por Ngn3. Uno de estos factores es NeuroD/BETA2. NeuroD1/BETA2 es una diana directa de Ngn3 y comparte con su activador la capacidad de promover el destino endocrino en ambientes permisivos. A parte de NeuroD1/BETA2, otros factores regulados directamente por Ngn3 y de demostrada relevancia en la formacin de las clulas endocrinas del islote son Pax4, Nkx2.2 e IA-1 (para revisiones extensas sobre los factores de transcripcin endocrinos, ver bibliografa recomendada). Una cuestin de gran inters, si deseamos aplicar los conocimientos sobre biologa del desarrollo al diseo de protocolos de generacin de clulas beta, la determinacin del subtipo especfico (alfa, beta, delta o PP) de los precursores endocrinos. La identificacin de clulas que coexpresan insulina y glucagn en las etapas tempranas del desarrollo pancretico sugiri la existencia de clulas progenitoras bipotenciales para los linajes alfa/beta. No obstante, esta idea fue desestimada tras demostrarse que las clulas beta maduras derivan de clulas que nunca expresaron glucagn, y viceversa. El conjunto de datos disponibles hasta el momento sugiere que la decisin sobre el subtipo endocrino se toma en etapas iniciales del proceso de diferenciacin y antes de la expresin de hormonas. El modelo vigente establece que la accin concertada de distintos factores de transcripcin, que funcionan en paralelo
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con Ngn3 o por debajo de la misma, es la responsable de determinacin de linaje endocrino especfico. As, Pax4 y Arx son necesarios para la especificacin de los linajes beta y alfa, respectivamente. La ausencia simultnea de los dos factores resulta en la prdida total de clulas beta y alfa y en el aumento de clulas delta. Tambin los factores Nkx2.2 y Nkx6.1 juegan un papel relevante en la determinacin del linaje beta. Animales genoanulados para Nkx2.2 no tienen clulas positivas para insulina pero sin embargo tienen clulas endocrinas con otros marcadores de clulas beta y expresan la hormona grelina. La ausencia de Nkx6.1, por su parte, es la causa de que no se produzca neognesis de clulas beta durante la transicin secundaria.
3. Sealizacin y desarrollo pancretico

El estudio de las redes genticas es esencial para comprender los cambios de fenotipos celulares que ocurren durante el proceso de diferenciacin. Sin embargo, estas redes no pueden explicar por s solas el desarrollo pancretico. Efectivamente, la formacin del pncreas requiere una serie de seales inductivas, unas iniciales y otras secundarias, procedentes de tejidos vecinos que dirijan su diferenciacin. Para la correcta formacin del pncreas son necesarias seales enviadas por tejidos mesodrmicos situados cerca del endodermo prepancretico. El notocordio enva seales que reprimen la expresin de Sonic Hedgehog (Shh) en el endodermo prepancretico dorsal, lo que constituye un prerequisito para la expresin de Pdx-1 en esta regin y para el consiguiente desarrollo del pncreas. La activina-b, perteneciente a la familia de TGF (factor de crecimiento transformante beta) y el FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos 2) son dos de las molculas secretadas por el notocordio y mediadoras de dicho efecto. La especificacin del pncreas ventral ocurre de manera independiente. Pdx-1 se expresa en el endodermo ventral y las seales procedentes del mesodermo cardaco y del septum transversum no son necesarias para inducir la expresin de este factor en la regin prepancretica sino para inhibir su expresin en la regin preheptica. El mismo FGF2 o BMP4 (protena morfognica sea 4), otro miembro de la familia TGF-beta, son dos de las molculas encargadas de inhibir la expresin de Pdx-1 en la regin preheptica permitiendo as el desarrollo del hgado. Por lo tanto, los mismos morfgenos se encargaran de la induccin del pncreas dorsal y vental pero con estrategias esencialmente opuestas.
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La interaccin con vasos sanguneos es tambin crtica para la diferenciacin del pncreas. Estudios in vitro han demostrado que seales procedentes del endotelio de la aorta son necesarias para inducir la expresin de Pdx-1 e insulina en el endodermo prepancretico dorsal. Las molculas mediadoras de dicho efecto incluyen miembros de la familia FGF. Una vez iniciada la formacin de los primordios, la proliferacin y morfognesis del epitelio pancretico depende de seales procedentes del mesnquima circundante. Se postula que estas seales son determinantes para establecer la proporcin de tejido exocrino versus endocrino del pncreas. Experimentos en cultivo celular demuestran que el mesnquima es necesario para la estimulacin del crecimiento epitelial y de la diferenciacin exocrina. Uno de las molculas candidatas secretadas por el mesnquima y que podra participar en la induccin del destino exocrino es la folistatina. Esta molcula actuara unindose a miembros de la familia TGF? como la activina o los BMPs y inhibiendo su accin. De hecho, molculas de la familia de TGF-beta se expresan en el epitelio pancretico y suprimen el desarrollo exocrino en etapas tempranas del desarrollo.
4. El pncreas endocrino, un rgano en constante renovacin

Respecto al individuo adulto, en los ltimos aos ha cambiado sustancialmente la concepcin cientfica que tenemos del funcionamiento de la masa de clula beta. Se ha pasado de considerarse un rgano esttico a uno dinmico y plstico. La plasticidad endocrina se puede definir como la capacidad que tiene este rgano para regular la masa de clula beta segn las necesidades de insulina y poder asi garantizar un ptimo control de la glucemia. Esta plasticidad celular implica tanto un capacidad de expansin como de disminucin de la masa de clula beta. El pncreas endocrino est en continua remodelacin mediante un proceso dinmico, en el cual participan tanto la regeneracin como la muerte celular (ver figura 2). Existen numerosos factores genticos, metablicos y ambientales que afectan este proceso de remodelacin. El balance entre los diferentes mecanismos que controlan la masa de clula beta permiten que sta se adapte a las necesidades metablicas de diferentes situaciones como el embarazo o la obesidad. Aunque se ha avanzado considerablemente en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la home131
FIGURA 2
ostasis de clula beta, aun existen muchas lagunas y controversias cientficas. Los mecanismos de adaptacin de la clula beta funcional, aunque son diversos, no son mutuamente excluyentes y pueden actuar simultneamente. Tanto la involucin como la expansin de la clula beta no slo conlleva cambios en el numero de clulas, sino tambin en el tamao celular mediante el aumento (hipertrofia) o disminucin (atrofia) del volumen celular. Adems de estos mecanismos compensatorios, que actan a medio o largo plazo, no debemos olvidar que existen otros mecanismos a corto plazo que permiten adaptar la funcionalidad de la clula beta a las variaciones en las necesidades metablicas del organismo. Por ejemplo, la clula beta puede aumentar su capacidad de secretar insulina usando una gran variedad de complejos mecanismos como un aumento en la sntesis o secrecin de insulina o la variacin del umbral de respuesta a los diferentes estmulos. En referencia a los mecanismos que controlan la masa de clula beta, el nmero absoluto de clulas beta puede aumentar mediante dos mecanismos: replicacin y neognesis. La replicacin consiste en la divisin de una clula beta funcional para obtener dos nuevas clulas beta. En el islote se ha postulado que existen diferentes tipos de clula beta: el pool replicativo y el pool senescente. El primero incluye las clulas beta capaces de dividirse por mitosis en repuesta a diferentes factores de
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crecimiento; el segundo pool se refiere a las clulas beta funcionales incapaces de replicarse. Sin embargo, esta teora ha sido rebatida en estudios recientes que demuestran que, en el ratn adulto, todas las clulas beta comparten esta capacidad replicativa y, por tanto, participan de igual manera en el mantenimiento de la masa celular beta. Por otra parte, la neognesis se refiere a la formacin de nuevas clulas beta a partir de precursores no endocrinos; el proceso requiere la proliferacin de estos precursores y una posterior diferenciacin de estos hacia clulas beta funcionales. La naturaleza de estos precursores no ha sido determinada con claridad, pero diferentes estudios sugieren que se encontraran en el ducto pancretico y seran de origen epitelial. La importancia de la neognesis en la homeostasis de la masa de clula beta en el adulto no est clara siendo sta un tema muy controvertido en la comunidad cientfica. El aumento en la masa de clula beta producido por replicacin o neognesis puede ser contrarestado por la disminucin del nmero celular mediante la muerte celular por apoptosis o necrosis. La apoptosis o muerte celular programada permite moldear el tejido pancretico durante la organognesis y la vida del individuo; adems juega un papel fundamental en modular la expansin y posterior involucin de la masa de clula beta en la diabetes tipo 2. Por lo tanto, la regulacin de la homeostasis de la masa de clula beta es un proceso complejo y genticamente heterogneo. La contribucin relativa de los diferentes mecanismos de expansin e involucin puede variar de manera considerable, incluso en el mismo individuo, cuando cambian las condiciones fisiolgicas.
5. Crecimiento del pncreas posnatal

En los roedores, justo despus del nacimiento, la replicacin se convierte en el principal mecanismo de aumento de masa de clula beta, aunque la neognesis continua producindose. De hecho, se han identificado clulas ductales alrededor de los islotes neonatales con una alta tasa de replicacin que daran lugar a clulas beta funcionales despus de su diferenciacin. No obstante, estas estructuras desaparecen despus de la primera semana de vida de los roedores. El aumento de masa de clula beta mediante replicacin y neognesis dura hasta el destete de los animales. Justo en este momento se produce un pico de apoptosis que est asociado a la disminucin de la tasa de crecimiento que se produce a partir de este momento. En la
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actualidad no existen evidencias de neognesis a partir de precursores celulares en el pncreas intacto de roedores adultos. Durante este periodo neonatal y en el momento del destete, se produce un remodelado del pncreas endocrino que es fundamental para la maduracin de la clula beta y que permite su correcto funcionamiento y respuesta a los principales secretagogos. Esta maduracin tiene lugar mediante los cambios que se producen en los procesos de replicacin y neognesis, as como los apoptticos, durante las primeras semanas de vida del animal. Se sabe en la actualidad que una incorrecta maduracin de la clula beta durante este periodo incrementa las probabilidades de desarrollar diabetes o intolerancia a la glucosa en la madurez. Alteraciones en la dieta tanto durante el embarazo como durante la lactancia modifican la maduracin de la clula beta y podran tener consecuencias a largo plazo amenazando la capacidad homeosttica del pncreas endocrino. Una vez se produce el destete, como se ha mencionado anteriormente, el ritmo de crecimiento de la masa de clula beta disminuye significativamente. No obstante, el pncreas continua comportndose como un rgano dinmico pero con una tasa de crecimiento mucho menor. La masa total de clula beta aumenta significativamente hasta los 20 meses de edad en las ratas. Por ejemplo durante los seis primeros meses de vida se produce un incremento de unas cuatro veces en la masa de clula beta. Mediante estudios morfomtricos se ha determinado la tasa de replicacin de la clula beta, la cual disminuye del 4% por da en animales jvenes (1 mes de edad) hasta valores menores al 0.5% en ratas adultas. En humanos, la tasa de replicacin en el adulto es parecida a la de las ratas adultas. El incremento de masa se debe a un aumento del tamao de los islotes y de la clula beta, y no a la formacin de nuevos islotes. Esta hiperplasia e hipertrofia del islote se produce hasta los diez meses de vida de la rata. A partir de entonces slo se produce un aumento en el tamao de la clula beta. Para determinar si realmente tiene lugar la neognesis en el adulto, se han realizado estudios de linaje celular utilizando ratones modificados genticamente que permiten determinar la procedencia de las clulas divididas independientemente del momento en el que se produce la divisin. Estos estudios demostraron que a partir de los dos meses de edad, las nuevas clulas beta formadas provienen de clulas ya existentes del islote que expresaban insulina. Por lo tanto, concluyeron que en el adulto el aumento de masa de clula beta se produce exclusivamente por la replica134
cin de clulas beta preexistentes en el islote y que la neognesis a partir de precursores ductales no tiene lugar. No obstante, no podemos olvidar que estos estudios han sido realizado en modelos animales y las diferencias entre ratones y humanos puede modificar la posible contribucin de la neognesis en la homeostasis de la masa de clula beta. Por ejemplo, en el pncreas humano existe una poblacin de clulas beta aisladas, fuera del islote, distribuidas por el tejido exocrino, esta poblacin celular es casi inexistente en roedores. Estos datos morfolgicos pueden sugerir que la neognesis s que tiene lugar en los humanos.
6. Regeneracin del pncreas adulto.

El pncreas, a diferencia de otros rganos, tiene una capacidad regenerativa muy limitada. Esto se debe probablemente a una baja tasa de replicacin o a la dificultad de activar la neognesis. Sin embargo, en determinadas situaciones se ha podido estimular la capacidad regenerativa del pncreas. En todos los modelos en los cuales se ha estudiado la capacidad regenerativa del pncreas, se ha inducido un dao en el tejido pancretico ya sea mediante txicos qumicos o por ciruga. El dao qumico se produce mediante la administracin de estreptozocina o aloxano, dos drogas que selectivamente destruyen la clula beta. Para los modelos con dao por ciruga, se puede utilizar una pancreatectoma parcial (70%) o subtotal (9095%), o una ligacin del ducto. En este ltimo caso se produce una destruccin e inflamacin de una parte del pncreas debido a la liberacin de los productos de secrecin exocrinos. En todos los casos, despus del dao en el tejido se produce un aumento en la capacidad mittica del pncreas producindose una regeneracin parcial del pncreas endocrino y exocrino. A diferencia del hgado, que tiene una alta capacidad regenerativa, en estos modelos la recuperacin nunca es total. Dependiendo del modelo utilizado, en algunos casos se observa un aumento en el ritmo de replicacin de la clula beta indicando que esta regeneracin endocrina se produce por una aumento de la replicacin, de manera parecida a lo observado en el aumento fisiolgico que se produce durante el crecimiento del adulto. No obstante, en otros casos se observa un aumento en la tasa de replicacin de los ductos pancreticos y se observa expresin de Pdx-1 e insulina en estas clulas ductales. Esto sugiere, que en estos casos, la regeneracin se produce por una activacin de la neognesis mediante la
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activacin de clulas precursoras o stem cells. Los resultados indican que estas clulas se diferenciaran a clula beta utilizando los mismos mecanismos moleculares que tienen lugar durante la embriognesis. Adems se ha demostrado que existen sustancias capaces de estimular eprocesos regenerativos cuando se administran a estos modelos animales. La administracin de GLP-1 a animales pancreatectomizados estimula la regeneracin del pncreas mediante la expansin de la clula beta tanto por replicacin como por neognesis. La betacelulina, un factor de crecimiento de la familia de los EFGs (factores de crecimiento epidermal) promueve la regeneracin de la clula beta tanto en ratas pancreatectomizadas como en ratones prefundidos con aloxano. Tambin la combinacin de diferentes factores, como por ejemplo gastrina y EGF, inducen el aumento de clula beta en ratones tratados con aloxano o en ratones con una ligacin en el ducto. En este ltimo caso la regeneracin se produce principalmente por la estimulacin de los mecanismos neognicos.
7. Conclusiones
En resumen, el estudio de los procesos de diferenciacin y regeneracin son de gran utilidad para entender las seales que controlan positiva y negativamente el crecimiento de la clula beta. En los ltimos aos se ha abierto una nueva aproximacin teraputica a la diabetes con el objetivo de mantener la masa de clula beta mediante la estimulacin de su regeneracin, ya sea por aumento en el ritmo de replicacin o por induccin de la diferenciacin de las clulas ductales. Esperemos que un futuro no muy lejano sta nos ofrezca la posibilidad de curar la diabetes, o sino, por lo menos mejorar considerablemente la calidad de vida de los pacientes diabticos.
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CAPTULO 9
Clulas Troncales en el Tratamiento de la Diabetes
AUTORES
Franz Martn Pilar Vaca Bernat Soria

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1. Introduccin
Desde el ao 1922, fecha en la que empezaron los primeros tratamientos con xito de la diabetes, hasta la actualidad, la principal aproximacin teraputica para la diabetes tipo 1 ha sido el tratamiento de los sntomas mediante la inyeccin de insulina. Recientemente, el llamado protocolo de Edmonton ha modificado este panorama, gracias al avance significativo llevado a cabo en las tcnicas de transplante de islotes humano, los cuales han permitido tener pacientes diabticos tipo 1 libres de las inyecciones de insulina. Sin embargo, la aplicacin de este tratamiento es de momento bastante restrictiva debido a la falta de donantes humanos. No obstante, los xitos prometedores de esta terapia de sustitucin de las clulas beta daadas por clulas sanas procedentes de donantes cadavricos, unido a la carencia de donantes, ha reactivado con gran fuerza la bsqueda de substitutos de clulas beta capaces de restaurar la funcin pancretica. Esto es lo que se conoce con el nombre de terapia celular de la diabetes. En esta revisin se tratar de describir la situacin actual de este campo. Se abordar el concepto de clula troncal (tambin llamada clula madre), se mencionarn los distintos tipos de clulas troncales que se podran usar para la terapia celular de la diabetes y se comentarn los xitos y problemas que han ido surgiendo en estos ltimos aos en la bsqueda de clulas que se puedan trasplantar. Hay que sealar que el fin ltimo de la terapia celular es conseguir la curacin de la enfermedad. Es decir, que los pacientes tengan valores de glucemia normales sin necesidad de la administracin de insulina.
2. Concepto de clula troncal y clasificacin de las mismas

A pesar de la creciente cantidad de estudios sobre el origen y las propiedades de las clulas troncales, todava hoy en da no existe una definicin universalmente aceptada de ellas. En principio, se definen por una serie de caractersticas que las hacen distintas del resto de las clulas. Dentro de ellas, las mas evidentes y sobre las que se asienta la base de la definicin mas comn de las clulas troncales es que son un grupo de clulas que forman clones, los cuales son capaces de auto regenerarse y diferenciarse en mltiples tipos de tejidos, aunque no pueden formar total142
mente un nuevo ser vivo (Figura 1). La primera propiedad supone la capacidad de dividirse de un modo contino y prcticamente ilimitado, dando lugar a hijas que son exactamente iguales a la madre. La segunda caracterstica, la pluripotencialidad, indica la capacidad de diferenciarse a cualquier tipo o linaje celular del organismo. Estas dos caractersticas son las que les confieren el tremendo potencial de aplicacin clnica que tienen estas clulas, ya que supondran una fuente ilimitada de clulas que se podran trasplantar en los ensayos de terapia celular. Por ltimo, tal y como se ha sealado, estas dos propiedades no son en s mismo totalmente definitorias de todos los tipos de clulas troncales existentes. Las clulas troncales se pueden clasificar sobre la base de su grado de pluripotencialidad o diferenciacin y segn su origen. No obstante, ambas clasificaciones estn relacionadas, ya que segn su origen tendrn mayor o menor capacidad de diferenciacin. En funcin de su capacidad de diferenciarse hacia distintos tipos de tejidos, las clulas troncales se pueden clasificarse en: i) totipotenciales; ii) pluripotenciales; iii) multipotenciales y iv) unipotenciales. El primer grupo se trata de clulas troncales capaces de diferenciarse hacia cualquier tipo celular, incluyendo el trofoblasto que dar lugar a la placenta, los tejidos extraembrionarios y el cordn umbilical. Este tipo de clulas solo estn presentes en el embrin en los primeros estadios de divisin (aproximadamente hasta la etapa de 8-16 clulas). Las clulas pluripotentes son aquellas que pueden dar lugar a los distintos tipos celulares que proceden de las tres hojas embrionarias, incluyendo la lnea germinal (vulos y espermatozoides). Dentro de este grupo se encuentran las clulas troncales embrionarias y las clulas troncales germinales. Las primeras proceden de embriones antes de su implantacin que se encuentran en la fase de blastocisto. En ellos hay una masa de unas 130 clulas, que se encuentran en su interior, y que se denominan masa celular interna. Esta masa celular cuando se asla y se consiguen cultivar origina a las clulas troncales embrionarias. Las clulas troncales germinales derivan de las clulas germinales primordiales, procedentes de de las futuras gnadas, que en un embrin humano se desarrollan entre las semanas cinco y nueve del desarrollo. Por ltimo, en los ltimos seis aos han ido apareciendo una serie de estudios que sugieren que en los tejidos adultos existen clulas troncales con una capacidad de crecimiento y diferenciacin mayor de lo que se pensaba, es decir, clulas troncales pluripotentes. Hasta ahora se han sugerido cuatro tejidos distintos
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en donde podran encontrarse esas clulas: i) el mesangioblasto; ii) la dermis; iii) el tejido muscular y la mdula sea. Lo que no se tiene claro es cuales son los posibles orgenes de estas clulas. Las clulas multipotentes son clulas mas comprometidas, presentes en tejidos adultos, que pueden derivar a los distintos tipos de clulas que se encuentran en un tejido determinado u rgano. Por ejemplo, las clulas troncales del epitelio intestinal que darn lugar a los cuatro tipos de clulas que forman parte del mismo. Finalmente, las clulas unipotentes son lneas celulares bastante comprometidas que se diferencian en un nico tipo celular.
3. Posibles fuentes de clulas troncales que pueden utilizarse para generar clulas productoras de insulina.
Hasta el momento, los diferentes estudios publicados han mostrado la posibilidad de obtener clulas productoras de insulina a partir de distintos tipo de clulas troncales, tanto de origen embrionario como adulto (Figura 2). A continuacin, discutiremos los avances obtenidos en la investigacin con ambas fuentes de clulas troncales.
3.1. Clulas troncales embrionarias

Los primeros estudios que establecan la posibilidad de utilizar clulas troncales embrionarias, de origen murino y humano, como una fuente de clulas productora de insulina aparecan a comienzos del ao 2000. Las clulas que se obtenan contenan insulina, la secretaban de un modo regular en respuesta a estmulos, y en el caso de las troncales embrionarias de ratn, eran incluso capaces de normalizar la glucemia cuando se trasplantaban a modelos de ratones diabticos. Las estrategias que se han empleado hasta ahora para diferenciar las clulas troncales embrionarias son dos. La primera de ellas utiliza un sistema que permite seleccionar las clulas productoras de insulina gracias a su resistencia a un antibitico. Para ello se inserta en las clulas troncales indiferenciadas un transgn que hace que
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todas las clulas que estn expresando el gen de la insulina sean resistentes a un antibitico. A continuacin, las clulas troncales embrionarias que han incorporado el transgn en su genoma se someten a varios protocolos de diferenciacin. Estos procesos consisten en cultivar las clulas en presencia de distintos factores de crecimiento, nutrientes y otros factores, con el fin de forzarlas a producir insulina. Generalmente, los protocolos de diferenciacin se disean en base a los conocimientos que nos proporciona la biologa del desarrollo del pncreas. Es decir, tratan de emplear factores que se saben que son claves en los diversos estadios del desarrollo pancretico. Posteriormente, las clulas diferenciadas se someten al proceso de seleccin con el antibitico, para tener en el medio de cultivo solo las clulas que producen insulina. A continuacin, esas clulas diferenciadas y seleccionadas se caracterizan. En el proceso de caracterizacin se busca la presencia de elementos claves, propios de las clulas beta nativas, y que son fundamentales para una secrecin regulada de insulina. En este sentido se busca la presencia del transportador de glucosa (Glut-2), del poro del canal de potasio dependiente de ATP (Kir 6.2), del receptor de sulfonilureas (Sur1), de la insulina, del pptido C y del factor de transcripcin homeobox-1 pancretico duodenal (PDX1). La presencia de todos estos elementos se estudia a nivel del mensajero, as como, de la protena. Posteriormente, se hacen pruebas de la funcionalidad de las clulas diferenciadas analizndose la secrecin regulada de insulina y pptido C. Tambin, se estudia la funcionalidad del canal de potasio dependiente de ATP. Finalmente, se comprueba en modelos de animales diabticos si estas clulas son capaces de restaurar la normoglucemia, tanto en situaciones de ayuno, como postpandriales. Dentro de este primer tipo de estrategia, tambin se pueden seleccionar las clulas en funcin de la expresin de un factor de transcripcin denominado NKx6.1, el cual est involucrado en los pasos finales de la diferenciacin hacia clula beta pancretica durante el desarrollo embrionario. La segunda estrategia consiste en inducir en las clulas troncales indiferenciadas una expresin elevada de determinados factores de transcripcin, que son importantes en los procesos de especificacin hacia clula beta pancretica durante el desarrollo embrionario. Dentro de estos factores cabe destacar los estudios llevados a cabo aumentando la expresin de Pax4 y de Pdx1. Pax4 es importante en la diferenciacin hacia clula beta pancretica, una vez que ya existe una clula progenitora propia que dar lugar a una clula beta pancretica. Pdx1 es un factor de transcripcin fundamental para el desarrollo del pncreas y para el mantenimiento del fenotipo de la clula beta pancretica adulta. Hay que sealar que esta estrategia de
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incremento de la expresin de los factores de transcripcin, tambin suele ir acompaada de manipulaciones en las condiciones de cultivo, con el fin de forzar an ms la diferenciacin hacia una clula productora de insulina. En cuanto a los trabajos llevados a cabo con clulas troncales embrionarias humanas, las investigaciones realizadas van por detrs. En este sentido, los protocolos de diferenciacin desarrollados han sido capaces de producir clulas que expresan a nivel del ARN mensajero varios marcadores propios de una clula beta. Adems, estas clulas tambin contienen insulina, pptido C, as como, otras hormonas presentes en los islotes. Por otro lado, son capaces de liberar insulina en respuestas a secretagogos que no se metabolizan, pero muestran una liberacin de insulina en respuesta a glucosa muy pobre. Finalmente, todava no se ha podido demostrar que sean capaces de normalizar la glucemia cuando se trasplantan a modelos de animales diabticos. De momento, la falta de xito en estas primeras aproximaciones ha hecho que se vuelva la vista hacia el estudio de lo que ocurre durante el desarrollo embrionario. Concretamente, es importante entender que es lo que pasa en los primeros pasos de la formacin del endodermo, ya que es fundamental disear protocolos de diferenciacin que nos permitan dirigir a las clulas troncales embrionarias hacia endodermo definitivo.
3.2. Clulas troncales adultas

Hasta el momento, las fuentes de clulas troncales adultas utilizadas para obtener clulas productoras de insulina tienen un doble origen: i) pancreticas y ii) extrapancreticas. Durante las ltimas dos dcadas, varios estudios han sealado que en el pncreas existen varias fuentes de clulas progenitoras con un potencial de diferenciacin restringido hacia clulas de fenotipo pancretico. De hecho, se sabe que hay procesos de regeneracin pancretica, pero no est claro si estos se deben a la autorreplicacin de las propias clulas beta o a la formacin de nuevas clulas beta a partir de clulas troncales adultas. Adems, hasta hoy da, los estudios realizados no han sido capaces de identificar realmente cual es la clula troncal adulta pancretica responsable de la regeneracin pancretica. Probablemente, el problema sea que la regeneracin pancretica no se deba a una nica estirpe celular o a un solo proceso de reparacin, sino que participen tanto clulas beta adultas que se replican, como distintos tipos de clulas troncales adultas. De hecho, cada da que pasa crece ms
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la lista de clulas troncales adultas pancreticas propuestas como candidatas para la regeneracin pancretica. Hasta el momento tenemos: i) clulas ductales; ii) clulas del tejido exocrino pancretico; iii) clulas progenitoras derivadas de los islotes y positivas a nestina; iv) clulas positivas a neurogenina 3; v) clulas precursoras multipotentes derivadas del pncreas y vi) clulas beta maduras. Mas recientemente han comenzado a publicarse trabajos donde se sugiere la existencia de clulas troncales adultas que estn fuera del pncreas y que pueden dar lugar a clulas productoras de insulina. Por ejemplo, debido a que el pncreas y el hgado comparten un origen embrionario endodrmico comn, este fue uno de los primeros lugares donde se busc para encontrar estas clulas. Se vio que en clulas troncales adultas hepticas de ratones y en clulas progenitoras hepticas presentes en hgados fetales humanos, la activacin del factor de transcripcin Pdx1 induca la expresin de varios genes propios de clulas beta, produca la liberacin de insulina en respuesta a glucosa y cuando se trasplantaban estas clulas en modelos de animales diabtico e inmunodeficientes, restauraban y mantenan la normoglucemia por perodos de tiempo prolongados. Otro tejido con un origen embriolgico similar es el intestino delgado. Hay un estudio donde se demuestra que clulas troncales adultas intestinales de rata, a las que se les induce la expresin de los factores de transcripcin Pdx1 e Isl1 y se las cultiva en presencia de factores que promueven la diferenciacin hacia clula beta, producen insulina y disminuyen la glucemia cuando se trasplantan a ratas diabticas. Uno de los tejidos donde se encuentran clulas troncales adultas con una enorme plasticidad es la mdula sea. Se ha comprobado que estas clulas, denominadas clulas progenitoras adultas multipotentes, son capaces de transdiferenciarse hacia destinos ectodrmicos, mesodrmicos y endodrmicos. Un estudio reciente indica que clulas troncales adultas procedentes de la mdula sea son capaces de generar, aunque con bastante limitacin, clulas pancreticas endocrinas funcionales. Tambin, existe otro trabajo donde se comprueba que el trasplante de clulas troncales procedentes de la mdula sea reduce la hiperglucemia en ratones diabticos. Los mecanismos propuestos para explicar estos trabajos son dos: i) existe una diferenciacin de las clulas troncales de la mdula sea en el interior de los islotes y los ductos pancreticos y ii) el trasplante de estas clulas de la mdula sea promueve la regeneracin endgena del tejido pancretico. Junto con la mdula sea, la sangre perifrica es otra de las fuentes propuestas para la obtencin de clulas troncales adultas con posibilidad de transformarse en clulas productoras de insulina. Un estudio publicado el ao pasado comprobaba la enorme plasticidad de monocitos obtenidos de sangre perifrica de
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donantes humanos. Estos monocitos eran forzados a transdiferenciarse a clulas productoras de insulina, las cuales tenan una secrecin de insulina regulada por glucosa, e incluso disminuan la glucemia durante una semana, cuando se trasplantaban a ratones inmunodeprimidos y diabticos. Finalmente, se sabe que clulas troncales obtenidas de determinadas regiones del cerebro son capaces de cultivarse y crecer in vitro, as como de transdiferenciarse a distintos linajes celulares. En este sentido, se demostr hace dos aos que a las clulas troncales adultas procedentes de cerebros de rata se las poda inducir a expresar el gen de la insulina. Adems, estas clulas secretaban insulina y respondan metabolitamente a nutrientes y sulfonilureas. As pues, en los ltimos aos se ha demostrado la posibilidad de utilizar distintas fuentes de clulas troncales para la obtencin de clulas productoras de insulina. A modo de resumen, los caminos por los que estos diferentes tipos de clulas troncales pueden llegar hasta una clula capaz de liberar insulina de un modo regulado son varios (Figura 3): i) replicacin de clulas beta adultas preexistentes; ii) diferenciacin a partir de clulas troncales embrionarias; iii) diferenciacin a partir de clulas troncales adultas pancreticas y iv) transdiferenciacin a partir de clulas troncales adultas extrapancreticas.
4. Perspectivas de la terapia celular de la diabetes mllitus

Una pregunta que cabra plantearse es cuales son los requerimientos mnimos que debe tener cualquier substituto de los islotes de Langerhans, si se quiere usar en la terapia celular de la diabetes mllitus. El primero de ellos es el nmero de clulas necesarias. Actualmente, los protocolos de transplante de islotes humanos usan aproximadamente 1 x 106 islotes por receptor. Esto equivale a transplantar de 2-4 x 109 clulas beta. Si multiplicamos esa cantidad, por ejemplo, por el nmero de receptores potenciales de trasplante con diabetes tipo 1 (hasta 105 personas en Espaa), la magnitud del problema es evidente. Por lo tanto, debido a la enorme cantidad de clulas que se necesitara estas tendran que obtenerse a partir de una fuente de clulas troncales que tuvieran una gran capacidad de proliferacin in vitro, antes de poder diferenciarlas. En este sentido, las clulas troncales embrionarias seran candidatas ms atractivas que las adultas, dado que poseen una mayor
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capacidad de proliferacin. El segundo requisito es que las clulas que se trasplanten tienen que tener la capacidad de sintetizar, almacenar y liberar insulina cuando sea necesario, es decir en respuesta a los cambios de la glucemia. Para ello las clulas beta han desarrollado mecanismos complejos que les permiten monitorizar y responder, de un modo constante y rpido, a las modificaciones en los valores circulantes de los nutrientes. La complejidad de estos mecanismos hace que las clulas troncales adultas de origen pancretico pueda ser la fuente ms idnea, ya que la distancia que las separa a ellas de las clulas beta es ms corta, por lo que el desarrollo de protocolos de diferenciacin debe ser tericamente ms sencillo. En tercer lugar, la capacidad de proliferacin de las clulas que se vayan a trasplantar tiene que estar estrictamente controlada, con el fin de evitar la formacin de tumores. Por esta razn, las clulas troncales adultas seran mejores, pues tienen una menor capacidad de formar tumores que las embrionarias. Tambin, las clulas trasplantadas deben evitar la destruccin inmunolgica por parte del receptor. Segn se public hace unos aos, la capacidad inmunognica de las clulas troncales embrionarias es bastante limitada, por lo que seran mejores candidatos. Por ltimo, hay un problema aadido en el trasplante a pacientes con diabetes tipo 1, dado que su sistema inmune est programado para destruir a toda las clulas beta primarias. Por eso, pudiera ocurrir que las clulas secretoras de insulina que se diferencian a partir de clulas troncales embrionarias obtenidas por procesos de clonacin teraputica, de un paciente con diabetes tipo 1, fueran rechazadas. Una alternativa sera generar clulas secretoras de insulina que tuvieran los elementos esenciales para poder liberar insulina en respuesta a nutrientes, pero que fueran, en el sentido inmunolgico y de la biologa del desarrollo, distintas de las clulas beta primarias. Por ltimo, es importante que las clulas productoras de insulina que se generen estn diseadas para poder funcionar en un ambiente fuera del pncreas, ya que los lugares de trasplante utilizados hasta ahora estn fuera del mismo.
5. Conclusiones
Gracias al avance producido por el protocolo de Edmonton y los pasos de gigante que se han dado en la investigacin de la biologa bsica de las clulas troncales, la terapia celular se podr convertir en un futuro prximo en un tratamiento ms de la diabetes mllitus. En este sentido, las clulas troncales ofrecen un enorme potencial. Los caminos que se estn siguiendo actualmente, con el fin de generar sufi149
cientes clulas productoras de insulina que se puedan transplantar y suplir la deficiencia de clulas beta son muchos. Entre ellos destacan la expansin de las clulas beta primarias, la utilizacin de clulas troncales embrionarias, el empleo de clulas progenitoras pancreticas y la transdiferenciacin de clulas troncales adultas no pancreticas. Aunque todas estas opciones son prometedoras, tambin plantean un grado de dificultad y un reto enorme para la comunidad cientfica. De momento, ninguno de los caminos propuestos es claramente mejor que el otro. Por eso, deberan dejarse todas las puertas abiertas y apostar por la investigacin en todas estas lneas, as como, por la interaccin que habr entre ellas.
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Tablas y Figuras
FIGURA 1
Esquema representativo de las dos propiedades ms importantes de las clulas madre
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Tablas y Figuras
FIGURA 2
Tipos celulares empleados para la terapia celular de la diabetes. En esta figura se representan las distintas fuentes de clulas utilizadas hasta hoy como tejido productor de insulina y cuyas aplicaciones en la terapia celular de la diabetes se estn investigando. Enmarcadas en rojo aparecen los distintos tipos de clulas troncales usados.
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Tablas y Figuras
FIGURA 3
Mecanismos posibles de obtencin de nuevas clulas beta. A) Replicacin de clulas beta adultas preexistentes, B) Diferenciacin a partir de clulas troncales embrionarias; C) Diferenciacin a partir de clulas troncales adultas pancreticas y iv) Transdiferenciacin a partir de clulas troncales adultas extrapancreticas.
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La monografa que presentamos ofrece al lector interesado, pero no necesariamente especializado, una visin actual del papel fundamental del islote pancretico en la etiopatogenia y tratamiento de la diabetes. Los captulos de la monografa reflejan la diversidad y complementariedad de las lneas de investigacin de los miembros del Grupo de Islotes de la SED. En un entorno en el que la interrelacin entre investigadores es fundamental, el Grupo de Islotes ofrece un foro de comunicacin, intercambio y participacin entre profesionales de mbitos distintos que a menudo es difcil encontrar en otros entornos, e incorpora, a partir del nexo comn que significa el inters por el islote pancretico y la diabetes, perfiles profesionales y reas de conocimiento diversos que van de la investigacin bsica y preclnica a la clnica, como queda reflejado en este libro. Es el deseo de los miembros del Grupo de Islotes que hemos participado en su elaboracin, que la monografa sea de utilidad para facilitar una mejor comprensin del papel central del islote pancretico en el desarrollo de la diabetes, y al mismo tiempo acerque de una forma rigurosa pero comprensible las aportaciones al tratamiento de la diabetes de la investigacin en islote pancretico.
Eduard Montanya Mias

Tomo 5 - El Islote Pancreático en El Desarrollo Y Tratamiento de La Diabetes

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El islote pancretico en el desarrollo y tratamiento de la diabetes

EDITORIAL DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES

El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

MIEMBROS DEL GRUPO DE TRABAJO ISLOTES PANCREATICOS DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.

Dr. ngel Nadal Navajas

Dr. Albert Barber Lluis

Dra. Anna Novials Sard

Dr. Ivan Quesada Moll

Dr. Francisco Jos Bedoya Bergua

Dra. M Jos Redondo Velasco

Dr. Enrique Blzquez Fernndez

Dr. Enrique Roche Collado

Dr. Jess Cancelas Navias

Dra. Petra Snchez Garca Cervign

Dr. Lus Castao Gonzlez

Dr. Bernat Soria Escoms

Dra. Mara Gasa Amaldich

Dr. Juan R. Tejedo Huamn

Dra. Isabel Valverde Alonso

Dr. Fernando Gmez Peralta,

Dr. Ramn Gomis Barber

Dra. Mara Luisa Villanueva-Peacarrillo

Dr. Antonino Jara Albarrn

Dra. Marta Vives-Pi

Dra. Judith Lpez Fernndez

Dr. Franz Martin Bermudo

Dr. Eduard Montanya Mias

SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.

VICEPRESIDENTE 1. Dr. Lus Castao Gonzlez

VICEPRESIDENTA 2. Dra. Adela Rovira Loscos

SECRETARIA. Dra. Lucrecia Herranz de la Morena

VICESECRETARIO. Dr. Juan Emilio Feliu Albiana

TESORERO. Dr. Jos Manuel Fernndez-Real Lemos

VOCAL 1. Dra. Sara Artola Menndez

VOCAL 2. Dra. Ana Chico Ballesteros

VOCAL 3. Dr. Alberto Moreno Carazo

VOCAL 4. Dr. Joseph Franch Nadal

VOCAL 5 Dr. Alfonso Lpez Alba

Vives-Pi M Lucas Martn A

Las incretinas en la secrecin de insula

Autoinmunidad frente a los islotes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1

Terapia celular en diabetes: trasplante de islotes

Glucolipotoxicidad en la clula beta y su relacin con la diabetes tipo 2

Desarrollo embrionario del pncreas y regeneracin en el pncreas adulto

Lesin y supervivencia de las clulas beta pancreticas

Celulas Troncales en el tratamiento de la diabetes

Amilina y toxicidad beta pancretica

El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

Edita: Sociedad Espaola de Diabetes

Diseo, realizacin y produccin:

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Ivan Quesada Eva Tudur ngel Nadal

Instituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

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2. Regulacin de la secrecin de insulina de la clula por glucosa.

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3. Regulacin de la secrecin de glucagn de la a clula por glucosa

El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

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4. Regulacin de la secrecin de somatostatina d en la clula por glucosa.

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Francisco Bedoya* Juan Tejedo Gladys Cahuana*