TCNICAS BSICAS DE MORFOLOGIA VEGETAL

A morfologia vegetal, ao estudar a forma descrevendo as relaes espaciais dos elementos estruturais, utiliza-se de recursos diversos, tais como: lupa para a anlise de rgos (escala em cm ou mm), microscpio fotnico para a observao de sistemas, tecidos e clulas (escala em m), e microscpio eletrnico para o estudo de organelas celulares (escala em ) . Para que o material possa ser visualizado ao microscpio deve ser processado segundo microtcnicas vegetais.

MICROTCNICA VEGETAL
O material a ser observado ao microscpio deve ser fino e transparente, de modo a permitir a passagem de luz. Pode ser preparado a fresco, indicado para estruturas delicadas ou muito hidratadas e para testes histoqumicos; ou pode ser fixado, o que detm os processos vitais de autlise. As amostras so fragmentadas e diafanizadas, ou seccionadas mo livre ou por micrtomo (de deslize, rotativo, ultramicrtomo etc.), obtendo-se preparaes temporrias, semipermanentes ou permanentes.

CORTES HISTOLGICOS
CORTES MO LIVRE
uma tcnica simples e rpida, que requer certa habilidade manual para obteno de cortes finos, executando-se como se segue : selecionar parte adequada do vegetal e apar-la segundo o sentido do corte (transversal ou longitudinal); quando material muito rgido, reidrat-lo ou ferv-lo em gua; quando muito delicado, inclu-lo em suporte (isopor, cortia, medula de embaba ou sabugueiro etc.);

53

segurar o material com uma das mos e com a outra seccion-lo com navalha ou lmina cortante nova; receber os cortes em vidro-de-relgio contendo gua; selecionar os mais delgados, transportando-os com pincel ou estilete; se necessrio, diafanizar com soluo de cloral hidratado a 60% ou de hipoclorito de sdio a 20%; lavar os cortes com gua; cor-los com reagentes ou corantes adequados; para preparao temporria, confeccionar as lminas utilizando como meio de montagem gua ou soluo de etanol a 30%, cobrindo com lamnula; para preparao semipermanente, confeccionar as lminas com soluo de glicerina a 60% ou gelatina glicerinada, cobri-las com lamnula e lutar com esmalte incolor; para preparao permanente, desidratar progressivamente os cortes em srie etanlica (50, 70, 90, 100 e novamente 100%) e diafanizar em srie etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro); montar as lminas com blsamo-do-canad ou resina sinttica.

CORTES EM MICRTOMO
O micrtomo permite que se obtenham cortes com espessura definida, a partir de material rgido ou, quando frgil, infiltrado em suporte adequado. O

micrtomo de deslize secciona o material em cortes individuais, enquanto que o rotatrio possibilita a formao de uma fita, com cortes sequenciais. O preparo das amostras para seccionamento geralmente envolve fixao, desidratao, infiltrao e emblocamento.

Fixao
O processo de fixao procura preservar a estrutura celular, sem alterar a qumica da clula. Os fixadores so agentes fsicos (calor, frio, dessecamento) ou

54

qumicos, sendo que estes ltimos, coagulam ou precipitam protenas celulares e endurecem os tecidos. Os fixadores qumicos podem ser simples ou misturas. Os primeiros so geralmente solues aquosas de uma nica substncia, como : etanol a 70% - precipita as protenas e os cidos nucleicos e dissolve os lipdios; cido actico a 5% - precipita as nucleoprotenas e difunde-se com facilidade; acetona - poderoso solvente de lipdios e preservante de enzimas; tetrxido de smio - forte oxidante, muito voltil e irritante; formalina ou formaldedo a 40% - endurece os tecidos, embora no dissolva os lipdios.

Entre os segundos - as misturas - diversas substncias tm demonstrado poder de fixao superior, a saber : FAA 50 ou 70 - compe-se de formalina, cido actico e lcool etlico. O etanol produz retrao do protoplasma, no entanto o cido actico o expande; o lcool e a formalina endurecem os tecidos, enquanto o cido os amacia; FPA - modificao do fixador anterior, onde o cido actico substitudo pelo cido propinico; Nawaschin - no causa endurecimento nem retrao do material, porm possui pequena penetrao.

O tempo para que ocorra fixao varivel, dependendo do fixador escolhido, do volume da pea a ser fixada e da resistncia da mesma penetrao dos reagentes. Exemplificando, material delicado, como folhas membranceas, pode ser fixado em 12h, enquanto que ramos lenhosos podem necessitar de 7 dias. Depois de fixado, o material estocado em soluo de etanol a 70% indefinidamente.

Desidratao
A desidratao remove a gua dos tecidos fixados e endurecidos, para que a matriz possa penetrar nas clulas e tornar o material resistente ao impacto do micrtomo. O mtodo de desidratao mais comum emprega srie etanlica, onde o

55

material passa sucessivamente por solues cada vez mais concentradas de etanol (50, 70, 90, 100 e 100%), por um tempo determinado.

Infiltrao
Quando a matriz escolhida insolvel em etanol, este deve ser substitudo gradualmente por um solvente onde a mesma seja solvel, para que possa penetrar no interior da clula. No caso da matriz ser parafina, aps

desidratao, o material passa por srie etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3, xilol puro), o que o torna apto a receber a matriz. Procede-se substituio gradativa do xilol pela parafina, adicionando-se parafina fundida em estufa ao solvente e descartando-se metade da mistura, repetidamente aps tempo adequado. Frequentemente, a matriz de escolha a parafina, por ser menos onerosa e apresentar bons resultados. Entretanto, pode-se optar por : paraplast - mistura de parafina altamente purificada com polmeros plsticos e dimetilsulfxido, que permite melhor penetrao e infiltrao (aderncia); celoidina - nitrato de celulose, que se solubiliza em mistura de lcool e ter, em ambiente anidro; metacrilato - historresina ou metacrilato glicol diestearato, solvel em gua e usado para materiais duros.

Incluso ou emblocamento
O material devidamente infiltrado colocado em um molde (caixinha de papel ou de plstico), que preenchido pela matriz, de modo a formar um pequeno bloco. Este aparado e pode ser encaixado no micrtomo para ser seccionado.

Seccionamento em micrtomo
O bloco devidamente aparado colocado sobre suporte, fixado no micrtomo e seccionado. A fita formada ou os cortes individuais so apoiados em fundo escuro para facilitar a visualizao.

56

Distenso dos cortes

Os cortes so aderidos a lminas histolgicas, geralmente utilizando-se dos adesivos de Haupt ou Bissing. Essas lminas so colocadas em placa

aquecedora at distenso dos cortes (ficam translcidos) e depois levadas estufa para secar.

Desparafinizao e diafanizao
As lminas so retiradas da estufa e imersas em xilol para retirada da parafina (matriz). So coradas, usualmente por meio de reidratao, soluo de

corante e desidratao, como se segue : srie etanol-xillica (1:3, 1:1, 3:1 e etanol a 100%), srie etanlica descendente (100, 90, 70 e 50%), colorao com soluo de corante a 50% em etanol, srie etanlica ascendente (50, 70, 90, 100 e 100%) e srie etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro). O xilol favorece a transparncia dos cortes.

Montagem
lamnula adiciona-se o meio de montagem (blsamo-do-canad, euparal ou resinas sintticas: Harlecco, Permount etc.) e esta sobreposta na lmina, deixando secar.

CELULARES DISSOCIAO DE ELEMENTOS CELULARES

Os cortes histolgicos apresentam as estruturas bidimensionalmente. Para se obter uma viso tridimensional, os elementos celulares devem estar isolados, mediante tcnica de dissociao ou macerao. Essa tcnica consiste na separao mecnica e qumica das clulas, por meio de reagentes que desintegram a lamela mdia. Vrios mtodos podem ser aplicados, tais como : mtodo de Jeffrey - mistura de cido ntrico a 10% e cido crmico a 10%, na proporo de 1:1; mtodo de Foster - mistura de etanol a 70% e cido clordrico concentrado (3:1);

57

mtodo de Franklin - mistura de gua oxigenada 20 vol. e cido actico glacial (1:1).

DIAFANIZAO OU CLARIFICAO
A tcnica de tornar semitransparentes peas vegetais de tamanhos variados, geralmente laminares, denominada de diafanizao ou clarificao. Basicamente consiste na dissoluo do contedo celular, restando apenas a parede celular, o que se presta eficientemente para o estudo da nervao foliar. Os reagentes empregados para diafanizao comumente so solues aquosas de hidrxido de sdio a 5-20%, cloral hidratado a 30-60% ou hipoclorito de sdio a 10-20%. Para se confeccionar lminas permanentes, o material diafanizado corado, desidratado em srie etanlica e etanol-xillica e montado com blsamo ou resina, entre lmina e lamnula.

PREPARO DE SOLUES Fixadores

Nawaschin
cido crmico a 1% cido actico glacial formalina 75ml 5ml 20ml

F A A 50 (ou 70 )
formalina cido actico glacial lcool etlico a 50% (ou 70%) 5ml 5ml 90ml

Craft III
cido crmico a 1% cido actico a 10% formalina gua destilada 30ml 20ml 10ml 40ml

58

Corantes e reagentes
Sudan IV
Sudan IV etanol a 80% glicerina 5g 100ml 10ml

Lugol
iodo iodeto de potssio gua destilada 1g 3g 300ml

Cloreto de zinco iodado

cloreto de zinco iodo iodeto de potssio gua destilada 30g 0,9g 5g 14ml

Floroglucinol clordrico
etanol a 95% cido clordrico floroglucinol gua destilada 100ml 25ml 1g 25ml

Sulfato frrico
sulfato frrico formalina gua destilada 10g 5ml 100ml

Cloreto frrico
cloreto frrico carbonato de clcio gua destilada 10g traos 100ml

Azul de astra
azul de astra cido tartrico gua destilada 0,5g 2g 100ml

59

Fucsina bsica
fucsina bsica etanol a 50% 0,5g 100ml

Safranina
safranina 1g etanol a 95% 100ml * no momento do uso, diluir em gua destilada (1:1).

Adesivos
Adesivo de Haupt
gelatina fenol glicerina gua destilada 1g 2g 15g 100ml

Adesivo de Bissing
formalina adesivo de Haupt gua destilada 6ml 1,4ml 194ml

Meio de montagem
Gelatina glicerinada de Kaiser
glicerina gelatina fenol gua destilada 70ml 10g 1,4g 60ml

60

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
BERLYN, G.P. & MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa Sate University Press, 1976. BUCHERL, W. Tcnica microscpica. 3.ed. So Paulo: Polgono, 1962. FOSTER, A.S. Practical plant anatomy. 2.ed. Princeton: D. Van Nostrand, 1949. FRANKLIN, G.L. Preparation of thin sections of synthetic resins and wood-resin composites, and a new macerating method for wood. Nature, London, v. 155, n. 3924, p. 51, 1945. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw-Hill Book, 1940. ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, Stuttgart, v. 61, n. 2, p. 33-36, 1962. SASS, J.E. Botanical microtechnique. 2.ed. Ames: Iowa State College Press, 1951.